この作品は、主任科学者のオフィス (TCS/16/37) と MRC 博士奨学金からの賞でサポートされていました。

1. ひと多能性幹細胞 (hPSCs) に 96 もプレートの肝細胞分化の播種
注: 試薬、このプロトコルで使用する機器は、表 1に記載されています。この実験で使用されるメディアは、生殖不能および細胞培養のため室温でにある必要があります。特に指定しない限り、プロトコルのこの部分に記載されているすべての試薬/ソリューション ボリュームは 96 ウェル プレートの単一の井戸に基づいています。
<ol><li>
準備ラミニン コート 96 ウェル プレート。
	<ol>
<li>組換えラミニン 521 (100 μ g/mL) のバイアルを解凍 (LN 521) 一夜に 4 ° C で 2 時間</li>
		<li>5 μ g/mL の溶液を準備するには、冷たい 1 ダルベッコ リン酸緩衝生理食塩水 (DPBS) (Ca2 +/Mg で2 +) x LN 521 を希釈します。</li>
		<li>調剤カセット標準チューブでディスペンサーを扱う自動液体を使用すると、50 μ L/ウェルの 96 ウェル プレート LN 521 ソリューションを追加できます。 注: すべてのボリューム分配が特に指定しない限り、カセットを調剤標準管自動液体ハンドリング ディスペンサーと実行されます。プライム ソリューション、カセットの調剤の終わりに到達するまでは、調剤に進みます。複数の 96 ウェル プレートは、回数に応じて手順を繰り返して、同じ実験で用意できます。</li>
		<li>37 °C/5% CO2 2 に 4 h で LN521 コーティング版を孵化させなさい。 注: LN521 コーティング プレートに格納できる 4 ° C で 2 週間蒸発し、汚染を避けるために平らな面にシール プレートを維持します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>1 時間に 30 分の 37 ° C でプレコート板の必要な数を暖かい。</li>
	<li>8 ch 吸引アダプターを使用して塗装面の残りの LN 521 溶液を吸引します。 注: コーティングの劣化を避けるために表面との接触を避けるために重要です。</li>
	<li>すぐに 10 μ M (ロック) Rho 関連キナーゼ阻害剤 Y27632 mTeSR1 培のウェルあたり 50 μ L を追加し、細胞 37 °C/5% CO2播種までインキュベーターでプレートを保ちます。 注: は、乾燥するラミニン コート井戸は認めません。</li>
	<li>
3 x 105セル/10 μ M ROCK 阻害剤 Y27632 mTeSR1 培 mL の細胞懸濁液を準備します。 注: 各セルライン播種密度の最適化が必要になります。<ol>
<li>培地を吸引 hPSCs で約 75% から 85% の未分化文化シャーレから LN 521 で培養の confluency 前述12。 注: hPSCs が上で培養した LN 521 mTSER1 のすべての 24 h を変更し、セル前述12として密度の 80% に到達後、定期的に継代培地で。</li>
		<li>洗浄室内温度 1 の 5 mL のセル (せずに Ca2 +/Mg2 +) x DPBS と吸引バッファー。</li>
		<li>セルに優しく細胞解離試薬 × 1 の 5 mL を追加し、, 細胞解離の 6 ~ 8 分くらいの 37 ° C で。 注: 反作用を停止し、するには、顕微鏡下でマトリックスから細胞の剥離を調べます。セルは、プレートから部分的に切断する必要があります。ない場合は、余分な 1 を 2 分間インキュベーションを拡張します。</li>
		<li>穏やかな細胞解離試薬の吸引によって、反応を終了し、10 μ M ROCK 阻害剤 Y27632 細胞に新鮮な mTeSR1 培の 5 mL を追加します。細胞スクレーパーを使用して、マトリックスとピペットをミックスする数回 P1000 ヒントを使用して上下から細胞を持ち上げます。</li>
		<li>トリパン ブルー染色除外法に基づく検定を使用して実行可能なセルをカウントし、必要な濃度と細胞懸濁液を準備します。</li>
		<li>滅菌 15 mL や 50 mL の遠心管に必要な細胞数をピペット又それらを室温で 5 分間 115 x gで遠心分離によって細胞をスピンダウンします。 注: 1 つの 96 ウェル プレート、mTeSR1 培 3 × 105セル/mL の 5 mL は H9 セル行必要です。</li>
