この原稿の開発は、ルートおよび Rhizobiome 技術革新賞イア 1557417 国立科学財団 EPSCoR センターによってサポートされます。データ コレクションはあったネブラスカ大学リンカーン校、農業研究および開発からの資金で米国農務省からハッチの助成金でサポートされています。我々 はまた、米国農務省-アルスからのサポートを認めるし、サポートが確立し、これらのフィールドを管理する米国農務省国立食品研究所や農業から農業と食品研究イニシアチブ競争グラント号 2011-68005-30411 によって提供されました。

<ol>
	<li>Philippot, L., Raaijmakers, J. M., Lemanceau, P., vander Putten, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Going+back+to+the+roots:+the+microbial+ecology+of+the+rhizosphere.">Going back to the roots: the microbial ecology of the rhizosphere.</a> Nature Reviews Microbiology. 11, 789-799 (2013).</li><li>Fierer, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embracing+the+unknown:+disentangling+the+complexities+of+the+soil+microbiome.">Embracing the unknown: disentangling the complexities of the soil microbiome.</a> Nature Review Microbiology. 15 (10), 579-590 (2017).</li><li>Wang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shifts+in+microbial+communities+in+soil,+rhizosphere+and+roots+of+two+major+crop+systems+under+elevated+CO2+and+O3.">Shifts in microbial communities in soil, rhizosphere and roots of two major crop systems under elevated CO2 and O3.</a> Scientific Reports. 7 (1), 15019 (2017).</li><li>White, L. J., Jothibasu, K., Reese, R. N., Br&#246;zel, V. S., Subramanian, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatio+Temporal+influence+of+isoflavonoids+on+bacterial+diversity+in+the+soybean+Rhizosphere.">Spatio Temporal influence of isoflavonoids on bacterial diversity in the soybean Rhizosphere.</a> Molecular Plant-Microbe Interactions. 28 (1), 22-29 (2015).</li><li>Edwards, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure,+variation,+and+assembly+of+the+root-associated+microbiomes+of+rice.">Structure, variation, and assembly of the root-associated microbiomes of rice.</a> Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 112 (8), E911-E920 (2015).</li><li>Lundberg, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+the+core+Arabidopsis+thaliana+root+microbiome.">Defining the core Arabidopsis thaliana root microbiome.</a> Nature. 488, 86-90 (2012).</li><li>Bougoure, D. S., Cairney, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assemblages+of+ericoid+mycorrhizal+and+other+root-associated+fungi+from+Epacris+pulchella+(Ericaceae)+as+determined+by+culturing+and+direct+DNA+extraction+from+roots.">Assemblages of ericoid mycorrhizal and other root-associated fungi from Epacris pulchella (Ericaceae) as determined by culturing and direct DNA extraction from roots.</a> Environmental Microbiology. 7 (6), 819-827 (2005).</li><li>Doty, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diazotrophic+endophytes+of+native+black+cottonwood+and+willow.">Diazotrophic endophytes of native black cottonwood and willow.</a> Symbiosis. 47 (1), 23-33 (2009).</li><li>Gottel, N. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+microbial+communities+within+the+endosphere+and+rhizosphere+of+populus+deltoides+roots+across+contrasting+soil+types.">Distinct microbial communities within the endosphere and rhizosphere of populus deltoides roots across contrasting soil types.</a> Applied and Environmental Microbiology. 77 (17), 5934-5944 (2011).</li><li>Xin, G., Glawe, D., Doty, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+three+endophytic,+indole-3-acetic+acid-producing+yeasts+occurring+in+Populus+trees.">Characterization of three endophytic, indole-3-acetic acid-producing yeasts occurring in Populus trees.</a> Mycological Research. 113, 973-980 (2009).</li><li>Salter, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reagent+and+laboratory+contamination+can+critically+impact+sequence-based+microbiome+analyses.">Reagent and laboratory contamination can critically impact sequence-based microbiome analyses.</a> BMC Biolology. 12, 87 (2014).</li><li>Gohl, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+improvement+of+amplicon+marker+gene+methods+for+increased+accuracy+in+microbiome+studies.">Systematic improvement of amplicon marker gene methods for increased accuracy in microbiome studies.</a> Nature Biotechnology. 34 (9), 942-949 (2016).</li><li>Kozich, J. J., Westcott, S. L., Baxter, N. T., Highlander, S. K., Schloss, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+dual-index+sequencing+strategy+and+curation+pipeline+for+analyzing+amplicon+sequence+data+on+the+MiSeq+Illumina+sequencing+platform.">Development of a dual-index sequencing strategy and curation pipeline for analyzing amplicon sequence data on the MiSeq Illumina sequencing platform.</a> Applied Environmental Microbiology. 79 (17), 5112-5120 (2013).</li><li>Caporaso, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultra-high-throughput+microbial+community+analysis+on+the+Illumina+HiSeq+and+MiSeq+platforms.">Ultra-high-throughput microbial community analysis on the Illumina HiSeq and MiSeq platforms.</a> ISME Journal. 6 (8), 1621-1624 (2012).</li><li>Lundberg, D. S., Yourstone, S., Mieczkowski, P., Jones, C. D., Dangl, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Practical+innovations+for+high-throughput+amplicon+sequencing.">Practical innovations for high-throughput amplicon sequencing.</a> Nature Methods. 10 (10), 999-1002 (2013).</li><li>Edgar, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=UPARSE:+highly+accurate+OTU+sequences+from+microbial+amplicon+reads.">UPARSE: highly accurate OTU sequences from microbial amplicon reads.</a> Nature Methods. 10 (10), 996-998 (2013).</li><li>Caporaso, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=QIIME+allows+analysis+of+high-throughput+community+sequencing+data.">QIIME allows analysis of high-throughput community sequencing data.</a> Nature Methods. 7 (5), 335-336 (2010).</li><li>Shannon, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mathematical+theory+of+communication.">A mathematical theory of communication.</a> Bell System Technical Journal. 27, 379-423 (1948).</li><li>Simpson, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+diversity.">Measurement of diversity.</a> Nature. 163, 688 (1949).</li><li>Chao, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-parametric+estimation+of+the+number+of+classes+in+a+population.">Non-parametric estimation of the number of classes in a population.</a> Scandanavian Journal of Statistics. 11, 265-270 (1984).</li><li>Legendre, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studying+beta+diversity:+Ecological+variation+partitioning+by+multiple+regression+and+canonical+analysis.">Studying beta diversity: Ecological variation partitioning by multiple regression and canonical analysis.</a> Journal of Plant Ecology. 1 (1), 3-8 (2008).</li><li>Oksanen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+vegan+package.">The vegan package.</a> Community Ecology Package. 10, 631-637 (2007).</li><li>Wickham, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ggplot2:+Elegant+graphics+for+data+analysis.">ggplot2: Elegant graphics for data analysis.</a> Ggplot2: Elegant Graphics for Data Analysis. , 1-212 (2009).</li><li>Cole, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Ribosomal+Database+Project+(RDP-II):+sequences+and+tools+for+high-throughput+rRNA+analysis.">The Ribosomal Database Project (RDP-II): sequences and tools for high-throughput rRNA analysis.</a> Nucleic Acids Research. 33, D294-D296 (2006).</li><li>Wagner, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host+genotype+and+age+shape+the+leaf+and+root+microbiomes+of+a+wild+perennial+plant.">Host genotype and age shape the leaf and root microbiomes of a wild perennial plant.</a> Nature Communications. 7, 12151 (2016).</li><li>O'Brien, H. E., Parrent, J. L., Jackson, J. A., Moncalvo, J. M., Vilgalys, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fungal+community+analysis+by+large-scale+sequencing+of+environmental+samples.">Fungal community analysis by large-scale sequencing of environmental samples.</a> Applied and Environmental Microbiology. 71 (9), 5544-5550 (2005).</li><li>Taylor, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+first+comprehensive+census+of+fungi+in+soil+reveals+both+hyperdiversity+and+fine-scale+niche+partitioning.">A first comprehensive census of fungi in soil reveals both hyperdiversity and fine-scale niche partitioning.</a> Ecological Monographs. 84 (1), 3-20 (2014).</li><li>Lebeis, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salicylic+acid+modulates+colonization+of+the+root+microbiome+by+specific+bacterial+taxa.">Salicylic acid modulates colonization of the root microbiome by specific bacterial taxa.</a> Science. 349 (6250), 860-864 (2015).</li><li>Ofek-Lalzar, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Niche+and+host-associated+functional+signatures+of+the+root+surface+microbiome.">Niche and host-associated functional signatures of the root surface microbiome.</a> Nature Commununications. 5, 4950 (2014).</li><li>Niu, B., Paulson, J. N., Zheng, X., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simplified+and+representative+bacterial+community+of+maize+roots.">Simplified and representative bacterial community of maize roots.</a> Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 114 (12), E2450-E2459 (2017).</li><li>Fitzpatrick, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+and+ecological+function+of+the+root+microbiome+across+angiosperm+plant+species.">Assembly and ecological function of the root microbiome across angiosperm plant species.</a> Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 115 (6), E1157-E1165 (2018).</li><li>Ramirez, K. S., Lauber, C. L., Knight, R., Bradford, M. A., Fierer, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Consistent+effects+of+nitrogen+fertilization+on+soil+bacterial+communities+in+contrasting+systems.">Consistent effects of nitrogen fertilization on soil bacterial communities in contrasting systems.</a> Ecology. 91 (12), 3463-3470 (2010).</li><li>Paungfoo-Lonhienne, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Turning+the+table:+Plants+consume+microbes+as+a+source+of+nutrients.">Turning the table: Plants consume microbes as a source of nutrients.</a> PLoS One. 5 (7), e11915 (2010).</li><li>Yeoh, Y. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+core+root+microbiome+of+sugarcanes+cultivated+under+varying+nitrogen+fertilizer+application.">The core root microbiome of sugarcanes cultivated under varying nitrogen fertilizer application.</a> Environmental Microbiology. 18 (5), 1338-1351 (2016).</li><li>Bulgarelli, D., Schlaeppi, K., Spaepen, S., Ver Loren van Themaat, E., Schulze-Lefert, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+functions+of+the+bacterial+microbiota+of+plants.">Structure and functions of the bacterial microbiota of plants.</a> Annual Review of Plant Biology. 64, 807-838 (2013).</li><li>Peiffer, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversity+and+heritability+of+the+maize+rhizosphere+microbiome+under+field+conditions.">Diversity and heritability of the maize rhizosphere microbiome under field conditions.</a> Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 110 (16), 6548-6553 (2013).</li></ol>

