アン ・ ドッドソン感謝やステファニーハインリッヒ smFISH プロトコルを最適化する方法についてのアドバイスをザビエルの Darzacq 解析プラットフォーム、統計解析に関する提案 Haiyan 黄を助けます。この作品は、ダイムの月 (5-FY15-99)、ピュー慈善信託 (00027344)、デイモン ・ ラニアンがん研究振興財団 (35-15) と EÜ、グレン財団、NSF の大学院研究奨学金の付与号からの資金によって支えられました。JC に DGE 1106400。

メモ: すべてのバッファーとこのプロトコルで使用されるメディアは、表 1に表示されます。試薬用のベンダー情報は、材料のテーブルに表示されます。
一日 1/一日 1-2:
注: 栄養文化の細胞を好ましい媒体で 0.4 〜 0.6 の OD600に成長します。減数分裂文化受ける減数分裂 (1.85 の OD600で通常養殖) 最寄りのメソッドを使用してセルを誘発します。
1. サンプルの固定法と消化
<ol><li>3% ホルムアルデヒドのセルの ~3.5 OD600の合計を修正します。<ol>
<li>植物の文化文化の 5.52 mL を 15 mL の円錐管に 37% ホルムアルデヒドの 480 μ L に追加します。</li>
		<li>減数分裂の文化文化の 1840 μ L を 2 mL マイクロ遠心チューブ用の 37% ホルムアルデヒドの 160 μ L に追加します。〜 5 回を逆転してミックスします。 注意: ホルムアルデヒドは有毒です。処理、制度上の規則に従って処分してください。</li>
	</ol>
</li>
	<li>室温で 20 分間のローラー ドラムにチューブを置きます。減数分裂のサンプル、20 分間室温で修正した後継続、4 ° C で一晩固定、回転します。 注: 一晩固定再現性と減数分裂のサンプル取得した smFISH データの品質が向上します。固定時間を最適化する必要があります。</li>
	<li>サンプルを修正しながら 200 mM バナジル リボヌクレオシド複合体 (VRC) の少なくとも 10 分の 65 ° C に解凍します。</li>
	<li>15 mL チューブに消化マスター ミックスを調製: 1 サンプル、200 mm (65 ° C に加温); VRC 40 μ L でバッファー B の 425 μ L をミックス5 つのサンプルで 200 mM (65 ° C に加温) VRC の 200 μ L でバッファー B の 2125 μ L をミックスします。渦 ~ 5 s VRC 添加後明るい茶色緑が表示されます、マスターのミックスに追加する前に、VRC を完全に再懸濁します。 注意: 消化中に添加 VRC はザイモリエイスの混合物は、粗抽出物から精製されたによって導入されるヌクレアーゼ汚染物質を阻害することによって可能性があります smFISH 結果の一貫性向上します。VRC のこのステップで必要な量を最適化してください。</li>
	<li>植物サンプルの 3 分間 ~ 1057 x g でチューブを遠心します。(一晩固定) 後減数分裂サンプル 1.5 分デカント 21,000 × g で遠心分離機またはホルムアルデヒド無駄に上清を吸引します。 注: すべての遠心分離手順は、室温で実行されます。</li>
	<li>上下にピペッティングか、チューブを反転してミックスするフリックは、コールド バッファー B の 1.5 mL の細胞を再懸濁します。再懸濁後、植物サンプルを 2 mL チューブに転送します。</li>
	<li>21,000 × g で遠心する 1.5 分削除液体のバルクは真空吸引によりピペッティング、〜 100 μ L を残してします。</li>
	<li>コールド バッファー B の 1.5 mL の細胞を再懸濁します</li>
	<li>21,000 × g で遠心する 1.5 分削除液体のバルクは真空吸引によりピペッティング、〜 100 μ L を残してします。</li>
	<li>液体真空によって完全にまたはピペッティングによる冷たいバッファー * 1.5 分吸引 21,000 × g で遠心の 1.5 mL の細胞を再懸濁します。</li>
	<li>消化のマスターの組合せ、および簡潔に再懸濁しますに渦の 425 μ L で細胞を再懸濁します。各チューブに 100 t 10 mg/mL ザイモリエイスの 5 μ L を追加します。 注: 渦ザイモリエイス前にチューブを追加するたびに。マスターのミックスに追加するのではなく、個別に各チューブにザイモリエイスを追加します。両方の手順は、ザイモリエイスはすぐに析出するため消化管の間で一貫性を維持に役立ちます。</li>
