This work is supported in part by NIH-P41 P41-RRO3155 and NIH P50-GM076516 (grant to EG), and Fondazione Monte dei Paschi di Siena (grant to FB).

1。システムのキャリブレーション<ol><li>点広がり関数（PSF）のキャリブレーション<ol><li>蒸留水90μlの中で30nmの蛍光ビーズ溶液10μl（約5μM）を希釈し、次いで20分間溶液を超音波処理する。四角（1センチ×1cm）にアガロースゲル（10％）と預金ゲルの上に溶液10μlの部分をカット。 2センチメートルペトリ皿の底ガラスのゲルの一部を覆す、ガラスのドロップを絞る。 </li><li>買収の設定をオンにし、ホルダーにサンプルを入れ、カメラの露出とEMgainを設定（100ミリ1000は良いパラメータであるが、システムに応じて最適化）とクールダウンするためにカメラを待つ。 </li><li> 100ミリ秒、1000カメラEMgain、取得モードに設定し、カメラの露出はセーブの設定の転送、100反復と自動フレームに。 </li><li>ゲルの境界に接眼レンズと透過光のフォーカスを使用して、その後、ゲルの中央に目標を移動し、フォーカスとSTAを調整レーザーアライメント手順RT（LAS AFで、「TIRFのセットアップ」を選択し、オートアライメント手順に従ってください）​​。 </li><li> 100フレームを取得し、複数の単一のスポットを獲得するために、ステップを5-6回繰り返し、基準として、（通常はビーズの集合体を表していること）明るいスポットに焦点を正確に、孤立した単一のスポットを有する視野を検索します。 </li><li>データ処理プログラムに獲得したシリーズをインポートし、時間内に（ 図1A）スタックを平均化し、単一の孤立したビーズを選択します。粒子凝集を回避するために、最小のものを選択するように注意してください。 </li><li> （Matlabの中で材料におけるICS-Matlabのツールでの）コマンド「gaussfit」を使用してガウス関数で選択された強度分布（単一ビーズプロファイルの一例を図1Bに示されている）を取り付け。得られた残差を調べることによって適合度を確認します（対応する残差と当てはめられたガウス分布の例は、私が提示されているn 図1B）。 </li></ol></li><li>カメラ較正<ol><li>カメラの電源を入れ、カメラが冷えるのを待ちます。 （32×128にトリミングモード、ROIサイズにつまり 、使用したカメラのために私たちは1,000 0.5ミリ秒、カメラEMgainへの露出を設定し、取得モード、万回の繰り返し）の設定、カメラの取得を、設定し、カメラの背景の取得を開始信号。 </li><li>インポートは、データ処理プログラムにフレームシリーズを取得しました。カメラの背景は、チップの選択された領域でほぼ平坦であることを確認するために、各画素内の平均強度を計算し、検査します。カメラの背景は通常、境界線にバイアスされているため、クロップドモードでは、各フレームの最初と（ROIのサイズに応じて3から10）最後の数本の水平線を削除します。 </li><li> （Matlabのコマンド「シーッ」を使用して）スタック取得された画像に（また、デジタルレベル、DLが定義されている）値のヒストグラムを作成し、対数をプロットする（Matlabの中でsemilogyのコマンドを使用して）周波数を生じたの。カメラ背景のDL分布の一例を図2に示されている。 注：カメラがうまく機能している場合は、プロットは対数スケールで指数関数的減衰（負の傾きを持つ行が続くゼロの光子に関連付けられた値の分布を表す約ガウスピーク（対数スケールで放物線プロファイル）を表示します1）光子（ 図2）に関連付けられた値の分布を表す。指数部の減衰定数は、それぞれ単一光子をカメラによって割り当てられたDLの推定を表している、特に、中心とガウス関数の分散は、それぞれ、カメラのオフセットとの誤差を表す。 MATLABで材料をサポートするスクリプトのセクション「CalibrateCamera &quot;を使用します。 </li><li>選択したすべてのカメラEMGainとゲインのための操作を繰り返します。 </li></ol></li></ol>ラベル付き2。細胞調製<ol><li> （1,2-dioleoyl- のsnグリセロ-3 -ホスホエタノールアミン）、脂質取り込み36に必要なリポソームを調製DOPEの別途の1mgを溶解するために、DOTAP（1,2 -ジオレオイル-3 -トリメチルアンモニウム-プロパン）1mgを、クロロホルム1ml中PPE-ATTO488 1mgの。 24時間、真空下で一緒に0.5 DOPE溶液を加え、DOTAP溶液0.5ml、及びPPE-ATTO488溶液25μlとドライを混ぜる。 HEPES緩衝液を20mM、40℃で15分間、15分間、超音波処理のための渦の0.5ミリリットルを追加します。 </li><li>セルを製造するために、PBSでコンフルエントCHO-K1（チャイニーズハムスター卵巣）のP100ディッシュを3回洗浄、5分間インキュベーター内トリプシンおよびストアの1ミリリットルを追加します。 10％のFBSを補充したDMEM / F12培地9mlを加える剥離細胞を一時停止し、同培地800μLを含むペトリ皿に細胞溶液150μlをシード。 </li><li> 37℃で24時間、5％CO 2インキュベータで保管してください。脂質取り込みのために、500細胞培地を交換してください無血清培地μL; 30分後、リポソーム溶液2μlを追加します。およびPSBで15分間洗浄した後に画像化するための新しいDMEM / F12培地を追加します。 </li><li>トランスフェクションのために、イメージングの前にインキュベーター内でのTfR-GFPプラスミドとストアの24時間を使用して、リポフェクタミンプロトコル（メーカーの指示）に従って、細胞をトランスフェクト。 </li></ol> 3。データ収集<ol><li>セットアップの準備<ol><li>顕微鏡をサーモスタットするためには、実験前の24時間は、培養器の電源をオンにします。 </li><li>最速の達成可能な取得時間を適用するためには、トリミングセンサーモードでの作業（導入を参照）、電池（カメラ2）を選択するイメージング（カメラ1）と第2のカメラのための最初のカメラを使用しています。セットアップ設定の方式は補足図S1に示す。その後、顕微鏡上の2台のカメラのターンを合わせ、カメラが冷えるまで待ちます。 </li><li>両方のカメラ透過光イメージングのためのパラメータに設定します（ つまり、 </em露光時間&gt;、20ミリ秒、EMゲインのための1）、明視野モードで顕微鏡を置く。 </li><li>ホルダーにサンプルを入れて、接眼レンズを使用して焦点を合わせる、カメラ1に光を送信し、静かにのみ細胞イメージング（ここでは32×32ピクセルのROI）に使用されるROIに光を可能にするスリットを押してください。 </li><li>その後の参照を持つために、カメラ2を制御するソフトウェアでROIを描き、選択した領域内のセルを移動し、カメラ2に光を送る。 </li></ol></li><li>イメージング（ 図3A） <ol><li>まず第一に、あなたのセットアップの手順に従って全反射レーザーの位置を合わせます。私たちのセットアップでは、「TIRFのセットアップ」を選択し、オートアライメント手順を開始します。レーザーが整列されると浸透深さ（約70℃）の70ナノメートルに設定してください。 </li><li>カメラ1とカメラ2の両方に100に70ミリ秒とEMGainに露光時間を設定します。次に、カメラ1を用いて細胞を選択し、カメラ2に光を送信し、正確に細胞膜を当てる。 CAの最小露出を設定しますメラ2、千EMGain、クロップドセンサーモード、10 5回の繰り返しとファイル（柔軟なイメージ輸送システム、容易に管理できる形式）が収まるように自動保存を設定しますが。 </li><li>画像シリーズを記録する取得を開始します。 8-10細胞を取得するために最後の2つの手順を繰り返し、その後、新しいセルを取得する前に温度安定化を可能にするためにゲインとトリミングされたモードを解除してください。 </li></ol></li></ol>イメージングから平均二乗変位の4。計算（I MSD） 注：以下のプロトコルは、直接生データに適用することができる。同時に、全体のプロトコルは、MATLABでかつSimFCSの両方でシミュレートされたデータの取得のために有効です。対応するチュートリアルへのリンクが「マテリアル」のセクションに記載されています。 <ol><li> MATLABが計算<ol><li> ImportImageSeriesスクリプトを使用してMATLABに獲得したシリーズをインポートします。共同を使用して時間内に各画像の平均輝度を計算するmmand最初の2次元上の意味と、得られたベクターを見るために、プロットを使用しています。 </li><li>光退色の10％以上が存在する場合、一連の破棄またはそれらの最初の部分を取り除く。それが低い場合は、37の前に示したように、各画像の平均輝度を減算することにより相関関数への影響を補正しようとする。 </li><li>第三の次元に平均値を用いて各ピクセルの平均強度を計算し、画像を生じた参照。 注：特に注意人工相関を避けるために必要とされる。実際、以前に同様の技術38、セルの枠線のためだけでなく、フォーカス小胞の外に示したように強い相関をもたらす可能性があります。平均画像の検査がセルの枠線やフォーカス小胞の外に明らかになった場合、それ以外の買収を破棄関与する領域を除外してみてください。この不動の構造の影響を補正するために、各画素39からの平均時間的強度を差し引く。 </li><li> Tを計算する機能CalculateSTICScorrfuncを使用して、彼の時空間相関（G（ξ、χ、τ））。 Gは（ξ、χは、0）が低いため、光領域におけるショットノイズの相関は、Gを支配しているため（0,0,0）を外します。による検出器への相関が測定され、腰を大きくすることにより、τ= 0のため、G（ξ、χ、τ）を変形させることができ、露光時間の間にG（±1,0,0）、および粒子の動きを支配する（この効果はτのために消える&gt; 0）34。 </li><li>平均G（ξ、χ、τ&gt; 0）材質のサポートに「LogBinStack」機能を使用することにより、ノイズを低減してから関数を使用して結果G（ξ、χ、τ）に合うように対数時間ビンを使用して「gaussfit」の私 MSD（結果の配列の2番目の列）を回収するための材料におけるICS-Matlabのツール。 </li><li>時間の関数として得られ腰σ（τ）2（I MSD）をプロットします。データがあまりにもうるさいであれば、acquの数を増やそう赤外発光ダイオードのフレームは、一緒にレーザーパワー、平均よりG（ξ、χ、τ）を増加させる。 </li></ol></li><li> SimFCSによる計算<ol><li> BioFormatインポータープラグインを使用してImageJを、取得したファイルを開き、Tiffをシーケンスとして取得されたシリーズを保存します。 </li><li>オープンSimFCSとRICSツールと[ファイル]&gt; [インポート複数の画像（補足図S2）を選択します。 </li><li>フィットを選択し、正しい収集パラメータを挿入し、フィットウィンドウ（補足図S3）を閉じる。 </li><li>ディスプレイ&gt;平均強度&gt; CH1を選択して、（補足図S4）の光退色の存在を確認。 </li><li>光退色の10％以上が存在する場合は、シリーズを破棄するか、再びシリーズの最初の部分を除去し、画像シーケンスの可能な負荷である場合。 </li><li>それを漂白すると10％未満の[ツール]の場合&gt; 私は 、MSD&gt;パラメータの設定、左への投資効果（ROI）]パネルで設定、「使用して、移動平均」をチェック特派時間は（粒子が1μm2秒-1 10秒の時間が良い移動平均である時に移動するための）特性拡散時間よりも高いことが、移動平均気をつけて、フレームのアンバー</li><li> [ツール]&gt; [iMSD&gt; 私 MSD（補足図S5）とフィット感を計算し、メモ帳から私 MSDをエクスポート（補足図S6）。 </li></ol></li></ol> 私 MSDから拡散法第5の計算<ol><li>インターセプト（σ0 2）を外挿する最初のいくつかのポイントを取り付け（5ポイントが通常は十分ですが、より多くのポイントは、彼らが線形挙動を示す場合装着することができる）と、以前に測定されたPSF 2で、この値を比較します。それらが同等である場合、単離されたフルオロフォアのダイナミクスが守られている。これとは対照的に、σ0 2 &gt;&gt; PSF 2トライのことを確実にするために高速取得する場合は、隠れダイナミクスは34存在しない。 </li><li> （概要を参照）、式3および4を使用して、見かけの拡散係数（D アプリ ）と平均変位（R）を計算します。 </li><li> FCS 12（ 図3D）ベースのスポット変動を用いて測定されるものと同程度の拡散の法則を得るためのRの関数としてプロットD アプリ 。 </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