		<li>上清を吸引し、10 μ M ROCK 阻害剤 Y27632 mTeSR1 培の 37 ° C で同種のソリューションが得られるまで優しく細胞ペレットを再懸濁します。 注: セル生存ポスト再めっきを改善しながら、ROCK 阻害剤の使用はお勧めします。</li>
	</ol>
</li>
	<li>10 μ M ROCK 阻害剤 Y27632 と mTeSR1 の 50 μ L を含む 96 well プレートに細胞懸濁液の 50 μ L を追加します。</li>
	<li>播種後、プレートを 37 °C/5% CO2を付けるセルを許可するように 24 時間で細胞インキュベータに戻ります。</li>
	<li>次の日細胞を調べるし、細胞に細胞の接触が確立されたら、ROCK 阻害剤を撤回します。40% の confluency で分化培地 (図 1 b) に切り替えます。 注: セル密度が 40% 以上の場合、プレートは、H9 セルラインで足 HLC の差別化のため適していません。</li>
</ol>2. 96 プレートで組換え Laminins の肝細胞様細胞に hPSCs を区別します。
<ol><li>
中小企業の成長要因の分化を準備します。
	<ol>
<li>滅菌 0.2% ウシ血清アルブミン (BSA) の PBS で人間のアクチビン A 粉末を溶解することにより、人間のアクチビン A 原液 (100 μ g/mL) を準備します。在庫の約数と-20 ° C にてストア1:1, 000 で使用します。</li>
		<li>0.2 %bsa を無菌のマウス Wnt3a 粉末を溶解することによりマウス Wnt3a 原液 (10 μ G/ml) を準備します。在庫の約数と-20 ° C にてストア1: 200 で使用します。</li>
		<li>滅菌 0.2 %bsa で人間 HGF の粉末を溶解することにより、ひと肝細胞増殖因子 (HGF) 原液 (10 μ G/ml) を準備します。在庫の約数と-20 ° C にてストア1: 1000 で使用します。</li>
		<li>オンコスタチン M (OSM) 原液 (20 μ g/mL) を準備するには、滅菌の 0.2 %bsa の粉末を溶解します。在庫の約数と-20 ° C にてストア1:1, 000 で使用します。</li>
		<li>決定的な内胚葉: 2 %b27 サプリメント (50 x、インスリンがなければ)、1% ペニシリン/ストレプトマイシンから成る、内胚葉分化培地を準備 (最終濃度: 100 IU/mL と 100 μ g/mL、それぞれ) ロズウェル パーク記念研究所 1640 (追加RPMI 1640) 基礎培地。4 ° C で保存し、2 週間以内に使用します。それぞれの媒体の変更で必要なボリュームやで補うアクチビン A Wnt3a 100 ng/mL と 50 ng/mL、最終濃度でそれぞれ。</li>
		<li>Hepatoblast 分化: 20% ノックアウト血清交換 (KSR) 0.5% 1%、1% DMSO 0.1 mM β-メルカプトエタノール 1% 非必須アミノ酸 (NEAA) L-グルタミンの代替補完から成る、hepatoblast 分化培地の準備ペニシリン/ストレプトマイシン (最終濃度 100 IU/mL と 100 μ g/mL、それぞれ) ノックアウト DMEM (KO DMEM) に追加されます。真空下でフィルターし、4 ° C で保存2 週間以内に使用します。</li>
		<li>肝細胞の分化: 肝細胞分化培地、L-グルタミン、10 μ M ヒドロコルチゾン 21 hemisuccinate ナトリウム塩 (HCC) 1% ペニシリン/ストレプトマイシンに代わる補足 1% から成るを準備 (最終濃度 100 IU/mL と100 μ g/mL、それぞれ) HepatoZYME 培地に添加します。4 ° C で、在庫を保管し、2 週間以内使用します。HGF と OSM 必要なボリュームを補う、それぞれの媒体の変更について (最終濃度 10 ng/mL で 20 ng/mL、それぞれ)。</li>
	</ol>
</li>
	<li>播種、24 h の記事は慎重にハンドヘルド電子チャネルの自動ピペット システムを使用してメディアを取り出して、100 ng/mL アクチビン A と 50 ng/mL Wnt3a と新鮮な内胚葉プライミング培の 100 μ L を追加します。 注: 分化過程開始決定的な内胚葉媒体が追加されます。細胞の播種を最適化すると、細胞の分化は通常 24 h 内で開始されます。すべての媒体の変更はハンドヘルド電子チャネルの自動ピペット システムとメディアを削除して、標準で自動液体ハンドリング ディスペンサーを使用して新鮮な媒体の 100 μ L を分注した調剤カセットをチューブは、しない限り、それ以外の場合指定します。ハンドヘルド電子チャネルの自動ピペット システムは、300 μ L のヒントを使用して、よく頭 96 で使用されました。簡単に言えば、90 μ L もの細胞が付いている接触を避けるから吸気された、細胞のストレスを軽減する中型の変更時にセルを乾燥しないことが重要です。</li>