	<li>渦 2-3 s をミックスします。ローラー ドラムのチューブを置き、15-30 分のための 30 ° C に消化します。栄養細胞は、減数分裂初期 ~ 15 分かかります、減数分裂前期と減数分裂の部門は、通常かかります 〜 30 分。 注: 15 分後 5 分毎に顕微鏡を確認、非透明性と非屈折細胞の約 80% が表示される場合、消化を停止します。この時点から細胞が非常に壊れやすい。セルをそっと扱うし、真空吸引またはボルテックスを使用しないでください。
</li>
	<li>遠心分離機 ~ 376 x g で 3 分間削除でチューブ液体完全にピペッティングによる。</li>
	<li>優しく上下に 1-2 回をピペットで 1 ml のバッファー B の細胞を再懸濁しますミックスします。</li>
	<li>ピペッティングで ~ 376 x g で 3 分間削除バッファー B 液でチューブを遠心します。優しく (RNase フリー水で希釈) 70% エタノール 1 mL に細胞を再懸濁します。</li>
	<li>3.5-4 時間室温で孵化させなさい。</li>
</ol>2. 交配
<ol><li>部屋の温度にホルムアミドをもたらす (50 mL の約数のかかる 〜 30 分湯せんで)。 注: ボトル ホルムアミドの酸化を避けるために部屋の温度に達するまでは、ホルムアミド ボトルを開かないでください。 注意: ホルムアミドは有毒です。処理、制度上の規則に従って処分してください。</li>
	<li>15 mL の円錐管に 10% ホルムアミド洗浄バッファーを準備します。</li>
	<li>ピペッティングで 70% のエタノールの 3 分を削除 500 μ L の ~ 376 x g でチューブを遠心します。優しく上下に、残りの細胞を再懸濁します、低接着管にセルを転送ピペット。 注: は大幅低接着管を使用後の洗浄中にセル損失を低減します。</li>
	<li>ピペッティングによるすべてのエタノール ~ 376 x g で 3 分間削除で再度チューブを遠心します。</li>
	<li>上下に 2-3 回の 10% ホルムアミド洗浄バッファー、およびゆっくりピペット 1 mL を追加、細胞を再懸濁します。</li>
	<li>交配のソリューションを準備している間 〜 20 分室温に坐るため細胞を許可します。1 サンプルの交配バッファー (部屋の温度) の 50 μ L、5 μ L 200 mM (65 ° C に温めて) VRC の各プローブ (200 nM ファイナル) の 1 μ L をミックスします。5 つのサンプルで交配バッファー (部屋の温度) の 250 μ L、200 mM (65 ° C に温めて) VRC の 25 μ L、5 μ L の各プローブ (200 nM ファイナル) をミックスします。<ol>
<li>ホルムアミドの酸化を防ぐために管を開く前に、部屋の温度に交配バッファー (-20 ° C で凍結) を解凍します。</li>
		<li>200 mM VRC、渦、プローブを追加する前に 5 10 秒を追加した後して、商業的に購入は、製造元の指示に従って再構成されました。</li>
		<li>2 つのプローブが共同培養の場合追加 1 μ L、1:10 のプローブ #1 株だけでなく、1 μ L、1:10 の希釈の最終的な希釈を行うため、プローブ #2 株式の希釈 〜 プローブのレバレッジ。信号対雑音比最高のニーズに必要な濃度を最適化 (詳細についてのディスカッションを参照してください)。</li>
	</ol>
</li>
	<li>遠心分離機 ~ 376 x g で 3 分間削除でサンプル上清有害廃棄物にピペッティングによる。</li>
	<li>各チューブに交配ソリューションの少なくとも 50 μ L を追加します。ミックス チューブをフリックします。</li>
	<li>暗闇の中で、少なくとも 16 時間ローラー ドラムの 30 ° C で孵化させなさい。</li>
</ol>2 日目/3 日目
3. 洗浄およびイメージング
<ol><li>ホルムアミドを室温に戻します。</li>
	<li>15 mL の円錐管に 10% ホルムアミド洗浄バッファー (FWB) を準備します。</li>
	<li>ローラー ドラムからチューブを外し、光から保護するためにホイルで覆われたボックスにそれらを置きます。</li>
	<li>遠心分離機 ~ 376 x g で 3 分間削除でサンプル上清有害廃棄物にピペッティングによる。</li>
