英語の編集を博士サイモン バートレットを感謝いたします。この調査・ デ ・ セルバンテス協会からの補助金によってサポートされたサラッド カルロス III (ISCIII) (PI14/00526;PI17/01395;CP11/00145;CPII16/00022)、ミゲル サーブレット プログラム、フンダシオン Areces;共同フォンド エウロペオ ・ デ ・開発地域 (フェダー) から資金調達。CNIC は経済省、業界競争力 (MEIC) とプロの CNIC 財団によってサポートされて、セヴェーロ オチョア Center of Excellence (SEV-2015-0505) です。RTF は、フンダシオン Areces と CNIC、ISCIII、セルバンテス de BHF で VZG によって設立された危惧地方病院 12 デ Octubre (imas12) と JMG-G ISCIII ミゲル サーブレット プログラムと imas12。

実験手順は、フンダシオン セントロ ナシオナル デによって承認された研究 Cardiovasculares カルロス III (CNIC) とスペインやヨーロッパのガイドラインに従ってコムニダード Autónoma デマドリード。マウスは特定病原体無料 (SPF) 条件で飼育し、二酸化炭素 (CO2) 吸入による安楽死されました。
1 脛骨と大腿骨からマウス骨髄細胞の分離
注: C57BL/6 コンジェニック マウスひずみ差分白血球マーカー Ptprcは野生型 C57BL 系統 CD45.2 または Ly5.2 として知られている、 Ptprcbの対立遺伝子を運ぶに対し CD45.1 または Ly5.1、として一般に認識を運ぶ。CD45.1 および CD45.2 バリアントは、抗体を用いたフローサイトメトリーによる区別できます。CD45.1/CD45.2、CD45.2, CD45.1 マウスは、フローサイトメトリーによる細胞集団の追跡を許可する養子の転送のため、細胞ソースまたは宛先として使用できます。年齢を優先的に使用- と 12 週齢以下の性別をマッチさせたのオスかメスのマウス。
<ol><li>
大腿骨と脛骨の準備
	<ol>
<li>制度上のアニマル ・ ケア委員会で承認プロトコルを使用してマウスを安楽死させます。</li>
		<li>後肢を 70% エタノールで動物の表面を噴霧して消毒します。</li>
		<li>滅菌ハサミ、鉗子やメスを使用します。メス、皮膚のカットを行うし、後の四肢を覆う皮膚を含むマウスの遠位部から皮膚を削除します。下のふくらはぎの筋肉の周りの皮膚の皮をむくし、足から皮膚を完全に削除 (図 2 a、2 b)。</li>
		<li>メスを用いた大腿骨から大腿四頭筋を分離します。股関節は、大腿骨頭を壊すことがなく disarticulate します。メス (図 2、2 D) による脛骨から筋肉を削除します。脛骨骨端を壊すことがなく、大腿骨を分離します。</li>
		<li>10% 牛胎児血清 (FBS) と冷たい 1 x ロズウェル パーク記念研究所 (RPMI) 1640 中 1% ペニシリン/ストレプトマイシンを含むペトリ皿に骨をしてください。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
細胞分離 メモ: 汚染を避けるため無菌素材と文化フードの下では、これ以降の手順を行う必要があります。<ol>
<li>滅菌シャーレ、メス各骨の近位および遠位端を慎重にカットします。</li>
		<li>温かみのある完全 RPMI 培地 (RPMI + 10 %fbs、2 ミリメートルの EDTA、1% ペニシリン/ストレプトマイシン、20 mM HEPES、55 μ M 2-メルカプトエタノール、1 mM ピルビン酸ナトリウムと 2 mM L グルタミン) の 10 mL の容量で何度も骨をフラッシュします。1 mL の注射器に接続されている 25 G 針を使用して両端から骨をフラッシュします。</li>
		<li>70 μ m ナイロン web フィルターが装備 50 mL のコニカル チューブ、effluate に転送します。穏やかな攪拌ピペッティングして残骸と細胞集塊を慎重に外します。</li>
		<li>250 × g 10 分間室温 (RT) の細胞懸濁液を遠心します。</li>
		<li>1 mL の冷たい赤血球溶解バッファー (0.15 M NH4Cl + 1 mM KHCO3 + 0.1 ミリメートルの EDTA、0.4 μ m 滅菌、フィルター選択、4 ° C で保存、1 N の HCl で 7.2 調整 pH) で細胞ペレットを再懸濁します。揺れマニュアルと氷上で 5 分間維持します。</li>
		<li>不活性化し、赤い血セル換散バッファーを洗い流すコールド バッファー (リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) + 2 ミリメートルの EDTA + 2% ウシ血清アルブミン (BSA) x 1) 10 mL を追加します。</li>
		<li>4 ° C で 5 分間 250 x gで細胞懸濁液を遠心分離します。</li>
		<li>完全 RPMI 培地 25 mL、250 x gで 4 ° C で 5 分間遠心すると血球を洗浄します。</li>
		<li>完全 RPMI 培地 5 mL に細胞を再懸濁します。細胞懸濁液トリパン ブルーと 1:1 のミックス 50 μ L。顕微鏡下でカウント チャンバーで細胞の数を決定します。数式を使用してセル数を計算する: 細胞/ml = [(非染色細胞数/4) 2 x 10,000 x]12。 注: このメソッドの利回り 40 x 106 60 x 106骨骨髄細胞 12 週齢の c57bl/6 マウスに感染していない 8 あたり。</li>
		<li>4 ° C で 5 分間 250 x gで細胞懸濁液を遠心分離します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. DC 分化、成熟および抗原読み込み
<ol><li>
BM の細胞採取
	<ol>
<li>ウェルあたり 5 mL で通常、中の mL あたり 10 の6セルで 6 も超低付着表面板の完全な文化をシードします。分化したマクロファージは、培養皿にアタッチされます。12 h 後 6 ウェル プレート、付着のマクロファージで古い 6 ウェル プレートを破棄することをきれいにする、単球は主に培養上清を転送します。</li>
		<li>20 ng/mL 37 ° C、5% 二酸化炭素 (CO2) で遺伝子組換えマウス GM-CSF を商業的取得を含む完全 RPMI 培地の井戸あたり通常 5 mL の mL あたり 5 x 10 の5セルで非付着細胞の培養細胞の分化を促進して毎日を観察します。</li>
		<li>3 日ごと浮遊細胞スピンダウンし 5 mM PBS で EDTA と付着性のセルを収集し、スピン ・ ダウン。組み合わせるし、5 x 105セル/20 ng/mL rm-GM-CSF を含む新鮮な培地で mL で再懸濁します。</li>
		<li>8 日上記と付着性と戸建の細胞を収集し、非培養処理滅菌シャーレ、高 MHC-II を誘導するために 24 時間を 5 × 105セル/mL 中含む 20 ng/mL に GM-CSF と 20 ng/mL リポ多糖 (LPS) で再懸濁します、CD80 および CD86 の発現。</li>
		<li>2.2 の手順で示されているようにフローサイトメトリーによるチェック DC 分化。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
流れの Cytometry の分化と成熟分析。
	<ol>
<li>4 ° C で 5 分間 250 x gで細胞懸濁液を遠心分離します。この手順を 2 回繰り返します。</li>
		<li>マウス Fc 受容体拮抗薬 (抗マウス IgG CD16/CD322b抗体精製) 製造元の指示に従って 4 ° C で 15 分間で再懸濁細胞ペレットの孵化によってブロック Fc 受容体。</li>
		<li>4 ° C で 5 分間 250 x gで細胞懸濁液を遠心分離します。</li>
		<li>各プローブの 4 ° C で流れ cytometry バッファー (1 × PBS + 2 ミリメートルの EDTA + 2 %bsa) の 300 μ L で 250,000 の細胞を再懸濁します。</li>
		<li>96 ウェル プレートに 30 μ L/ウェルの細胞液を転送します。</li>
		<li>4 ° C で 5 分間 250 x gで細胞懸濁液を遠心分離します。</li>
		<li>上澄みを廃棄し、抗体を含む 30 μ L を追加各メーカーの指示を次もバッファー。4 ° C で 20 分のための抗体を持つ細胞をインキュベートします。 注: は、Dc、単球、マクロファージ、CD11b、CD64、CD115、CD11c、動的、CD80、CD86 通常マーカーを採用 (図 3)。</li>
		<li>250 x g 4 ° C で 5 分間のサンプルを遠心し、死んだ細胞 (propidium ヨウ化など, 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) またはアミン反応性色素を除外するマーカーを含む冷たい流れ cytometry バッファーの井戸あたり 200 μ L で再懸濁します) 製造元の推奨濃度13。</li>
		<li>0、3、6、9 の日に死んだ細胞を除く流動フローサイトメトリー解析を行うことで、流れの cytometry のチューブにサンプルを転送する細胞分化を監視します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