単一粒子追跡（SPT）は、分子動力学を研究するための最も一般的な戦略の1つを表し、それは粒子軌道を測定するという大きな利点を有する。これは、複雑なシステムでさえ、いくつかの標識された粒子の挙動をプロービングを可能にする。しかし、SPTは、典型的には、プローブと、非常に明るいラベルの低密度を必要とするこの利点に到達する。特に、高い時間分解能（マイクロ秒の範囲）は、無機プローブを得るためには、通常（ 例えば、量子ドット、または金属ナノ粒子）が必要です。この場合、システムへの生産、ラベル付けおよび挿入の複雑な手順が必要である。 SPTに比べて本発明の方法は、いくつかの重要な利点を示しています。まず第一に、このアプローチは、蛍光タンパク質との結合に使用することができる。このように、SPTに比べて、より高い時間分解能が光子の少ない量のおかげで34を必要とした （同じラベル上）を実現しました。より詳細には、このプロパティは、時間的レゾールを押すことができます10以下のution - 3秒もエンコード可能な蛍光タンパク質を使用する場合は、このタイムスケールは、膜構成成分のナノスケールのダイナミクスへの排他的アクセスを提供します。最後に、分子拡散法が各分子を追跡する必要なく、完全な時空間相関関数を分析することによって説明されていることは注目に値する。 STEDベースのFCSとの比較も興味深い。 STED-FCS測定において観測量を減少させるための分子の平均通過時間は、蛍光信号の時間的相関によって測定される。これは、回折限界以下の分子動力学のローカル測定値を得ることができます。提示のアプローチにおいて、拡散法は、すべての標準を用いて観察された選択されたROIに移動する粒子、回折限界観察体積の平均値として測定される。しかし、結果は、この方法は、回折によって制限されないことを実証するだけ番目によって報告電子時間分解能利用できる。実際には、回折限界取得が（同様にそのようなPALM及びSTORMのような他の超解像技術で行われるものに）変動を検出するために使用されているが、十分に回折限界未満の分子変位が（直接的に）既にとして、計算することができる。分子流れ32を測定するためにSTICSを使用することによって実証した。また、STED-FCSとは異なり、このアプローチは、容易にそのようなラスタ走査顕微鏡や広視野カメラベースの顕微鏡などの商業的および既存の顕微鏡のセットアップ、広い範囲に適用することができる。これは、分子拡散法のSTED-FCS測定は厳密にインストゥルメンタルのウエストのサイズの蛍光団依存較正を必要と言及に値する。逆に、測定は（粒径の推定のためにのみ必要）システム·キャリブレーションを必要としないここで紹介する。 提示された方法·ドによる粒子変位の測定における実際の解像度私たちは、相関関数を測定することができますどれだけ正確に保留します。したがって、それは本質的に同様の解像度は、粒子「画像」が測定されるかを正確に依存してSPTケースに、回折によって制限されない。提案された実験のために1分未満で有意な相関を測定するために、各フレームにおける各粒子のためのいくつかの光子（通常は以下の10の光子）が十分である。相関関数を算出する際、実際には、すべての観察される粒子の寄与は、粒子が分離されていない場合でも、一緒に平均化される。このプロパティは、変動相関法​​の固有であり、そのような生きた細胞にトランス蛍光タンパク質などの薄暗いと密なラベルを、使用することを可能にする。 これを念頭において、最小測定可能な変位は、粒子の拡散係数に及びイメージングセットアップの時間分解能に依存することが明らかに見える。例として、細胞膜上の分子の拡散を考慮してくださいタンパク質または脂質の最大測定された拡散率は約5〜2秒-1である。これらの条件下では、50nmの平均変位をキャッチするために、約10 -4秒の時間分解能を必要とする。この時間分解能は、単一のラインに沿って主走査顕微鏡により、またはここに示したように、時間分解能は、露光時間に一致している高速EMCCDカメラによって達成することができる。 正確に分子動力学を記述する場合は、この方法のための追加の必須要件は、正しい空間サンプリングである。実際には、相関関数を適合させるために、私たちは楽器PSFの腰よりも低い空間サンプリング（画素サイズ）を必要とする。ほとんどの市販の顕微鏡（共焦点またはワイドフィールド）では、PSFの腰が200nm〜500nmのまたがる（使用される選択された対物レンズの開口上と波長を中心に依存します）、簡単にキャリブレーション実験を用いてナノで測定することができるサイズの蛍光ビーズ。 THUS、（インスト腰より3倍低い）70〜150ナノメートルの画素サイズが十分であることができる。しかしながら、画素サイズを考慮に単純な規則を考慮研究中のシステムに適合させることができる。相関関数の記述の画素サイズ、より高い精度を下げる。また、取得する画像の最小サイズは、目的の最大変位（プラス器械腰）よりも少なくとも3倍大きくなければならない。これは、適合アルゴリズムと分子変位の統計的に有意なサンプルの良好な収束を達成するために必要とされる。一例として、数ミクロンの数百ナノメートル（ 例えば 200nm）よりも小さい平均分子変位を研究するための画像サイズで十分である。また、相関関数の品質に影響を総画素数（一定の画素サイズを取る）。実際には、画像を拡大しても、時間resolutを犠牲にしている場合、相関関数でより多くの情報を平均化することができますイオン。ここで使用したカメラベースのシステムに関しては、チップ上のピクセルの物理的サイズが固定されていることに注意してください。したがって、画素サイズを小さくすると、（画素サイズの二乗に依存する）の各画素の信号を低下させるの視野を減少させ、より高い倍率を必要とする。一方、観察領域は、画素サイズを小さくする、固定された走査システム、通常時間分解能を犠牲にして増加した画素数になる。 使用した検出器についてのいくつかの詳細が議論されなければならない。単一光子検出器とは異なり、EMCCDシステムは、オフセットの存在により収集された光に正比例していない平均強度（デジタルレベル、DL）を測定する。このオフセット多くの光子が収集された実験において、カメラのダイナミックレンジに比べて低い（数百2 16 16ビットの読み出しと比較して）無視できる場合であっても、それがために考慮しなければならない相関関数の正確な正常化が得られる。また、オフセットは、収集された信号の量を識別するために、低光条件下での基準として使用することができる。また、獲得中に収集される光子の平均量を推定するために、各収集光子に関連する平均デジタルレベルが測定されなければならない。この量は、非常に低い光強度（ 例えば 、部屋の中で背景光）にカメラを暴露することによって取得できます。実際に、この場合には、合理的に測定された強度のみ、ゼロまたは1つの光子に関連付けることができ、すなわち単一光子は、カメラに到達することを仮定することができる。 最後に、私たちはいくつかの代替取得システム（ すなわち 、異なる顕微鏡のセットアップ）が提示測定を実行するために使用することができるかについてはコメントしましょう。まず、数式2の「W&#39;factor（つまり、インストPSFの自己相関を表す）tまで適合させることができる実験的な相関関数に適合させるために使用される彼の特定の収集システム。以前に34に示されるように、簡単にケースは走査速度は、粒子のダイナミクスよりも有意に高い場合に、取得は、レーザ走査顕微鏡を降臨祭である。このような場合には、実際には、取得時間中に粒子の移動（ すなわち 、ライン時間）は無視できると考えることができ、相関関数はよくガウス関数で近似される。新興イメージング技術の文脈では、興味深いアプローチは、サンプル41を介して、非常に薄い光シート（1-2μm）を生産する可能性に基づいています。シート光は、試料中の単一の平面（シングル平面照明顕微鏡法、SPIM）を選択的に照明を可能にし、カメラベースの収集システム、3D 42における高速光学切片と組み合わせる。これらの特徴により、SPIMは正常にFCS 43と共役しており、VALIを表すことができ開発ツールは、細胞質や生きた細胞の核などの3D環境に提示、分析を拡張することができます。 実験的観点から、このアプローチを要約すると、高速の取得モジュールを備えた顕微鏡へのアクセスだけを必要とします。目的のタンパク質は、このように多色画像化のためにも可能にする、任意の蛍光タンパク質または有機フルオロフォアでタグ付けすることができる。この文脈では、分子の亜集団を選択し、生細胞膜上の相互作用及び共拡散を明らかにするためにiを MSD分析をクロス使用する可能性を想定している。最後に、このアプローチは、原形質膜上のナノドメイン内の動的パーティショニングを受けたタンパク質および/または脂質を研究するための強力なツールを表すことができると信じています。この場合、ナノドメインの高度に可変サイズと寿命は2色イメージングを含む更な​​る方法論的な実装を必要とする実際のデータ内の複雑さのレベルを追加導入し、地元の分析（ 例えば 、2D対相関）および/ ​​または蛍光異方性。