	<li>ヒト胚性幹細胞 (hESCs)、三日間内胚葉分化培地毎日を変更します。ひと誘導多能性幹細胞 (hiPSCs) の分化を実行すると、2 の余分な日だけアクチビン A を使用して決定的な内胚葉ステージを拡張します。</li>
	<li>決定的な内胚葉誘導後、hepatoblast 仕様 KSR/DMSO 中に切り替えて、5 日間ごとに 2 日間媒体を変更します。 注: 非添付も細胞数が存在する場合は、次の媒体の変更の前に 1 回血球を洗浄する以外の添加 KO DMEM を使用します。プロトコル (5 日) の第二期の期間のため、hepatoblast 仕様の最後の日の最後の 1 と 3 の中変更があります。</li>
	<li>次の hepatoblast 分化肝細胞成熟の HepatoZYME 中に切り替えます。KSR/DMSO 中を削除した後の補足なし HepatoZYME で血球を洗浄し、10 ng/mL HGF と 20 ng/mL OSM HepatoZYME 成熟培の 100 μ L を追加します。</li>
	<li>7 ~ 10 日間、媒体ごとの 48 h を変更します。日 18、分化、遺伝子発現と CYP P450 代謝活性を分析することによって HLCs を特徴付けます。</li>
</ol>3. 肝細胞様の細胞組換え Laminins の区別
<ol><li>肝細胞特異的マーカーと免疫染色を用いた偏波マーカーの発現を検出します。</li>
	<li>12前に説明したように CYP P450 の試金を使用して肝細胞の代謝機能をテストします。</li>
	<li>プレートごとウェルあたりの細胞の総数を数えるプレート バリエーションを決定します。</li>
</ol>4. 高スループット免疫細胞化学、画像集録
<ol><li>分化の 18 日に 1 x DPBS と 3 回洗浄、4% パラホルムアルデヒド (PFA) の 50 μ L 分注によって、HLCs を修正し、15 〜 30 分間室温でインキュベートします。固定、3 回で洗い流して PBST (0.1% トゥイーン) (Ca2 +/Mg2 +) を使用せずに自動皿洗浄機。 注: このセクションですべての洗浄は、特に指定しない限り、自動皿洗浄機を使用して実行します。すべての洗浄は、同じプロトコルに従って行われます。</li>
	<li>(せずに Ca2 +/Mg2 +) PBST の 100 μ L 分注で膜を permeabilize、室温で 20 分間インキュベートします。次に、pbst; 10 %bsa の 100 μ L 分注による蛋白質のブロックを実行し、プレート シェーカーを使用して穏やかな揺れで 1 時間インキュベートします。タンパク質をブロック後、1 %bsa の 50 μ L を加えて pbst; 一次抗体を含む、プレート シェーカーを使用して穏やかな揺れで一晩, 4 ° C で。 注意: 蛋白質のブロックと抗体の添加の間洗わないでください。</li>
	<li>24 h 後 (せずに Ca2 +/Mg2 +) 1 x DPBS にて 3 回洗浄し、pbst; で 1 %bsa の 50 μ L 分注による二次抗体を追加します。暗闇の中で室温で 1 時間インキュベートします。</li>
	<li>二次抗体の孵化後 1 x DPBS で 3 回を洗ってください。DAPI の DPBS の 50 μ L を追加 (10 μ G/ml) と暗闇の中で部屋の温度で 5-10 分間インキュベートします。</li>
	<li>最後に、DPBS 3 回洗うし、井戸の 1 x DPBS の 100 μ L を残します。プレートは、イメージングのため準備ができています。 注: プレートは、イメージングまで暗闇の中で 4 の ° C で保存する必要があります。</li>
	<li>高コンテンツ イメージング システムを使用してプレートをイメージし、井戸の良い表現を取得するだけにいくつかのフィールドを取得します。コロンバス ソフトウェア (高コンテンツ イメージング解析システム ソフトウェア) を使用して、HLCs の別のマーカーの発現を定量化します。 注: コロンバスは、細胞表現型解析のためのセル分割分析を提供しています高いコンテンツ解析ソフトウェアです。同様の結果は、CellProfiler、生物画像22の定量分析のためのオープン ソース ソフトウェアを使用して実現できます。</li>
</ol>