著者が明らかに何もありません。

本稿で説明する方法は、科学者が簡単に土壌や植物のメタゲノミクスのフィールドを入力する有効にしてください。長年にわたってこの原稿に記載されている実験を実施して以来私たちの方法を精製しています。1 つの変更は、今、サンプルのフィールドに出かける前にチューブをあらかじめラベル我々 です。当研究室は、バーコード システムとラベル プリンタを使用します。ラベル プリンターだけでなく管がも、すべて追跡し、正しく人間の手書きの気まぐれなしサンプルを識別するために簡単にラベルを保存します。もう一つの重要なポイントは、我々 は、できるだけ早く戻ってフィールドからそれを持って後材料を処理しようです。DNA 分析に使用される土を凍結、滅菌し根を凍結し、フィルター、フィールドから帰国後 12 〜 36 時間以内の根の凍結を目指します。我々 は DNA の抽出のプロトコルのための時間に手を最小化し、導入することができるヒューマン エラーを低減するロボット (Flex のカワセミ、ThermoFisher) を購入したので、DNA 抽出手順は特に土壌と根圏のための多くの手順と時間のかかる方法別の一貫性の向上、土壌、根や根のバッチ処理されます。植物材料を操作するとき、勉強することや様々 な「代表的なサンプル」を取得するルートの種類ルート種類を決定する重要です。維持するルーツし、DNA の抽出を実施が重要である、サンプル抽出 DNA 96 ウェルの入力時間交差汚染がないことを確認は、冷凍状態のまま。考慮するもう一つの重要な要因は、フィールド実験を設計し、完全なを使用して可能な限りデザインを無作為に使用する複製の数26。高磁場変動に起因は、小さな違いを検出する複製の大きい数を持っている必要があります。最後に、私たちの経験からそれは根を掘るときに土が余りにぬれてないかどうかを確認することが欠かせません。土壌水と飽和している場合だけ、動作するように面倒ではないも根を定義し、根から土を削除する非常に困難です。
これらのメソッドの開発初期段階で作られた 1 つの変更ではなく、フィールドでの作業を容易にするためのガスの発電機によって供給 vortexers にアップグレードした根を解放する手でチューブを揺れ標準化されたの面で時間とマナーを各チューブが乱れた。私アンプリコン配列のアプローチの 1 つの制限は、結果の分類の解像度が多い多くの OTUs は科や属のレベルで不明なまたは唯一の知られていることです。データ分析結果の解像度を高めることができるため特に新しいと開発のアプローチを認識する上で重要な研究のこの分野は急速に進化します。
これらのプロトコル、細菌、古細菌、真菌ではなく勉強だけです。同じ DNA サンプル27,28を使用して真菌のコミュニティの調査のため増幅のため異なるプライマーの使用になります。これらのメソッドには、メソッドを単純化できるため大量の機器の購入は不要です。述べる方法ここでは、主に「誰が」、を決定するフィールドは散弾銃の配列方法分離を使用しての機能のテストに対処する可能性があります、関数に関する重要な質問にすぐに展開して微生物、またはシーケンス全体微生物ゲノム。
代表的な結果は、微生物コミュニティを説明する方法を使用して識別される可能性がありますの違いを強調します。データ解析22ベータ多様性アプローチを使用して、サンプルの型との間の組成の違いを示した。これらの違いは、土壌、根圏、endosphere がユニークな微生物群集3を含む他のほとんどの研究で明らかに観察されています。シャノン多様性指数は、豊かさと endosphere、根、および土に各植物種の存在の微生物種の均一性を決定する計算しました。本研究では、他の多くのように、アルファ多様性は土壌、根圏でやや減少していると、endosphere3,5,29の大幅な減少で最高。ここで説明する方法は、endosphere、根、および土の組成の変化を識別するのに適していることが示唆されました。
プロテオ バクテリアの優位性は、endosphere と土壌の30,31,32の研究の一般的な発見です。Endosphere は、プロテオ バクテリアのより高い相対的な豊富な微生物種の低い多様性を一般的には。これはもう一度ここで結果が文献の他の調査結果のものを強調します。本研究では治療効果が大幅に異なるなかったし、治療によって課せられた差は検出する十分な変化を生成するのに十分な大きさではなかったし、このサンプリングの終わりに行われていた、2 つの主要な理由があります、成長期、ときフィールド可能性があります十分な時間が描き下ろしの窒素と同様のレベルに今シーズン末で測られたものであります。時間の長い期間にわたって同様の受精率を使用して、別の研究だけは比較的、マイクロバイ組成の小変化測定33だった。他の研究は、窒素肥料34,35原因真菌と細菌の両方のコミュニティの変更を示しています。
その内細菌叢解析3,32,36の決定に役割を果たす知られている植物種と内で別の植物遺伝子型間群集変動の小さい相違を示されている、単一種37。本研究では種の植物群集組成に差が見つかりました。すべてのサンプル タイプのグラスは、最も明確な微生物組成を持っていたが、種の違いが、endosphere で統計的に有意なだけ登場。根群集組成可能性より複製された分析に利用できる場合があります。
結合されたフィールド、ラボ、およびここで説明されている分析のプロトコル ルート36の endosphere、根、土壌における微生物群集の組成方法別の要因の影響を研究するための強力な方法を提供します。さまざまな農業分野で特に内細菌叢解析を勉強の領域で行われる作業があります。土壌微生物相によって利回りを変更する方法についての重要な質問まだ完全に解明する必要があります。土壌微生物相、タイミングが、マイクロバイを変更する方法、どのように非生物的ストレスの輪作の影響に関する最も基本的な質問でも、マイクロバイを変更は、土壌の種類、マイクロバイを変更するこれらの要因との対話方法、およびあるかどうか特定の作物や米国の地域で普遍的な微生物は、すべての未解決の問題です。これらのメソッドは存在と病原性および有益な細菌の永続性を特定する疫学研究の役に立ちます。植物と微生物 RNA 代謝物データとここで説明する DNA 方法の統合を開始するこれらのメソッドの別の将来水平線になります。追加の改善とより多くの変数のテストは、これらのプロトコルの最適化を行うため重要になります。