シンガーとニコルソンによるオリジナル「流体モザイク」モデルから始めて、携帯形質膜の画像を連続的に細胞骨格と脂質ドメイン1,2の新たな役割を含めるために、過去数十年の間、更新されています。 最初の観察は、膜タンパク質のかなりの割合が不動3-5であることを発表（FRAP）の光退色後蛍光回復により得た。これらの先駆的な研究は、非常に有益なものの、FRAPのセットアップの比較的乏しい空間での分解能（ミクロン）と時間（秒）に苦しんだ。また、アンサンブル平均測定値である、FRAP、単一分子の挙動についての情報を与えることに欠けている。 この文脈において、特に非常に明るいタグ（一度に拡散工程つの分子の研究を可能にする）を有する単一の分子を標識する可能性は非常に成功している。特に、押してマイクロ秒の時間スケールへの単一粒子追跡（SPT）アプローチの時間分解能、楠見ら大幅に膜生理学6におけるアクチンベースの膜骨格の役割の認識に貢献した脂質とタンパク質ダイナミクスの未知の機能へのアクセスを獲得7。これらの知見は、脂質およびタンパク質の拡散がアクチン系骨格によって調節される、いわゆる「ピケットフェンス」モデルが、生成された。しかし、SPT多くの実験の問題によって提供される情報の膨大な量にアクセスするためにアドレス指定されなければならない。特に、標識操作は、一般的に、生産、精製、およびシステムへの標識種の導入のような多くのステップによって構成されています。さらに、大きなラベルは、量子ドット、または金属ナノ粒子のような、多くの場合、ミリ秒以下の時間スケールに達するために必要とされ、ラベルによる標的分子の架橋は、多くの場合において回避することができなかった。最後に、多くの軌跡統計的基準に適合するために記録されなければならないし、同時にラベルの低密度は、追跡を可能にするために必要とされている。 SPT、蛍光相関分光法（FCS）と比較して、これらの欠点の多くを克服し、分子動力学を研究するための非常に有望なアプローチを表す。実際には、FCSが一過性にトランスフェクションされた細胞に蛍光タンパク質タグ化分子のダイナミクスを研究するために有効に、薄暗い、緻密なラベルでもうまく動作します。また、限られた時間の中で高い統計を達することができます。最後に、ラベルの「高」密度にもかかわらず、FCSが単一分子情報を提供します。おかげで、これらすべての特性のために、FCSは非常に簡単なアプローチを表し、広範囲にモデル膜において、生細胞8-10に両方の脂質およびタンパク質のダイナミクスを研究するために適用されている。多くの異なるアプローチは、分子拡散の詳細を明らかにするためにFCSの能力を増加させるために提案されている。例えば、それはshにあっ異なるサイズの観察領域にFCSを実行することによって、一つは分子運動11,12の「FCS拡散法」啓発隠された機能を定義できることを自分自身。サイズが多様であることに加え、焦点領域も13重複した行14-20または高速カメラ21,22共役一緒に空間内を移動。これらの「時空間」相関アプローチを用いて、いくつかの膜成分の関連する生物学的パラメータを定量的にこのようにして、膜の空間的組織への洞察をもたらす、モデル膜と実際の生物学的なものの両方に記載されている。 しかし、すべてのFRAPとFCS用途でこれまでに説明した焦点領域の大きさを克服することができない空間分解能の限界を表している。いくつかの超解像画像化方法は、最近、この制限を回避するために開発されている。いくつかは、そのような確率論的光学再構築顕微鏡（STORM）として、ローカライズの精度に基づいています&lt;SUP&gt; 23,24、光活性化局在化顕微鏡（PALM）25、蛍光PALM（FPALM）26、及び単一粒子追跡PALM（sptPALM）27：各スナップショットに必要な光子の比較的大きな量が、しかしながら、時間分解能を制限する少なくとも数ミリ秒、これらの方法は、従って、インビボでのそれらの適用を妨げる。 対照的に、超解像イメージングのための有望な代替手段は、空間的に誘導放出の枯渇法（STEDまたは可逆的飽和性光学蛍光遷移（RESOLFT））28,29で蛍光発光を変調することによって開かれている。これらのアプローチは、高速走査型顕微鏡および検出システムを使用する可能性を有するだけでなく、回折限界以下の観察体積の整形を組み合わせる。蛍光変動解析と組み合わせて、STED顕微鏡を直接脂質およびpのナノスケール時空間的動態を探査することができ生細胞膜30,31中roteins。 STED顕微鏡ベースの同一の物理量は、生細胞中の蛍光標識膜タンパク質及び/又は脂質のダイナミクスを研究するのに適している改変された時空間画像相関分光法（STICS 32,33）の方法によって得ることができるや商業顕微鏡による。ここで紹介する実験プロトコルは、いくつかの手順によって構成されています。最初のものは膜上の関心領域の高速撮像を必要とします。そして、画像の得られる積層体は、平均空間 - 時間相関関数を計算するために使用される。 -平均変位プロット対 -相関関数のシリーズを嵌合することにより、分子の「拡散法は、「見かけの拡散係数（D アプリ ）の形態の撮像から直接得ることができる。このプロットは、批判的に分子によって探求、環境に依存しており、直接、実際の拡散モードを認識することができます興味のある脂質/タンパク質の。 より詳細には、先に示した34ように、取得した画像シリーズの時空間的自己相関関数は、批判的に収集された画像シリーズ内を移動する分子のダイナミクスに依存する（同じ論法がラインの取得に適用することができることに注意してください空間内のただ一つの次元が考慮されている）。特に、本発明者らは、のように、相関関数を定義する。 <img fo:content-width="2.3in" src="/files/ftp_upload/51994/51994eq1.jpg" width="230" /> （1） どこ<img fo:content-width=".5in" src="/files/ftp_upload/51994/xyt.jpg" width="50" />位置xで測定された蛍​​光強度を表し、yおよび時間tにおける、 <img fo:content-width=".08in" src="/files/ftp_upload/51994/e.jpg" width="8" />そして<img fo:content-width=".1in" src="/files/ftp_upload/51994/x.jpg" width="10" /> x方向の距離を表し、それぞれy方向、 <img fo:content-width=".1in" src="/files/ftp_upload/51994/t.jpg" width="10" />タイムラグを表し、そして<img fo:content-width=".2in" src="/files/ftp_upload/51994/brackets.jpg" width="20" />平均を表す。この関数は、のように表すことができる。 <img fo:content-width="2.3in" src="/files/ftp_upload/51994/51994eq2.jpg" width="230" /> （2） &#39;N&#39;は、観察領域内の分子の平均数を表す<img fo:content-width=".10in" src="/files/ftp_upload/51994/circlex.jpg" width="10" />空間における畳み込み演算を表し、そして<img fo:content-width=".5in" src="/files/ftp_upload/51994/ex.jpg" width="50" />楽器の腰の自己相関を表しています。この後者は、光学/録画設定に単一の発光体の光子が空間に広がっているかの尺度として解釈することができる（いわゆる点広がり関数、PSF、遺伝子よくガウス関数で近似ラリー）。最後に、 <img fo:content-width=".5in" src="/files/ftp_upload/51994/ext.jpg" width="50" />距離で粒子を見つけるために確率を表す<img fo:content-width=".10in" src="/files/ftp_upload/51994/e.jpg" width="10" />そして<img fo:content-width=".10in" src="/files/ftp_upload/51994/x.jpg" width="10" />時間遅延の後に<img fo:content-width=".10in" src="/files/ftp_upload/51994/t.jpg" width="10" /> 。私たちは、粒子が全ての方向にランダムに移動し、正味フラックスは存在せず、この関数はまた、よく分散が移動する粒子の平均二乗変位（MSD）として識別することができ、ガウス関数で近似される拡散動力学を考慮した場合。従って、相関関数（の腰とも呼ば<img fo:content-width=".3in" src="/files/ftp_upload/51994/2t.jpg" width="30" /> ）、粒子のMSDの和楽器の腰のように定義することができ、ガウスフィットによって測定することができる各時間遅延のための相関関数のティン。測定された私 MSD移動分子の見かけの拡散係数を計算するために使用することができ<img fo:content-width=".4in" src="/files/ftp_upload/51994/dappt.jpg" width="40" />と平均変位<img fo:content-width=".4in" src="/files/ftp_upload/51994/rt.jpg" width="40" />として： <img fo:content-width="1.7in" src="/files/ftp_upload/51994/51994eq3.jpg" width="170" /> （3） <img fo:content-width="1.7in" src="/files/ftp_upload/51994/51994eq4.jpg" width="170" /> （4） 使用された実験のセットアップには、いくつかの考慮事項は、次のセクションを通して読者を導くことができる。選択的に生細胞の基底膜上のフルオロフォアを励起するために、私たちは、商業のTIR蛍光（TIRF）顕微鏡（詳細は材料セクションを参照のこと）を使用して、全反射（TIR）照明を使用します。また、順番​​に目を収集する電子蛍光当社は高倍率の対物レンズ（100X NA 1.47、高開口数を全反射照明に必要とされる）と、EMCCDカメラ（内蔵さ16μmの画素の物理サイズ）を使用します。 100nmのピクセルサイズに到達するために、私たちは、1.6Xのさらなる拡大レンズを適用する。以下に説明するように、1ミリ秒以下の時間分解能を適切に100nm未満の速い膜脂質の動力学を記述するために必要とされるであろう。この時間分解能を達成するために、私たちは、カメラ（512×512）のチップ全体よりも小さい関心領域（ROI）を選択する必要があります。このように、カメラは、時間分解能を増加線の数の減少を読み取る。しかし、この読み出し領域でフレーム時間は、カメラの読み出しチップへの暴露からの電荷をシフトするために必要な時間によって制限されると、512×512ピクセルEMCCDミリ秒のオーダーで通常である。この制限を破ったために、新しい技術は、wは、ROIラインのみの代わりに、フレーム全体をシフトできます（私たちのEMCCDにクロップドセンサーモードと呼ばれる）が露出し、チップサイズの実用的な効果的な減少番目。この設定を有効にするには、ROIの外側のチップは、光路に取り付けられたスリットのカップルによってカバーされなければならない。時間分解能ダウン10 -4秒にこのセットアップのおかげで達成することができる。 「議論」のセクションで説明したように、このアプローチは、多くの異なった実験装置と結合することができること、しかし、注意してください。 この方法の実証は両方ATTO488を使用することにより、生きた細胞内で提供される1 -パルミトイル-2-ヒドロキシのsnグリセロ-3 -ホスホエタノールアミン（ATTO488-PPE）及びトランスフェリン受容体のGFP標識された変異体（GFP-標識されたのTfR）。以前に30,35を報告したようにATTO488-PPEの場合、このアプローチは成功し、大部分は自由拡散を示す平均変位の関数としてほぼ一定のD アプリを回復することができます。対照的に、TfRは-GFPは減少Dを示している<su部分的に閉じ込められた拡散6を示唆して平均変位の関数としてb&gt;のアプリ。また、後者の場合には、ローカル拡散定数と膜面上の多数のミクロンを超える平均閉じ込め領域を定量化することが可能である。