<ol>
	<li>Forbes, S. J., Gupta, S., Dhawan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+therapy+for+liver+disease:+From+liver+transplantation+to+cell+factory.">Cell therapy for liver disease: From liver transplantation to cell factory.</a> J Hepatol. 62 (1, Supplement), S157-S169 (2015).</li><li>Avior, Y., Sagi, I., Benvenisty, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pluripotent+stem+cells+in+disease+modelling+and+drug+discovery.">Pluripotent stem cells in disease modelling and drug discovery.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 17 (3), 170-182 (2016).</li><li>Szkolnicka, D., Lucendo-Villarin, B., Moore, J. K., Simpson, K. J., Forbes, S. J., Hay, D. 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教授デビッド C. Hay は共同創設者兼 Stemnovate 限定のディレクターです。
教授デビッド c. ヘイ HigherSteaks 限定のディレクターであります。

私たちの半自動の手順は効率、信頼性と経済性、規模 (図 1) で HLCs の生産を許可します。このプラットフォームのセル ベースのスクリーニング (図 2) の適切なアプローチを行う、プレートの井戸間に細胞数の面で有意差がなかった。さらに、半自動化ワークフローは手動プロセス5,12を使用する前にできなかった、一度にプレートの数が多いを生成するユーザーをできます。
重要なは、自動化プロセスは HNF4α を発現する細胞の大半との分化収量に影響しなかった (89.2% ± 2) および ALB (92.8% ± 6) (図 3)。HLCs は、CYP P450 酵素 CYP2D6、CYP3A4 の発現し、CYP1A2 と CYP3A 代謝活性以前報告された実験 (図 3)5に匹敵するが表示します。にもかかわらず、プロトコルの標準化、分化前のセル密度は純粋な足 HLC 分化にとって重要です。したがって、井戸に良い細胞分布を確保は、重要な考察 (図 1) です。これは依存のセルラインをあると証明した、従って細胞の播種と密度の最適化は各セル行前にスケール アップに必要です。
現在の形態でこのプラットフォームは適していません HLCs の臨床応用のための大量生産に、これは最も可能性の高いセル工場とバイオリアクターを使用して達成します。ただし、疾患モデリング、薬剤のスクリーニングおよび/または薬物の研究を転用のためひと肝細胞の急速な生成のため開発された方法論が許可されます。また、アッセイは、解明の多重データセットの生成を許可する多重化、影響を受けやすいです。今後は、我々 はまたこの技術が 3 D 分化など足 HLC 表現型生体外で改善するためのプラットフォームとしてシステムの in vitro複雑に適用することと考えています。
結論としては、考えています私たちの単純な半自動システムを実験のスループットを増加し、実験的な変化を減らす人間の生理への外挿と生物学的データセットの品質が向上します。

ひと肝細胞 (PHHs) は、肝の生物医学研究のための現在の標準を表します。彼らの利点にもかかわらず、PHHs は不安定な表現型1成熟肝細胞の限られたソースを表しています。ヒト胚性幹細胞 (Esc)、ひと誘導多能性幹細胞 (iPSC) は肝2,34,を含む人間のティッシュの再生可能エネルギー源を有望な医学研究の強力なリソースとして提案されています。.現在の肝細胞分化プロシージャ肝細胞マーカー、遺伝子、PHHs3,4,5,6,7に類似した機能を発現する細胞を生成します。 8,9,10,11。最近では、定義された材料と組換え laminins など行列の使用は、改良された細胞表現型と実験的再現性5,12,13,14。
従来の細胞培養の技術は、時間がかかり、エラーを起こしやすいです、手動ピペッティングに重く頼る。これは、アッセイおよび 1 つを扱うことができますプレート形式のスループットを制限します。まで、HLCs の生成を記述する研究のほとんどが労働集約的な性質で、サイズ15,16,17したがって小規模となっています。
最近の液体ハンドリング、ピペッティング システム研究所分析器、自動顕微鏡との組み合わせで可能となって人間の介入のための要件を最小限に抑えるための手順を開発します。これらの技術の利点を撮影し基本的な人間の肝臓組織を大量に生成する半自動化された分化システムを開発し、応用医学研究。このアプローチは、人間の ESC と iPSC 行セル行に応じて、必要な若干の調整を実行できます。高の内容分析とこのシステムを組み合わせて、我々 は足 HLC フェノタイピングより時間がかかり、スケール18,19,20,21で実行ことを示します。
要約すると、細胞培養の技術が記載のオートメーションは信頼性、実験時間管理、測定スループットの改善につながっています。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>405 LS Washer</td>
			<td>Biotek</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplement</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12587-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>beta-mercaptoethanol</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>31350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D5879</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS with Calcium and Magnesium</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>14040133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentle cell dissociation reagent</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>7174</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMax</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>35050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GripTips for VIAFLO 96</td>
			<td>Integra</td>
			<td>6434</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HepatoZYME-SFM</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>&#160; 17705021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Activin A</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>120-14E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Hepatocyte Growth Factor</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-39</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Oncostatin M</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>300-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Recombinant Laminin 521</td>
			<td>BioLamina</td>
			<td>LN521-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrocortisone 21-hemisuccinate sodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H4881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Knockout DMEM</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10829</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Knockout Serum Replacement</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10828</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTeSR1 medium</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>5850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MultidropCombi Reagent Dispenser</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>5840300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-essential amino acids</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Operetta High-Content Imaging System</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>HH12000000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant mouse Wnt3a</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>1324-WN-500/CF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rho-associated kinase (ROCK)inhibitor Y27632</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Y0503-1MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>21875</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard tube dispensing cassette</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>24072670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TWEEN 20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9416&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VIAFLO 96 Electronic 96-channel pipette</td>
			<td>Integra</td>
			<td>6001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS, no calcium, no magnesium</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>14190250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde solution 4%, buffered, pH 6.9</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1.00496&#160;EMD MILLIPORE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P450-Glo CYP3A4 Assay and Screening System</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V8801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P450-Glo CYP1A2 Assay and Screening System</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V8771</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A6684</td>
			<td>1:200 (mouse)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alpha-fetoprotein</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab3980</td>
			<td>1:500 (mouse)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CYP2D6</td>
			<td>University of Dundee</td>
			<td>University of Dundee</td>
			<td>1:200 (sheep)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CYP3A4</td>
			<td>University of Dundee</td>
			<td>University of Dundee</td>
			<td>1:200 (sheep)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HNF-4&#945;</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-8987</td>
			<td>1:400 (rabbit)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E-cadherin</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab76055</td>
			<td>1:200 (mouse)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IgG</td>
			<td>DAKO</td>
			<td></td>
			<td>1:400</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse 488 (secondary antibody)</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>A-11001</td>
			<td>1:400</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-sheep 488 (secondary antibody)</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>A-11015</td>
			<td>1:400</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-rabbit 488 (secondary antibody)</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>A-11008</td>
			<td>1:400</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