	<li>優しく上下にピペットで 1 mL の 10 %fwb で再懸濁します 2-3 回。</li>
	<li>ホイルで覆われたボックスで 30 分 (回転しない) 30 ° C で孵化させなさい。</li>
	<li>3 分は、ピペッティングで有害廃棄物に上清を除去のために ~ 376 x g でサンプルを遠心し、〜 50 μ L のまま。</li>
	<li>一方、15 mL の円錐管に DAPI/FWB を準備: 1 サンプル、5 Mg/ml の DAPI の 1 μ L で 10% ホルムアミド洗浄バッファーの 1000 μ L をミックスします。10 個のサンプルの 5 mg/mL DAPI の 10 μ L と 10 mL の 10% ホルムアミド洗浄バッファーをミックスします。優しく上下にピペットで 1 mL DAPI/FWB ので再懸濁します 2-3 回。</li>
	<li>ホイルで覆われたボックスで 30 分 (回転しない) 30 ° C で孵化させなさい。</li>
	<li>氷の上の反漂白剤試薬を解凍します。</li>
	<li>遠心分離機 ~ 376 x g で 3 分間削除でサンプル上清完全にピペッティングによる。必要な場合は遠心上清のすべてを削除する再び。</li>
	<li>時に、すぐにサンプル、50 μ L の酵素 GLOX バッファーなしでペレットを再懸濁します。上下ピペット 3-4 回をミックスします。<ol>
<li>すべての unimaged サンプル ボックスのままホイルで覆われた 4 ° C で準備が整うまでイメージに。イメージする準備ができたら、2 分間 ~ 376 x g でサンプルを遠心し、ピペッティングで清を完全に除去。以下の酵素と GLOX で再懸濁します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>サンプルをすぐにイメージされる、GLOX バッファーと酵素の 15-20 μ L を追加します。ミックスを上下に優しくピペット。 注: 追加ボリューム細胞ペレットのサイズによって異なります。我々 は 15 μ L の酵素とバッファーを GLOX ので、ペレットを再をお勧めし、顕微鏡で細胞密度を確認します。細胞は密度が高すぎる (互いの上に群生していること細胞) である場合は、酵素と余分な GLOX バッファーを追加します。細胞はまばら、遠心分離機のサンプル、~ 5 μ L のバッファーを削除します。</li>
	<li>ピペット 5 coverslip (18 mm × 18 mm、第 1)、およびスライドの coverslip を入れて上に μ L。</li>
	<li>Coverslip の配置場所研究室ワイプ、スライドの上を置きます。研究室ワイプを軽く押して、スライド (液体、カバーガラスのすべての 4 つのエッジから外れを参照する必要があります) に設定します。</li>
	<li>スライドをアルミ箔で覆われた箱で顕微鏡室に転送します。</li>
	<li>高倍率 (60 〜 100 倍) と高開口数ワイド フィールド蛍光顕微鏡を使用してイメージ。 注: smFISH プローブによって放出されるフォトンの最大数を収集するには、共焦点顕微鏡は推奨されません、彼らが収集する光の量を大幅に制限します。ここでは、データが収集された 100 X 1.4 NA 目的を搭載した顕微鏡を使用してフィルター CY5 1.3 でイメージ (EX632/22, EM679/34) s、100 %t;TRITC (EX542/27、EM597/45)、1.3 s、100 %t;DAPI (EX390/18、EM435/48) 0.05 0.1 s、32%-50 %t.明るいフィールド参照画像も取得する必要があります。0.1 から 0.2 のステップ サイズで 15 25 スライスを取得 μ m から完全に上記のビューのフィールドのフォーカス以下完全すべてのことを確認するために RNA のスポットに対応します。</li>
</ol>4. 画像解析
<ol><li>魚クワント17など StarSearch2、公開された smFISH 分析ツールや実験の正確な要件に応じてのオーダー メード プログラム smFISH のデータを分析します。 注: 良い解析パイプラインにより、ユーザーは、背景から真の RNA スポットを分離し、X、Y、および Z (オプション) 座標と各スポットでは、各セルでのスポットの数の強さなどの統計情報を出力するしきい値を決定するには、とおそらく誤検出を排除する方法としてパラメーターを調整します。</li>
</ol>