<table><tbody><tr><td>iXon Ultra 897</td><td>Andor</td><td>DU-897U-CS0</td><td></td></tr><tr><td>Solis</td><td>Andor</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CHO-K1</td><td>ATCC</td><td>CCL-61</td><td></td></tr><tr><td>ATTO 488 labeled PPE</td><td>ATTO-TEC GmbH</td><td>AD 488-151</td><td></td></tr><tr><td>DOPE</td><td>Avanti Polar Lipids, Inc.</td><td>850725</td><td></td></tr><tr><td>DOTAP</td><td>Avanti Polar Lipids, Inc.</td><td>890890</td><td></td></tr><tr><td>100x Penicillin-Streptomycin-Glutamine</td><td>Gibco</td><td>10378-016</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12</td><td>Gibco</td><td>21331</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco</td><td>10082147</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Gibco</td><td>15630-106&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>SimFCS 3.0</td><td>Globals Software</td><td></td><td>the software can be downloaded here: http://www.lfd.uci.edu/globals/</td></tr><tr><td>DMI6000 with TIRF modulus</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LAS AF</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Lipofectamine</td><td>11668019</td><td></td></tr><tr><td>Matlab</td><td>MathWork</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">[header]</td></tr><tr><td>C-terminal GFP tagged Tranferrin Receptor</td><td>OriGene</td><td>RG200980</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A5306</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Sigma Aldrich</td><td>528730</td><td></td></tr><tr><td>Latex beads, fluorescent yellow-green, 30 nm</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L5155</td><td></td></tr><tr><td>SONICA Ultrasonic Cleaners</td><td>SOLTEC</td><td>ETH S3</td><td></td></tr><tr><td>Petri Dishes</td><td>Willco</td><td>GWSt-3522</td><td></td></tr><tr><td>Bio-Format importer for Matlab</td><td></td><td></td><td>http://www.openmicroscopy.org/site/support/bio-formats5/users/matlab/</td></tr><tr><td>ICS-MatLab Tools</td><td></td><td></td><td>&lt;a href=&quot;https://www.cellmigration.org/resource/imaging/software/ICSMATLAB_28-02-06.zip&quot;&gt;https://www.cellmigration.org/resource/imaging/software/ICSMATLAB_28-02-06.zip&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Simulation by Matlab Tutorial</td><td></td><td></td><td>https://www.cellmigration.org/resource/imaging/icsmatlab/ICSTutorial.html</td></tr><tr><td>Simulation by SimFCS Tutorial</td><td></td><td></td><td>https://www.cellmigration.org/resource/imaging/ppt-pdf/RICS%20Simulations.ppt</td></tr></tbody></table>

