当社のプロトコルは、CRISPR技術を介して製造中のCAR-T細胞の遺伝子改変を記述し、より効果的で毒性の低い製品を生成します。この技術の利点は、CAR-T細胞の産生と遺伝子操作の両方が効率の良い1つの細胞で起こり得る点である。この手順のデモンストレーションは、MD博士課程の学生であるロザリー・スターナー、技術者で大学院生のミシェル・コックス、私の研究室の博士研究員のレオナ・サケムラです。
採取した末梢血単核細胞からT細胞を単離した後、最初にT細胞培地を調製し、0.45マイクロメートルの無菌真空フィルターを通してそれを濾過し、0.22マイクロメートルの無菌真空フィルターで殺菌することによって培養を開始する。T細胞刺激またはゼロ日の日には、刺激の前に、無菌1.5ミリリットルマイクロ遠心チューブに必要な量のビーズを入れ、TCMの1ミリリットルで再懸濁してCD3/CD28ビーズを洗浄します。チューブを磁石に1分間接触します。
その後、TCMを吸引し、新鮮なTCMの1ミリリットルで再懸濁してビーズを再び洗浄し、合計3回の洗浄を繰り返します。そして最後に、ビーズをTCMの1ミリリットルで再中断します。T細胞を数えた後、ビーズをT細胞に3対1のビーズの比率で細胞に移す。
その後、1ミリリットル当たり100万個の細胞の最終濃度に細胞を希釈し、摂氏37度、5%CO2で24時間インキュベートします。LENTiviralベクターでCART19コンストラクトを取得した後、レンチウイルスプラスミド、包装ベクター、エンベロープベクター、前錯化試薬、トランスフェクション試薬、トランスフェクション試薬、トランスフェクション培地を室温で30分間インキュベートすることによりレンチウイルス産生を行う。BSL2+の予防措置を使用してレンチウイルス作業を行い、細胞培養フード、個人用保護具、廃棄前に使用済み物質の漂白剤による消毒を行います。
インキュベーション後、これらのトランスフェクション試薬を70~90%の合流度に達した293個のT細胞に加え、トランスフェクト細胞を摂氏37度および5%CO2で培養します。トランスフェクション、収穫、遠心分離機、超遠心分離によるウイルス含有上清を濾過し濃縮し、将来の使用のためにマイナス80°Cで凍結した後、24時間と48時間後に。初日、ゼロ日目に1ミリリットル当たり100万個の細胞で刺激されたT細胞を穏やかに再懸濁し、細胞のロゼットを分解する。
適切なBSL2+予防策の下で、3.0の感染の多重度でシミュレートされたT細胞に新鮮または凍結収穫されたウイルスを追加する。トランスデューションされたT細胞を摂氏37度、5%CO2でインキュベートし続ける。3日目と5日目に、CAR-T細胞を数え、新鮮な事前温められたTCMを培養物に加え、1ミリリットル当たり100万個の細胞のCAR-T細胞濃度を維持する。
シミュレーションの6日後、細胞を最初に採取して再懸濁させることで、トランスデューシングされたT細胞からビーズを取り除きます。50ミリリットルの円錐管で細胞を移し、1分間磁石にチューブを入れる。CAR-T細胞含有上清を回収し、ビーズを廃棄した後、培養フラスコ中の1ミリリットル当たり100万個の細胞の濃度で細胞を培養に戻す。
フローサイトメトリーの細胞サンプルを使用して、CALの表面発現を評価します。残りをインキュベートして拡張を再開し、原稿に記載されているように8日目に細胞を収穫して凍結保存します。顆粒球マクロファージコロニー刺激因子を破壊するために、原稿に記載されているガイドRNAを利用する。
トランスフェクション試薬を室温で30分間インキュベートします。インキュベーション後、70~90%の合流度に達した293個のT細胞に加え、トランスフェクション細胞を摂氏37度、5%CO2で培養し、レンチウイルスを産生する。24時間と48時間で、50ミリリットル超遠心チューブで超遠心分離することによりウイルス含有上清を収穫し濃縮し、将来の使用のためにマイナス80°Cで凍結する。
そして1日目に、T細胞を穏やかに再中断してロゼットを分解します。BSL2+承認された実験室で、CAR-T細胞を生成するために、CAR19レンチウイルスおよびGMCSF標的CRISPRレンチウイルスをシミュレートされたT細胞に加える。3日目と5日目に、ピューロマイシン耐性を持つLentiCRISPR編集T細胞を正常にトランスデューシングし、1ミリリットル当たり1マイクログラムのピューロマイシンの濃度でプロマイシンジヒドロクロリドを有する細胞を治療する。
潮汐シーケンシングは、生きたCD3陽性細胞にゲート付きCAR-T細胞表面染色ゲートの約71%フロープロットの破壊効率を有するGM-CSFノックアウトCART19細胞のGM-CSF減少を確認するために使用され、野生型CART19およびGM-CSFノックアウトCART19の両方が正常に、同様の方法でCAR受容体を発現することを示す。一方、フローサイトメトリーによるGM-CSFの細胞内染色は、生きたCD3陽性細胞にもゲートされ、ノックアウトの機能的な成功を確認する野生型CART19細胞と比較して、ノックアウト細胞におけるGM-CSFの発現が低下することを示している。遺伝子組み換えCAR-T細胞の開発に最も重要であるため、この手順の導入ステップ中に特に注意する必要があります。
記載された方法論は、CRISPR/CAS9を介してCAR-T細胞を改変するために様々な遺伝子に適用される可能性があり、毒性が低く、より効果的な産物を生成するのに役立ちます。CRISPR/CAS9技術は、CAR-T細胞のゲノムを直接標的にして、現在の臨床欠点に対するソリューションを設計する戦略を提供します。