<ol>
	<li>Femino, A. M., Fay, F. S., Fogarty, K., Singer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+single+RNA+transcripts+in+situ.">Visualization of single RNA transcripts in situ.</a> Science. 280 (5363), 585-590 (1998).</li><li>Raj, A., van den Bogaard, P., Rifkin, S. 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著者はある利益相反を開示します。

ここで提示されたプロトコルその他公開されている smFISH プロトコル2,3,21,22,23から派生した、酵母のひずみ背景 SK1 用に最適化されました。携帯番号、固定期間、遠心分離速度と期間、消化期間、消化バッファー、プローブの濃度および交配バッファー最適化されたパラメーターが含まれています。交配の温度や時間などの他のパラメーターが最適化されていません。このセクションでは、任意の酵母のひずみ背景および興味の成長条件にこのプロトコルの適応に役立つだろういくつかのメモを共有します。
出芽酵母の細胞壁は細胞壁がプローブの浸透を防ぎますので出芽酵母における高品質 smFISH 画像の取得に対して 1 つの主要な課題です。ザイモリエイスによる細胞壁の不完全な消化力は、プローブと信号の高細胞間変動の非能率的な交配につながります。しかし、過剰消化できる細胞も壊れやすい、洗浄のステップの間に細胞の損失と細胞のイメージングのためのスライドの準備の間に破裂につながる重要です。したがって、消化の時間を最適化することが重要です。時間の量が異なるため同じサンプルの消化によってパイロットの smFISH の実験をお勧めします。細胞の約 80% が非屈折となったとき、我々 は消化を停止された場合私たちのケースでは、最高の smFISH データを得られました。通常、同じ成長条件の異なる遺伝的突然変異系統を似たようなタイミングで消化することができます。ただし、生育条件と出芽酵母における減数分裂のさまざまな段階の間で比較した場合消化の時間が異なります。一度タイミングを決定すると、smFISH の品質、再現できます。注、15 分未満ザイモリエイスの異なるバッチの使用で完了できます消化不良細胞壁合成や組成変異株のも若干消化のタイミングを変更可能性があります。
プローブの最適濃度は、高い信号対雑音比を達成するために必要です。設計し、商業的に私たちの smFISH プローブを購入しました。良いプローブ (多くの場合 20-mers) 35% から 45%、2 塩基プローブや低交差間の最小間隔に至るまで GC の割合が必要です。プローブのリストを生成するメーカーから web ベースのプローブ デザイナーを用いて、オーバー ラップよりも 17 の塩基対のプローブを排除する出芽酵母ゲノムのデータベースで BLAST アルゴリズムに使用私たちから選択する十分な調査があった場合他のゲノムの領域。我々 はこのセットで満足のすべての上記の条件 (20 本) プローブ数が低かったのでNDC80白頭(CF 590) のユニークな地域に焼鈍プローブ セットのためにもっとある蛍光色素 (CAL Fluor 590) を選んだ、(〜 25 プローブ) の製造元の推奨最小数です。製造元の指示に従ってプローブ ソリューションを再構築後、1:10 を行い原液の希釈、-20 ° C で 5 μ 因数で希釈した溶液を保存します。各因数は 1 回だけ使用されました。最適化、1 つはシリアルする必要があります、1:10 からの希釈希釈ソリューションとテスト集中が最高の信号対雑音比が得られます。1: 250、1: 500、1: 1000、および元の在庫から集の希釈系列をお勧めします。私たちの場合、1: 500 希釈倍率結果 CF 590 および Q 670 の両方のプローブ セットのため、最高の信号対雑音比。
最適な固定時間も出芽酵母で成功した smFISH のため重要です。その一晩の固定は 4 ° C、ある我々 は、一貫性と減数分裂のサンプルの smFISH 結果の品質を大幅に向上、20 分間室温で固定するのではなく。我々 がテストしていませんがどのように一晩固定の植物サンプルに影響を与えるかもしれない、この成長条件、室温での固定がうまくいきました。したがって、新種の成長条件 smFISH プロトコルを最適化して、お勧めします室温で短い固定時間から始まると信号の高い変動が発生した場合、固定時間を増やします。
他公開プロトコル3,22,23と比較して、我々 のプロトコルは、消化と交配時 VRC の高濃度の間に RNase 阻害剤 VRC を使用します。VRC のこれらの 2 つの手順を加えて改善 smFISH 結果の一貫性おそらくより良いザイモリエイス ミックス (酵素の粗抽出物から精製した、RNase を含めることができますが導入される可能性がありますのヌクレアーゼ活性に対する RNA 分子を保持します。汚染物質)。したがって、プロトコル最適化の VRC のさらに高い濃度の記載されている VRC の量を使用をお勧めします。
細胞のかなりの部分はバッファー B とホルムアミド洗浄バッファーで洗浄のステップ中に失われます。セル損失を減らすためには、1 つは遠心分離速度を増加可能性があります。私たちのケースでバッファー B 中に我々 のサンプルをペレットに高速 (21,000 x g) を使用して大幅に削減セル損失を洗います。ただし、セルにザイモリエイス消化後非常に壊れやすい、遠心分離速度の変更は推奨されません。代わりに、ホルムアミド洗浄バッファーで洗浄中に細胞のペレットを助ける米国科学から低付着の管の使用をおすすめします。全体的にみて、私達のプロトコルは一貫して効率的なイメージングのため十分な高密度の細胞の膜を生成できます。通常は、7 の視野を得られるはず > 130、定量化のため適当な細胞。
最後に、最適パラメーターおよび画像解析から必要な出力を決定することが重要です。公開されている解析プログラムは smFISH スポットを検出、一般的バック グラウンド信号を削除するガウス カーネルを使用して raw 画像をフィルターし、画像2,17の各セットで使用する信号対雑音比を決定してもらいます。残念ながら、現在、適切なパラメーターが決定する単一の標準はなく、だからこれらさまざまな設定のいくつかの実証的な検証が必要です。これらの各手順に必要なパラメーターを設定するには、繰り返し別のパラメーターのセットを入力し、どれだけ各セットから得られた結果と一致するいくつかの代表的な細胞で手動カウントからチェックが必要です。1 組のパラメーターが見つかると、一度は、生育条件や遺伝的背景にもかかわらず得られた画像のほとんどに使えます。
さらに、1 つは smFISH 画像の最大強度投影できる定量化22の前に実行する場合をテストできます。この手順では、スポットの検出アルゴリズムを簡素化し、彼らの細胞レベル下のローカリゼーションなど、個々 のスポットに関するいくつかの潜在的に有用な情報を犠牲にしても、撮像時間を大幅に短縮します。私たちのケースでNDC80遺伝子によって生成される mRNA の分子の数はこの処理 (新進の転写物酵母3、7のためか珍しく) 後、スポットは分かれても十分に低かった。共局在解析が重要な場合は、解析パイプラインの共存を評価するためにそれぞれのチャネル内の各 smFISH スポットの場所を決定する必要があります。特定の質問に応じて求められている、各スポットの強度などの他の情報も詳しく分析するためパイプラインから抽出する必要があります。プロトコル キーを最適化する手順し、画像解析パイプラインは興味のある質問を研究する smFISH データの高品質を得ることが重要です。