マイクロバイ研究理解し、栄養サイクリング、有機物の売り上げ高と、開発の抑制または土壌病原体1,2など生態系プロセスを操作するための重要な含意があります。この分野の調査はまた自然植物群落と農耕の生産性に土壌微生物の影響を理解するための大きな可能性を保持します。自然の生態系における土壌微生物相を当てている多くの研究、植物 endosphere と根圏微生物生態系3に焦点を当てたが少ない。ネブラスカ州の農業は農学上重要な作物が研究の重要なトピックを栽培されてこれらの土壌の研究を行った、国の大部分の風景を支配します。この方法の論文の目的は植物の根が根と endosphere、および最終的にまでの微生物コミュニティを変更する方法を決定するため、生態系の存在の微生物を記述するプロトコルの標準的なセットを研究者に提供するにはこれらの微生物は、土壌の健康と植物の生産性の再生機能を理解します。
ここで紹介した方法は排他的に内部ルートとどのように異なる微生物のルートのすぐ外側から4,5で本稿が微生物を学習を目指しているが他のユーザーによって使用される方法から若干異なります、根。本研究で使用される私アンプリコン シーケンス DNA サンプルで見つかった微生物分類群を識別し、研究者コミュニティがサンプルの種類や治療によって変更する方法を決定することができます。このプロトコルとランドバーグらによって使用される非常に同じようなプロトコルの主な違いの 1 つ6は、超音波処理、代わりにこのプロトコルを使用表面殺菌漂白剤とエタノールと根から根圏を削除します。他のユーザーは効果的に表面殺菌を使用も7,8,9,10。これらのメソッドは、わずかに異なるが、他の方法よりも有利ではありません。これらのメソッドは、十分な人々 と最大約 450 のサンプル土壌、根圏、endosphere に分割されている場合追加 1 日あたりの以上 150 のフィールド プロットを処理する可能性があるため大規模なフィールド実験のため特に適しています。この原稿は、詳細フィールドのサンプル、実験室で材料の処理、抽出し、DNA シーケンスに使用するメソッドについて説明し、結果のシーケンス データを分析する手順の概要について説明します。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Dneasy PowerSoil HTP 96 Kit</td>
			<td>Qiagen/MoBio</td>
			<td>12955-4</td>
			<td>Extraction kit for soil and rhizosphere</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dneasy PowerPlant HTP 96 Kit</td>
			<td>Qiagen/MoBio</td>
			<td>13496-4</td>
			<td>Extraction kit for roots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Handle Digging shovel, 101 cm L</td>
			<td>Fiskars</td>
			<td>9669</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rapid Tiller, 40 cm L</td>
			<td>Truper</td>
			<td>34316</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ziploc Bags, 17.7 cm x 19.5 cm</td>
			<td>Ziploc</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cooler</td>
			<td>Any</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wash pan</td>
			<td>Any</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic bucket</td>
			<td>Any</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gloves (work and lab)</td>
			<td>Any</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 cm diameter Soil sieve #8, 2360 &#956;m mesh size</td>
			<td>Dual Manufacturing Co., Chicago IL</td>
			<td>US8-8FS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 cm diameter Soil Sieve #4, 4750 &#956;m mesh size</td>
			<td>Dual Manufacturing Co., Chicago IL</td>
			<td>US8-4FS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>portable generator</td>
			<td>Honda brand works well</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile cell strainers 100 &#956;m mesh size</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-363-549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4&#183;H2O</td>
			<td>VWR</td>
			<td>0823</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>VWR</td>
			<td>0404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silwet L-77</td>
			<td>Lehman Seeds</td>
			<td>VIS-30</td>
			<td>Surfactant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclaves</td>
			<td>Any</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drying Oven</td>
			<td>Any</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scale</td>
			<td>Any</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bleach</td>
			<td>CLOROX - household strength</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Any</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid Nitrogen</td>
			<td>Any</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dry Ice pellets</td>
			<td>Any</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Any</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>11 cm precision fine point tweezers</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>17456209</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18 cm Straight point specimen forceps</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82027-436</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>13.5 cm Pruning Scissors</td>
			<td>Fiskars</td>
			<td>9921</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL tube</td>
			<td>Any</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL PP conical tube</td>
			<td>MIDSCI</td>
			<td>C15B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL PP conical tube</td>
			<td>MIDSCI</td>
			<td>C50B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure water</td>
			<td>Millipore-sigma</td>
			<td>Milli-Q Integral, Q-POD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit 2.0 fluorometer</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Q32866</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit dsDNA HS Assay Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Q32854</td>
			<td>For DNA quantification of removed samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuantiFluor dsDNA System</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E2670</td>
			<td>For DNA quantification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-Well Black with Clear Flat Bottom Plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3631</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pPNA PCR Blocker</td>
			<td>PNA Bio</td>
			<td>PP01-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mPNA PCR Blocker</td>
			<td>PNA Bio</td>
			<td>MP01-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Genomic DNA from Microbial Mock Community B (Even Low Concentration) v5.1L, for 16s rRNA Gene sequencing</td>
			<td>BEI Resources</td>
			<td>HM782D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesive 8 well-strips for plates</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89134-434</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless steel beads, 3.2 mm dia</td>
			<td>Next Advance</td>
			<td>SSB32</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 ml Assay block (DNA extraction plate for the Qiagen/MoBio Dneasy PowerPlant HTP Kit)</td>
			<td>CoStar</td>
			<td>3959</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>antistatic PP weighing funnel, size small for soil/rhizosphere</td>
			<td>TWD Tradewinds, INC</td>
			<td>ASWF1SPK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>antistatic PP weighing funnel, size x-small for root/leaf</td>
			<td>TWD Tradewinds, INC</td>
			<td>ASWFXSCS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Genie 2 Digital Vortex</td>
			<td>Scientific Industries</td>
			<td>SI-0236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex adapter for 50 mL tubes</td>
			<td>Scientific Industries</td>
			<td>SI-H506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mortar (100 mL) and pestle</td>
			<td>Any</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metal micro-spatula</td>
			<td>VWR</td>
			<td>80071-672</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable antistatic microspatulas</td>
			<td>VWR</td>
			<td>231-0106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brown Paper bag 2# (10.95 cm x 6.19 cm x 20 cm)</td>
			<td>Duro</td>
			<td>18402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5424 Centrifuge for 2 mL tube</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22620461</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge for 96-well plate</td>
			<td>Sigma4-16S</td>
			<td>81510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge rotor for 50 mL tubes</td>
			<td>Sigma4-16S</td>
			<td>12269 - Biosafe</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KAPA HiFi DNA polymerase</td>
			<td>Kapa Biosystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and analysis of microbial communities in soil, rhizosphere, and roots in perennial grass experiments

