癌細胞の移動は転移の開始に重要である。したがって、腫瘍細胞の細胞の動きや侵襲能の調査は大きな関心事である。この統合されたがん細胞の移動と浸潤を、単一のプラットフォーム上でリアルタイムで調査する統合された方法は、細胞の移動性と病理を研究するための容易に再現可能で時間効率の高いオプションを提供します。
この方法は、細胞外マトリックスを介して癌細胞浸潤に関する洞察を提供し、他の細胞タイプに適用することができる。最適なスクラッチ時間を達成するために、シード密度が最適化されていることを確認し、細胞単層が合流率100%に達した後、インキュベーション期間を延長しないでください。移行アッセイに最適なシードセル数を決定するには、細胞を密度の範囲内に 96 壁プレートに 3 倍に配置します。
プレートをライブ セル イメージャーに配置し、イメージャー ソフトウェアのタスク リストからスケジュール スキャンを選択します。引き出しの設定ペインで、プレートの位置を決定し、[容器を追加]をクリックしてプレートタイプを選択します。スキャンのセットアップ ペインで、実験版の設定に従ってスキャン パターンを選択または編集し、スキャンの種類を標準として設定します。
タイムラインを右クリックし、間隔の設定を選択します。次に、24時間ずつ[スキャンを追加]を2時間に設定し、[適用]をクリックします。24時間後、引き出しのセットアップを開いて実験プレートを選択し、容器を取り外します。
3 ~ 6 個の代表的なイメージを選択し、新しいイメージ コレクションに配置します。適切な処理定義を決定するには、セグメンテーション調整、クリーンアップ、およびフィルターを使用して適切な合流マスクを適用し、プレビュー電流 all'を使用してマスクの精度を表示します。移行アッセイの開始時期に応じて、6~18時間以内に、時間に対する約100%の合流に従って、分析ジョブを起動し、最適化された細胞密度を決定します。
次に、合流処理解析ツールを、時間に対して細胞増殖曲線を生成するために自動的に収集された高精細位位相コントラスト画像に適用する。アッセイを開始する前に、浸潤アッセイ用プレートを50マイクロリットルの細胞外マトリックスゲルでコーティングし、氷冷細胞培養培地で希釈し、1ミリリットル当たり100マイクログラムにします。次いで、細胞培養インキュベーターにプレートを一晩入れる。
翌日の午後、余分な培地を穏やかに吸引し、細胞を最適化された密度で、三重化して、細胞外マトリックスコーティングされたプレートの適切な井戸に、そして追加のコーティングされていない96ウェルプレートにプレートします。次いで、細胞培養インキュベーターにプレートを一晩入れる。翌朝、塗装されていない移動アッセイプレートをスクラッチツールのベースプレートホルダーに入れ、導くダボを使用してホルダーの上部を慎重にベースに置きます。
慎重にピンブロックを持ち上げて傷を作りながら、黒いレバーを押し、保持します。各井戸の傷は、顕微鏡の下だけでなく、肉眼で見える必要があります。次いで、プレートを予め温めた培養培地で1〜2回洗浄し、脱離した細胞または細胞シートを除去する。
侵略アッセイのために、ちょうど実証したようにコーティングされたプレートを傷つける。切り離された細胞とシートを取り除いた後、冷たい媒体を慎重に吸引する前に、冷たい4°Cでプレートを5分間平滑にするために冷やした冷たい箱を使用してください。次に、希釈した細胞外マトリックスゲル50マイクロリットルを適切なウェルに加え、プレートを細胞培養インキュベーターに30分間入れます。
気泡は細胞外マトリックスゲルを使用する場合によく見られますが、70%エタノールを吸引することで除去できます。次に、100マイクロリットルの新鮮な、暖かい媒体を、試験化合物の有無にかかわらず、移行または侵入アッセイプレートの適切なウェルに加え、ライブセルイメージングプラットフォームにプレートを配置します。スクラッチツールをクリーニングするには、上部のピンブロックを、5%の洗剤1個、洗剤2個、滅菌蒸留水2個、滅菌蒸留水、または70%エタノールを含む個々の45ミリリットルの洗浄ボートに入れ、スクラッチツールをベースプレートに戻して、ほこりのない環境に保管します。
創傷アッセイを撮像するために、プレートを5分間平衡させた後、画像ログ面として容器タイプを選択し、スキャンタイプを傷傷として設定する。実験プレートの設定に従ってスキャンパターンを選択または編集し、72時間、または示したように傷が治癒するまで、1〜2時間ごとに24時間の繰り返しスキャンをスケジュールします。すべての創傷が治癒したら、スキャンを停止し、創傷が行われた直後の画像を含む音の割合の範囲にまたがる3〜6つの代表的な画像を選択し、創傷を10%と50%で閉鎖する。
適切な処理定義を決定するには、適切な傷巻きマスクと合流マスクを例示に適用し、プレビュー電流を使用してマスクの精度を表示します。次に、分析ジョブを起動します。移動アッセイでは、創傷幅は創傷の横にある細胞シート間の平均距離である。
創傷合流は、傷ついた領域内の合流点である。理想的な初期創傷合流はゼロ%に近いはずです。相対的な創傷密度および創傷合流は、傷の傷領域を占める細胞の速度を示唆する。
これらのデータは、これらの代表的なセルラインの両方でほぼ重複しています。異なる細胞株は、非常に異なる創傷治癒能力を示し、細胞株間の異なる回遊能力を示す。例えば、ラメリポディアは、移行の開始時に移行前線でこの乳房腺癌細胞株において観察されるが、このムチン1産生乳癌細胞株は同時に細胞移動の兆候を示さなかった。
また、乳房腺癌線の相対創傷密度は50時間後に飽和したが、一方、ムチン1産生乳癌細胞株の相対創傷密度は経時変化しなかったのに対し、腺癌細胞の侵襲性の高い表現型および非侵襲性を強調する1産生乳癌細胞。腺癌細胞はまた、細胞外マトリックスゲルを介して侵入しながら異なる振る舞い、一流の突起を有する細長い形態を実証し、移行アッセイでは、移行前線のブレブを視覚化した。めっきする場合、播種する細胞が少なすぎると傷が正しく形成されず、播種された細胞が多すぎると過密状態になることを覚えておいてください。
この手順に従って、トラック治療を追加することができ、この方法をハイスループットトラックスクリーニングに適応させることができます。この方法により、研究者はこれらのアッセイを高スループットである単一のプラットフォームで実行することができ、研究者は実験エンドポイントではなくリアルタイムで細胞を監視することができます。スクラッチツールの殺菌に使用する消毒剤は危険である可能性があります。
関連する MSDS と施設の通常のトリガーラインに従って、ソリューションを収集して廃棄してください。
