このMLBジェノタイピングプロトコルは、国際的に重要な魚病原細菌であるエルシニア・ラッケリの疫学と世界的な人口構造に対する理解を大幅に高めています。以前に確立されたエルシニアラッケリタイピングスキームと比較して、それは非常に高い歪み解像度を提供しています。プロシージャは実験室間で容易に比較することができる簡単で、安く、そして賞の携帯用の結果である。
この技術は診断の特異性を大幅に改善し、感染のトレースを可能にする。例えば、非有害な環境株を背景に、有害なエルシニア・ラッケリクローンを区別することが多くなっています。この手順のデモンストレーションは、研究室の技術者であるサイマ・ナスリン・モハマドです。
まず、無菌接種ループを使用して、ペトリ料理の適切な寒天タイプにエルシニア・ラッケリ純粋な文化をまき出します。摂氏22度で1~2日、摂氏15度で3~4日間インキュベートします。その後、接種ループを使用して、各ペトリ皿から1つの代表的なコロニーを選び、再中断する50マイクロリットルの超精製水を含む1.5ミリリットルの遠心管に移します。
渦を短時間、摂氏100度の暖房ブロックで7分間インキュベートします。次いで、16,000 gで3分間遠心分離機を使用し、ピペットを使用して上清テンプレートDNAを空の1.5ミリリットル遠心管に慎重に移します。次のステップに進むか、20°CでDNAを保存します。
マスターミックスを調製するために、まず、分析される細菌サンプルの数に応じて試薬の量を計算し、また、原稿に詳述されているように、1つの陰性および1つの正の対照、および最終的な10%余剰体積を考慮する。異なるプライマー濃度が使用されることに注意してください。PCRアッセイごとに1本の別々の遠心分離管で、マルチプレックスPCRプラスマスターミックス、プライマー、およびRNaseフリーウォーターを加えます。
ボルテックスは、調製されたマスターが低速で穏やかに混合し、各マスターミックスの22マイクロリットルを、PCRストリップまたはプレート上の個々のウェルに個別に分配します。次に、調製したDNAテンプレートの3マイクロリットルをマスターミックスを含む各ウェルに加え、細菌サンプルあたり2つのウェルを、アッセイごとに1つずつ加えます。確認されたエルシニア・ラッケリ株のDNAを正の対照に使用し、超精製水を使用して陰性対照を行います。
シールと遠心分離機を簡単に。準備した反応をPCRサーモサイクラーにロードし、原稿に従ってプログラムを設定します。プログラムは3時間以内に完了します。
メーカーの推奨事項に従って、アガロースゲルパウダーをTBEバッファーに1回加えて1.5重量/体積%に達し、熱を溶かします。鋳造する前に、溶存したゲル溶液を流水下で短時間冷やし、50マイクロリットルのゲル溶液と混合につき5マイクロリットルの蛍光核酸染料を加える。鋳造トレイを組み立て、レベル付けします。
サンプル数に合わせてコーンを追加します。ゲル溶液をキャストに注ぎ、固めるのを待ちます。その後、ゲルを含むキャストをゲル電気泳動システムにTBEバッファーを1回に沈水する。
新しい PCR ストリップに 2 マイクロリットルの PCR 製品と 2 マイクロリットルの負荷染料を混合します。5マイクロリットルの混合物をゲル内のウェルに移す。少なくとも 1 つの空を保存します。
参照のために空の井戸にDNAの梯子の5マイクロリットルを加える。電極を差し込み、ゲルを15センチメートル当たり110ボルトで約1時間動かします。PRCアンプリコンを表す複数のバンドの存在を確認するには、UVベースのゲルイメージングシステムを使用します。
PCR アンプリコンの確認後、新しい PCR ストリップまたはプレートを使用して、PCR 製品を精製水に 1 ~ 10 まで希釈します。渦と遠心分離機を簡単に。ヒューム食器棚で作業しながら、フォームアミドとリファレンスサイズの標準溶液からなる遠心分離管にマスターミックスを準備します。
分析するPCR産物の数に応じて、原稿に詳述されている試薬量を使用する。10%の余剰ボリュームを許可します。ボルテックスは、利用可能なキャピラリー電気泳動システムに適したPCRプレート上の個々のウェルに9.5マイクロリットルを簡単に分配します。