植物や土壌のマイクロバイ研究は理解役割微生物を農業生産性の再生にとって、ますます重要になっています。本稿の目的は、急速に土壌、根圏、およびレプリケートされたフィールド試験の endosphere のサンプルおよび微生物サンプルの種類、治療、および植物遺伝子型が原因で発生する可能性の変化を分析する方法の詳細を提供することです。これらのメソッドを示すために使用実験は、レプリケートされたフィールド プロットを含む 2 つの純粋な暖かい季節の草 (キビ virgatumとアンドロポゴン gerardii)と低多様性草の混合物 (a. gerardii, Sorghastrumカメムシタケ、とBouteloua curtipendula)。簡単に言えば、植物が出土、さまざまな根のカットしリン酸バッファーに置かれます、根圏を収集するを振っています。根は、氷と表面殺菌漂白剤とエタノール (エタノール) に研究室に運ばれます。根は濾過し、遠心分離によって集中されます。ルートボールの周りから土砂がビニール袋に置かれ、DNA の抽出のための少量の土の撮影場所の研究室に持って来られます。DNA は根、土壌と根から抽出および 16S rRNA 遺伝子の V4 の地域のためのプライマーで増幅し。Amplicons シーケンスし、バイオインフォマティクスのツールをオープン アクセスと分析します。これらのメソッドは、サンプルの種類、治療法、原因微生物群集の多様性と構成がどのように変化をテストする研究者を許可する、植物の遺伝子型。統計モデルと一緒にこれらのメソッドを使用して、代表的な結果を示す根、根、および土の微生物コミュニティの重要な違いがあります。紹介した方法フィールドのサンプルを収集、分離、抽出、定量化、増幅、DNA をシーケンスする方法についての完全なセットを提供し、微生物群集の多様性とレプリケートされたフィールド試験で組成を分析します。