遺伝子発現の動的な制御は、代謝環境ストレス、感染症、および変更への応答と同様、有機体の開発をドライブします。転写制御に焦点を当てる研究は RNA 量測定技術に頼る。単一分子蛍光性上皮内交配 (smFISH) と呼ばれる 1 つそのような方法は、単一セル1,2で個々 の RNA 分子の検出に使用します。このメソッドでは、遺伝子発現、細胞間の変動の測定と細胞内の RNA の局在性の決定をことができます。
最も一般的に使用される smFISH の手法で個々 の RNA 分子の検出は、複数短い DNA のプローブ (多くの場合 ~ 48 20 mer プローブ) 標的 RNA を補完し、同じ蛍光色素の共役を必要があります。弱い信号における単一蛍光プローブの結合結果が、すべてのプローブのアンサンブルからの信号は堅牢です。にもかかわらず、単一のプローブでは、ターゲットからバインディングを表わすことができる、このような信号は、ターゲット RNA 分子3のに比べて非常に弱いと予想されるので、この機能は信号対雑音比を大幅に向上します。検出の誤差範囲内で RNA 分子の数をカウントし、様々 な成長条件と異なる突然変異体間で比較できます。
その最初の開発以来 smFISH は、遺伝子式4、転写伸長1,2,5,6、7を破裂転写スプライシングなどのさまざまな側面を研究する適応されています,8,9細胞内の対立表現10、11,12RNA 局在13,14,15最近、我々 の同じ遺伝子の 2 つの議事録フォームの発現を研究するこのメソッドを使用している短い写しアイソ フォーム (NDC80ORF) 長いアイソ フォーム (NDC80白頭と共有の全体のシーケンスを)16。2 つのプローブ セットを用いて 2 つの mRNA のアイソ フォームを一意に識別するには、: 1 セットはNDC80白頭一連のユニークな他の設定では、他の蛍光色素の共役を 2 つのアイソ フォームの共通の領域にバインドします。一方では両方の蛍光信号のNDC80白頭RNA をコードして, スポットとして識別、 NDC80ORF RNA は一般的なプローブ セットからの信号のみが含まれています。数、 NDC80ORF自信を持って smFISH スポットを特定し、エラーを削減するプローブの交配の高効率化と高い信号対雑音比が必要、成績証明書を「差分」法による計算伝搬します。
本稿では、出芽酵母酵母の smFISH を実行するための最適化されたプロトコルについて説明します。SK1 ひずみ背景出芽酵母の中の栄養このプロトコル、セル数、固定時間、消化時間、消化バッファー、プローブの濃度および交配の smFISH 実験のために使用されるバッファーに最適化成長または減数分裂です。しかし、我々 はこの原稿でなお: (1) 画像集録、およびプロトコル別の系統の背景と成長条件の最適化が必要で (2) の手順を実行後、smFISH データの品質をチェックするようメソッド。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:881px;" width="881">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:205px;">BSA, RNase-free (50 mg/mL)</td>
			<td style="width:99px;">Ambion</td>
			<td style="width:87px;">AM2616</td>
			<td style="width:491px;">Store at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:205px;">Catalase</td>
			<td style="width:99px;">Sigma</td>
			<td style="width:87px;">C3515</td>
			<td style="width:491px;">Store at 4 &#176;C for short-term. Vortex before use.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:205px;">DAPI</td>
			<td style="width:99px;">Sigma</td>
			<td style="width:87px;">D9564</td>
			<td style="width:491px;">Store at -20 &#176;C after reconstitution in water. Protect from light.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:205px;">50% Dextran Sulfate</td>
			<td style="width:99px;">Milli Pore</td>
			<td style="width:87px;">S4030</td>
			<td style="width:491px;">Store at room temperature. Very viscous liquid. Handle with patience.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:205px;">E. coli tRNA</td>
			<td style="width:99px;">Sigma</td>
			<td style="width:87px;">R4251</td>
			<td style="width:491px;">Store at -20 &#176;C in aliquots after reconstitution in water.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:205px;">Ethanol (100%, 200 proof)</td>
			<td style="width:99px;">various</td>
			<td style="width:87px;"></td>
			<td style="width:491px;">Flammable.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:205px;">37% Formaldehyde</td>
			<td style="width:99px;">Fisher</td>
			<td>F79-500</td>
			<td style="width:491px;">Store at room temperature. Toxic. Use and dispose with caution.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:205px;">Formamide</td>
			<td style="width:99px;">Ambion</td>
			<td style="width:87px;">AM9342</td>
			<td style="width:491px;">Store at 4 &#176;C. Open after the temperature equilibrates to room temperature in order to prevent oxidation. Toxic. Use and dispose with caution.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:205px;">Glucose</td>