semi-automated production of hepatocyte like cells from pluripotent stem cells

ひと多能性幹細胞は、人体組織の再生可能エネルギー源を表します。本研究では、ヒト胚性幹細胞 (hESCs) からひと肝組織の生成に焦点を当てたし、誘導多能性幹細胞 (Ips)。現在の差別化の手順は、ひと肝細胞様細胞 (HLCs) 胎児および大人の特性の混合物を表示するを生成します。細胞表現型を改善するために完全に定義しました私たちの分化の手順と細胞ニッチ表示改善された遺伝子発現と機能細胞の生成に終っています。一方、これらの研究は、進行状況をマーク、マルチ プレートのスクリーニングのための大量を生成する能力は労働集約的なプロシージャとバッチ変化されています。この問題に取り組むため、我々 は HLCs。 幹細胞播種に多能性幹細胞を分化する半自動化されたプラットフォームを開発しているし、分化は、96 ウェル プレート形式の液体処理と自動ピペッティング システムを使用して行われました。次の分化、細胞表現型を自動顕微鏡とマルチもルミノを使用して行った。

細胞の分化は萌芽期の幹細胞ライン (H9) を用いて行った。半自動化されたプラットフォームは、差別化し、細胞 (図 1 a) の特徴に慣れていた。自動液体ハンドリング ディスペンサーは、行列をコートで単一のセルをシードに使用されました。細胞の分化は、細胞に達すると 40% の confluency (0 日) に開始されました。媒体および媒体追加 (図 1 a) の液体ハンドリング ディスペンサーを削除するハンドヘルド電子チャネルの自動ピペット システムを使用してメディアの変更を行った。細胞の固定・染色を自動皿洗浄機との組み合わせで自動液体ハンドリング ディスペンサーを使用して行った。コロンバス ソフトウェア高コンテンツ イメージング システムを用いたイメージングと定量を行った。確立されたアッセイを用いたシトクロム P450 活性を測定しました。基板培養、細胞培養上清が収穫され、発光記録マルチモード マイクロ プレート リーダー (図 1 a) を使用しています。さらに、従来の位相差顕微鏡は、肝細胞の分化 (図 1 b) に細胞の形態の変化を測定する使用されました。
日 18 日 (図 2 a) を汚す DAPI 以下ウェル間の細胞数の変動を調べた。7 つのフィールドの表示は、井戸と核の定量化 (図 2 a) 数ごと捕獲されました。我々 は井戸 41,662 ± 3 の平均とよく (図 2 b) あたり 366 細胞間の統計的な差異を検出されません。
18 日に HLCs が固定し、典型的な肝細胞マーカー (図 3A G) 染色 CYP P450 活性をテストします。HLCs 表現 HNF4α など肝細胞マーカー (89.2% ± 2 陽性細胞) ALB (92.8% ± 6 陽性細胞)、AFP (61.8% ± 2 陽性細胞)。HLCs も CYP P450 タンパク質、CYP2D6、CYP3A4 の発現し、E-カドヘリン蛋白質の発現によって示すように多角形に独自の外観を表示します。18 日 HLCs CYP P450 活性を測定しました。HLCs は、295,906 ± 45、828 RLU/mL/mg タンパク質と 1,066,112 ±177、416 RLU/mL/mg タンパク質 (図 3 H) で CYP3A で CYP1A2 活性を示した。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57995/57995fig1v2.jpg"> 図 1: 96 で Psc からの肝細胞分化もフォーマットします。細胞分化の半自動化、固定、染色・ イメージングと運動機能に使用される装置の(A) します。ダイアグラムです。(B).代表は足 HLC 分化細胞形態の変化します。簡単に言えば、Psc は決定的な内胚葉、石畳のような形態を表示する細胞と肝細胞成熟前の特徴細胞多角形を取得を hepatoblast 仕様に続いてに向けて準備万端します。スケールバー = 100 μ m.<a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57995/57995fig1v2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57995/57995fig2v3.jpg"> 図 2: HLCs 井戸-井戸変動の評価。(A)表現、96 ウェル プレート HLCs DAPI 染色のビュー。スケール バー = 1 ミリメートル。 (B)ウェルあたりのセル数の定量化。列 (上) とも、コロンバスのソフトウェアを使用して定量化されたあたりの 7 つのフィールドから行 (下) の井戸あたりのセル数の平均です。板全体平均セル数は 41,662 ± 3,366 SEM 細胞/ウェルです。井戸間に統計的有意差は認められなかった。テューキー事後検定と一方向の分散分析を用いて.<a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57995/57995fig2v2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57995/57995fig3v2.jpg"> 図 3: 肝細胞マーカーの発現と 18 日 HLCs CYP P450 活性測定。(A)肝細胞核因子 4 α の割合(HNF4α) 式 ± SEM 30 井戸井戸あたり 10 フィールドのビューに基づいています。(B) SEM、+/-アルブミン (ALB) 式の割合は、ウェルあたり 10 のフィールドの表示と 3 つの井戸に基づいています。(C) SEM ± α フェトプロテイン (AFP) の割合は、ウェルあたり 10 のフィールドの表示と 3 つの井戸に基づいています。(D) E-カドヘリンの汚損。(E) CYP2D6 の汚損。(F) CYP3A4 の汚損。(G). 免疫グロブリン G (IgG) コントロールを染色します。スケールバー = 50 μ m (H) CYP 1 a 2 と 3 a 代謝内 P450 活性 HLCs 18 日目。6 生物複製 SEM. 活動 +/-が表すデータは蛋白 1 mg 当たりの相対的なライト ユニット (RLUs)/mL として引用されます。<a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57995/57995fig3v2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。