from fast fluorescence imaging to molecular diffusion law on live cell membranes in a commercial microscope

それは、空間分布および脂質やタンパク質のような膜成分の動きが多くの細胞機能の調節に重要な因子であることがますます明らかになった。ただし、高速ダイナミクスと関係する小さな構造に起因し、非常に高い時空間的分解能は、分子の実際の行動をキャッチするために必要とされている。ここでは、高時空間分解能で生きた細胞内の蛍光標識形質膜タンパク質や脂質のダイナミクスを研究するための実験プロトコルを提示する。注目すべきことに、このアプローチは、各分子を追跡する必要がないが、それは、膜の所定の領域内のすべての分子を用いて母集団の挙動を計算する。出発点は、膜上の所定の領域の高速撮像である。その後、完全な空間時間的自己相関関数は、例えば、それぞれ2個、3個、nは繰り返しの時間遅延を増加させるで取得された画像を相関計算される。それは、幅があることを証明することができます空間的自己相関関数のピークの拡散による粒子移動の関数として増加する時間遅延で増加する。そのため、自己相関関数の一連のフィッティング（iMSD）を画像化するから、正方形の変位を意味し、実際のタンパク質を抽出することができ、ここでは平均変位対見掛け拡散係数の形で提示。これは、ナノメートルの精度で単一分子の平均ダイナミクスの定量的な見解が得られます。標識されたトランスフェリン受容体（TfRは）及びATTO488のGFPタグ付き変異体を用いて、1 -パルミトイル-2 -ヒドロキシ- のsnグリセロ-3 -ホスホエタノールアミン（PPE）は、上のタンパク質および脂質拡散の時空間レギュレーションを観察することが可能であるマイクロ対ミリ秒の時間範囲の程度の大きさの膜領域を含む。

楽器の腰を較正するために、単一の蛍光ナノビーズの画像は、プロトコルのステップ1.1に記載のように措置することができる。これらのビーズの典型的な蛍光画像を図1に示されている。2Dガウス関数による強度分布のフィッティングは、バック良い残差を提供し、270 nmでの楽器のウエストを測定することを可能にする。この値は、レイリーの式で推定し、予想される回折限界とよく一致している。この較正は、粒子のダイナミクスを測定するために必要ではないが、それは、見かけの粒径を測定する必要がある。 カメラの背景の典型的な周波数分布は約180 DLのピークは全く光子に対するカメラの応答によるものである。 図2に提示され、それはアナログデジタル（AD）変換器の寄与を表す。この寄与は、オフセットを推定するためのガウス分布および分散のように近似することができる信号記録によって導入。 200 DLの上にデジタルレベル分布は指数（対数スケールにおけるリニア）になると、単一光子に対する平均のカメラ応答を表す。指数分布でこの部分をフィッティングすると、各単一光子に割り当てられた平均のDLの測定が可能。高いほど低いが、計算された相関関数のノイズとなり、各光子とADコンバータエラーに割り当てられた平均DLとの比である。また、平均単光子応答は、カメラのダイナミックレンジを推定することができる。 完全な実験手順の図を図3に要約され、膜へのAtto488-PPE挿入の画像が図4Aに示されている。 Atto488-PPEで標識されたCHO細胞の基底膜の代表的なTIRF画像は、 図4Bに示されている。いくつかの明るいスポットは李のために細胞の外側に存在してもよいガラスの上に積層posomes。彼らは（ すなわち 、細胞形質膜）は蛍光がほとんど均一な膜部分上のROIを選択することにより、廃棄することができる。予想されたように、この脂質のために測定された拡散法（ 図4C）は 、以前にSTED-FCS測定30,35で示すように、ほとんどが自由拡散を示す、平坦である。これは、すべて示さ変位値は明らかに良く、回折限界以下の超解決平均分子変位へと数十ナノメートルまでこのアプローチの能力を示す、回折限界以下であることを言及する価値がある。 膜へのTfR-GFPダイマー挿入の図式は、 図5Aに示されている。多くの研究は、この受容体の細胞質尾部が順番に受容モビリティ12,40用のフェンスとして作用する膜骨格と相互作用することを示した。のTfR-GFPを発現するCHO細胞の代表的なTIRF画像がpresaの複数形である図5Bにnted。膜は、天然の状態に近いと過剰発現に関連するアーチファクトの可能性が最小化されるように、低い蛍光強度細胞が、好まれるべきである。また、セルの中央部が（例えば、細胞質から）ピンボケ蛍光の効果を、避けるべきで存在してもよい。予想されたように測定された拡散則のTfR-GFPについて（ 図5C）は、0.2〜2まで見かけ拡散係数その結果として急速な減少が続き、約0.7μm2秒-1の平均D アプリで、100 nm以下の第1の平坦な挙動を示す秒-1（典型的には、回折限界FCS 12によって測定された値）。この結果は、われわれのアプローチは、容易に数十ナノメートルの解像度でGFP標識されたタンパク質の平均変位を測定できることを示している。 D アプリがセットの特性を減少させるために開始する。また、空間スケール以前の推定値6で維持するのに約120 nmの膜骨格によるタンパク質の部分的な閉じ込めの空間スケール、。 <img alt="図1" fo:content-width="7in" src="/files/ftp_upload/51994/51994fig1highres.jpg" width="700" /> 点広がり関数の図1のキャリブレーション。 （A）単離されたビーズおよびビーズの凝集体の擬似カラー画像。孤立ビードの強度プロファイルの（B）は 、3Dプロットは明確に定義されたガウス分布を示す。（C）ガウス関数による強度分布のフィット（上のパネル）対応する残差（下のパネル）で。フィット分布と測定された強度プロファイルとの間に良好な一致でも楽器のPSFをガウス関数で近似できることを証明しています。 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/51994/51994fig1highres.jpg" target="_blank">viにはこちらをクリックしてください</a><html>この図の拡大版をEW。 <img alt="図2" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51994/51994fig2highres.jpg" width="600" /> 単一光子にカメラの応答の図2のキャリブレーション。図は、32×128のROIにして、カメラの背景用デジタル·レベル（DL）分布を示し、暴露0.5ミリ秒、クロップドセンサーモード。約180 DLのピークは全く光子にカメラの応答を表す。特に、アナログデジタル（AD）変換器の寄与を表し、オフセットおよび信号記録によって導入分散を推定するためにガウス関数で近似することができる。 200 DLの上のデジタルレベルの分布は、指数関数的になり、単一光子の平均カメラの応答を表す。これらのパラメータの測定は、取得中に記録された光子の密度を推定することができる。S / ftp_upload / 51994 / 51994fig2highres.jpg &quot;ターゲット=&quot; _ブランク」&gt;この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 <img alt="図3" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51994/51994fig3highres.jpg" width="600" /> この方法の図3。図式。 （A）EMCCDカメラによる広視野イメージングは、TIRFの縮小コピーが原形質膜の正確な光学セクショニングを提供するために利用されている間、サブミリ秒の分解能を達成するために適用される。（B）画像の得られるスタックは平均空間を算出するために、自己相関され-temporal相関関数。この相関関数はよくガウス関数で近似される（概要を参照）、それは、粒子の変位に応じて時間的に広がる。（C）をこのようにして、、分子変位に相関関数の広がりを定量化するために、ガウスと適合する<html>イアン機能が実行される。これは、平均変位プロット対見掛け拡散係数の形で、撮影から直接分子&#39;拡散の法則」を測定することができます。（D）このプロットのおかげで、分子拡散モードは直接約解釈モデルや仮定を必要とせずに識別することができる膜の空間的構成。彼らの移動度は、測定の空間スケールに依存しないように実際には、自由に拡散する分子が一定の見かけの拡散率が表示されます。これとは対照的に、部分的に閉じ込められた分子が閉じ込めサイズよりも大きい空間スケールの減少拡散その後、閉じ込めサイズよりも小さい変位のために非常に一定の見かけの拡散係数が表示されます。関連した空間スケールが閉じ込め空間延長を推定するために使用することができつつ、見かけの拡散係数の減少の出現は、一過性の閉じ込めの指紋として解釈することができる。<html> .jove.com /ファイル/ ftp_upload / 51994 / 51994fig3highres.jpg &quot;ターゲット=&quot; _ブランク」&gt;この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 <img alt="図4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51994/51994fig4highres.jpg" width="500" /> 。。ATTO488-PPEで標識されたCHO基底膜の生細胞膜における図4 ATTO488-PPE拡散法を細胞膜中ATTO488-PPE挿入の（A）の模式図（B）TIRF画像：ROI（赤いボックス）が選択される細胞の大部分が均一な部分的には、セル境界の高い蛍光スポットを回避することができる。（C）選択されたROIで測定された拡散法は、このコンポーネントの自由な拡散モデルを確認したフラットな挙動を示している。 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/51994/51994fig4highres.jpg" target="_blank">の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。この図。</a> 常に &quot;&gt;：&quot; =キープtogether.withinページのFO」jove_content <img alt="図5" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51994/51994fig5highres.jpg" width="500" /> 生細胞膜における図5のTfR-GFP拡散法（A）細胞膜中のTfR-GFP挿入の模式図：受容体の細胞質テールは、受容体のモビリティのためのフェンスとして機能する膜骨格と相互作用（Bは 。 ）CHOを発現するのTfR-GFPのTIRF画像：ROI起因過剰発現にアーチファクトを避けるために低発現している細胞を優先に選択される（C）とのTfR（黒ドットの拡散法則）、PPEとは異なり（灰色の線は、） 図4から取ら。第1平坦部は、D アプリの減少が続いている、部分的に閉じ込められた拡散の典型的な挙動を示している。 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/51994/51994fig5highres.jpg" target="_blank">この第の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a>グレ。