DC 抗原負荷。
	<ol>
<li>8 日に 250 x g 4 ° C で 5 分間のサンプルを遠心し、200 μ L 中でペレットを再懸濁します (RPMI + 10 %fbs 抗生物質なし)。この手順を 2 回繰り返します。</li>
		<li>10 μ G/ml OVAp (323-339; と Dc を孵化させなさいISQAVHAAHAEINEAGR) 1 x 107 1 mL 中の Dc あたり (RMPI + 1 %fbs) 37 ° C で少なくとも 30 分のプラスチック製のチューブで陰性対照条件として Dc の非 OVAp ロードを使用します。</li>
		<li>250 x g 4 ° C で 5 分間のサンプルを遠心し、200 μ L 完全 RPMI 培地でペレットを再懸濁します。この手順を 2 回繰り返します。</li>
		<li>250 x g 4 ° C で 5 分間のサンプルを遠心し、200 μ L 中でペレットを再懸濁します (RPMI + 10 %fbs) 2 x 106セル/mL で。</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. OTII マウスからナイーブ cd4 陽性 T 細胞の分離
注: このメソッドは、12 週齢の c57bl/6 マウスに感染していない 8 あたり約 100 × 106脾臓細胞を生成します。男性と女性の両方を使用できます。CD4 T 細胞は脾臓やリンパ節から分離することができます。CD4 T 細胞はそれぞれ約 25% とこれらの器官の細胞の 50% を占めています。無菌状態で次の手順を実行します。
<ol><li>鼠径部、腋窩、上腕、頚部、および腸間膜のリンパ節および脾臓 OTII トランスジェニック マウス (図 4) から分離し、プラスチック シャーレ完全 RPMI 培地 10 ml に転送。</li>
	<li>完全 RPMI 培地 2 mL でセル ストレーナーを洗浄、50 mL のチューブから取り外します。転送リンパ節および脾臓に 70 μ m の細胞ストレーナーは、50 mL のチューブに配置。シリンジのプランジャー (図 5) を使用して均質化し、媒体を追加 15 mL まで。</li>
	<li>250 x g 4 ° C で 5 分間のサンプルを遠心し、完全 RPMI 培地 15 mL にペレットを再懸濁します。この手順を 2 回繰り返します。</li>
	<li>脾臓細胞懸濁液、細胞ペレットを再懸濁します、1.2.5 の手順で示されているように、赤の血液細胞を溶解します。</li>
	<li>4 ° C で 5 分間 250 x gで細胞懸濁液を遠心分離します。</li>
	<li>完全 RPMI 培地 25 mL、250 x gで室温 5 分間遠心すると血球を洗浄します。</li>
	<li>5 mL の培地で細胞を再懸濁します。トリパン ブルーと 1:1 の細胞懸濁液を 50 μ l 添加をミックスします。顕微鏡下でカウント チャンバーを用いた細胞の数を決定します。数式を使用してセル数を計算する: 細胞/ml = [(非染色細胞数/4) 2 x 10,000 x]12。</li>
	<li>2.2.2 手順を繰り返します。</li>
	<li>製造元の指示に従って、1:800 CD8α、IgM、B220、CD19、MHCII (私 Ab)、CD11b、CD11c、CD44、CD25、DX5 CD4 T 細胞の後で否定的な選択のための氷の上で 30 分間ビオチン化抗体の希釈でセルをインキュベートします。</li>
	<li>製造元の指示に従って、セルの数と、ビーズの容量に基づいて、マイクロ磁気ビーズのストレプトアビジン コーティングの必要量を計算磁気セル区切り記号および適切な cd4 陽性 T 細胞を分離分離カラム。</li>
	<li>完全 RPMI 培地 5 mL に細胞を再懸濁します、3.7 の手順で説明されているように生きているセルをカウントしながら氷の上にそれらを保ちます。</li>
	<li>2 x 10 の5セルを抽出し、メーカー推奨の抗体希釈液を使用して流れの cytometer で蛍光抗体を使用して抗 CD8 B220、CD3、CD4 収集した細胞の純度を確認してください。</li>
	<li>分離ナイーブ CD4/OTII T 細胞を染色するには、500 μ L バッファー (1 × PBS + 2 ミリメートルの EDTA + 2 %bsa) の 10 の6セルを再懸濁します。500 を準備重要な細胞トレーサー染料の最終的なメーカー推奨濃度をダブル μ L バッファー (PBS、2 ミリメートルの EDTA + 2 %bsa × 1) を含みます。ゆっくりと細胞懸濁液に細胞トレーサーのソリューションを追加することによって、両方のソリューションをミックスします。37 ° C で 5 分間細胞をインキュベートします。</li>
	<li>完全 RPMI 培地 5 mL、250 x g で 4 ° C で 5 分間遠心するとセルを洗浄してこの手順を 2 回繰り返します。1 x 107セル/mL で完全 RPMI 培地 1 mL の細胞を再懸濁します。</li>
</ol>4.生体内で活性化、増殖と th1 細胞分化アッセイ
注: 重要な細胞トレーサー染料 carboxyfluorescein ジアセテート サクシニミジルエステル (CFSE) ・その他染色エステル ベースの染料、興奮している、異なる波長の蛍光を発する活躍してリンパ球増殖を評価する流れで高い蛍光強度、長寿命、変動の少ない、低毒性14などフローサイトメトリー。
<ol><li>本静脈内 (静注) 1 x 106ライブの重要な細胞トレーサー染料染色ナイーブ CD4/OTII T 細胞マウスあたり 100 μ L の PBS を転送します。尾静脈またはレトロ軌道注入15; によってラベル付けされた T 細胞、に対して転送できます。両方のケースでの家では、細胞、リンパ器官 (図 6 a)。</li>
	<li>受信者のマウス 1 日後によって挑戦に対して皮下注射 (点火) (図 6 b) で 100,000 LPS 成熟 OVAp ロード DCs を転送します。</li>
	<li>受信者マウス膝窩リンパ節の収穫、3.1 と 3.2 で前述したように同じ手順に従って単一細胞懸濁液の入手まで処理します。予防接種 2 日後 CD4/OTII T 細胞の活性化を測定して増殖と th1 細胞分化を測定する 5 日目には、これを行います。</li>
	<li>2 日目の T 細胞活性化を分析する CD69 CD4, CD25 蛍光抗体と細胞を染色 (必要に応じて CD45.1 および CD45.2) C69 の割合を決定して+CD25+ T 細胞の CD4 人口。フローサイトメトリー (図 7) を分析します。</li>
	<li>5 日目に T 細胞の増殖を確認するには、CD4 と必要に応じて CD45.1 および CD45.2 に対する適切な蛍光抗体を用いて細胞を染色します。フローサイトメトリー (図 8) による CD4 人口の重要な細胞トレーサー染料信号の減衰を分析します。これらの研究は、重要な細胞トレーサー染料、各蛍光ピークの分裂細胞の割合、総細胞の分裂細胞の割合で標識細胞が細胞分裂の数などのいくつかのパラメーターを確認できます。人口。</li>
	<li>/1 μ M イオノマイシンと 10 ng/mL 12 13 フォルボールエステル (PMA) のインキュベーター内の 37 ° C で 6 時間を含む完全 RPMI 培地を 200 μ l 添加の 96 ウェル プレートのウェル プレート 400,000 セル、5 日目で th1 細胞分化を決定します。最後の 4 h 3-10 μ G/ml ブレフェルジン A 媒体にサイトカイン分泌をブロックするを追加します。</li>
	<li>遠心分離機の 4 ° C で 250 x gで 5 分間プレート96 ウェル プレートの急速な反転で上澄みを廃棄します。</li>
	<li>2.2.2 手順を繰り返します。</li>
	<li>メーカー推奨希釈液に含まれている抗体 CD4、必要に応じて CD45.1 および CD45.2 をバッファー (1 × PBS + 2 ミリメートルの EDTA + 2 %bsa) の 30 μ L で 4 ° C で 15 分間インキュベートし、細胞膜を染色します。バッファー (1 × PBS + 2 ミリメートルの EDTA + 2 %bsa) の 150 μ L を追加することによって、細胞を洗浄し、遠心分離機の 4 ° C で 250 x gで 5 分間プレート上澄みを廃棄します。</li>
	<li>1,000 x gで 5 分間、4 ° C の板した遠心分離機で 20 分間 2 %paraformaldehyde/1% ショ糖の 100 μ L を追加することでセルを修復します。上清を捨てます。</li>
	<li>細胞内透過バッファー (1 × PBS + 0.01 M HEPES、0.3% サポニン 0.1 %bsa) の 50 μ L を追加することによって、セルを permeabilize し、4 ° C で 30 分間インキュベート</li>
	<li>破棄した上清に 1,000 x gで 150 μ L の PBS と 5 分間遠心を追加します。</li>
	<li>バッファー (PBS + 0.1% サポニン) で抗肝腎抗体蛍光体共役の 30 μ L を追加することによって細胞内サイトカインを汚し、室温 30 分間インキュベート</li>
	<li>バッファー (PBS + 0.1% サポニン) の 150 μ L を追加することによって、細胞を洗浄します。RT で 1,000 x gで 5 分間プレートを遠心し、上澄みを廃棄します。この手順を 2 回繰り返します。</li>
	<li>(図 8) フローサイトメトリーによる細胞集団を分析します。</li>
</ol>