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Semi-automated Production of Hepatocyte Like Cells from Pluripotent Stem Cells

このプロトコルでは、96 well プレート形式でひと多能性幹細胞からの肝細胞様細胞を生成する半自動化されたアプローチについて説明します。このプロセスは、迅速かつコスト効率の高い、品質の生産保証基礎・応用研究の肝細胞のような細胞のバッチを許可します。

多能性幹細胞からの細胞のような肝細胞の半自動化生産

Human pluripotent stem cells represent a renewable source of human tissue. Our research is focused on generating human liver tissue from human embryonic ...

semi-automated-production-hepatocyte-like-cells-from-pluripotent-stem

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

8.1K ビュー.  University of Edinburgh. このプロトコルでは、96 well プレート形式でひと多能性幹細胞からの肝細胞様細胞を生成する半自動化されたアプローチについて説明します。このプロセスは、迅速かつコスト効率の高い、品質の生産保証基礎・応用研究の肝細胞のような細胞のバッチを許可します。

ビデオ: Semi-automated Production of Hepatocyte Like Cells from Pluripotent Stem Cells

Generation of Induced-pluripotent Stem Cells Using Fibroblast-like Synoviocytes Isolated from Joints of Rheumatoid Arthritis Patients

Mature somatic cells can be reversed into a pluripotent stem cell-like state using a defined set of reprogramming factors. Numerous studies have generated induced-Pluripotent Stem Cells (iPSCs) from various somatic cell types by transducing four Yamanaka transcription factors: Oct4, Sox2, Klf4 and c-Myc. The study of iPSCs remains at the cutting edge of biological and clinical research. In particular, patient-specific iPSCs can be used as a pioneering tool for the study of disease pathobiology, since iPSCs can be induced from the tissue of any individual. Rheumatoid arthritis (RA) is a chronic inflammatory disease, classified by the destruction of cartilage and bone structure in the joint. Synovial hyperplasia is one of the major reasons or symptoms that lead to these results in RA. Fibroblast-like Synoviocytes (FLSs) are the main component cells in the hyperplastic synovium. FLSs in the joint limitlessly proliferate, eventually invading the adjacent cartilage and bone. Currently, the hyperplastic synovium can be removed only by a surgical procedure. The removed synovium is used for RA research as a material that reflects the inflammatory condition of the joint. As a major player in the pathogenesis of RA, FLSs can be used as a material to generate and investigate the iPSCs of RA patients. In this study, we used the FLSs of a RA patient to generate iPSCs. Using a lentiviral system, we discovered that FLSs can generate RA patient-specific iPSC. The iPSCs generated from FLSs can be further used as a tool to study the pathophysiology of RA in the future.

Here we describe a protocol for generating human induced-pluripotent stem cells from patient-derived fibroblast-like synoviocytes, using a lentiviral system without feeder cells.

関節リウマチ患者の関節から分離された線維芽細胞様滑膜細胞を用いて誘導多能性幹細胞の生成

Mature somatic cells can be reversed into a pluripotent stem cell-like state using a defined set of reprogramming factors. Numerous studies have generated ...

発生生物学

Large-Scale Production of Cardiomyocytes from Human Pluripotent Stem Cells Using a Highly Reproducible Small Molecule-Based Differentiation Protocol

Maximizing the benefit of human pluripotent stem cells (hPSCs) for research, disease modeling, pharmaceutical and clinical applications requires robust methods for the large-scale production of functional cell types, including cardiomyocytes. Here we demonstrate that the temporal manipulation of WNT, TGF-&#946;, and SHH signaling pathways leads to highly efficient cardiomyocyte differentiation of single-cell passaged hPSC lines in both static suspension and stirred suspension bioreactor systems. Employing this strategy resulted in ~ 100% beating spheroids, consistently containing &#62; 80% cardiac troponin T-positive cells after 15 days of culture, validated in multiple hPSC lines. We also report on a variation of this protocol for use with cell lines not currently adapted to single-cell passaging, the success of which has been verified in 42 hPSC lines. Cardiomyocytes generated using these protocols express lineage-specific markers and show expected electrophysiological functionalities. Our protocol presents a simple, efficient and robust platform for the large-scale production of human cardiomyocytes.

Here, we present a robust, fast and scalable cardiomyocyte differentiation protocol for human pluripotent stem cells (hPSCs). Cardiomyocytes derived using this large-scale method can provide sufficient cell numbers for their effective use in human cardiovascular disease modeling, high-throughput drug screening, and potentially clinical applications.

