המטרה הכוללת של שיטה זו היא ליצור מערכת ביטוי ממוקדת ספציפית לרקמות. בשיטה זו, הדגמנו את הדור של נהג שעתוק בינארי ספציפי עבור homolog FGF Drosophila שלנו, ללא ענף. ביטוי דינמי, spatiotemporal של ענף מווסת המוגנזה ענף של אפיתל דרכי הנשימה קנה הנשימה.
למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנה על הביטוי המרחבי והנדידה של תאים מייצרים ללא ענף, ניתן ליישם אותה בקלות על גנים ורקמות אחרים בדרוסופילה או באורגניזמים מודליים אחרים, כגון C.Elegans ו- zebrafish. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מייצרת מערכות ביטוי אמינות ביותר, ספציפיות לרקמות ולגנים, ופעילות אך ורק בתאים שבהם האלמנטים הרגולטוריים של הגן המוחלף מתפקדים. מערכות שעתוק בינארי הן כלים חיוניים לביטוי גנים ממוקד ומניפולציה.
מפעיל טרנס, כגון GAL4 או LexA, לידי ביטוי תחת שליטה של אלמנטים רגולטוריים cis של גן, כונן גן טרנס משפיע כי הוא ממוקם במורד הזרם של אתרי קשירה שעתוק ספציפיים, כמו UAS עבור GAL4 ו / או LexO עבור LexA. מתודולוגיה זו מחליפה את אקסון הקידוד הראשון של הגן ללא ענף בנהג התמלול. השיטה המבוססת על CRISPR Cas9 מציבה רצף מפעיל טרנס של LexA תחת הרגולציה הא אנדוגנית של הגן ללא ענף, וכתוצאה מכך, מקלה על ביטוי מפעיל טרנס אך ורק בדפוסים מרחביים ספציפיים ללא ענף.
התחל על-ידי בחירת שני אתרי יעד RNA מנחה המיועדים באופן ספציפי לשני קצוות של אזור העניין שנבחר. פתח את כלי העיצוב CRISPR לבחירה. כאן נעשה שימוש בממצא היעד האופטימלי של Fly CRISPR.
לחץ על בחר גנום'insert רצף של עניין, ובחר את ביאור הגנום Drosophila מלנוגסטר שהועלה לאחרונה, כרגע R מקף תחתון שש, בתפריט הנפתח. לאחר מכן, לחץ על בחר אורך מדריך'ו וקלט 20. בחרו 'כל יעדי CRISPR' ולחצו על 'חפש יעדי CRISPR'.
הערך את כל יעדי ה- RNA של מדריך המועמדים על-ידי הגדרת מקסימום עבור מחרוזות ו- NGG בלבד'עבור PAM. כדי ליצור וקטור ביטוי RNA קו מנחה טנדם, PCR הראשון להגביר קטע DNA כדי להציג שני רצפי רווח פרוטו לתוך עמוד שדרה וקטור ביטוי pCFD4 RNA. השתמשו בפריימר קדמי והפוך, כל אחד עם רצף מאריחים פרוטו, וחופפים לרצף הווקטורי pCFD4 ב-PCR באמצעות פולימראז בנאמנות גבוהה ודנ"א תבנית pCFD4.
כדי להכין pCFD4 לשיבוט, לעכל את הפלסמיד עם אנזים Bbs1. הגדר תגובה במאגר העיכול המתאים המכיל שניים עד חמישה מיקרוגרם של פלסמיד pCFD4 ומיקרוליטר אחד של אנזים Bbs1 ונפח סופי של 50 מיקרוליטר. מערבבים את תוכן התגובה על ידי ג'נטריפינג הקשה על הצינור ואיסוף כל טיפות מפוזרות מקיר הצינור לתחתית על ידי ספין קצר.
הדגירה את תערובת התגובה ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעתיים לאחר הפעלת מוצר PCR פלסמיד מתעכל על ג'ל אגרוז אחוז אחד. לטהר את 6.4 קילו-בסיס זוג פלסמיד ליניארי ו 600 זוג בסיס מוצר PCR באמצעות עמודות טיהור ג'ל סטנדרטי. הגדר את תגובת ההרכבה של הדנ"א לפי פרוטוקול היצרן.
עבור חיקוי גנומי של רצף GAL4 או LexA, תכנן תורם HDR דו-תקע המכיל את רצף מפעילי הטרנס, מוקף בשתי זרועות הומולוגיה. כדי למנוע פילוח מחדש של המדריך RNA אל לוקוס מהונדס, לעצב את התורם החלופי באופן כזה אתרי זיהוי RNA המדריך מופרעים על ידי רצף אקסוגני הציג. כמו כן, כדי למנוע שינוי הטוהר של אלמנטים רגולטוריים cis, תמיד לבחור את אתרי זיהוי RNA מדריך בתוך אזור exon קידוד.
