この方法は、ハプロタイプの多様性やこれが病気にどのように関連しているのかといったNK細胞受容体遺伝学に関する重要な質問に答えることができます。この方法の視覚的なデモンストレーションは、自動化プロセスやデータ分析を含む、研究室でプロトコルを設定するのに役立ちます。この技術の主な利点は、従来の方法とは異なり、定量的KIR自動タイピングの略であるqKATは高スループットであり、遺伝子コピー数を提供することです。
qKATは疾患関連に関する洞察を提供することができる。この技術の意味合いは、HIVやC型肝炎などのウイルス感染、癌、幹細胞移植、および妊娠障害の治療に有用であり得る。qKATは、集団遺伝学の研究や、KIRとHLA分子間の発現および機能的相互作用の探索にも適用できます。
qKATは、2つのKIR遺伝子と1つの参照遺伝子のエキソンを特異的に標的とする10の多重反応からなる。このプロトコルでは、特定のプライマーは、与えられた遺伝子の対立遺伝子を検出するように設計されており、PCRは短いアンプリコンで結果を得る。この後、デュアル標識された特異的加水分解プローブを使用して、リアルタイムでPCR増幅を監視します。
コピー数解析は、標的KIR遺伝子を基準遺伝子に対して相対的に定量することを用いた。qKAT は、ハイスループット技術として設計およびセットアップされています。したがって、各反応は1,000サンプルの下で行うことができます。
以下のステップは、各96ウェルDNAプレートの調製およびめっきに関与するステップを示す。まず、DNAを定量化した後、DNAを96ウェル深層プレートで希釈します。既知のコピー番号とテンプレート以外のコントロールを 1 つ含むコントロール サンプルを少なくとも 1 つ含めます。
プレートを450 gsで2分間遠心分離します。次に、各サンプルを4倍にして384ウェルqPCRプレートに分配します。この後、室温でクリーンな場所で24時間空気乾燥したDNA。
10個の384ウェルプレートに対して1つのqKAT反応を設定するには、まず、qPCRバッファー、プライマー、プローブアリコートを摂氏4度で解凍します。テキストプロトコルに従って氷の上にマスターミックスを準備します。次に、マルチチャンネルピペットを使用して、96ウェルのディープウェルプレートにマスターミックスを均等に分配します。
9.5マイクロリットルのマスターを乾燥したgDNAサンプルと共にプレートの各ウェルに混ぜます。この後、ホイルでプレートを密封し、すぐに摂氏4度で保存します。塗布マスターが複数の384ウェルDNAプレートに混入する場合は、液体ハンドリングシステムの針をきれいにするために短い水洗浄を行うことを忘れないでください。
450 gsのgDNAサンプルを用いてプレートを3分間遠心分離する。その後、プレートを摂氏4度でインキュベートし、DNAを再懸濁し、気泡を放散します。プレートを一晩インキュベートした後、遠心分離を繰り返して気泡を放散します。
次に、冷却された貯蔵ドックにプレートを置きます。qPCR マシンをマイクロプレートハンドラに接続します。次に、テキストプロトコルに従ってマイクロプレートハンドラをプログラムします。
実行が完了したら、ロボットにqPCRマシンからプレートを集め、廃棄ドックに入れさせます。増幅が完了したら、qPCR ソフトウェアを開きます。「ナビゲータ」タブで、プレートの保存された反応実験ファイルを開きます。
次に、[新しい解析の作成]ウィンドウを開き、2番目の微分最大値法に適切な設定を選択します。次に、[フィルターコーム]を選択し、STAT6 用に収集されたデータが選択されていることを確認します。適切な色補正を選択します。
[計算] をクリックし、[ファイルの保存] をクリックします。[ポイントのフィット]方法を使用してデータを解析するには、[新規解析を作成]ウィンドウを開き、[フィット点]方法に適切な設定を選択します。次に、STAT6 の正しいフィルターとカラー補正を選択します。
ノイズバンドを設定して、バックグラウンドノイズを除外します。その後、[解析]タブを開き、フィット点を 3 に設定し、[フィット点を表示]を選択します。変更を保存し、KIR 遺伝子のフィット点および 2nd 微分解析の適切な設定で手順を繰り返します。
qPCR ソフトウェアで「ナビゲーター」タブを開き、「結果バッチ・エクスポート」を選択します。次に、実験ファイルを含むフォルダを開き、ウィンドウの右側に転送します。[次へ] をクリックし、エクスポート ファイルの名前と場所を選択します。
その後、対象の解析タイプを選択し、[次へ]をクリックします。エクスポートプロセスを開始するには、[次へ] をクリックする前に、ファイルの名前、エクスポート フォルダ、および分析タイプが正しいことを確認してください。エクスポートの状態が [OK] に変わると、画面は自動的に次のステップに移動します。
選択したすべてのファイルが正常にエクスポートされたことを確認し、[完了] をクリックします。次に、テキストプロトコルのスクリプトを使用して、エクスポートされたプレートを個々の反応に分割し、コピー番号解析ソフトウェアで読み取り可能なソフトウェアにファイルを変換します。次に、コピー番号分析ソフトウェアを開き、[リアルタイム PCR 結果ファイルのインポート] を選択して、スクリプトで作成されたテキスト ファイルを読み込みます。
最後に、[分析]を選択し、[最も頻繁なサンプルコピー番号]を選択して分析を実行します。このプロトコルでは、半自動タイピング(qKAT)を使用して、数値型KIR遺伝子をコピーしました。KIR2DL4 のコピー番号が最も多かったのは 2 部でしたが、KIR3DS1 のコピー番号は最も多かったのがゼロでした。
この手順を試みる間、DNAが正確に定量化されていることを確認し、氷上のすべてのステップを実行し、試薬が光から覆われていることを確認することが非常に重要です。また、KIR遺伝子の既知のLD規則に準拠していないサンプルの生データを徹底的にチェックすることも重要です。この手順に従って、シーケンスのような他の方法は、追加の質問、例えば、融合遺伝子の存在、または新規対立遺伝子の同定に答えるために行うことができる。
この方法は、開発後、NK細胞生物学、疾患耐性、ヒト生殖におけるKIRの役割を探求する免疫遺伝学の研究者への道を開いた。