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From Fast Fluorescence Imaging to Molecular Diffusion Law on Live Cell Membranes in a Commercial Microscope

Spatial distribution and temporal dynamics of plasma membrane proteins and lipids is a hot topic in biology. Here this issue is addressed by a spatio-temporal image fluctuation analysis that provides conceptually the same physical quantities of single particle tracking, but it uses small molecular labels and standard microscopy setups.

商業顕微鏡でのライブ細胞膜上の分子拡散法への高速蛍光イメージングから

It has become increasingly evident that the spatial distribution and the motion of membrane components like lipids and proteins are key factors in the ...

from-fast-fluorescence-imaging-to-molecular-diffusion-law-on-live

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Bioengineering

11.4K ビュー.  Scuola Normale Superiore. Spatial distribution and temporal dynamics of plasma membrane proteins and lipids is a hot topic in biology. Here this issue is addressed by a spatio-temporal image fluctuation analysis that provides conceptually the same physical quantities of single particle tracking, but it uses small molecular labels and standard microscopy setups.

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Single-Molecule Tracking Microscopy - A Tool for Determining the Diffusive States of Cytosolic Molecules

Single-molecule localization microscopy probes the position and motions of individual molecules in living cells with tens of nanometer spatial and millisecond temporal resolution. These capabilities make single-molecule localization microscopy ideally suited to study molecular level biological functions in physiologically relevant environments. Here, we demonstrate an integrated protocol for both acquisition and processing/analysis of single-molecule tracking data to extract the different diffusive states a protein of interest may exhibit. This information can be used to quantify molecular complex formation in living cells. We provide a detailed description of a camera-based 3D single-molecule localization experiment, as well as the subsequent data processing steps that yield the trajectories of individual molecules. These trajectories are then analyzed using a numerical analysis framework to extract the prevalent diffusive states of the fluorescently labeled molecules and the relative abundance of these states. The analysis framework is based on stochastic simulations of intracellular Brownian diffusion trajectories that are spatially confined by an arbitrary cell geometry. Based on the simulated trajectories, raw single-molecule images are generated and analyzed in the same way as experimental images. In this way, experimental precision and accuracy limitations, which are difficult to calibrate experimentally, are explicitly incorporated into the analysis workflow. The diffusion coefficient and relative population fractions of the prevalent diffusive states are determined by fitting the distributions of experimental values using linear combinations of simulated distributions. We demonstrate the utility of our protocol by resolving the diffusive states of a protein that exhibits different diffusive states upon forming homo- and hetero-oligomeric complexes in the cytosol of a bacterial pathogen.

3D single-molecule localization microscopy is utilized to probe the spatial positions and motion trajectories of fluorescently labeled proteins in living bacterial cells. The experimental and data analysis protocol described herein determines the prevalent diffusive behaviors of cytosolic proteins based on pooled single-molecule trajectories.

単一分子トラッキング顕微鏡 - 細胞細胞分子の拡散状態を決定するツール

Single-molecule localization microscopy probes the position and motions of individual molecules in living cells with tens of nanometer spatial and ...

生化学

Visualizing Single Molecular Complexes In Vivo Using Advanced Fluorescence Microscopy

Full insight into the mechanisms of living cells can be achieved only by investigating the key processes that elicit and direct events at a cellular level. To date the shear complexity of biological systems has caused precise single-molecule experimentation to be far too demanding, instead focusing on studies of single systems using relatively crude bulk ensemble-average measurements. However, many important processes occur in the living cell at the level of just one or a few molecules; ensemble measurements generally mask the stochastic and heterogeneous nature of these events. Here, using advanced optical microscopy and analytical image analysis tools we demonstrate how to monitor proteins within a single living bacterial cell to a precision of single molecules and how we can observe dynamics within molecular complexes in functioning biological machines. The techniques are directly relevant physiologically. They are minimally-perturbative and non-invasive to the biological sample under study and are fully attuned for investigations in living material, features not readily available to other single-molecule approaches of biophysics. In addition, the biological specimens studied all produce fluorescently-tagged protein at levels which are almost identical to the unmodified cell strains ("genomic encoding"), as opposed to the more common but less ideal approach for generating significantly more protein than would occur naturally ('plasmid expression'). Thus, the actual biological samples which will be investigated are significantly closer to the natural organisms, and therefore the observations more relevant to real physiological processes.