代表的な結果はこの原稿で提示来る 2012 年にミード近くネブラスカ大学リンカーン校農学部農場設置現場から、トウモロコシ大豆の回転として管理されたサイト、実験する前にね.研究サイトは、土の 3 種類に位置していたが、土質の変更をすべて課せられた治療に起因していたかのようにデータが行った。
現場 2 つ、純粋な含まれている、大きなブルーステム、indiangrass (S. カメムシタケ) および 'ビュート' sideoats grama (を含む低多様性草の混合物と同様、スイッチ グラス (P. virgatum cv 自由) と大きなブルーステム (A. gerardii) の略B. curtipendula)。3 つの暖かい季節の草のプロットは、3 回がレプリケートされたランダム化完全ブロック デザイン。3 つの異なった草のプロットにネストされたいた 56 (N1)、112 (N2) kg N ha、2 つの窒素 (N) 施肥治療尿素の-1 。生育期の終わりにマイクロバイ サンプリング時に、含まれている土 (平均 ± SD) 8.0 ± 1.1 ppm 硝酸塩プロットと受精 112 kg N ハ-1と 6.8 ± 0.7 (平均 + SD) プロットの ppm 硝酸塩と受精 56 kg N ハ-1。プロットは、年に一度受精されていた。プロットは主要なプロット (8000 m2)、N トリートメントとして示された暖かい季節の草は分割プロット (4000 m2).大きなブルーステム '大当たり' と '金鉱' の 50: 50 のブレンドとして種を取られた、Indiangrass 'スカウト' と '戦士' の 50: 50 のブレンドとしてシードだった。プロットは、2012 年に植えられた、最初の N アプリケーションが 2013 年春に発生しました。
土壌と根のサンプリングは、2014 年 9 月 15 日に実施されました。3 複製 (図 1) と分割プロット無作為化デザインとして設定されたフィールドに以下の作業を行った。Endosphere のサンプルは次のとおりすべての平均のシーケンス深さ: 4871 ± 5711 (平均 ± SD) 根: 40726 ± 14684、土: 38184 ± 9043。記載されている、メソッドを使用して、これらの実験の変化の最大の源の一つは、サンプルの種類 (図 2) の間にある微生物の違いです。この代表的なデータセット、根と土壌が (図 2 a) endosphere よりも互いに構成で類似する表示されます。しかし、そこがまた非常に重要な (p = 0.001) 根と土 (図 2 b) の群集組成の違い。サンプルの種類によって分析これらの実験で占めて全変動 26% であった。
アルファ多様性解析の結果、endosphere の微生物は、土壌および根圏 (図 3) と比べてサンプル多様性の低かった。あらゆるコンパートメントにおける草種の多様性の唯一の大きな違いは、大きなブルーステムの endosphere サンプルとスイッチ グラス、スイッチ グラスの有意に高い微生物種の多様性 (図 3) を有するとの間でした。相対的な豊富な分析 (図 4) は、プロテオ バクテリア続いてアクチノ バクテリアのすべてのサンプル タイプの優位性を強調表示します。Endosphere Bacteriodetesの大きな相対的な豊かさを持っていたに対し、土壌および根圏はアシドバクテリウム門とクロロフレクサス門によってまた支配されます。
この実験では、2 N 施肥量と生育、したがって治療の効果があったかどうかを判断するデータ分析を行った。治療効果は全変動の 12% を占めているが、叙階の 2 つの治療に見える異なる (図 5) 有意差は認められなかった。これは、これらのデータセットではなく目視検査や定性的な判断のための統計解析の重要性を強調表示します。
植物細胞および土壌のマイクロバイの植物影響の違いは、制約の調整法を用いた, 可視化されました。種などの特定の変数のサンプル間の大幅に異なる群集組成の結果かどうかをテストするのには PERMANOVA を用いた統計的な差異を調べた.すべてのサンプルの型を一緒に行った、非常に有意差が微生物群集組成 (図 6) の植物種のために発見されました。この実験では、植物種による変化量 6.7% であった。最後に、各サンプルの種類は、サンプルの種類は重要な植物種の効果を駆動する可能性がありますを決定する個別に行った。Endosphere でのみ有意差があった (p = 0.001) (図 7) の異なる植物の群集組成の間。その他のサンプルの種類、種の効果は個別に分析するとき重要なでした。それは根圏 (18%) と土 (15%) に低下したに対し、endosphere の種によるパーセント変動 27% であった。これはさらに、個別に各組織の種類の分析の重要性を強調表示します。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57932/57932fig1.jpg"> 図 1: 実験設計の例です。ネブラスカ大学リンカーン校東ネブラスカ研究、ミード、ねー近くのエクス テンション センターにある現場の 3 通の無作為化の完全なブロック設計を示す実験的フィールド デザイン完全なサイトの説明は、結果を参照してください。N1 は低 (56 kg N ha-1尿素) と N2 (112 kg N ハ-1尿素) 適用されたより高い窒素率です。<a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57932/57932fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57932/57932fig2.jpg"> 図 2: 2014 年の多年生の草のサンプリングからの土、根、endosphere を含む別のサンプル タイプで微生物の組成を比較するベータ多様性解析します。ブレイ カーティス非類似度行列を生成する QIIME1.9.1 の Python スクリプトを使用して分析を行った。ブレイ カーティス非類似度行列に基づく主座標分析 (PCoA) は RStudio で可視化しました。PCoA1 と PCoA2 は、PCoA の分析によって説明される最初と二番目に大きい分散を示します。PERMANOVA 統計的分析を行った、サンプル型の意義し、 p値は、右上隅に表示されます。数字の各シンボルは、各サンプルの全体の群集を表しています。(A) Endosphere、根と土壌サンプルの型が同時に分析されました。87 のすべてのサンプルは、サンプルあたり 486 シーケンスに希薄だった。(B)根と土のサンプルを同時に分析されました。59 のすべてのサンプルは、8231 シーケンスで希薄だった。<a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57932/57932fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57932/57932fig3.jpg"> 図 3: アルファ多様性解析と endosphere、根圏土壌にそれぞれの種にシャノン インデックスを使用します。分析は、Python スクリプトを使用して、QIIME1.9.1 で行った。真空は、endosphere、根、および土質サンプル サンプルあたり 486、17154 および 8231 シーケンスでそれぞれ行われていた。ボックスは 25 そして第 75 百分位数を示します (最初と第 3 四分位数)。ボックス内の水平の線は中央値と赤を表しますプラス平均を表示します。ひげの 1.5 倍以上四分位範囲に落ちた (黒いドットとして表示されます)、外れ値を除くデータの範囲を示す (n = sideoats grama ミックスどこを除いて各サンプルの 6 n = 5)。全 5 種、endosphere でのシャノン インデックスは根と土壌の両方よりも低かった。非パラメトリック ウィルコクソンの順位和検定を用いて種間の意義し、種の違いは箱の上に示されていた。<a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57932/57932fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57932/57932fig4.jpg"> 図 4: endosphere、根、および土の門レベルの相対的な豊かさ。種類の異なるサンプル間で微生物の門の豊かさを比較するサンプルを分析した (n = 29 サンプルの種類ごとに)。乙表から QIIME1.9.1 で Python スクリプトを使用して分析を行った。円グラフ内の異なる色を示す門。割合は、サンプルの種類ごとに各門の相対的な豊かさを示します。門情報はリボソームのデータベース プロジェクトの分類 (RDP)25を使用して注釈が付けられました。<a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57932/57932fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57932/57932fig5.jpg"> 図 5: すべてのサンプル型の制約の要因と治療を用いた解析します。治療の間の群集組成の違いがあったかどうかを決定する (CAP) 主座標分析の標準分析を行った。N 治療法、 nの N1 = 42 (56 kg N ha-1) およびn = N2 の 45 (112 kg N ハ-1)。ブレイ カーティス非類似度行列は、QIIME1.9.1 で python スクリプトを使用して生成されました。ブレイ カーティス非類似度行列に基づくキャップは RStudio に要因として治療の制約によって行われました。治療の違いは有意し、 p値は、右上隅に表示されるかどうかを決定する PERMANOVA の解析を行った。<a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57932/57932fig5large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57932/57932fig6.jpg"> 図 6: すべてのサンプル型の制約の要因としての植物種を用いた解析します。すべてのサンプル タイプの種の植物群集組成の違いがあったかどうかを決定する分析を行った。主座標調整とすべてのサンプル型 (endosphere、根、および土壌) のキャップの分析が行われたブレイ カーティス非類似度行列を使用します。ブレイ カーティス非類似度行列は QIIME1.9.1 で Python スクリプトを使用して生成されました。ブレイ カーティス非類似度行列に基づくキャップは RStudio の要因としての植物種の制約によって行われました。PERMANOVA 統計的分析を行った種の植物、意義し、P 値は、右上隅に表示されます。数字の各シンボルは、そのサンプルの全体の群集を表します。n = nを除くすべてのサンプル タイプにそれぞれの種に対して 18 = sideoats grama ミックス 15。<a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57932/57932fig6large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57932/57932fig7.jpg"> 図 7: 制約の要因としてサンプルの種類ごとに個別に種を用いたキャップ解析の例です。主座標調整とキャップ各サンプル タイプ (endosphere、根、および土) 解析ブレイ カーティス非類似度行列を使用して。各サンプルの種類は、486、17154、それぞれ、endosphere、根圏土壌サンプル当たり 8231 読み取りし、希薄だった。種は、叙階を制約する要因として使用されました。PERMANOVA 統計的分析を行った各サンプル タイプにおける植物種の意義し、 p値は、右上隅に表示されます。図の各シンボルは、各サンプルの全体の群集を表します。サンプル サイズがn = 29 各サンプルの種類、 n = 6 sideoats grama ミックスを除く各サンプル タイプでそれぞれの植物種 (n = 5)。<a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57932/57932fig7large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Analysis of Microbial Communities in Soil, Rhizosphere, and Roots in Perennial Grass Experiments at JoVE.com

