このプロトコルは、反復的な腫瘍細胞チャレンジを介して、キメラ抗原受容体、またはCAR T細胞の評価のための長期の、インビトロ、機能的な方法を提供する。この技術は、真の抗腫瘍効果の正確な表現を達成しながら、インビボCAR T細胞機能評価よりも時間がかかり、労働集約的ではない。このインビトロ技術は、CAR T細胞抗腫瘍力の高スループットスクリーニングおよび分化を可能にする。
これは、CAR T細胞製品の臨床的有効性を評価するための潜在的なアプリケーションを有する。神経膠芽腫腫瘍球を神経膠芽腫腫瘍球培養から解離することから始める。冷たいアキュターゼの1ミリリットル、およびピペットの30〜60秒で。
腫瘍球が破壊されたら、5ミリリットルの温かい共培養培地で反応を止める。そして遠心分離による腫瘍細胞懸濁液をペレット化する。神経膠芽腫細胞を、新鮮なコ培養培地濃度のミリリットル当たり1.6倍から5番目の腫瘍細胞に再懸濁し、CAR T細胞培養から採取したT細胞を、共培養培地濃度のミリリットル当たり適切な割合のCAR陽性T細胞に希釈した。
次に、96ウェルフラットボトム組織培養プレートの各ウェルに希釈腫瘍細胞の100マイクロリットルを加える。そして、100マイクロリットルのCAR T細胞を、穏やかな混合を伴う腫瘍細胞の各ウェルに入る。その後、プレートを摂氏37度、5%の二酸化炭素インキュベーターに入れる。
培養の2日目、4日目、および6日目に、腫瘍細胞の各ウェルから50マイクロリットルの培地を慎重に除去し、T細胞共培養プレートは表に従って再挑戦を予定している。次いで、50マイクロリットルの新鮮な神経膠芽腫細胞懸濁液を加え、ちょうど実証したように調製したが、初期共培養の細胞数を2倍にして穏やかな混合を行う。そして、細胞培養インキュベーターにプレートを戻す。
1日目、3日目、5日目、7日目の共培養は、表に従って新しい96ウェルラウンドボトムプレートに収穫される各ウェルから上澄み物を移し、50マイクロリットルのプリウォームド0.5%トリプシンEDTAを各培地によく枯渇させた。摂氏37度で5分後、軽い顕微鏡検査で各ウェルの底から細胞が剥離していることを確認し、各ウェルの底部の周りに酵素溶液を穏やかにピペットして細胞を再懸濁させる。取り外された細胞懸濁液を新しい96ウェルプレートの適切な対応する井戸に移す前に。
ペレット細胞を遠心分離により、200マイクロリットルの蛍光を用いて細胞を活性化し、細胞選別放置溶液、またはFFS当たり2回目の遠心分離で洗浄する。100マイクロリットルの目的の抗体カクテルを1ウェルあたり100マイクロリットルのSSSで100マイクロリットルでペレットを再懸濁し、摂氏4度で30分のインキュベーションを行います。インキュベーションの終わりは、逐次100および200マイクロリットルFSSの水解によって任意の非結合抗体を除去し、DAPI核染色およびFSSの100〜200マイクロリットルで細胞を再中断する。
次に、標準的なフローサイトメトリック解析プロトコルに従って細胞を解析する。腫瘍細胞共培養後のCAR T細胞の機能的およびフェノティピック分析のために、フローサイトメーターからデータファイルを取得し、生きたDAPI陰性細胞のすべてをゲートする。腫瘍細胞を定量化するには、CD45陰性集団をゲートする。
CAR T細胞を定量化するために、CD45陽性CAR陽性集団をゲートする。次に、実験の経時に腫瘍およびCAR T細胞数をプロットし、41BB、およびCD69の共発現によりT細胞活性化を同定する。T細胞は、PD1、LAG3、TIM3、T細胞記憶状態LAG3、およびTIM3、CD45ROによるT細胞記憶状態、およびCD62リガンド発現によるT細胞の枯渇を示す。
CD45RO、およびCD62リガンド発現によって。CD4陽性、およびCD8陽性CART細胞は共に、CD107aおよび細胞内サイトカイン発現によって示されるように標的抗原を発現する神経膠芽腫細胞に対して等しく活性化される。しかし、反復性腫瘍チャレンジSA、CD4陽性、CD8陽性ではなく、CAR T細胞によって評価されるように、CAR T細胞は複数のラウンド殺傷が可能である。
CD4陽性CAR T細胞はまたより強い拡大を達成する。CD4陽性、およびCD8陽性CAR T細胞が1対1の比率で混合されると、この細胞組み合わせはCD8陽性を行うが、CD4陽性CAR T細胞は長期細胞傷害性の点で行わない。また、CD4陽性T細胞の添加によりCD8陽性CART細胞の増殖が誘導される。
CD4陽性CAR T細胞の増殖はCDa陽性細胞の存在下で阻害される。最初の共培養の24時間後に、CD4陽性およびCD8陽性CAR T細胞の両方が同様に活性化される。繰り返し腫瘍チャレンジ中、CD4陽性およびCD8陽性CAR T細胞の両方がCD45RO陽性、CD62リガン陽性中央記憶表現型からCD45RO陽性CD62リガンネガティブエフェクター記憶表現型への移行を示す。
CD8陽性CAR T細胞はまた、3日間の共培養後にPD1、LAG3、TIM3発現によって評価されるCD4陽性CAR T細胞に比べて疲労を起こしやすい。また、CD4陽性T細胞の存在下または存在の有無においてCDa陽性CAR T細胞の枯渇に見られる違いはなく、CD4誘導CD8陽性CAR T細胞拡張が、より良いエフェクター機能と関連していないことを示す。このエッセイは、T細胞を並べ替えて共培養を行い、トランスクリプトム、プロテオミクス、および関心のある特定の遺伝子に対してさらなる分析を行うこともできる。
この繰り返しの腫瘍チャレンジは、CAR T細胞腫瘍認識後の生物学的事象を調査するためのプラットフォームとしても使用できる。