			<td style="width:99px;">various</td>
			<td style="width:87px;"></td>
			<td style="width:491px;">Store at 4 &#176;C after dissolving in nuclease-free water.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:205px;">Glucose oxidase</td>
			<td style="width:99px;">Sigma</td>
			<td style="width:87px;">G2133</td>
			<td style="width:491px;">Store at -20 &#176;C in aliquots after reconstitution in 50 mM NaOAc, pH 5.</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:205px;">Nuclease-free water</td>
			<td style="width:99px;">Ambion</td>
			<td style="width:87px;">AM9932</td>
			<td style="width:491px;">Store at room temperature.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:205px;">Potassium phosphate (monobasic and dibasic)</td>
			<td style="width:99px;">various</td>
			<td style="width:87px;"></td>
			<td style="width:491px;">Store at room temperature.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:205px;">Probe library, diluted in TE, pH 8.0&#160;</td>
			<td style="width:99px;">Biosearch Technologies</td>
			<td style="width:87px;"></td>
			<td style="width:491px;">Store at -20 &#176;C in aliquots (5 &#181;L) after reconstitution in TE pH 8.0, following the instructions from the manufacturer. Protect from light.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:205px;">Sorbitol</td>
			<td style="width:99px;">various</td>
			<td style="width:87px;"></td>
			<td style="width:491px;">Store at room temperature.</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:205px;">20X SSC</td>
			<td style="width:99px;">Ambion</td>
			<td style="width:87px;">AM9763</td>
			<td style="width:491px;">Store at room temperature.</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:205px;">TE, pH 8.0</td>
			<td style="width:99px;">Ambion</td>
			<td style="width:87px;">AM9849</td>
			<td style="width:491px;">Store at room temperature.</td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:31px;width:205px;">1 M Tris, pH 8.0</td>
			<td style="width:99px;">Ambion</td>
			<td style="width:87px;">AM9856</td>
			<td style="width:491px;">Store at room temperature.</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:205px;">Trolox</td>
			<td style="width:99px;">Sigma</td>
			<td style="width:87px;">238813</td>
			<td style="width:491px;">Store at -20 &#176;C in aliquots.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:205px;">200 mM Vanadyl ribonucleoside complex (VRC)</td>
			<td style="width:99px;">NEB</td>
			<td style="width:87px;">S1402S</td>
			<td style="width:491px;">Store at -20 &#176;C in aliquots after reconstitution, following the instructions from the manufacturer.</td>
		</tr>
		<tr height="44">
			<td height="44" style="height:44px;width:205px;">Zymolyase 100T</td>
			<td style="width:99px;">MP Biomedicals</td>
			<td style="width:87px;">08320932</td>
			<td style="width:491px;">Store at -20 &#176;C in aliquots after reconstitution in water.</td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:205px;">Low-adhesion tubes</td>
			<td style="width:99px;">USA Scientific</td>
			<td>1415-2600</td>
			<td style="width:491px;">Store at room temperature.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single molecule fluorescence in situ hybridization (smfish) analysis in budding yeast vegetative growth and meiosis