Visualizing Single Molecular Complexes In Vivo Using Advanced Fluorescence Microscopy

Here we demonstrate the protocols for performing single-molecule fluorescence microscopy on living bacterial cells to enable functional molecular complexes to be detected, tracked and quantified.

単一分子複合体の可視化インビボでの高度な蛍光顕微鏡を用いて

Full insight into the mechanisms of living cells can be achieved only by investigating the key processes that elicit and direct events at a cellular ...

生物学

Spot Variation Fluorescence Correlation Spectroscopy for Analysis of Molecular Diffusion at the Plasma Membrane of Living Cells

Dynamic biological processes in living cells, including those associated with plasma membrane organization, occur on various spatial and temporal scales, ranging from nanometers to micrometers and microseconds to minutes, respectively. Such a broad range of biological processes challenges conventional microscopy approaches. Here, we detail the procedure for implementing spot variation Fluorescence Correlation Spectroscopy (svFCS) measurements using a classical fluorescence microscope that has been customized. The protocol includes a specific performance check of the svFCS setup and the guidelines for molecular diffusion measurements by svFCS on the plasma membrane of living cells under physiological conditions. Additionally, we provide a procedure for disrupting plasma membrane raft nanodomains by cholesterol oxidase treatment and demonstrate how these changes in the lateral organization of the plasma membrane might be revealed by svFCS analysis. In conclusion, this fluorescence-based method can provide unprecedented details on the lateral organization of the plasma membrane with the appropriate spatial and temporal resolution.

This article aims to present a protocol on how to build a spot variation Fluorescence Correlation Spectroscopy (svFCS) microscope to measure molecular diffusion at the plasma membrane of living cells.

生細胞原形質膜における分子拡散解析のためのスポット変異蛍光相関分光法

Dynamic biological processes in living cells, including those associated with plasma membrane organization, occur on various spatial and temporal scales, ...

Molecular Diffusion in Plasma Membranes of Primary Lymphocytes Measured by Fluorescence Correlation Spectroscopy

Fluorescence correlation spectroscopy (FCS) is a powerful technique for studying the diffusion of molecules within biological membranes with high spatial and temporal resolution. FCS can quantify the molecular concentration and diffusion coefficient of fluorescently labeled molecules in the cell membrane. This technique has the ability to explore the molecular diffusion characteristics of molecules in the plasma membrane of immune cells in steady state (i.e., without processes affecting the result during the actual measurement time). FCS is suitable for studying the diffusion of proteins that are expressed at levels typical for most endogenous proteins. Here, a straightforward and robust method to determine the diffusion rate of cell membrane proteins on primary lymphocytes is demonstrated. An effective way to perform measurements on antibody-stained live cells and commonly occurring observations after acquisition are described. The recent advancements in the development of photo-stable fluorescent dyes can be utilized by conjugating the antibodies of interest to appropriate dyes that do not bleach extensively during the measurements. Additionally, this allows for the detection of slowly diffusing entities, which is a common feature of proteins expressed in cell membranes. The analysis procedure to extract molecular concentration and diffusion parameters from the generated autocorrelation curves is highlighted. In summary, a basic protocol for FCS measurements is provided; it can be followed by immunologists with an understanding of confocal microscopy but with no other previous experience of techniques for measuring dynamic parameters, such as molecular diffusion rates.

A method to measure protein diffusion in membranes of primary immune cells using fluorescence correlation spectroscopy (FCS) is described. In this paper, the use of antibodies for fluorescent labeling is illustrated.

蛍光相関分光法により測定初代リンパ球のプラズマ膜における分子拡散

Fluorescence correlation spectroscopy (FCS) is a powerful technique for studying the diffusion of molecules within biological membranes with high spatial ...

免疫・感染学

Visualizing Intracellular SNARE Trafficking by Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy

Soluble N-ethylmaleimide sensitive fusion protein (NSF) attachment protein receptor (SNARE) proteins are key for membrane trafficking, as they catalyze membrane fusion within eukaryotic cells. The SNARE protein family consists of about 36 different members. Specific intracellular transport routes are catalyzed by specific sets of 3 or 4 SNARE proteins that thereby contribute to the specificity and fidelity of membrane trafficking. However, studying the precise function of SNARE proteins is technically challenging, because SNAREs are highly abundant and functionally redundant, with most SNAREs having multiple and overlapping functions. In this protocol, a new method for the visualization of SNARE complex formation in live cells is described. This method is based on expressing SNARE proteins C-terminally fused to fluorescent proteins and measuring their interaction by F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) employing fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM). By fitting the fluorescence lifetime histograms with a multicomponent decay model, FRET-FLIM allows (semi-)quantitative estimation of the fraction of the SNARE complex formation at different vesicles. This protocol has been successfully applied to visualize SNARE complex formation at the plasma membrane and at endosomal compartments in mammalian cell lines and primary immune cells, and can be readily extended to study SNARE functions at other organelles in animal, plant, and fungal cells.

This protocol describes a new method allowing for the quantitative visualization of complex formation of SNARE proteins, based on F&#246;rster resonance energy transfer, and fluorescence lifetime imaging microscopy.

蛍光寿命イメージングによる細胞内のスネアを可視化

Soluble N-ethylmaleimide sensitive fusion protein (NSF) attachment protein receptor (SNARE) proteins are key for membrane trafficking, as they catalyze ...

Determination of Lipid Raft Partitioning of Fluorescently-tagged Probes in Living Cells by Fluorescence Correlation Spectroscopy (FCS)

In the past fifteen years the notion that cell membranes are not homogenous and rely on microdomains to exert their functions has become widely accepted. Lipid rafts are membrane microdomains enriched in cholesterol and sphingolipids. They play a role in cellular physiological processes such as signalling, and trafficking1,2 but are also thought to be key players in several diseases including viral or bacterial infections and neurodegenerative diseases3.
Yet their existence is still a matter of controversy4,5. Indeed, lipid raft size has been estimated to be around 20 nm6, far under the resolution limit of conventional microscopy (around 200 nm), thus precluding their direct imaging. Up to now, the main techniques used to assess the partition of proteins of interest inside lipid rafts were Detergent Resistant Membranes (DRMs) isolation and co-patching with antibodies. Though widely used because of their rather easy implementation, these techniques were prone to artefacts and thus criticized7,8. Technical improvements were therefore necessary to overcome these artefacts and to be able to probe lipid rafts partition in living cells.
Here we present a method for the sensitive analysis of lipid rafts partition of fluorescently-tagged proteins or lipids in the plasma membrane of living cells. This method, termed Fluorescence Correlation Spectroscopy (FCS), relies on the disparity in diffusion times of fluorescent probes located inside or outside of lipid rafts. In fact, as evidenced in both artificial membranes and cell cultures, probes would diffuse much faster outside than inside dense lipid rafts9,10. To determine diffusion times, minute fluorescence fluctuations are measured as a function of time in a focal volume (approximately 1 femtoliter), located at the plasma membrane of cells with a confocal microscope (Fig. 1). The auto-correlation curves can then be drawn from these fluctuations and fitted with appropriate mathematical diffusion models11.
FCS can be used to determine the lipid raft partitioning of various probes, as long as they are fluorescently tagged. Fluorescent tagging can be achieved by expression of fluorescent fusion proteins or by binding of fluorescent ligands. Moreover, FCS can be used not only in artificial membranes and cell lines but also in primary cultures, as described recently12. It can also be used to follow the dynamics of lipid raft partitioning after drug addition or membrane lipid composition change12.

Determination of Lipid Raft Partitioning of Fluorescently-tagged Probes in Living Cells by Fluorescence Correlation Spectroscopy FCS

A technique to probe the lipid raft partitioning of fluorescent proteins at the plasma membrane of living cells is described. It takes advantage of the disparity in diffusion times of proteins located inside or outside of lipid rafts. Acquisition can be performed dynamically in control conditions or after drug addition.

脂質ラフトの決定は、蛍光相関分光法（FCS）による生細胞の蛍光タグ付きプローブの分割

In the past fifteen years the notion that cell membranes are not homogenous and rely on microdomains to exert their functions has become widely accepted. ...