כדי ליצור קלטת חלופית, תכנן את אסטרטגיית הרכבת הדנ"א כדי לאחד ארבעה מקטעים יחד. חמש זרועות ההומולוגיה העיקריות ושלוש הזרועות ההומולוגיות העיקריות, רצף הדנ"א הטרנסי האקסוגני האמצעי, ועצם השדרה של וקטור השיבוט ליניארי. PCR להגביר GAL4 או קלטת ביטוי LexA מווקטור מתאים PCR להגביר את זרועות הומולוגיה מן ה-DNA הגנומי שחולץ מ קו זבוב האב שנבחר להזרקה.
השתמש פולימראז נאמנות גבוהה בכל PCR כדי ליצור את שברי היעד. כדי להגדיר את תגובת ההרכבה של הדנ"א, ערבבו את וקטור השיבוט והשברים היעד ליניאריים שנוצרו על ידי שיבוט PCR עם Mastermix הרכבה DNA ונפח התגובה הסופי ל 20 microliters לפי הוראות היצרן. דגירה תערובת התגובה במשך שעה אחת ב 50 מעלות צלזיוס.
כאשר עוברי Nos-Cas9 הוזרקו בעבר הן עם המדריך RNA ביטוי פלסמיד ואת התורם החלופי, להתפתח למבוגרים, לחצות G0 זבובים בנפרד כדי לאזן את הזבובים שלך מ קו מתאים אלל ממוקד. הרדמה של צאצאי F1 מכל צלב G0 על כרית פחמן דו חמצני. בחר באופן אקראי 10 עד 20 זכרים תחת מיקרוסקופ סטריאו.
בנפרד לחצות כל זכר נבחר לנקבה מאזנת מ קו מתאים אלל ממוקד. כאשר הזחלים F2 בוקעים, לבחור את האב F1 מכל צלב. יש לחלץ דנ"א גנומי על ידי ריסוק כל זבוב למשך 10 עד 15 שניות עם קצה פיפטה, המכיל 50 מיקרוליטרים של חיץ מעך מבלי לחלק את המאגר.
לאחר מכן, מחלקים את החיץ הנותר לתוך הצינור ומערבבים היטב. דגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 20 עד 30 דקות. לאחר הדגירה, מניחים את הצינורות בבלוק חום של 95 מעלות צלזיוס למשך שעה עד שתי דקות כדי להשבית את החלבון K.לאחר סיבוב במשך חמש דקות ב 10, 000 פעמים G, לאחסן את ההכנה בארבע מעלות צלזיוס לניתוח PCR נוסף.
בצע מסכים מבוססי PCR תלת-שלביים באמצעות פריימרים קדימה אחד והפוך אחד כדי לסנן את קיומו של הכנסה או החלפה. בצע PCR באמצעות שני פריימרים קדימה והפוך שני פריימרים כדי לאמת את הכניסה או ההחלפה משלושת האזורים החדשים. בצע PCR באמצעות פריימרים M13F והפוך שלושה כדי לבדוק את הקצוות'HDR.
שמור את קווי הזבוב עם ה- 'HDR של הקצוות המאושרים ובסס מניות מאוזנות מדור ה- F2. החוצה לחצות את המאזן עף שוב כדי להסיר כל מוטציות לא מכוונות על כרומוזומים אחרים. ביטוי ללא ענף, או bnl, מוצג כאן באדום בדיסק כנף הזחלים instar השלישי, עם תאים מבטאים ללא נשימה הקולטן, מוצג בירוק, ב primordium sac האוויר גדל.
תאי הבעה ללא ענף מוצגים כאן בסניף החיבור הרוחבי TR5 ובענף הגב TR2. תאי קנה הנשימה חסרי הנשימה מוצגים כאן בירוק. תאים מבטאים חסרי נשימה מוצגים בירוק, מסמנים את קנה הנשימה העוברי המתפתח מהשלב 9 לשלב 14 ותאי ההבעה חסרי הענף מוצגים באדום.
תמונה זו מציגה ביטוי ללא ענף המושרה במקומות רקמות חוץ רחמיים בתנאים היפוקסיים, יחסית לשליטה. שיטה זו נועדה לשמור על כל התקנות המרחביות המקוריות של שעתוק גנים ללא ענף. לכן, היה חשוב להחליף רק את exon הקידוד הראשון של הגן עם רצף קידוד מפעיל טרנס LexA.
לאחר התפתחותה, כלים גנטיים חדשים אלה סללו את הדרך לחקור דפוסי ביטוי רקמה חדשניים של הגן ללא ענף. היא גם אפשרה ביטוי שגוי של גנים והפלה בלעדית בתאי הבעה ללא ענף ועזרה בניטור הגירה ליניארית ואינטראקציות איתות של התאים.