<ol>
	<li>Zhu, J., Yamane, H., Paul, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+effector+CD4+T+cell+populations+(*).">Differentiation of effector CD4 T cell populations (*).</a> Annual Review of Immunology. 28, 445-489 (2010).</li><li>Bustos-Moran, E., Blas-Rus, N., Martin-Cofreces, N. B., Sanchez-Madrid, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Orchestrating+Lymphocyte+Polarity+in+Cognate+Immune+Cell-Cell+Interactions.">Orchestrating Lymphocyte Polarity in Cognate Immune Cell-Cell Interactions.</a> International Review of Cell and Molecular Biology. 327, 195-261 (2016).</li><li>Gonzalez-Granado, J. 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著者がある何も開示するには

このプロトコルは、BM から派生した Dc の活性化・増殖・ ナイーブ cd4 陽性 T 細胞の分化を調節する能力の評価を使用できます。また、BM から派生した Dc によって変調する CD4 T 細胞の感受性を評価するために使用もできます。このプロトコルで測定された生体内でこれらのイベントの変更ができます。
調査中の仮説によって T 細胞と DCs のいくつかの組み合わせを使用できます。たとえば、1 つはまたは特定の遺伝子や CD4 T 細胞の活性化や th1 細胞の分化、増殖、特定の刺激の効率をノックのノックの結果を分析できます。Dc や CD4 にこれらの手順を実行することができます細胞または両方のセルのタイプ。したがって、野生型や遺伝子組み換えマウスから cd4 陽性 T 細胞は、野生型マウスから派生した Dc と結合できます。
このプロトコルは、フローサイトメトリーと CD45.1 および CD45.2 に対する抗体を使用して異なるセル人口の起源を区別するために合わせることができます。確かに、CD45.1/CD45.1 と CD45.2/CD45.2 のマウスでは、任意の組み合わせで養子の転送の使用する携帯型のいずれかのソースまたは宛先として使用できます。たとえば、CD45.2/CD45.2 マウスは DC 世代の BM の起源をすることができますは、cd4 陽性 T 細胞を CD45.1/CD45.1/OTII マウスから入手できます。この実験では、両方の細胞の種類は、CD45.1/CD45.2 マウスに対して転送できます。さらに、CD45.1/CD45.1 から OTII/CD4 T 細胞はいずれかにマウスを入力し、CD45.2/CD45.2 型の 2 つのマウスの 1 つの種類の動作を比較し競争で 2 つの CD4 T 細胞集団を入力 CD45.1/CD45.2 タイプ 3 受信者の同じまたは異なる組み合わせと非競合条件、それぞれ。
このメソッドでは、DCs の GM-CSF BM 由来の生成について説明します。ただし、代替プロトコルは、利用可能な DC の成熟と分化たとえば、パパインは、LPS や GM-CSF、cd4 陽性 T 細胞免疫をアクティブに異なる表現型 Dc の容量の検討を許可するのではなく fms 関連チロシン キナーゼ 3 リガンド (Flt3-L) の代わりに使用できます。同じ目的で抗原の読み込みとプレゼンテーションの Dc をすることができます直接マウスから分離しました。組み合わせ他このプロトコルの9により世間知らずの操作 CD4/OTII T 細胞ウイルス感染16受信者マウスへの養子の移転前に。BM は、プロトコルでは、使用前に DCs の制御セル修正の効果を研究するレトロ ウイルス9も導入することができます。
さらに、このプロトコルは、蛍光タンパク質を発現細胞を用いた生体顕微鏡研究17の適応になります。たとえば、CD4/OTII マウスは GFP またはチェリー/OTII CD4 マウスを取得する GFP またはチェリー発現マウスと交配することができます。これらのマウスは CD4 T 細胞のソースとして使用することができますおよび生体内の実験、必要に応じてのチェリーまたは gfp 発現するマウスから骨髄由来 Dc と併用できます。