再現性の高い小分子ベースの分化プロトコルを使用したヒト多能性幹細胞から心筋細胞の大規模生産

Maximizing the benefit of human pluripotent stem cells (hPSCs) for research, disease modeling, pharmaceutical and clinical applications requires robust ...

The Production of Pluripotent Stem Cells from Mouse Amniotic Fluid Cells Using a Transposon System

Induced pluripotent stem (iPS) cells are generated from mouse and human somatic cells by forced expression of defined transcription factors using different methods. Here, we produced iPS cells from mouse amniotic fluid cells, using a non-viral-based transposon system. All obtained iPS cell lines exhibited characteristics of pluripotent cells, including the ability to differentiate toward derivatives of all three germ layers in vitro and in vivo. This strategy opens up the possibility of using cells from diseased fetuses to develop new therapies for birth defects.

In this study, we generate induced pluripotent stem cells from mouse amniotic fluid cells, using a non-viral-based transposon system.

トランスポゾンのシステムを用いたマウスの羊水細胞から多能性幹細胞の作製

Induced pluripotent stem (iPS) cells are generated from mouse and human somatic cells by forced expression of defined transcription factors using ...

Defined and Scalable Generation of Hepatocyte-like Cells from Human Pluripotent Stem Cells

Human pluripotent stem cells (hPSCs) possess great value for biomedical research. hPSCs can be scaled and differentiated to all cell types found in the human body. The differentiation of hPSCs to human hepatocyte-like cells (HLCs) has been extensively studied, and efficient differentiation protocols have been established. The combination of extracellular matrix and biological stimuli, including growth factors, cytokines, and small molecules, have made it possible to generate HLCs that resemble primary human hepatocytes. However, the majority of procedures still employ undefined components, giving rise to batch-to-batch variation. This serves as a significant barrier to the application of the technology. To tackle this issue, we developed a defined system for hepatocyte differentiation using human recombinant laminins as extracellular matrices in combination with a serum-free differentiation process. Highly efficient hepatocyte specification was achieved, with demonstrated improvements in both HLC function and phenotype. Importantly, this system is easy to scale up using research and GMP-grade hPSC lines&#160;promising advances in cell-based modelling and therapies.

The method presented here describes a scalable and good manufacturing practice (GMP)-ready differentiation system to generate human hepatocyte-like cells from pluripotent stem cells. It serves as a cost-effective and standardized system to generate human hepatocyte-like cells for basic and applied human liver research.

ヒト多能性幹細胞から肝細胞様細胞の定義され、スケーラブルな世代

Human pluripotent stem cells (hPSCs) possess great value for biomedical research. hPSCs can be scaled and differentiated to all cell types found in the ...

Horizontal Whole Mount: A Novel Processing and Imaging Protocol for Thick, Three-dimensional Tissue Cross-sections of Skin

Processing a tissue of interest to generate a microscopic image that supports a scientific argument can be challenging. The acquisition of high-quality microscopic images is not entirely dependent upon the quality of the microscope, but also upon the methods of tissue processing, which often involve multiple critical actions or steps. Furthermore, mesenchymal cell types in the skin and other tissues represent a new challenge for tissue preparation and imaging. Here, we present a complete process, from tissue harvest to microscopy. Our technique, called &#34;horizontal whole mount,&#34; is one that novices can quickly become proficient in and that allows for antigen preservation and detection in 60-300 &#181;m-thick sections cut with a cryostat. Sections of this thickness provide enhanced visualization of tissue microarchitecture in a three-dimensional environment. In addition, the protocol preserves mesenchymal cells in a manner that enhances image quality when compared to standard cryostat or paraffin sections, thereby increasing the efficacy and reliability of immunostaining. We believe that this protocol will benefit all laboratories that visualize skin, and possibly other tissues and organs.

This work presents a novel processing and imaging protocol for thick, three-dimensional tissue cross-section analysis that enables the full exploitation of confocal imaging modalities. This protocol preserves antigenicity and represents a robust system to analyze skin histology and potentially other tissue types.

水平全マウント：皮膚の厚い3次元組織断面のための新規処理および画像化プロトコール

Processing a tissue of interest to generate a microscopic image that supports a scientific argument can be challenging. The acquisition of high-quality ...

Rapid, Directed Differentiation of Retinal Pigment Epithelial Cells from Human Embryonic or Induced Pluripotent Stem Cells

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing a detailed and thorough protocol is to clearly demonstrate each step and to make this readily available to researchers in the field. This protocol results in a homogenous layer of RPE with minimal or no manual dissection needed. The method presented here has been shown to be effective for induced pluripotent stem cells (iPSC) and human embryonic stem cells. Additionally, we describe methods for cryopreservation of intermediate cell banks that allow long-term storage. RPE generated using this protocol might be useful for iPSC disease-in-a-dish modeling or clinical application.

This protocol describes how to produce retinal pigment epithelial cells (RPE) from pluripotent stem cells. The method uses a combination of growth factors and small molecules to direct the differentiation of stem cells into immature RPE in fourteen days and mature, functional RPE after three months.