Mapping Molecular Diffusion in the Plasma Membrane by Multiple-Target Tracing (MTT)

Our goal is to obtain a comprehensive description of molecular processes occurring at cellular membranes in different biological functions. We aim at characterizing the complex organization and dynamics of the plasma membrane at single-molecule level, by developing analytic tools dedicated to Single-Particle Tracking (SPT) at high density: Multiple-Target Tracing (MTT)1. Single-molecule videomicroscopy, offering millisecond and nanometric resolution1-11, allows a detailed representation of membrane organization12-14 by accurately mapping descriptors such as cell receptors localization, mobility, confinement or interactions.
We revisited SPT, both experimentally and algorithmically. Experimental aspects included optimizing setup and cell labeling, with a particular emphasis on reaching the highest possible labeling density, in order to provide a dynamic snapshot of molecular dynamics as it occurs within the membrane. Algorithmic issues concerned each step used for rebuilding trajectories: peaks detection, estimation and reconnection, addressed by specific tools from image analysis15,16. Implementing deflation after detection allows rescuing peaks initially hidden by neighboring, stronger peaks. Of note, improving detection directly impacts reconnection, by reducing gaps within trajectories. Performances have been evaluated using Monte-Carlo simulations for various labeling density and noise values, which typically represent the two major limitations for parallel measurements at high spatiotemporal resolution.
The nanometric accuracy17 obtained for single molecules, using either successive on/off photoswitching or non-linear optics, can deliver exhaustive observations. This is the basis of nanoscopy methods17 such as STORM18, PALM19,20, RESOLFT21 or STED22,23, which may often require imaging fixed samples. The central task is the detection and estimation of diffraction-limited peaks emanating from single-molecules. Hence, providing adequate assumptions such as handling a constant positional accuracy instead of Brownian motion, MTT is straightforwardly suited for nanoscopic analyses. Furthermore, MTT can fundamentally be used at any scale: not only for molecules, but also for cells or animals, for instance. Hence, MTT is a powerful tracking algorithm that finds applications at molecular and cellular scales.

Mapping Molecular Diffusion in the Plasma Membrane by Multiple-Target Tracing MTT

Multiple-Target Tracing is a homemade algorithm developed for tracking individually labeled molecules within the plasma membrane of living cells. Efficiently detecting, estimating and tracing molecules over time at high-density provide a user-friendly, comprehensive tool to investigate nanoscale membrane dynamics.

複数のターゲットトレース（MTT）による原形質膜中の分子拡散のマッピング

Our goal is to obtain a comprehensive description of molecular processes occurring at cellular membranes in different biological functions. We aim at ...

Image Processing Protocol for the Analysis of the Diffusion and Cluster Size of Membrane Receptors by Fluorescence Microscopy

Particle tracking on a video sequence and the posterior analysis of their trajectories is nowadays a common operation in many biological studies. Using the analysis of cell membrane receptor clusters as a model, we present a detailed protocol for this image analysis task using Fiji (ImageJ) and Matlab routines to: 1) define regions of interest and design masks adapted to these regions; 2) track the particles in fluorescence microscopy videos; 3) analyze the diffusion and intensity characteristics of selected tracks. The quantitative analysis of the diffusion coefficients, types of motion, and cluster size obtained by fluorescence microscopy and image processing provides a valuable tool to objectively determine particle dynamics and the consequences of modifying environmental conditions. In this article we present detailed protocols for the analysis of these features. The method described here not only allows single-molecule tracking detection, but also automates the estimation of lateral diffusion parameters at the cell membrane, classifies the type of trajectory and allows complete analysis thus overcoming the difficulties in quantifying spot size over its entire trajectory at the cell membrane.

Here, we present a protocol for single particle tracking image analysis that allows quantitative evaluation of diffusion coefficients, types of motion and cluster sizes of single particles detected by fluorescence microscopy.

画像処理プロトコル、拡散の解析と蛍光顕微鏡による膜受容体のクラスター サイズ

Particle tracking on a video sequence and the posterior analysis of their trajectories is nowadays a common operation in many biological studies. Using ...

FLIMベースの代謝および低酸素分析のための多細胞スフェロイド形成

Production and Multi-Parameter Live Cell Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy (FLIM) of Multicellular Spheroids

Multicellular tumor spheroids are a popular 3D tissue microaggregate&#160;model for reproducing tumor microenvironment, testing and optimizing drug therapies&#160;and using bio- and nanosensors in a 3D context. Their ease of production, predictable size, growth, and observed nutrient and metabolite gradients are important to recapitulate the 3D niche-like&#160;cell microenvironment. However, spheroid heterogeneity and variability of their production methods can influence overall cell metabolism, viability, and drug response. This makes it difficult to choose the most appropriate&#160;methodology, considering the requirements in size, variability, needs of biofabrication, and use as in vitro 3D tissue models in stem and cancer cell biology. In particular, spheroid production can influence their compatibility with quantitative live microscopies, such as optical metabolic imaging, fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM), monitoring of spheroid&#160;hypoxia with nanosensors, or viability. Here, a number of conventional spheroid formation protocols are presented, highlighting their compatibility with the live widefield, confocal, and two-photon microscopies. The follow-up imaging to analysis&#160;pipeline with multiplexed autofluorescence FLIM and, using various types of cancer and stem cell spheroids, is also presented.

著者スポットライト:蛍光寿命イメージング顕微鏡を用いた代謝および酸素化分析のためのスフェロイド形成法の標準化(英語)

Here, we describe different multicellular spheroid formation methods to perform follow-up multi-parameter live cell microscopy. Using fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM), cellular autofluorescence, staining dyes, and nanoparticles, the approach for analysis of cell metabolism, hypoxia, and cell death in live three-dimensional (3D) cancer and stem cell-derived spheroids is demonstrated.

多細胞スフェロイドの作製およびマルチパラメーター生細胞蛍光寿命イメージング顕微鏡(FLIM)

Multicellular tumor spheroids are a popular 3D tissue microaggregate&#160;model for reproducing tumor microenvironment, testing and optimizing drug ...

商業顕微鏡でのライブ細胞膜上の分子拡散法への高速蛍光イメージングから

要約

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単一分子トラッキング顕微鏡 - 細胞細胞分子の拡散状態を決定するツール

単一分子複合体の可視化インビボでの高度な蛍光顕微鏡を用いて

生細胞原形質膜における分子拡散解析のためのスポット変異蛍光相関分光法

蛍光相関分光法により測定初代リンパ球のプラズマ膜における分子拡散

蛍光寿命イメージングによる細胞内のスネアを可視化

脂質ラフトの決定は、蛍光相関分光法（FCS）による生細胞の蛍光タグ付きプローブの分割

複数のターゲットトレース（MTT）による原形質膜中の分子拡散のマッピング

画像処理プロトコル、拡散の解析と蛍光顕微鏡による膜受容体のクラスターサイズ

多細胞スフェロイドの作製およびマルチパラメーター生細胞蛍光寿命イメージング顕微鏡(FLIM)

多細胞スフェロイドの作製およびマルチパラメーター生細胞蛍光寿命イメージング顕微鏡(FLIM)

商業顕微鏡でのライブ細胞膜上の分子拡散法への高速蛍光イメージングから

要約

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単一分子トラッキング顕微鏡 - 細胞細胞分子の拡散状態を決定するツール

単一分子複合体の可視化インビボでの高度な蛍光顕微鏡を用いて

生細胞原形質膜における分子拡散解析のためのスポット変異蛍光相関分光法

蛍光相関分光法により測定初代リンパ球のプラズマ膜における分子拡散

蛍光寿命イメージングによる細胞内のスネアを可視化

脂質ラフトの決定は、蛍光相関分光法（FCS）による生細胞の蛍光タグ付きプローブの分割

複数のターゲットトレース（MTT）による原形質膜中の分子拡散のマッピング

画像処理プロトコル、拡散の解析と蛍光顕微鏡による膜受容体のクラスター サイズ

多細胞スフェロイドの作製およびマルチパラメーター生細胞蛍光寿命イメージング顕微鏡(FLIM)

多細胞スフェロイドの作製およびマルチパラメーター生細胞蛍光寿命イメージング顕微鏡(FLIM)

画像処理プロトコル、拡散の解析と蛍光顕微鏡による膜受容体のクラスターサイズ