CD4 T 細胞と抗原提示細胞 (APCs) Dc などは、微生物病原体1,2に免疫の必要なメディエーターです。末梢のリンパ組織における CD4 T 細胞は Apc3,4,5によって提示された特定の抗原の認識に基づいてアクティブ化されます。活性化 cd4 陽性 T 細胞は、増殖し、正しい適応免疫応答6、7の開発に必要な個別の特定エフェクター Th 細胞に分化します。これらのプロセスの制御は、有害な組織損傷8を生成せず、病原体を殺す十分な適応性の防衛を生産するため重要です。Th 細胞は式または表面分子、転写因子やエフェクター サイトカインの生産によると定義され、病原体1への応答で不可欠な機能を実行します。Th1 細胞サブセットの細胞は、転写因子 t-bet とサイトカイン インターフェロン γ (肝腎) を表現、1細胞内の病原体に対する生体防御に参加します。ナイーブな cd4 陽性 T 細胞の活性化・増殖・ th1 細胞分化の定量化は、免疫応答における役割 T 細胞再生を評価するための有用な手段です。
このプロトコルによりin vivo解析で体外の容量には、活性化・増殖・ ナイーブ cd4 陽性 T 細胞の th1 細胞の分化を調節するための Dc の BM の派生が生成されます。プロトコルもナイーブ cd4 陽性 T 細胞活性化、増殖誘導の能力を評価して th1 細胞分化 (図 1)。この汎用性の高いプロトコルは、具体的操作またはプロトコル純粋な生体内での研究セル人口を選択できないことを回避できます。多様な分子と Dc の治療の影響は、治療または分離 BM セル9を遺伝子操作、遺伝子改変マウス5から BM を使用して学ぶことができます。同様に、養子の転送のための T 細胞の異なるソースからまたはいくつかの操作3,8,10後取得することによって T 細胞の反応を探索できます。
このプロトコルの主な利点は 2 つあります。T 細胞の活性化・増殖・ th1 細胞分化を流れの cytometry アプローチ; 分析します。これが生体内で研究、体外で発生する変更を回避したがってと細胞のタイプとだけそのまま臓器11に見られるその他の要因などを含むと組み合わされています。
重要な染料の使用は、放射能の使用を回避しながら増殖を追跡するため広く使用されている手法です。これらの試薬と拡散の測定は、細胞分裂後色素希釈法に基づいています。また、これらの染料は、複数の波長で検出することができます、複数の蛍光抗体またはマーカーと組み合わせてフローサイトメトリーによる分析が簡単に。Th1 細胞分化、増殖、活性化 T 細胞をフローサイトメトリーによる分析する方法を示すことによってこのプロトコルの有用性を強調表示します。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>VWR Chemicals</td>
			<td>20,824,365</td>
			<td>5 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools (F.S.T.)</td>
			<td>14001-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools (F.S.T.)</td>
			<td>11000-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools (F.S.T.)</td>
			<td>11253-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel</td>
			<td>Fine Science Tools (F.S.T.)</td>
			<td>10020-00</td>
			<td>Box of 100 blades</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>F7524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin</td>
			<td>LONZA</td>
			<td>DE17-602E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roswell Park Memorial Institute medium (RPMI)</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>21875-034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Petri dishes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25-gauge needle</td>
			<td>BD Microlance 3</td>
			<td>300600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 ml syringe</td>
			<td>Novico</td>
			<td>N15663</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml conical tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml conical tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#956;m nylon web filter</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Red blood lysis buffer</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>R7757</td>
			<td>100 Ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>ED2SS-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>A7906</td>
			<td>100 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>302643-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture-plates</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES)</td>
			<td>Cambrex</td>
			<td>BE17-737E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beta-mercaptoethanol</td>
			<td>Merck</td>
			<td>8-05740-0250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>LONZA</td>
			<td>BE13-115E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>LONZA</td>
			<td>BE17-605E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant murine Granulocyte Macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF)</td>
			<td>Prepotech</td>
			<td>315-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lipopolysaccharide (LPS)</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>L2018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well-plate</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3799</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>v450 anti-mouse CD11b antibody</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>560455</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE anti-mouse CD64 antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>139303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE anti-mouse CD115 antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>135505</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC anti-mouse CD11c antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>117305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC anti-mouse MHCII antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>125507</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC anti-mouse CD86 antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>105011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC anti-mouse CD80 antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>104713</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Cytometry tubes</td>
			<td>Zelian</td>
			<td>300800-1</td>
			<td>PS 12X75 5mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OTII Ovoalbumine peptide</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td>323-339</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse biotinylated CD8&#945; antibody</td>
			<td>Tonbo Biosciences</td>
			<td>30-0081-U500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse biotinylated IgM antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>406503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse biotinylated B220 antibody</td>
			<td>Tonbo Biosciences</td>
			<td>30-0452-U500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse biotinylated CD19 antibody</td>
			<td>Tonbo Biosciences</td>
			<td>30-0193-U500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse biotinylated MHCII (I-Ab) antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>115302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse biotinylated CD11b antibody</td>
			<td>Tonbo Biosciences</td>
			<td>30-0112-U500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse biotinylated CD11c antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>117303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse biotinylated CD44 antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>103003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse biotinylated CD25 antibody</td>
			<td>Tonbo Biosciences</td>
			<td>30-0251-U100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse biotinylated DX5 antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>108903</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>streptavidin-coated magnetic microbeads</td>
			<td>MACS Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-048-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic cell separator</td>
			<td>MACS Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-090-976</td>
			<td>QuadroMACS Separator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Separation columns</td>
			<td>MACS Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE anti-mouse CD4 antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>100408</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC anti-mouse CD3 antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>100235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC anti-mouse CD8 antibody</td>
			<td>Tonbo Biosciences</td>
			<td>35-0081-U025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Violet Tracer</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>C34557</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC anti-mouse CD25 antibody</td>
			<td>Tonbo Biosciences</td>
			<td>20-0251-U100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa647 anti-mouse CD69 antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>104518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerCPCY5.5 anti-mouse CD45.1 antibody</td>
			<td>Tonbo Biosciences</td>
			<td>65-0453</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC anti-mouse CD45.1 antibody</td>
			<td>Tonbo Biosciences</td>
			<td>20-0453</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PECY7 anti-mouse CD45.1 antibody</td>
			<td>Tonbo Biosciences</td>
			<td>60-0453</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC anti-mouse CD45.2 antibody</td>
			<td>Tonbo Biosciences</td>
			<td>35-0454</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ionomycin</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>I0634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phorbol 12 Myristate 13 Acetate (PMA)</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>P8139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brefeldin A (BD GolgiPlug)</td>
			<td>BD</td>
			<td>555029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>8-18715-02100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Intracellular permeabilization buffer</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>00-8333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC anti-mouse IFNg antibody</td>
			<td>Tonbo Biosciences</td>
			<td>20-7311-U100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fc-block (anti-mouse CD16/CD32)</td>
			<td>Tonbo Biosciences</td>
			<td>70-0161-U100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B6.SJL CD45.1 mice</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>002014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD LSRFortessa&#8482; Cell Analyzer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>649225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI Solution</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>62248</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an in vivo mouse model to measure na&#239;ve cd4 t cell activation, proliferation and th1 differentiation induced by bone marrow-derived dendritic cells

