このインビトロアッセイは、高スループットとスケーラブルなプラットフォームでの血管新生発芽を示しています。これは、血管新生における新しい標的を見つけるために使用することができます。この血管新生アッセイは、勾配と灌流を含む複雑な細胞マイクロ環境と、高スループットスクリーニングに対応するプラットフォームを組み合わせたものです。
血管新生は健康と病気の両方で重要な役割を果たしています。血管新生の間に起こるメカニズムを理解することは、がんがどのように成長し、組織がどのように修復するかを理解するのに役立ちます。この方法は、心血管疾患および組織再生中のメカニズムの洞察を与えることができる。
両方とも、血管新生が重要な役割を果たしている。このマイクロ流体プラットフォームの初めての使用のためには、ボリュームの法則とピペットの方法を認識する必要があります。顕微鏡の下を見るか、プレートを逆さまに反転させることで、ステップを確認できます。
いくつかのステップは、例えばマイクロ流体チャネルがどれほど小さいか、プレートを保持する方法など、方法を読むだけで感触を得ることは困難です。これらの手順を実証することは、ウェンディ・スタム、私たちの研究室の技術者になります。まず、マイクロフルディック 384 ウェル プレートを無菌層流れフードに移します。
蓋を取り外し、マルチチャンネルピペットを使用して40の観測井戸のそれぞれに50マイクロリットルの水またはリン酸緩衝生理食塩水を加えます。その後、各マイクロ流体ユニットのゲル入口に1ミリリットルコラーゲン1溶液あたり4ミリグラムの1.5マイクロリットルを加えます。ゲルがチャネルに入るためにゲルの液滴が各ウェルの中央に置かれておくことを確認してください。
5つのマイクロ流体ユニットを充填した後、プレートを裏返し、ゲルチャネルの正しい充填を視覚的に検査します。マイクロフルディックプレートを37°Cのインキュベーターに置き、5%の二酸化炭素を10分間置き、コラーゲン1を重合します。その後、インキュベーターからプレートを取り出し、滅菌層流れフードに移します。
各マイクロ流体ユニットの上部灌流チャネルの出口ウェルに1ミリリットルフィブロネクチンコード溶液あたり10マイクログラムの50マイクロリットルを追加します。気泡をトラップせずに井戸の正しい充填のために井戸の側面にピペットチップを押してください。チャネルは、出口をよく充填することなく、出口に充填し、液体パンを充填します。
その後、少なくとも2日間、インキュベーターにプレートを置きます。現在、37°Cの水浴で凍結したIPSC-ICを1分未満で急速に解凍します。その後、細胞を15ミリリットルのチューブに移し、ゆっくりと10ミリリットルの基底培地を加え、希釈します。
溶液の10マイクロリットルを引き出し、セルカウンターのセルを数えます。チューブを100回gで5分間遠心分離する。上清を細胞ペレットを乱さずに吸引し、基底培地で再懸濁して、1ミリリットル当たり7番目の細胞に2倍の濃度を得た。
次に、マイクロ流体384ウェルプレートをインキュベーターから滅菌層流れフードに移します。フィブロネクチンコード溶液を灌流出口から吸引し、25マイクロリットルの基底培地を出口ウェルに加える。各上部灌流注入口に細胞懸濁液の1マイクロリットルの液滴を加えます。
液滴は数秒で平らになります。1つのチャネル内およびチャネル間で、播種が均質であるかどうかを顕微鏡で確認します。マイクロ流体ウェルプレートを摂氏37度と5%の二酸化炭素で1〜1.5時間インキュベートします。
その後、セルが接着していることを確認します。上部灌流出口の井戸から基底培地を取り除きます。上部灌流注入口および出口に温かい容器培養培地を加える。
インキュベーターの7度の角度および8分の揺れる間隔に置くロッカーのプラットホームの皿を置く。1日目と2日目のポストシードでは、自動ステージでブライトフィールド顕微鏡を使用してプレートを画像化し、細胞の生存率を確認します。2日後、コラーゲン1足場に対してコンフルエント単層が形成された。
まず、4.5ミリリットルの基礎培地を4.5ミリリットルのVEGFストック、4.5マイクロリットルのPMAストック、および2.25マイクロリットルのS1Pストックで補って、4.5ミリリットルの血管新生発芽培地を調製します。VEGFの5.1マイクロリットルとBFGFの3.4マイクロリットルで基底培地を補うことによって、8.5ミリリットルの血管成長培地を調製する。ウェルから培地を吸引し、上部灌流入口および出口ウェルおよびゲル入口および出口ウェルに50マイクロリットルの新鮮な容器培養培地を加える。
