プロトコルを使用しない場合、生細胞イメージングを利用して、ミオブラスト分化と筋繊維形成の動的過程、特に核ポジショニングを調べることができます。異種細胞核を有する筋芽細胞の生細胞イメージングは、生細胞における筋芽細胞分化と核の自動追跡の研究を可能にする。視覚的なデモンストレーションは、一次細胞分離とライブイメージングおよびイメージング解析を組み合わせる方法を理解するのに役立ちます。
フレデリカ・コロンボとの手順をデモンストレーション, ジョルガ・カレジカ, 私たちの研究室で博士課程の学生になります.脛骨ソレウス、伸張ジジットロンサス、胃頭筋、四頭筋、三頭筋を成虫マウスの両後肢から氷上のPBSのペトリ皿に収穫することから始めます。滅菌はさみとピンセットを使用して、各筋肉から腱と脂肪を慎重に取り除き、筋肉を空のペトリ皿に移します。
無菌湾曲したはさみを使用して、均一な塊が得られるまで筋肉を切断し、ミンチし、筋肉片を50ミリリットルのチューブに移します。その後、1分間に250回転で37°Cの水浴で30分のインキュベーションのために筋肉片に消化媒体の10ミリリットルを追加します。酵素消化の終わりに、ブロッキング培地の10ミリリットルで反応を停止する。
そして、遠心分離によってサンプルをスピンダウン。チューブを氷の上に置き、上澄み物を新しい50ミリリットルチューブに移します。再び上清を遠心分離します。
そして、ペレットをDMEMの1ミリメートルで再中断します。氷の上に10%の牛血清、またはFBSでそれを補う。ちょうど実証したように新鮮な消化培地の10ミリリットルで予約ペレットを消化し、氷の上で、予備細胞の懸濁液と消化されたペレットを組み合わせます。
引っ張られた細胞を70マイクロメートルのフィルターでひずみ、続いて40マイクロメートルのフィルターを続けます。そして、10%FBSを補った新鮮なDMEMの15ミリメートルで細胞を洗います。遠心分離の終了時に、ペレットを室温で3ミリリットルの赤血球リシスバッファーに再懸濁させる。
PBSの40ミリリットルと追加の遠心分離で5分後に溶精を停止します。ペレットを10%FBSで補ったDMEMの20ミリリットルで再懸濁し、コーティングされていないペトリ皿に細胞をプレプレートします。摂氏37度と5%の二酸化炭素で1時間後に上清を含む衛星細胞を収集する。
そして、実証したように細胞懸濁液をさらに2回プレプレートする。最後のめっきの後、遠心分離によって衛星細胞を収集し、新鮮な増殖培地の40ミリリットルにペレットを再中断する。2つのコラーゲンの間で細胞を分割し、150ミリリットルのペトリ皿を1皿当たり1ミリグラムのドキシサイクリンでコーティングし、H2BGFP発現を誘導した。
そして、細胞を2〜3日間培養インキュベーターに戻す。筋芽細胞が適切な実験密度に達したら、各皿の細胞を5ミリリットルのPBSで洗い、1皿あたり2ミリリットルのトリプシンを37°Cでプレート底から5分間取り除きます。光顕微鏡による剥離を確認し、DMEMの5ミリリットル+プレート当たり10%FBSで反応を停止します。
生細胞イメージングの場合、350マイクロリットルの分化培地でコーティングされた12のウェルプレートのウェルに20〜5番目の細胞を2回プレートし、2時間の間、ウェルあたり基膜マトリックスを補充する。細胞がプレートの底に付着したら、プレートを37°C、二酸化炭素インキュベーターを共焦点顕微鏡ステージに5%置き、20回乾燥した目的を使用して数百個の細胞を有する視野を得て、16時間毎に1フレームあたり1024 x 1024ピクセルの16ビット画像を取得します。獲得したポジションごとに、マルチフレームドットtifファイルを生成し、選択したフォルダに用意されているドットzipソフトウェアをダウンロードして解凍します。
セグメンテーション トラッキング フォルダの例を開き、[セグメンテーションドット M を実行] をクリックして、Matlab でコマンド ウィンドウを開きます。可変ファイル名トラックが tif ファイルの名前になるように、セグメント化ドット M スクリプトを変更し、パス入力トラックはドット tif が含まれるフォルダになります。[実行] をクリックしてスクリプトを実行します。
セグメンテーションの結果はファイルドットマットとして保存され、核のセグメンテーションは出力図で視覚化できます。トラックを生成するには、最初にダブルクリックすると、同じ作業フォルダ内のトラックドット M を生成します。次に、ファイル名を、セグメント化された核に適したドット Mat ファイルのファイル名を変更します。
[実行] をクリックしてスクリプトを実行します。トラッキングの結果は別のドットマットファイルとして保存され、生成されたトラックがプロットされます。トラックの品質を評価します。
まず、チェックトラッキングドットMをダブルクリックし、ファイル名を適切なドットtif名に変更します。次に、ファイル名トラックをクリックしてトラックのドットマットファイルを使用し、[実行]をクリックします。図ウィンドウで、下のスクロールバーを使用して核を選択します。
選択した核は赤で囲まれ、選択したセルの軌跡は上部スクロールバーを使用して時間に従うことができます。緑色の十字は検出された核を示す。増殖と分化は、Hoechstで培養された筋芽細胞において強く損なわれる。
ミオブラストはH2BGFPマウスから単離され、ドキシサイクリンまたは野生型で培養されたのと比較して、ミオシン重鎖は筋芽細胞と標識した。H2BGFPタンパク質を発現する原発性筋芽細胞を用いた生細胞イメージングは、分化中の核の追跡を可能にする。分化期間の初期および最終時点でのGFPチャンネルでの伝送の画像をマージし、ミオチューブの識別を可能にし、その結果、ミオチューブに統合されるか、またはミオチューブに融合しない核。
共焦点蛍光顕微鏡によるイメージング後、核は実証されているようにセグメント化することができ、流域変換は近くの物体を分離するために使用することができる。このアプローチでは、ほとんどの核が画像内で特定され、実証されているように核運動を追跡することができます。例えば、Hoechstで染色された細胞の軌道の全長がわずかに高くなるように見えます。
違いは重要ではありませんが。しかし、タイムラプス中の総変位の計算は、Hoechstで染色された細胞の総変位が染色されていない細胞の変位よりも有意に小さいことを明らかにする。予測通り、染色されていない細胞の年間総変動は、Hoechstで染色された細胞と比較して有意に小さい。
生物学的ステップの技術スキルを共焦点顕微鏡およびソフトウェア使用ステップと組み合わせる際に、特に実証されたプロトコルに従うことが重要です。目的の別の筋肉モデルにおける筋芽細胞分化と核ポジショニングを研究するために、単離された心芽細胞を蛍光核タンパク質で転写することが可能である。この技術は、筋肉分化中の細胞および核ダイナミクスを探求し、このプロセスの欠陥をさらに調査する道を開いた。
筋肉ジストロフィーなどの様々な病理学的条件下で.