ナイーブな cd4 陽性 T 細胞の活性化・増殖・ T ヘルパー 1 への分化の定量化 (Th1) 細胞は免疫応答における T 細胞の役割を評価するために便利な方法です。このプロトコルでは、顆粒球マクロファージ コロニー刺激因子 (GM-CSF) の由来樹状細胞 (Dc) を取得する (BM) 骨髄前駆細胞の in vitro分化について説明します。プロトコルはまた卵白ペプチド (OVAp) の養子の転送を記述-GM 由来 CSF Dc とナイーブ cd4 陽性 T 細胞を生体内で活性化・増殖・ th1 細胞分化を解析するために OTII トランスジェニック マウスからロード、転送 CD4 T 細胞。このプロトコルは、純粋な生体内での方法の具体的操作または調査のセル人口を選択する無力によって課される制限を回避できます。さらに、このプロトコルは生体外で発生する可能性があります機能の要因など細胞の種類とそのまま臓器でのみ発見その他の要因の影響の変化を避けるため生体内の環境で研究をできます。Dc の変更を生成するための便利なツールであり、T 細胞をプロトコル適応免疫応答、潜在的起源や多数の免疫関連疾患の開発を理解するための重要な結果を提供することを変更します。

図 1は、このプロトコルで説明されている手順を示しています。図 2は、マウスの骨髄細胞の培養と分離を示しています。これらの文化に GM-CSF と LP の追加により、体外生成と dc図 3の成熟分化の流れのフローサイトメトリー解析と取得した dc OVAp ロード GM-CSF BM から派生した Dc の成熟を示しています分離された重要なトレース染色 CD4/OTII T 細胞に対してマウスに転送されます。図 4は、CD4/OTII T 細胞の分離に使用されるリンパ節の場所を示しています。50 mL チューブ 70 μ m ナイロン フィルターが装備とリンパ節および脾臓を均質化するために使用するシリンジのプランジャーを図 5に示します。図 6は、レトロな軌道神経叢に CD4/OTII T 細胞の注射液と足蹠に OVAp ロード GM-CSF BM から派生した Dc の皮下注射を示します。GM-CSF Dc 移行 GM-CSF Dc が OVAp のプレゼンテーションでナイーブ CD4/OTII T 細胞をアクティブに膝窩リンパ節に対し、CD4/OTII T 細胞は異なるリンパ器官に配布します。ナイーブ CD4/OTII T 細胞は増殖し、th1 細胞表現型の方を区別します。図 7は、素朴な膜 CD69 の分析から CD4/OTII T 細胞の活性化の定量化および CD25 式を示します。CD4/OTII T 細胞増殖の定量化を図 8に示します。図 9は、th1 細胞表現型に向かって CD4/OTII T 細胞分化の定量化を示しています。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58118/58118fig1.jpg"> 図 1: プロトコル スキーム。1) マウスの大腿骨および脛骨から BM 細胞を分離します。2) 文化 BM gm-csf GM-CSF BM を生成する細胞由来-DCs。 3) チェック DC 分化と成熟の GM-CSF BM 派生-Dc lps。4) DC の成熟を確認します。5) OVAp の Dc をロードします。6) CD4/OTII T 細胞フォーム マウス脾臓を分離します。7) 重要な細胞トレーサー染料と CD4/OTII T 細胞を染色します。8) 分離純度と重要な細胞トレーサー染料染色孤立 CD4/OTII T 細胞を確認します。9) に対して受信者マウスに孤立した CD4/OTII T 細胞の静脈を転送します。10). 本 Dc sc の OVAp ロードと成熟を受信者のマウスに転送します。11) CD4/OTII T 細胞の活性化を確認します。12) CD4/OTII T 細胞の増殖と分化を確認します。<a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/58118/58118fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58118/58118fig2.jpg"> 図 2: マウス大腿骨脛骨から骨髄分離プロセス。(A) 皮膚切開をハサミで。手足から皮膚の (B) の除去。(C) ハサミで切開を筋肉します。メスと下肢から筋肉の (D) の除去。<a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/58118/58118fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58118/58118fig3.jpg"> 図 3: GM-CSF BM から派生した Dc の成熟のフローサイトメトリー解析します。MHCII、CD80、CD86 LPS 活性化 (+ LP) の式を表面し、非活性化 (-LP) GM-CSF BM 派生 dc 番号は、任意の単位 (a.u.) で平均蛍光強度を表示します。<a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/58118/58118fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58118/58118fig4.jpg"> 図 4: 鼠径部、腋窩、上腕、頚部、および腸間膜リンパ節およびマウスの脾臓の位置。<a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/58118/58118fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58118/58118fig5.jpg"> 図 5: リンパ節および脾臓の均質化の実験設定します。<a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/58118/58118fig5large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58118/58118fig6.jpg"> 図 6: CD4/OTII T 細胞と OVAp ロードの GM の養子の転送-CSF BM-派生-DCs 。レトロ軌道神経叢に CD4/OTII T 細胞 (A) 静脈注射。(B) 足蹠に GM-CSF BM から派生した Dc の OVAp ロードの皮下注射。<a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/58118/58118fig6large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58118/58118fig7.jpg"> 図 7: T 細胞活性化に生体内の定量化します。流れの cytometry プロットと CD4 T 細胞の解析および CD69 の膜式の定量化を示すグラフ。CD45.1/CD45.2 マウスがマウス CD45.1/CD4/OTII と CD45.1/CD4/OTII 細胞 OVAp ロード GM-CSF BM のサウスカロライナ養子転送する前に 24 時間転送に対して静脈-派生-2 デイズのポスト-DC に dc T 細胞の活性化を測定したフローサイトメトリーによる転送示された抗原蛍光タグ抗体で染色。<a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/58118/58118fig7large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58118/58118fig8.jpg"> 図 8: T 細胞増殖の vivoの定量化します。流れの cytometry プロットと分析と増殖する cd4 陽性 T 細胞における染色減少重要な細胞トレーサー染料の定量化を示すグラフ。CD45.2 マウスがマウス CD45.1/CD4/OTII 細胞 OVAp ロード GM-CSF BM のサウスカロライナ養子転送する前に 24 時間転送に対して静脈-派生-5 日ポスト DC に dc T 細胞増殖を測定した染色後フローサイトメトリーによる転送、蛍光抗体を示されました。増殖細胞の割合、各部門ピークのセルの割合を測定することによって、または部門ピークのグラフに示すように、数を数えることによって、t 細胞の増殖を確認できます。<a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/58118/58118fig8large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58118/58118fig9.jpg"> 図 9: th1 細胞表現型体内に向かって T 細胞分化の定量化します。流れの cytometry プロットと分析と定量化肝腎表現する cd4 陽性 T 細胞の割合を示すグラフ。CD45.2 マウスがマウス CD45.1/CD4/OTII 細胞 OVAp ロード GM-CSF BM のサウスカロライナ養子転送する前に 24 時間転送に対して静脈-派生-デイズ ポスト DC に dc T 細胞分化を測定した染色後フローサイトメトリーによる転送、蛍光抗体を示されました。Th1 細胞表現型への t 細胞の分化は、パーセンテージ合計 CD4 T 細胞の CD4 T 細胞増殖のみから肝腎発現細胞として決定されました。<a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/58118/58118fig9large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。