Isolation and Analysis of Microbial Communities in Soil, Rhizosphere, and Roots in Perennial Grass Experiments

フィールドから植物の根の発掘だけでなく、土壌、根圏、endosphere に試料の加工は、DNA の抽出とデータ分析の方法を含め、詳細に説明します。本稿は、土壌、endosphere、および根圏内細菌叢解析の研究にこれらの技術を使用する他の研究室を有効にするのに設計されています。

実験で多年生の草の根、根、土壌微生物の分離と解析

Plant and soil microbiome studies are becoming increasingly important for understanding the roles microorganisms play in agricultural productivity. The ...

isolation-analysis-microbial-communities-soil-rhizosphere-roots

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Environment

54.4K ビュー.  University of Nebraska-Lincoln. フィールドから植物の根の発掘だけでなく、土壌、根圏、endosphere に試料の加工は、DNA の抽出とデータ分析の方法を含め、詳細に説明します。本稿は、土壌、endosphere、および根圏内細菌叢解析の研究にこれらの技術を使用する他の研究室を有効にするのに設計されています。

ビデオ: Isolation and Analysis of Microbial Communities in Soil, Rhizosphere, and Roots in Perennial Grass Experiments

Technique for Studying Arthropod and Microbial Communities within Tree Tissues

Phloem tissues of pine are habitats for many thousands of organisms. Arthropods and microbes use phloem and cambium tissues to seek mates, lay eggs, rear young, feed, or hide from natural enemies or harsh environmental conditions outside of the tree. Organisms that persist within the phloem habitat are difficult to observe given their location under bark. We provide a technique to preserve intact phloem and prepare it for experimentation with invertebrates and microorganisms. The apparatus is called a &#8216;phloem sandwich&#8217; and allows for the introduction and observation of arthropods, microbes, and other organisms. This technique has resulted in a better understanding of the feeding behaviors, life-history traits, reproduction, development, and interactions of organisms within tree phloem. The strengths of this technique include the use of inexpensive materials, variability in sandwich size, flexibility to re-open the sandwich or introduce multiple organisms through drilled holes, and the preservation and maintenance of phloem integrity. The phloem sandwich is an excellent educational tool for scientific discovery in both K-12 science courses and university research laboratories.

We provide a technique to preserve intact tree phloem and prepare it for observation. We create an apparatus called a phloem sandwich that allows for the introduction and observation of arthropods, microbes, and other organisms that inhabit phloem tissues.

ツリー組織内節足動物と微生物群集を研究するための技術

Phloem tissues of pine are habitats for many thousands of organisms.  Arthropods and microbes use phloem and cambium tissues to seek mates, lay eggs, rear ...

環境学

Design and Operation of a Continuous 13C and 15N Labeling Chamber for Uniform or Differential, Metabolic and Structural, Plant Isotope Labeling

Tracing rare stable isotopes from plant material through the ecosystem provides the most sensitive information about ecosystem processes; from CO2 fluxes and soil organic matter formation to small-scale stable-isotope biomarker probing. Coupling multiple stable isotopes such as 13C with 15N, 18O or&#160;2H has the potential to reveal even more information about complex stoichiometric relationships during biogeochemical transformations. Isotope labeled plant material has been used in various studies of litter decomposition and soil organic matter formation1-4. From these and other studies, however, it has become apparent that structural components of plant material behave differently than metabolic components (i.e. leachable low molecular weight compounds) in terms of microbial utilization and long-term carbon storage5-7. The ability to study structural and metabolic components separately provides a powerful new tool for advancing the forefront of ecosystem biogeochemical studies. Here we describe a method for producing 13C and 15N labeled plant material that is either uniformly labeled throughout the plant or differentially labeled in structural and metabolic plant components.
Here, we present the construction and operation of a continuous 13C and 15N labeling chamber that can be modified to meet various research needs. Uniformly labeled plant material is produced by continuous labeling from seedling to harvest, while differential labeling is achieved by removing the growing plants from the chamber weeks prior to harvest. Representative results from growing Andropogon gerardii Kaw demonstrate the system&#39;s ability to efficiently label plant material at the targeted levels. Through this method we have produced plant material with a 4.4 atom%13C and 6.7 atom%15N uniform plant label, or material that is differentially labeled by up to 1.29 atom%13C and 0.56 atom%15N in its metabolic and structural components (hot water extractable and hot water residual components, respectively). Challenges lie in maintaining proper temperature, humidity, CO2 concentration,&#160;and light levels in an airtight 13C-CO2 atmosphere for successful plant production. This chamber description represents a useful research tool to effectively produce uniformly or differentially multi-isotope labeled plant material for use in experiments on ecosystem biogeochemical cycling.

Design and Operation of a Continuous 13C and 15N Labeling Chamber for Uniform or Differential, Metabolic and Structural, Plant Isotope Labeling

This method explains how to build and operate a continuous 13C and 15N isotope labeling chamber for uniform or differential plant tissue labeling. Representative results from metabolic and structural labeling of Andropogon gerardii are discussed.

連続の設計および動作<sup&gt; 13</sup&gt; Cと<sup&gt; 15</sup均一または差動、代謝および構造·&gt; N標識化会議所、工場同位体ラベル化

Tracing rare stable isotopes from plant material through the ecosystem provides the most sensitive information about ecosystem processes; from CO2 fluxes ...

Integrated Field Lysimetry and Porewater Sampling for Evaluation of Chemical Mobility in Soils and Established Vegetation

Potentially toxic chemicals are routinely applied to land to meet growing demands on waste management and food production, but the fate of these chemicals is often not well understood. Here we demonstrate an integrated field lysimetry and porewater sampling method for evaluating the mobility of chemicals applied to soils and established vegetation. Lysimeters, open columns made of metal or plastic, are driven into bareground or vegetated soils. Porewater samplers, which are commercially available and use vacuum to collect percolating soil water, are installed at predetermined depths within the lysimeters. At prearranged times following chemical application to experimental plots, porewater is collected, and lysimeters, containing soil and vegetation, are exhumed. By analyzing chemical concentrations in the lysimeter soil, vegetation, and porewater, downward leaching rates, soil retention capacities, and plant uptake for the chemical of interest may be quantified. Because field lysimetry and porewater sampling are conducted under natural environmental conditions and with minimal soil disturbance, derived results project real-case scenarios and provide valuable information for chemical management. As chemicals are increasingly applied to land worldwide, the described techniques may be utilized to determine whether applied chemicals pose adverse effects to human health or the environment.

