デジタルPCRを用いたマウス組織における異種マウスモデルにおける移植片対宿主病の誘導とスコア付け

このプロトコルは、異種移植片対宿主病(xenoGVHD)を誘発する方法と、一貫した結果を確保するために臨床スコアリングを盲目および標準化する方法を概説する。xenoGVHDモデルは、マウスT細胞ではなくヒトに対する免疫抑制療法を試験するためのin vivo方法を提供し、これらの研究のクリニックへの翻訳を改善する。この手順を実証することは、私の研究室の大学院生であるアマラ・センです。

注射の前日、8〜12週齢の非肥満糖尿病性サイドガンマ、またはNSGを殺菌されたパイケージに入れたマウスを置き、セシウム137源のマウスを150センチグレイの総用量で照射し、ゆっくりと回転して均一な照射を確実にする。その後、無菌バイオセーフティキャビネットの中の清潔なケージにマウスを一晩置きます。翌朝、7つの末梢血単核細胞(PBMC)に1.1倍の10を単離するのに十分な健康なヒト血液を採取し、PBSでヘパリン化された血液を同量の2%ウシウシ血清(FBS)で希釈する。

慎重に50ミリリットルの円錐形チューブでリンパ球分離密度勾配媒体の15ミリリットルに希釈された血液の25ミリリットルまで重ね、密度勾配遠心分離を行います。分離の終わりに、界面でPBMCを収穫し、新しい50ミリリットル円錐形チューブでPBSの10ミリリットルで細胞を洗浄する。上清を吸引し、チューブをフリックしてペレットを緩めます。

別の遠心分離のために新鮮なPBSの10ミリリットルでPBMCsを再懸濁し、続いてカウントのための新鮮なPBSの5ミリリットルで再懸濁を行う。次いで、最終遠心分離で細胞を回収し、PBS濃度の1ミリリットル当たり8 PBMCsに10回10回でペレットを再懸濁する。マウスの目に孤立したヒトPBMCのレトロ軌道配信のために、100マイクロリットルの細胞を備えた28ゲージの針を装備した1ミリリットルの注射器を1つロードする。

つまみつまみへの反応の欠如を確認し、親指と中指でマウスを静かに拘束します。針ベベル側を下に、内側カンサスに内側に挿入し、眼の後部に達するまで結膜を通る。わずかに針を引っ込め、ゆっくりと細胞の全容を注入する。

その後、注射器と針の適切な処分のために針を完全に引き込みます。まぶたを閉じ、ガーゼスポンジで注射部位に軽い圧力をかける。次に、腫脹または他の目に見える外傷の注射部位を調べ、動物を自宅のケージに移動する前に、ペーパータオルと監視が並ぶ無菌ケージでマウスが意識を取り戻すことを可能にする。

GVHDスコアを測定するには、ケージを層流フードに入れ、ケージから食べ物と水を取り除きます。活性をスコア付けするには、マウスの挙動を5分間観察する。減量スコアを得るために、ガラスビーカーで各マウスの重量を量る。

マウスがビーカーに残っている間、動物の姿勢、毛皮の質感、肌の完全性を検査します。目的の組織を収穫した後、臓器から約3〜0.5ミリメートルの組織を切断し、バランスでサンプルを計量します。重み付けされた組織を無菌1.5ミリリットルチューブに移し、サンプルを液体窒素でスナップフリーズさせ、マイナス80°Cで一晩保存します。

翌朝、ゲノムDNA分離キットからの指示に従って、リシス前にサンプルを解凍する。デジタルポリメラーゼ連鎖反応またはPCRによるヒトT細胞定量のために、使用されているデジタルPCRマシン用のDNA結合色素のプロトコルに従ってデジタルPCR反応を調製し、ヒトCD3 εゲノムDNAに適切なプライマーを使用します。次に、適切な反応条件下でデジタルPCR反応を行う。

ヒトPBMCを受ける男女の8〜12週齢のNSGマウスを致死的に照射し、PBSのみで治療された陰性対照マウスと比較して、注射後10日目頃にGVHDの臨床徴候を示し始める。XenoGVHDマウスは、23.5日の生存期間の中央値を有する。デジタルPCRを用いて、ヒトPBMCを受けるマウスの肺および肝臓サンプルでCD3イプシロン陽性ヒトT細胞を検出することができる。

スコアリングが一貫して行われ、マウスを採点する研究者が治療に目をつぶることが重要です。この手順に従って、末梢サイトカイン発現解析のために安楽死マウスから血清を採取することができ、免疫細胞はフローサイトメトリーを介して分析するために脾臓から収集することができる。