Watch this Scientific Journal Video about An In Vivo Mouse Model to Measure NaÃƒÂ¯ve CD4 T Cell Activation, Proliferation and Th1 Differentiation Induced by Bone Marrow-derived Dendritic Cells at JoVE

An In Vivo Mouse Model to Measure Na&#239;ve CD4 T Cell Activation, Proliferation and Th1 Differentiation Induced by Bone Marrow-derived Dendritic Cells

今回ナイーブ cd4 陽性 T 細胞 (T 細胞) の活性化、増殖、GM-CSF 骨髄 (BM) による th1 細胞分化・生体内で定量のためのプロトコル-由来樹状細胞 (Dc)。さらに、このプロトコルでは、BM と T 細胞の分離、DC 世代と DC および T 細胞の養子移動について説明します。

メジャー ナイーブ cd4 陽性 T 細胞の活性化、増殖と骨髄由来樹状細胞による th1 細胞分化をIn Vivoマウス モデル

Quantification of na&#239;ve CD4 T cell activation, proliferation, and differentiation to T helper 1 (Th1) cells is a useful way to assess the role played ...

an-vivo-mouse-model-to-measure-nave-cd4-t-cell-activation

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

19.3K ビュー.  Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares Carlos III (CNIC). 今回ナイーブ cd4 陽性 T 細胞 (T 細胞) の活性化、増殖、GM-CSF 骨髄 (BM) による th1 細胞分化・生体内で定量のためのプロトコル-由来樹状細胞 (Dc)。さらに、このプロトコルでは、BM と T 細胞の分離、DC 世代と DC および T 細胞の養子移動について説明します。

ビデオ: An In Vivo Mouse Model to Measure Naïve CD4 T Cell Activation, Proliferation and Th1 Differentiation Induced by Bone Marrow-derived Dendritic Cells

Retroviral Transduction of T-cell Receptors in Mouse T-cells

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen presenting cells (APCs)1. This recognition leads to the activation of T-cells and a series of functional outcomes (e.g. cytokine production, killing of the target cells). Understanding the functional role of TCRs is critical to harness the power of the immune system to treat a variety of immunology related diseases (e.g. cancer or autoimmunity).
It is convenient to study TCRs in mouse models, which can be accomplished in several ways. Making TCR transgenic mouse models is costly and time-consuming and currently there are only a limited number of them available2-4. Alternatively, mice with antigen-specific T-cells can be generated by bone marrow chimera. This method also takes several weeks and requires expertise5. Retroviral transduction of TCRs into in vitro activated mouse T-cells is a quick and relatively easy method to obtain T-cells of desired peptide-MHC specificity. Antigen-specific T-cells can be generated in one week and used in any downstream applications. Studying transduced T-cells also has direct application to human immunotherapy, as adoptive transfer of human T-cells transduced with antigen-specific TCRs is an emerging strategy for cancer treatment6.
Here we present a protocol to retrovirally transduce TCRs into in vitro activated mouse T-cells. Both human and mouse TCR genes can be used. Retroviruses carrying specific TCR genes are generated and used to infect mouse T-cells activated with anti-CD3 and anti-CD28 antibodies. After in vitro expansion, transduced T-cells are analyzed by flow cytometry.

We present a protocol to produce antigen-specific mouse T-cells using retroviral transduction

マウスT細胞におけるT細胞受容体のレトロウイルス導入

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen ...

免疫・感染学

Generation and Labeling of Murine Bone Marrow-derived Dendritic Cells with Qdot Nanocrystals for Tracking Studies

Dendritic cells (DCs) are professional antigen presenting cells (APCs) found in peripheral tissues and in immunological organs such as thymus, bone marrow, spleen, lymph nodes and Peyer's patches 1-3. DCs present in peripheral tissues sample the organism for the presence of antigens, which they take up, process and present in their surface in the context of major histocompatibility molecules (MHC). Then, antigen-loaded DCs migrate to immunological organs where they present the processed antigen to T lymphocytes triggering specific immune responses. One way to evaluate the migratory capabilities of DCs is to label them with fluorescent dyes 4.
Herewith we demonstrate the use of Qdot fluorescent nanocrystals to label murine bone marrow-derived DC. The advantage of this labeling is that Qdot nanocrystals possess stable and long lasting fluorescence that make them ideal for detecting labeled cells in recovered tissues. To accomplish this, first cells will be recovered from murine bone marrows and cultured for 8 days in the presence of granulocyte macrophage-colony stimulating factor in order to induce DC differentiation. These cells will be then labeled with fluorescent Qdots by short in vitro incubation. Stained cells can be visualized with a fluorescent microscopy. Cells can be injected into experimental animals at this point or can be into mature cells upon in vitro incubation with inflammatory stimuli. In our hands, DC maturation did not determine loss of fluorescent signal nor does Qdot staining affect the biological properties of DCs. Upon injection, these cells can be identified in immune organs by fluorescent microscopy following typical dissection and fixation procedures.

Dendritic cells uptake antigens and migrate towards immune organs to present processed antigens to T cells. Qdot nanocrystal labeling provides a long-lasting and stable fluorescent signal. This allows tracking of dendritic cells to different organs by fluorescent microscopy.

追跡調査のためのQdot ®二ナノとマウス骨髄由来樹状細胞の世代とラベリング

Dendritic cells (DCs) are professional antigen presenting cells (APCs) found in peripheral tissues and in immunological organs such as thymus, bone ...