Field lysimetry and porewater sampling allow researchers to evaluate the fate of chemicals applied to soils and established vegetation. The goal of this protocol is to demonstrate how to install required instrumentation and collect samples for chemical analysis during integrated field lysimetry and porewater sampling experiments.

統合フィールドLysimetryと間隙水土壌中の化学物質の移動性の評価のためのサンプリングと設立植生

Potentially toxic chemicals are routinely applied to land to meet growing demands on waste management and food production, but the fate of these chemicals ...

Soil Sampling and Isolation of Entomopathogenic Nematodes (Steinernematidae, Heterorhabditidae)

Entomopathogenic nematodes (a.k.a. EPN) represent a group of soil-inhabiting nematodes that parasitize a wide range of insects. These nematodes belong to two families: Steinernematidae and Heterorhabditidae. Until now, more than 70 species have been described in the Steinernematidae and there are about 20 species in the Heterorhabditidae. The nematodes have a mutualistic partnership with Enterobacteriaceae bacteria and together they act as a potent insecticidal complex that kills a wide range of insect species.
Herein, we focus on the most common techniques considered for collecting EPN from soil. The second part of this presentation focuses on the insect-baiting technique, a widely used approach for the isolation of EPN from soil samples, and the modified White trap technique which is used for the recovery of these nematodes from infected insects. These methods and techniques are key steps for the successful establishment of EPN cultures in the laboratory and also form the basis for other bioassays that consider these nematodes as model organisms for research in other biological disciplines. The techniques shown in this presentation correspond to those performed and/or designed by members of S. P. Stock laboratory as well as those described by various authors.

Soil Sampling and Isolation of Entomopathogenic Nematodes Steinernematidae, Heterorhabditidae

Entomopathogenic nematodes are soil-inhabiting roundworms that parasitize a wide range of insects. We demonstrate sampling methods used for the isolation of these nematodes from the soil using two techniques: the insect baiting and the modified White trap, for the recovery of nematodes from soil samples and infected insect cadavers, respectively.

土壌のサンプリングと昆虫病原線虫の分離（Steine​​rnematidae、Heterorhabditidae）

Entomopathogenic nematodes (a.k.a. EPN) represent a group of soil-inhabiting nematodes that parasitize a wide range of insects. These nematodes belong to ...

Extraction and Analysis of Microbial Phospholipid Fatty Acids in Soils

Phospholipid fatty acids (PLFAs) are key components of microbial cell membranes. The analysis of PLFAs extracted from soils can provide information about the overall structure of terrestrial microbial communities. PLFA profiling has been extensively used in a range of ecosystems as a biological index of overall soil quality, and as a quantitative indicator of soil response to land management and other environmental stressors.
The standard method presented here outlines four key steps: 1. lipid extraction from soil samples with a single-phase chloroform mixture, 2. fractionation using solid phase extraction columns to isolate phospholipids from other extracted lipids, 3. methanolysis of phospholipids to produce fatty acid methyl esters (FAMEs), and 4. FAME analysis by capillary gas chromatography using a flame ionization detector (GC-FID). Two standards are used, including 1,2-dinonadecanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (PC(19:0/19:0)) to assess the overall recovery of the extraction method, and methyl decanoate (MeC10:0) as an internal standard (ISTD) for the GC analysis.

Phospholipid fatty acids provide information about the structure of soil microbial communities. We present methods for extraction from soil samples with a single-phase chloroform mixture, fractionation of extracted lipids using solid phase extraction columns, and methanolysis to produce fatty acid methyl esters, which are analyzed by capillary gas chromatography.

土壌中の微生物のリン脂質脂肪酸の抽出と分析

Phospholipid fatty acids (PLFAs) are key components of microbial cell membranes. The analysis of PLFAs extracted from soils can provide information about ...

A Lipid Extraction and Analysis Method for Characterizing Soil Microbes in Experiments with Many Samples

Microbial communities are important drivers and regulators of ecosystem processes. To understand how management of ecosystems may affect microbial communities, a relatively precise but effort-intensive technique to assay microbial community composition is phospholipid fatty acid (PLFA) analysis. PLFA was developed to analyze phospholipid biomarkers, which can be used as indicators of microbial biomass and the composition of broad functional groups of fungi and bacteria. It has commonly been used to compare soils under alternative plant communities, ecology, and management regimes. The PLFA method has been shown to be sensitive to detecting shifts in microbial community composition.
An alternative method, fatty acid methyl ester extraction and analysis (MIDI-FA) was developed for rapid extraction of total lipids, without separation of the phospholipid fraction, from pure cultures as a microbial identification technique. This method is rapid but is less suited for soil samples because it lacks an initial step separating soil particles and begins instead with a saponification reaction that likely produces artifacts from the background organic matter in the soil. 
This article describes a method that increases throughput while balancing effort and accuracy for extraction of lipids from the cell membranes of microorganisms for use in characterizing both total lipids and the relative abundance of indicator lipids to determine soil microbial community structure in studies with many samples. The method combines the accuracy achieved through PLFA profiling by extracting and concentrating soil lipids as a first step, and a reduction in effort by saponifying the organic material extracted and processing with the MIDI-FA method as a second step.

The article describes a method that increases throughput while balancing effort and accuracy for extraction of lipids from the cell membranes of microorganisms for use in characterizing both total lipids and the relative abundance of indicator lipids to determine soil microbial community structure in studies with many samples.

多数の試料を用いた実験における土壌微生物の同定のための脂質抽出と分析法

Microbial communities are important drivers and regulators of ecosystem processes. To understand how management of ecosystems may affect microbial ...

Nanopore DNA Sequencing for Metagenomic Soil Analysis

This article describes the steps for construction of a DNA library from soil, preparation and use of the nanopore flow cell, and analysis of the DNA sequences identified using computer software. Nanopore DNA sequencing is a flexible technique that allows for rapid microbial genome sequencing to identify bacterial and viral species, to characterize bacterial strains, and to detect genetic mutations that confer resistance to antibiotics. The advantages of nanopore sequencing (NS) for life sciences include its low complexity, reduced cost, and rapid real-time sequencing of purified genomic DNA, PCR amplicons, cDNA samples, or RNA. NS is an example of "strand sequencing" which involves sequencing DNA by guiding a single stranded DNA molecule through a nanopore that is inserted into a synthetic polymer membrane. The membrane has an electrical current applied across it, so as the individual bases pass through the nanopore the electrical current is disrupted to varying degrees by the four nucleotide bases. The identification of each nucleotide occurs by detecting the characteristic modulation of the electrical current by the different bases as they pass through the nanopore. The NS system consists of a handheld, USB powered portable device and a disposable flow cell that contains a nanopore array. The portable device plugs into a standard laptop computer that reads and records the DNA sequence using computer software.