次に、50マイクロリットルの血管新生スプラウト混合物を底灌流チャネルインレットと出口ウェルのそれぞれに加えます。血管形成成長因子の勾配を形成するために、プレートをロッカープラットフォームのインキュベーターに戻します。血管新生成長因子を添加した1日と2日後に、ブライトフィールド顕微鏡を使用して自動ステージでウェルを画像化します。
吻合と芽安定化を研究するには、蛍光標識されたアルブミンあたり0.5ミリグラムの1マイクロリットルを上部灌流注入口に加えます。その後、50マイクロリットルのピペットと溶液を混合します。自動ステージとインキュベーターを摂氏37度に設定した蛍光顕微鏡にプレートを移します。
10Xの目的で顕微鏡を設定し、露出設定を修正します。1分ごとにタイムラプス画像を10分間取得します。顕微鏡からプレートを取り出し、プレートを滅菌層流れフードに移します。
ウェルからすべての培地を取り出し、容器培養培地と血管新生発芽培地の両方を対応するウェルに交換します。マイクロ流体プレートをインキュベーターに戻し、血管新生発芽を継続します。6日目に、透光性を研究するためにイメージングを繰り返します。
細胞培養を修正するために、全ての培養培地をウェルから吸引する。すべての灌流注入および出口の井戸にPBSの4%PFAの25マイクロリットルを加える。その後、マイクロ流体プレートの片側を蓋の上に5度のわずかな角度で置き、流れを誘発します。
室温で10分間インキュベートします。その後、井戸からPFAを吸引する。すべての灌流入口と出口を50マイクロリットルのHBSSで2回洗います。
その後、井戸からHBSSを吸引します。パラホルムアルデヒドは、手袋を着用して取り扱うべき危険な化学物質であり、唯一の煙のフードで開きます。次に、0.2%非イオン界面活性剤の50マイクロリットルを全ての灌流注入口と出口に加えて、室温で10分間透過し、マイクロ流体プレートを蓋の上に5度のわずかな角度で置きます。
非イオン性界面活性剤をウェルから吸引し、50マイクロリットルのHBSSを全灌流注入および出口ウェルに加えて、灌流チャネルを2回洗浄する。井戸からHBSSを吸引します。核を染色するためのHoechst 1,000〜2,000を準備し、F-アクチンを染色するためにHBSSでファロイジン100〜200を調製する。
6ミリリットルのHBSS、30マイクロリットルのF-アクチン、3マイクロリットルのHoechstをファルコンチューブに組み合わせます。その後、各灌流入口と出口によく25マイクロリットルを加えます。プレートをわずかな角度で置き、室温で少なくとも30分間インキュベートします。
すべての灌流の入口および出口でHBSSの50マイクロリットルで2回洗う。次に、自動ステージで蛍光顕微鏡を使用して直接画像を作成するか、後で使用するために4°Cで光から保護されたプレートを保存します。このプロトコルでは、マイクロ血管を継続的に浸透させ、血管新生成長因子の勾配にさらした。
受動ポンプ法を用いてIPSC-ICをシードすると、均質な播種密度が得られた。マイクロ流体チャネルの入口の上に置かれた液滴のタイムラプスは、追加直後の液滴を示し、添加後の入口トランクの上に液滴を示し、滴滴半月板が流入口によって固定されるまで、出口に向かって流れ出た。血管形成因子の勾配への暴露は、パターン化されたコラーゲン1ゲル内のマイクロ血管の指向性血管形成発芽をもたらした。
透明な先端細胞形成およびコラーゲン1ゲルへの浸潤は、血管形成勾配の添加後24時間目に見えるが、内腔形成を含むストック細胞は48時間後に見えた。固定および染色後、これらの芽の形状および長さを同定した。しかし、成長因子を添加することなく、コラーゲン1ゲルへの浸潤は認められなかった。
共焦点イメージングでは、芽径を決定し、内腔形成を確認した。この方法は、新しい血管新生阻害剤をスクリーニングするために使用することができる。これは、糖尿病性網膜症、関節リウマチおよび癌に対する新しい治療法を見つけるのに役立つ可能性があります。
現在、血液脳関門や血管化されたオルガノイドのモデルを含む共培養を作り出す方法を模索しています。