Adenoviral Transduction of Naive CD4 T Cells to Study Treg Differentiation

Regulatory T cells (Tregs) are essential to provide immune tolerance to self as well as to certain foreign antigens. Tregs can be generated from naive CD4 T cells in vitro with TCR- and co-stimulation in the presence of TGF&beta; and IL-2. This bears enormous potential for future therapies, however, the molecules and signaling pathways that control differentiation are largely unknown.
Primary T cells can be manipulated through ectopic gene expression, but common methods fail to target the most important naive state of the T cell prior to primary antigen recognition. Here, we provide a protocol to express ectopic genes in naive CD4 T cells in vitro before inducing Treg differentiation. It applies transduction with the replication-deficient adenovirus and explains its generation and production. The adenovirus can take up large inserts (up to 7 kb) and can be equipped with promoters to achieve high and transient overexpression in T cells. It effectively transduces naive mouse T cells if they express a transgenic Coxsackie adenovirus receptor (CAR). Importantly, after infection the T cells remain naive (CD44low, CD62Lhigh) and resting (CD25-, CD69-) and can be activated and differentiated into Tregs similar to non-infected cells. Thus, this method enables manipulation of CD4 T cell differentiation from its very beginning. It ensures that ectopic gene expression is already in place when early signaling events of the initial TCR stimulation induces cellular changes that eventually lead into Treg differentiation.

Adenoviral gene transfer into naive CD4 T cells with transgenic expression of the Coxsackie adenovirus receptor enables the molecular analysis of regulatory T cell differentiation in vitro.

ナイーブCD4のアデノウイルス形質導入Tregの分化を研究するためにT細胞

Regulatory T cells (Tregs) are essential to provide immune tolerance to self as well as to certain foreign antigens. Tregs can be generated from naive CD4 ...

Isolation and Th17 Differentiation of Na&iuml;ve CD4 T Lymphocytes

Th17 cells are a distinct subset of T cells that have been found to produce interleukin 17 (IL-17), and differ in function from the other T cell subsets including Th1, Th2, and regulatory T cells. Th17 cells have emerged as a central culprit in overzealous inflammatory immune responses associated with many autoimmune disorders. In this method we purify T lymphocytes from the spleen and lymph nodes of C57BL/6 mice, and stimulate purified CD4+ T cells under control and Th17-inducing environments. The Th17-inducing environment includes stimulation in the presence of anti-CD3 and anti-CD28 antibodies, IL-6, and TGF-&#946;. After incubation for at least 72 hours and for up to five days at 37 &#176;C, cells are subsequently analyzed for the capability to produce IL-17 through flow cytometry, qPCR, and ELISAs. Th17 differentiated CD4+CD25- T cells can be utilized to further elucidate the role that Th17 cells play in the onset and progression of autoimmunity and host defense. Moreover, Th17 differentiation of CD4+CD25- lymphocytes from distinct murine knockout/disease models can contribute to our understanding of cell fate plasticity.

Isolation and Th17 Differentiation of Na&#239;ve CD4 T Lymphocytes

With effector functions distinct from other T cell subsets, Th17 cells have been centrally implicated in inflammatory autoimmunity. This in vitro Th17 differentiation protocol provides a means to determine whether na&#239;ve CD4+ T lymphocytes can differentiate into Th17 cells, and to further examine their role in autoimmunity and host response.

離とナイーブCD4 Tリンパ球のTh17分化

Th17 cells are a distinct subset of T cells that have been found to produce interleukin 17 (IL-17), and differ in function from the other T cell subsets ...

Bone Marrow-derived Macrophage Production

Macrophages are critical components of the innate and adaptive immune responses, and they are the first line of defense against foreign invaders because of their powerful microbicidal activities. Macrophages are widely distributed throughout the body and are present in the lymphoid organs, liver, lungs, gastrointestinal tract, central nervous system, bone, and skin. Because of their repartition, they participate in a wide range of physiological and pathological processes. Macrophages are highly versatile cells that are able to recognize microenvironmental alterations and to maintain tissue homeostasis. Numerous pathogens have evolved mechanisms to use macrophages as Trojan horses to survive, replicate in, and infect both humans and animals and to propagate throughout the body. The recent explosion of interest in evolutionary, genetic, and biochemical aspects of host-pathogen interactions has renewed scientific attention regarding macrophages. Here, we describe a procedure to isolate and cultivate macrophages from murine bone marrow that will provide large numbers of macrophages for studying host-pathogen interactions as well as other processes.

Macrophages have long been recognized as a critical component of the innate and adaptive immune responses. The recent explosion of knowledge pertaining to evolutionary, genetic, and biochemical aspects of the interaction between macrophages and microbes has renewed scientific attention to macrophages. This article describes a method to differentiate macrophages from mouse bone marrow.

骨髄由来マクロファージの生産

Macrophages are critical components of the innate and adaptive immune responses, and they are the first line of defense against foreign invaders because ...

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

HIV-1 innate sensing requires direct contact of infected CD4+ T cells with plasmacytoid dendritic cells (pDCs). In order to study this process, the protocols described here use freshly isolated human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) or plasmacytoid dendritic cells (pDCs) to sense infections in either T cell line (MT4) or heterologous primary CD4+ T cells. In order to ensure proper sensing, it is essential that PBMC are isolated immediately after blood collection and that optimal percentage of infected T cells are used. Furthermore, multi-parametric flow cytometric staining can be used to confirm that PBMC samples contain the different cell lineages at physiological ratios. A number of controls can also be included to evaluate viability and functionality of pDCs. These include, the presence of specific surface markers, assessing cellular responses to known agonist of Toll-Like Receptors (TLR) pathways, and confirming a lack of spontaneous type-I interferon (IFN) production. In this system, freshly isolated PBMCs or pDCs are co-cultured with HIV-1 infected cells in 96 well plates for 18-22 hr. Supernatants from these co-cultures are then used to determine the levels of bioactive type-I IFNs by monitoring the activation of the ISGF3 pathway in HEK-Blue IFN-&#945;/&#946; cells. Prior and during co-culture conditions, target cells can be subjected to flow cytometric analysis to determine a number of parameters, including the percentage of infected cells, levels of specific surface markers, and differential killing of infected cells. Although, these protocols were initially developed to follow type-I IFN production, they could potentially be used to study other imuno-modulatory molecules released from pDCs and to gain further insight into the molecular mechanisms governing HIV-1 innate sensing.

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

Unlike cell-free HIV-1 particles, infected CD4+ T cells are effectively sensed by plasmacytoid dendritic cells (pDCs). This manuscript describes a method where peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) or isolated pDCs are co-cultured with HIV-1 infected T cells to evaluate innate sensing by pDCs as assessed by release of type-I IFN.

HIV-1感染CD4の生得センシングを評価<sup&gt; +</sup&gt;使用して形質細胞様樹状細胞によるT細胞<em&gt;エクスビボ</em&gt;共培養系。

HIV-1 innate sensing requires direct contact of infected CD4+ T cells with plasmacytoid dendritic cells (pDCs). In order to study this process, the ...