その後、希釈PCR産物を0.5マイクロリットル加えます。シールと遠心分離機を簡単に。次に、サンプルを含むプレートをPCRサーモサイクラーにロードし、サンプルを摂氏95度で3分間変性させてから、無期限に摂氏4度まで冷却します。
1000 g で 1 分間遠心分離機を使用し、シールを慎重に取り外し、メーカーの指示に従ってプレートをキャピラリー電気泳動システムに積み込みます。フラグメント分析キャピラリー電気泳動を実行し、選択した装置に適した試薬を用いて、原稿の説明に従って実行条件を調整する。YersiniaラッカリVNTR毛管電気泳動サイズの呼び出しのために、最初のインポート毛細血管電気泳動の結果ファイルは、ジーンマッパー5ソフトウェアに。
解析方法を「マイクロサテライトのデフォルト」に設定し、サイズ標準で適切な製品を選択してから、「分析」ボタンを押します。サイズマッチエディタを使用して、サイズ標準フラグメントの正しい識別を確認し、目に見えて誤った割り当てを修正します。次に、読み取るサンプルを選択し、[印刷を表示]ボタンを押し、[コントロール A]を押してサイズ変更テーブルのビューを有効にします。
上部パネルで、コントロールを押しながら、VNTRアンプリコンを表す5つのピークをクリックします。Control G を押して、5 つの強調表示されたピークの特性のみを表示してサイズ変更テーブルをフィルタリングし、ダウンストリーム アプリケーションの各 VNTR 軌跡のサイズコールを記録します。キャピラリー電気泳動時の偏ったアンプリコン移動パターンを考慮するために、取得したサイズコールを軌跡固有の変数と組み合わせて使用して、正確なVNTR繰り返し回数を計算します。
数式は、自動化用のスプレッドシート テンプレートに実装できます。スプレッドシートでは、計算された VNRT のラウンドの繰り返しは、ダウンストリーム解析の前に最も近い整数にカウントオフされます。BioNumerics ソフトウェアで新しいデータベースを作成し、MLVA プラグインをアクティブにすることを選択します。
実験タイプパネルで、[新しい実験タイプの作成] を押し、[文字タイプ] を選択し、質問時にデフォルト設定を使用します。次に、新しい実験を選択し、値範囲としてゼロから100を使用して、10 VNTR loci のそれぞれに新しい文字を追加します。メインパネルに戻って、インポートフィールドと文字を選択して、Yersinia ruckeri VNTR繰り返しカウントとメソッドデータをインポートします。
このファイルが保存されているファイルを見つけ、[変換先の種類] 列で選択します。VNtrs の場合、これは適切な文字値を選択し、その他のメタデータは入力情報フィールドとして分類されるということを意味します。後で行ったプロセスを容易にするために、選択をテンプレートとして保存することができます。
MST クラスタ分析用にインポートされたサンプルを選択し、[比較] パネルの [新しい比較の作成] ボタンをクリックします。MST のビジュアル プレゼンテーションに必要な場合は、特定のメタデータ機能に従って、サンプルを色付きグループに割り当てます。次に、カテゴリ データの [高度なクラスター分析] と [MST] を選択して、選択したサンプルに基づいて MST ダイアグラムを生成します。
さらに、パーティションパラメータ、クロス長、ノードブランチラベリングなどを追加して、MSTの視覚的な表示を変更します。必要に応じて、[イメージのエクスポート] を使用して、確定した MST を目的の形式でエクスポートします。多重PCRに続いて、ゲル電気泳動画像は、サンプルを含む全12レーンに複数のアンプリコンの存在を確認し、最初のレーンはDNAラダーを表します。
毛細管電気泳動に起因する電気フェログラムでは、サイズと色素の標識の組み合わせに従って異なるVNTR遺伝子座を同定することができる。オレンジ色のピークは、使用されるサイズ標準を表します。5つの異なるノルウェーの農場で大西洋サケから回収されたエルシニア・ラッケリ分離株からのMLVAプロファイルに基づく最小スパニングツリーの例が示されています。
ファームの起源に関連する明確なクラスタリング傾向を観察することができます。例えば、魚種の地理的領域など、支配する異なるエルシニア・ラッケリクローンのMLVAによる同定は、この病原体に対するワクチン接種戦略を改善するために既に利用されている。