Nanopore technology for sequencing biomolecules has wide applications in the life sciences, including identification of pathogens, food safety monitoring, genomic analysis, metagenomic environmental monitoring, and characterization of bacterial antibiotic resistance. In this article, the procedure for metagenomic soil DNA sequencing for species identification using the nanopore sequencing technology is demonstrated.

ナノポア DNA シーケンス メタゲノム土壌分析用

This article describes the steps for construction of a DNA library from soil, preparation and use of the nanopore flow cell, and analysis of the DNA ...

High-throughput Siderophore Screening from Environmental Samples: Plant Tissues, Bulk Soils, and Rhizosphere Soils

Siderophores (low-molecular weight metal chelating compounds) are important in various ecological phenomenon ranging from iron (Fe) biogeochemical cycling in soils, to pathogen competition, plant growth promotion, and cross-kingdom signaling. Furthermore, siderophores are also of commercial interest in bioleaching and bioweathering of metal-bearing minerals and ores. A rapid, cost effective, and robust means of quantitatively assessing siderophore production in complex samples is key to identifying important aspects of the ecological ramifications of siderophore activity, including, novel siderophore producing microbes. The method presented here was developed to assess siderophore activity of in-tact microbiome communities, in environmental samples, such as soil or plant tissues. The samples were homogenized and diluted in a modified M9 medium (without Fe), and enrichment cultures were incubated for 3 days. Siderophore production was assessed in samples at 24, 48, and 72 hours (h) using a novel 96-well microplate CAS (Chrome azurol sulphonate)-Fe agar assay, an adaptation of the traditionally tedious and time-consuming colorimetric method of assessing siderophore activity, performed on individual cultivated microbial isolates. We applied our method to 4 different genotypes/Lines of wheat (Triticum aestivum L.), including Lewjain, Madsen, and PI561725, and PI561727 commonly grown in the inland Pacific Northwest. Siderophore production was clearly impacted by the genotype of wheat, and in the specific types of plant tissues observed. We successfully used our method to rapidly screen for the influence of plant genotype on siderophore production, a key function in terrestrial and aquatic ecosystems. We produced many technical replicates, yielding very reliable statistical differences in soils and within plant tissues. Importantly, the results show the proposed method can be used to rapidly examine siderophore production in complex samples with a high degree of reliability, in a manner that allows communities to be preserved for later work to identify taxa and functional genes.

We present a protocol for rapid screening of environmental samples for siderophore potential contributing to micronutrient bioavailability and turnover in terrestrial systems.

環境試料からの担鉄細胞高スループット スクリーニング: 植物細胞、一括土壌および根圏土壌

Siderophores (low-molecular weight metal chelating compounds) are important in various ecological phenomenon ranging from iron (Fe) biogeochemical cycling ...

Microplot Design and Plant and Soil Sample Preparation for 15Nitrogen Analysis

Many&#160;nitrogen fertilizer studies evaluate the overall effect of a treatment on end-of-season measurements such as grain yield or cumulative N losses. A stable isotope approach is necessary to follow and quantify the fate of fertilizer derived N (FDN) through the soil-crop system. The purpose of this paper is to describe a small-plot research&#160;design utilizing non-confined 15N enriched microplots for multiple soil and plant sampling events over two growing seasons and provide sample collection, handling, and processing protocols for total 15N analysis. The methods were demonstrated using a replicated study from south-central Minnesota planted to corn (Zea mays L.). Each treatment consisted of six corn rows (76 cm row-spacing) 15.2 m long with a microplot (2.4 m by 3.8 m) embedded at one end. Fertilizer-grade urea was applied at 135 kg N&#8729;ha-1 at planting, while the microplot received urea enriched to 5 atom % 15N. Soil and plant samples were taken several times throughout the growing season, taking care to minimize cross-contamination by using separate tools and physically separating unenriched and enriched samples during all procedures. Soil and plant samples were dried, ground to pass through a 2 mm screen, and then ground to a flour-like consistency using a roller jar mill. Tracer studies require additional planning, sample processing time and manual labor, and incur higher costs for 15N enriched materials and sample analysis than traditional N studies. However, using the mass balance approach, tracer studies with multiple in-season sampling events allow the researcher to estimate FDN distribution through the soil-crop system and estimate unaccounted-for FDN from the system.

Microplot Design and Plant and Soil Sample Preparation for 15Nitrogen Analysis

A microplot design for 15N tracer research is described to accommodate multiple in-season plant and soil sampling events. Soil and plant sample collection and processing procedures, including grinding and weighing protocols, for 15N analysis are put forth.

15窒素分析のためのマイクロプロット設計と植物および土壌サンプル調製

Many&#160;nitrogen fertilizer studies evaluate the overall effect of a treatment on end-of-season measurements such as grain yield or cumulative N losses. ...

Two-Dimensional Visualization and Quantification of Labile, Inorganic Plant Nutrients and Contaminants in Soil

We describe a method for two-dimensional (2D) visualization and quantification of the distribution of labile (i.e., reversibly adsorbed) inorganic nutrient (e.g., P, Fe, Mn) and contaminant (e.g., As, Cd, Pb) solute species in the soil adjacent to plant roots (the &#8216;rhizosphere&#8217;) at sub-millimeter (~100 &#181;m) spatial resolution. The method combines sink-based solute sampling by the diffusive gradients in thin films (DGT) technique with spatially resolved chemical analysis by laser ablation inductively coupled plasma mass spectrometry (LA-ICP-MS). The DGT technique is based on thin hydrogels with homogeneously distributed analyte-selective binding phases. The variety of available binding phases allows for the preparation of different DGT gel types following simple gel fabrication procedures. For DGT gel deployment in the rhizosphere, plants are grown in flat, transparent growth containers (rhizotrons), which enable minimal invasive access to a soil-grown root system. After a pre-growth period, DGT gels are applied to selected regions of interest for in situ solute sampling in the rhizosphere. Afterwards, DGT gels are retrieved and prepared for subsequent chemical analysis of the bound solutes using LA-ICP-MS line-scan imaging. Application of internal normalization using 13C and external calibration using matrix-matched gel standards further allows for the quantification of the 2D solute fluxes. This method is unique in its capability to generate quantitative, sub-mm scale 2D images of multi-element solute fluxes in soil-plant environments, exceeding the achievable spatial resolution of other methods for measuring solute gradients in the rhizosphere substantially. We present the application and evaluation of the method for imaging multiple cationic and anionic solute species in the rhizosphere of terrestrial plants and highlight the possibility of combining this method with complementary solute imaging techniques.

This protocol presents a workflow for sub-mm 2D visualization of multiple labile inorganic nutrient and contaminant solute species using diffusive gradients in thin films (DGT) combined with mass spectrometry imaging. Solute sampling and high-resolution chemical analysis are described in detail for quantitative mapping of solutes in the rhizosphere of terrestrial plants.