受容体クラスタリングは、遍在しており、カスケード活性化のシグナル伝達に必要な場合が多い。ただし、クラスタリングの程度を測定する方法はほとんどありません。我々は、全内部反射蛍光、TIRF顕微鏡を使用して、生細胞の原形質膜中のFGFR1-mEGFP分子の拡散に従う。
次に、N&B分析という数値輝度を適用して、刺激された受容体クラスタリングのダイナミクスを記述します。TIRFは、細胞表面付近で発生する分子事象の迅速な時間的イメージングに最適であり、N&Bは顕微鏡の照射量の拡散に基づいて蛍光分子の平均オリゴマー状態を決定します。実際、これは、シグナル伝達している細胞表面における受容体の空間的時間的組織を接続するツールである。
N&Bは、高速取得モジュールを備えた顕微鏡へのアクセスのみを必要とします。蛍光変動法の基礎知識を有する生細胞の広い領域を解析することができます。この方法は、ダイマーまたはクラスターを形成するタンパク質に適用することができ、蛍光色素でストイチオを測定的に標識することができます。
タンパク質が細胞内区画内にある場合、他のタイプの顕微鏡が画像の取得に使用されます。純粋な単量体の明るさをコントロールとして実験条件下で測定するためのフルオロフォアの単量体形態を発現する構成体を作製することが重要である。初日には、完全培地の1.5ミリリットルのHeLa細胞を100,000〜200,000個の濃度でガラス底皿に種付けします。
種子6〜8は皿を複製し、摂氏37度でインキュベーターでインキュベートします。2日目または3日目に、細胞は亜調合に達している。皿の半分にタンパク質プラスミドを含む無血清培地を加え、モノマーとダイマーを含む参照プラスミドを皿の後半に加え、細胞をトランスフェクトします。
1日後、トランスフェクトされた細胞が皿の底に付着しており、細胞膜が蛍光であることを確認してください。生い茂った細胞や蛍光が非常に低い料理を捨てます。実験の4時間前に、37°Cで顕微鏡の温度インキュベーターを活性化する。
顕微鏡、コンピュータ、カメラの電源を入れ、カメラがマイナス75°Cの適切な動作温度に達するのを待ちます。対物レンズに少量の油を入れます。サンプル皿を顕微鏡のインキュベーターに入れ、インキュベーターのドアを閉めて、皿の温度を10分間平衡させます。
蛍光灯と488ナノメートルレーザーをオンにします。眼球のコントラストモードを選択してサンプルを探索し、眼レンズから焦点を合わせる細胞を探索します。バンドパスEx 490/20 500とバンドパスEm 525/ 50または同様の顕微鏡カメラを介して緑の放出を収集するための適切なフィルタを選択します。
眼球からカムレポートに蛍光モードで切り替えます。フォーカスを絞り込み、TIRF モードに変更します。次に、TIRF顕微鏡の指示に従って自動位置合わせを有効にします。
適切な照明深さを選択し、エバネッセントフィールドの方向を最適化します。2 つ目のカメラに切り替えます。256 x 256 ピクセル以上の対象領域を定義します。
露出を 1 ミリ秒に設定し、EM ゲインを 1,000 に設定します。レーザーパワーを0.5ミリワットに調整します。露光時間は、発光体積の蛍光分子が費やした平均時間よりも短くなければならないので、タンパク質の拡散係数に関する情報を持っている必要があります。
最初のトライアルシーケンスを初期条件で実行し、信号対雑音値を概算します。この条件は、最初の時系列で測定された2~3以上の信号対雑音で許容されます。次に、カメラナンバー2を顕微鏡に接続する発光分割システムのスライダーを使用して、画像の側面をマスキングします。
カメラファイルの自動保存オプションを選択します。最小信号対雑音比 2 で、最小 700 フレームのイメージシリーズの取得を開始します。顕微鏡から皿を取り出さずに、リガンドを加えます。
明るい蛍光膜を持つ細胞を選択し、迅速に運動走行の最初の時系列を開始します。第2の細胞を探索し、運動の第2の時点を取得する。キネティックランの各時点の新しいセルをキャプチャします。
新しい皿ごとに、レーザーラインのアライメントとTIRF照明の最適化を繰り返します。今、変換し、tifファイルとしてカメラソフトウェアで取得した画像ファイルを保存します。N&Bグラフィカルユーザのフェーズ間MATLABを起動して、分析ソフトウェアルーチンにtifファイルをインポートします。
平均強度プロファイルが10%以上の光漂白を示すシリーズと、取得中に明らかな細胞膜歪みや翻訳があったシリーズを破棄する。明らかに焦点が合っていないクロップフレーム。少なくとも500時間枠での分析シリーズのみを維持します。
まず、カメラパラメータを決定します。ルーチンキャリブレーションカメラをアクティブにします。検出器のノイズ領域で、少なくとも20 x 50ピクセルの領域を選択します。
対数周波数とデジタルレベルのプロットでは、曲線の直線部分でガウスを区切るために、線形赤いカーソルを動かします。B キーをアクティブにします。最小ビン分割を 2.2 にして、データの分散を減らし、B-I ヒストグラムを生成します。
反復的な正方形カーソルを使用して、B-I ヒストグラムを検査します。解析に対して四角い ROI を選択し、選択した ROI の B マップを生成します。次に、選択に関連付けられた B 値の ASCII ファイルを保存します。
ASCII をグラフィックス ソフトウェアにインポートしてデータの周波数分布を計算し、平均 B 値のプラスまたはマイナス S.E を取得します。正規化式に従ってデータを正規化し、ここでB'tはリガンド添加後の時間tで測定された平均B値、B'0は、リガンド・アディティーノの10~20秒後の時点で測定された平均B値である。正規化された平均輝度と取得時間をプロットして、運動走行を構築します。
本研究では、0時および7時に捕捉されたmEGFP-FGR1を発現する同じ皿中の2つのHeLa細胞からの代表的な結果が、FGF2の1ミリリットル当たり20ナノグラムを添加した後、ここに示されている。参照構成体、GPI-mEGFPおよびGPI-mEGFP-mEGFPダイマーと比較して、全体の分析シーケンスは、時系列の平均強度を示す。すべての B 値のプロット。
B-Iヒストグラム。選択した ROI の B マップ。そして、関連するB分布ヒストグラム。
FGF2の1ミリリットル当たり20ナノグラムで刺激した後、時間の関数としての平均明るさを示す代表的な運動走行は、細胞表面で数分間持続する二量体化の遅いプロセスを記述する。NCAM-Fcのミリリットル当たり50マイクログラムで刺激されると、運動プロファイルはオリゴマー混合物中の受容体の速く、周期的な転移を明らかにし、これはまたダイマーのそれ以上の明るさの値に達する。正規化された平均値が3個繰り返し観察される。
分子の変動や漂白が無いため、余分な変異体を最小限に抑えることが重要です。そして、細胞はガラス底の皿によく付着し、生い茂らず、積み重なってはならない。細胞内コンパートメント内でより速く拡散するタンパク質に興味がある場合は、より速いゼロ回を適用し、焦点顕微鏡または多光子顕微鏡でスキャンを使用して細胞内の画像を撮影することができます。
我々のアプローチでは、二量化などの事象のダイナミクスを探求する際に、光漂白の有害な影響を最小限に抑えます。これらのイベントは、細胞の応答の様々な制御し、他の技術とライブ細胞で証明することは非常に困難です.