人間の胚または誘導多能性幹細胞からの網膜色素上皮細胞の急速な監督の分化

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing ...

Single-cell Photoconversion in Living Intact Zebrafish

Animal and plant tissue is composed of distinct populations of cells. These cells interact over time to build and maintain the tissue and can cause disease when disrupted. Scientists have developed clever techniques to investigate characteristics and natural dynamics of these cells within intact tissue by expressing fluorescent proteins in subsets of cells. However, at times, experiments require more selected visualization of cells within the tissue, sometimes at the single-cell or population-of-cells manner. To achieve this and visualize single cells within a population of cells, scientists have utilized single-cell photoconversion of fluorescent proteins. To demonstrate this technique, we show here how to direct UV light to an Eos-expressing cell of interest in an intact, living zebrafish. We then image those photoconverted Eos+ cells 24 h later to determine how they changed in the tissue. We describe two techniques: single cell photoconversion and photoconversions of populations of cell. These techniques can be used to visualize cell-cell interactions, cell-fate and differentiation, and cell migrations, making it a technique that is applicable in numerous biological questions.

Here, we present a protocol to show how cell photoconversion is achieved through UV exposure to specific areas expressing the fluorescent protein, Eos, in living animals.

生活そのままゼブラフィッシュの単一セルの光電

Animal and plant tissue is composed of distinct populations of cells. These cells interact over time to build and maintain the tissue and can cause ...

Using Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Hepatocyte-like Cells for Drug Discovery

The ability to differentiate human induced pluripotent stem cells (iPSCs) into hepatocyte-like cells (HLCs) provides new opportunities to study inborn errors in hepatic metabolism. However, to provide a platform that supports the identification of small molecules that can potentially be used to treat liver disease, the procedure requires a culture format that is compatible with screening thousands of compounds. Here, we describe a protocol using completely defined culture conditions, which allow the reproducible differentiation of human iPSCs to hepatocyte-like cells in 96-well tissue culture plates. We also provide an example of using the platform to screen compounds for their ability to lower Apolipoprotein B (APOB) produced from iPSC-derived hepatocytes generated from a familial hypercholesterolemia patient. The availability of a platform that is compatible with drug discovery should allow researchers to identify novel therapeutics for diseases that affect the liver.

The protocol presented here describes a platform for identifying small molecules for the treatment of liver disease. A step-by-step description is presented detailing how to differentiate iPSCs into cells with hepatocyte characteristics in 96-well plates, and to use the cells to screen for small molecules with potential therapeutic activity.

創薬における多能性幹細胞由来肝細胞様細胞を誘導人間を使用して

The ability to differentiate human induced pluripotent stem cells (iPSCs) into hepatocyte-like cells (HLCs) provides new opportunities to study inborn ...

Generation of First Heart Field-like Cardiac Progenitors and Ventricular-like Cardiomyocytes from Human Pluripotent Stem Cells

The generation of large amounts of functional human pluripotent stem cells-derived cardiac progenitors and cardiomyocytes of defined heart field origin is a pre-requisite for cell-based cardiac therapies and disease modeling. We have recently shown that Id genes are both necessary and sufficient to specify first heart field progenitors during vertebrate development. This differentiation protocol leverages these findings and uses Id1 overexpression in combination with Activin A as potent specifying cues to produce first heart field-like (FHF-L) progenitors. Importantly, resulting progenitors efficiently differentiate (~70&#8211;90%) into ventricular-like cardiomyocytes. Here we describe a detailed method to 1) generate Id1-overexpressing hPSCs and 2) differentiate scalable quantities of cryopreservable FHF-L progenitors and ventricular-like cardiomyocytes.

Here we describe a scalable method, using a simple combination of Activin A and lentivirus-mediated Id1-overexpression, to generate first heart field-like cardiac progenitors and ventricular-like cardiomyocytes from human pluripotent stem cells.

最初心臓フィールドのような心臓前駆細胞およびひと多能性幹細胞からのような心室心筋細胞の生成

The generation of large amounts of functional human pluripotent stem cells-derived cardiac progenitors and cardiomyocytes of defined heart field origin is ...

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and chromosome dynamics. While the germline is an excellent model, the analysis is often two dimensional due to the time and labor required for three-dimensional analysis. Major readouts in such studies are the number/position of nuclei and protein distribution within the germline. Here, we present a method to perform automated analysis of the germline using confocal microscopy and computational approaches to determine the number and position of nuclei in each region of the germline. Our method also analyzes germline protein distribution that enables the three-dimensional examination of protein expression in different genetic backgrounds. Further, our study shows variations in cytoskeletal architecture in distinct regions of the germline that may accommodate specific spatial developmental requirements. Finally, our method enables automated counting of the sperm in the spermatheca of each germline. Taken together, our method enables rapid and reproducible phenotypic analysis of the C. elegans germline.

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

We present an automated method for three-dimensional reconstruction of the Caenorhabditis elegans germline. Our method determines the number and position of each nucleus within the germline and analyses germline protein distribution and cytoskeletal structure.

核の分布、蛋白質および細胞骨格を研究する線虫生殖細胞の解析

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and ...