単一分子蛍光の in situハイブリダイゼーション (smFISH) は、その能力を検出し、個々 の RNA 分子をカウントのための単一細胞における遺伝子発現を研究する強力な手法です。深いシーケンス ベースの方法を補完するもの、smFISH は、トラン スクリプト豊富に細胞間変異と指定された RNA の細胞内分布についてを説明します。最近、我々 は出芽酵母の減数分裂期に遺伝子NDC80の発現を研究する smFISH を使用している、どの 2 つのトラン スクリプトにアイソ フォームが存在する、短い写しアイソ フォーム長いアイソ フォームと共有の全体シーケンス。自信を持って各トラン スクリプト アイソ フォームを識別するため、我々 は知られている smFISH プロトコルを最適化し、新進の中に取得したサンプルの smFISH データの高い一貫性と品質を得られる酵母の減数分裂です。ここでは、この最適化されたプロトコルは、かどうか smFISH データの高品質が得られると他の酵母菌株と成長条件でこのプロトコルを実装するためのいくつかのヒントを決定するために使用する基準について述べる。

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Single Molecule Fluorescence In Situ Hybridization smFISH Analysis in Budding Yeast Vegetative Growth and Meiosis

この単一分子蛍光その場で交配のプロトコルは、栄養生長と減数分裂中出芽酵母の RNA 分子の数を数値化に最適です。

単一分子蛍光In-situハイブリダイゼーション (smFISH) における出芽酵母の栄養増殖と減数分裂

Single molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) is a powerful technique to study gene expression in single cells due to its ability to detect ...

single-molecule-fluorescence-situ-hybridization-smfish-analysis

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Genetics

Single Molecule Fluorescence In Situ Hybridization (smFISH) Analysis in Budding Yeast Vegetative Growth and Meiosis

19.1K ビュー.  University of California, Berkeley. この単一分子蛍光その場で交配のプロトコルは、栄養生長と減数分裂中出芽酵母の RNA 分子の数を数値化に最適です。

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Detection of Inter-chromosomal Stable Aberrations by Multiple Fluorescence In Situ Hybridization (mFISH) and Spectral Karyotyping (SKY) in Irradiated Mice

Ionizing radiation (IR) induces numerous stable and unstable chromosomal aberrations. Unstable aberrations, where chromosome morphology is substantially compromised, can easily be identified by conventional chromosome staining techniques. However, detection of stable aberrations, which involve exchange or translocation of genetic materials without considerable modification in the chromosome morphology, requires sophisticated chromosome painting techniques that rely on in situ hybridization of fluorescently labeled DNA probes, a chromosome painting technique popularly known as fluorescence in situ hybridization (FISH). FISH probes can be specific for whole chromosome/s or precise sub-region on chromosome/s. The method not only allows visualization of stable aberrations, but it can also allow detection of the chromosome/s or specific DNA sequence/s involved in a particular aberration formation. A variety of chromosome painting techniques are available in cytogenetics; here two highly sensitive methods, multiple fluorescence in situ hybridization (mFISH) and spectral karyotyping (SKY), are discussed to identify inter-chromosomal stable aberrations that form in the bone marrow cells of mice after exposure to total body irradiation. Although both techniques rely on fluorescent labeled DNA probes, the method of detection and the process of image acquisition of the fluorescent signals are different. These two techniques have been used in various research areas, such as radiation biology, cancer cytogenetics, retrospective radiation biodosimetry, clinical cytogenetics, evolutionary cytogenetics, and comparative cytogenetics.

Detection of Inter-chromosomal Stable Aberrations by Multiple Fluorescence In Situ Hybridization mFISH and Spectral Karyotyping SKY in Irradiated Mice

The present protocol describes the usefulness of multiple fluorescence in situ hybridization (mFISH) and spectral karyotyping (SKY) in identifying inter-chromosomal stable aberrations in the bone marrow cells of mice after exposure to total body irradiation.