Isolation and Intravenous Injection of Murine Bone Marrow Derived Monocytes

As a subtype of leukocytes and progenitors of macrophages, monocytes are involved in many important processes of organisms and are often the subject of various fields in biomedical science. The method described below is a simple and effective way to isolate murine monocytes from heterogeneous bone marrow.
Bone marrow from the femur and tibia of Balb/c mice is harvested by flushing with phosphate buffered saline (PBS). Cell suspension is supplemented with macrophage-colony stimulating factor (M-CSF) and cultured on ultra-low attachment surfaces to avoid adhesion-triggered differentiation of monocytes. The properties and differentiation of monocytes are characterized at various intervals. Fluorescence activated cell sorting (FACS), with markers like CD11b, CD115, and F4/80, is used for phenotyping. At the end of cultivation, the suspension consists of 45%&#177; 12% monocytes. By removing adhesive macrophages, the purity can be raised up to 86%&#177; 6%. After the isolation, monocytes can be utilized in various ways, and one of the most effective and common methods for in vivo delivery is intravenous tail vein injection. 
This technique of isolation and application is important for mouse model studies, especially in the fields of inflammation or immunology. Monocytes can also be used therapeutically in mouse disease models.

Here we present a protocol that generates large amounts of murine monocytes from heterogeneous bone marrow for translational applications. In comparison to others, this new method helps reduce the number of sacrificed animals and lowers costs by avoiding expensive methods such as high gradient magnetic cell separation (MACS).

単離とマウス骨髄由来の単球の静脈注射

As a subtype of leukocytes and progenitors of macrophages, monocytes are involved in many important processes of organisms and are often the subject of ...

Mouse Na&#239;ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Antigen inexperienced (na&#239;ve) CD4+ T cells undergo expansion and differentiation to effector subsets at the time of T cell receptor (TCR) recognition of cognate antigen presented on MHC class II. The cytokine signals present in the environment at the time of TCR activation are a major factor in determining the effector fate of a na&#239;ve CD4+ T cell. Although the cytokine environment during na&#239;ve T cell activation may be complex and involve both redundant and opposing signals in vivo, the addition of various cytokine combinations during naive CD4+ T cell activation in vitro can readily promote the establishment of effector T helper lineages with hallmark cytokine and transcription factor expression. Such differentiation experiments are commonly used as a first step for the evaluation of targets believed to promote or inhibit the development of certain CD4+ T helper subsets. The addition of mediators, such as signaling agonists, antagonists, or other cytokines, during the differentiation process can also be used to study the influence of a particular target on T cell differentiation. Here, we describe a basic protocol for the isolation of na&#239;ve T cells from mouse and the subsequent steps necessary for polarizing na&#239;ve cells to various T helper effector lineages in vitro.

Mouse Na&#239;ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Na&#239;ve CD4+ T cells polarize to various subsets depending on the environment at the time of activation. The differentiation of na&#239;ve CD4+ T cells to various effector subsets can be achieved in vitro through the addition of T cell receptor stimuli and specific cytokine signals.

マウスナイーブCD4<sup&gt; +</sup&gt; T細胞の単離と<em&gt;インビトロ</em&gt; T細胞サブセットへの分化

Antigen inexperienced (na&#239;ve) CD4+ T cells undergo expansion and differentiation to effector subsets at the time of T cell receptor (TCR) recognition ...

T Cells Capture Bacteria by Transinfection from Dendritic Cells

Recently, we have shown, contrary to what is described, that CD4+ T cells, the paradigm of adaptive immune cells, capture bacteria from infected dendritic cells (DCs) by a process called transinfection. Here, we describe the analysis of the transinfection process, which occurs during the course of antigen presentation. This process was unveiled by using CD4+ T cells from transgenic OTII mice, which bear a T cell receptor (TCR) specific for a peptide of ovoalbumin (OVAp), which therefore can form stable immune complexes with infected dendritic cells loaded with this specific OVAp. The dynamics of green fluorescent protein (GFP)-expressing bacteria during DC-T cell transmission can be monitored by live-cell imaging and the quantification of bacterial transinfection can be performed by flow cytometry. In addition, transinfection can be quantified by a more sensitive method based in the use of gentamicin, a non-permeable aminoglycoside antibiotic killing extracellular bacteria but not intracellular ones. This classical method has been used previously in microbiology to study the efficiency of bacterial infections. We hereby explain the protocol of the complete process, from the isolation of the primary cells to the quantification of transinfection.

Here a protocol is presented to measure bacterial capture by CD4+ T cells which occurs during antigen presentation via transinfection from pre-infected dendritic cells (DC). We show how to perform the necessary steps: isolation of primary cells, infection of DC, DC/T cell conjugate formation, and measurement of bacterial T cell transfection.

T細胞は、樹状細胞からTransinfectionによって細菌をキャプチャ

Recently, we have shown, contrary to what is described, that CD4+ T cells, the paradigm of adaptive immune cells, capture bacteria from infected dendritic ...

Isolation and Ex Vivo Culture of V&#948;1+CD4+&#947;&#948; T Cells, an Extrathymic &#945;&#946;T-cell Progenitor

The thymus, the primary organ for the generation of &#945;&#946; T cells and backbone of the adaptive immune system in vertebrates, has long been considered as the only source of &#945;&#946;T cells. Yet, thymic involution begins early in life leading to a drastically reduced output of na&#239;ve &#945;&#946;T cells into the periphery. Nevertheless, even centenarians can build immunity against newly acquired pathogens. Recent research suggests extrathymic &#945;&#946;T cell development, however our understanding of pathways that may compensate for thymic loss of function are still rudimental. &#947;&#948; T cells are innate lymphocytes that constitute the main T-cell subset in the tissues. We recently ascribed a so far unappreciated outstanding function to a &#947;&#948; T cell subset by showing that the scarce entity of CD4+ V&#948;1+&#947;&#948; T cells can transdifferentiate into &#945;&#946;T cells in inflammatory conditions. Here, we provide the protocol for the isolation of this progenitor from peripheral blood and its subsequent cultivation. V&#948;1 cells are positively enriched from PBMCs of healthy human donors using magnetic beads, followed by a second step wherein we target the scarce fraction of CD4+ cells with a further magnetic labeling technique. The magnetic force of the second labeling exceeds the one of the first magnetic label, and thus allows the efficient, quantitative and specific positive isolation of the population of interest. We then introduce the technique and culture condition required for cloning and efficiently expanding the cells and for identification of the generated clones by FACS analysis. Thus, we provide a detailed protocol for the purification, culture and ex vivo expansion of CD4+ V&#948;1+&#947;&#948; T cells. This knowledge is prerequisite for studies that relate to this &#945;&#946;T cell progenitor`s biology and for those who aim to identify the molecular triggers that are involved in its transdifferentiation.

Isolation and Ex Vivo Culture of V&#948;1+CD4+&#947;&#948; T Cells, an Extrathymic &#945;&#946;T-cell Progenitor

Here, we provide an optimized protocol for the isolation and cloning of the scarce T-cell entity of peripheral V&#948;1+CD4+ T cells that is, as we showed recently, an extrathymic &#945;&#946; T-cell progenitor. This technique allows to quantitatively isolate, clone and efficiently expand these cells in ex vivo culture.

メジャー ナイーブ cd4 陽性 T 細胞の活性化、増殖と骨髄由来樹状細胞による th1 細胞分化をIn Vivoマウス モデル

メジャーナイーブ cd4 陽性 T 細胞の活性化、増殖と骨髄由来樹状細胞による th1 細胞分化をIn Vivoマウスモデル