複数の蛍光によるインター染色体安定型異常の検出<em&gt;その場で</em&gt;ハイブリダイゼーション（mFISH）と照射されたマウスにおけるスペクトル核型分析（SKY）

Ionizing radiation (IR) induces numerous stable and unstable chromosomal aberrations. Unstable aberrations, where chromosome morphology is substantially ...

遺伝学

Targeted in Situ Mutagenesis of Histone Genes in Budding Yeast

We describe a PCR- and homologous recombination-based system for generating targeted mutations in histone genes in budding yeast cells. The resulting mutant alleles reside at their endogenous genomic sites and no exogenous DNA sequences are left in the genome following the procedure. Since in haploid yeast cells each of the four core histone proteins is encoded by two non-allelic genes with highly homologous open reading frames (ORFs), targeting mutagenesis specifically to one of two genes encoding a particular histone protein can be problematic. The strategy we describe here bypasses this problem by utilizing sequences outside, rather than within, the ORF of the target genes for the homologous recombination step. Another feature of this system is that the regions of DNA driving the homologous recombination steps can be made to be very extensive, thus increasing the likelihood of successful integration events. These features make this strategy particularly well-suited for histone gene mutagenesis, but can also be adapted for mutagenesis of other genes in the yeast genome.

Targeted in Situ Mutagenesis of Histone Genes in Budding Yeast

A strategy for generating mutations in histone genes at their endogenous location in Saccharomyces cerevisiae is presented.

ターゲットを絞りました<em&gt;その場で</em出芽酵母におけるヒストン遺伝子の&gt;突然変異誘発

We describe a PCR- and homologous recombination-based system for generating targeted mutations in histone genes in budding yeast cells. The resulting ...

Single Molecule Analysis of Laser Localized Psoralen Adducts

The DNA Damage Response (DDR) has been extensively characterized in studies of double strand breaks (DSBs) induced by laser micro beam irradiation in live cells. The DDR to helix distorting covalent DNA modifications, including interstrand DNA crosslinks (ICLs), is not as well defined. We have studied the DDR stimulated by ICLs, localized by laser photoactivation of immunotagged psoralens, in the nuclei of live cells. In order to address fundamental questions about adduct distribution and replication fork encounters, we combined laser localization with two other technologies. DNA fibers are often used to display the progress of replication forks by immunofluorescence of nucleoside analogues incorporated during short pulses. Immunoquantum dots have been widely employed for single molecule imaging. In the new approach, DNA fibers from cells carrying laser localized ICLs are spread onto microscope slides. The tagged ICLs are displayed with immunoquantum dots and the inter-lesion distances determined. Replication fork collisions with ICLs can be visualized and different encounter patterns identified and quantitated.

Lasers are frequently used in studies of the cellular response to DNA damage. However, they generate lesions whose spacing, frequency, and collisions with replication forks are rarely characterized. Here, we describe an approach that enables the determination of these parameters with laser localized interstrand crosslinks.

レーザーローカライズソラレン付加物の単一分子解析

The DNA Damage Response (DDR) has been extensively characterized in studies of double strand breaks (DSBs) induced by laser micro beam irradiation in live ...

High Resolution Fluorescent In Situ Hybridization in Drosophila Embryos and Tissues Using Tyramide Signal Amplification

In our efforts to determine the patterns of expression and subcellular localization of Drosophila RNAs on a genome-wide basis, and in a variety of tissues, we have developed numerous modifications and improvements to our original fluorescent in situ hybridization (FISH) protocol. To facilitate throughput and cost effectiveness, all steps, from probe generation to signal detection, are performed using exon 96-well microtiter plates. Digoxygenin (DIG)-labelled antisense RNA probes are produced using either cDNA clones or genomic DNA as templates. After tissue fixation and permeabilization, probes are hybridized to transcripts of interest and then detected using a succession of anti-DIG antibody conjugated to biotin, streptavidin conjugated to horseradish peroxidase (HRP) and fluorescently conjugated tyramide, which in the presence of HRP, produces a highly reactive intermediate that binds to electron dense regions of immediately adjacent proteins. These amplification and localization steps produce a robust and highly localized signal that facilitates both cellular and subcellular transcript localization. The protocols provided have been optimized to produce highly specific signals in a variety of tissues and developmental stages. References are also provided for additional variations that allow the simultaneous detection of multiple transcripts, or transcripts and proteins, at the same time.

High Resolution Fluorescent In Situ Hybridization in Drosophila Embryos and Tissues Using Tyramide Signal Amplification

The described RNA in situ hybridization protocol allows the detection of RNA in whole Drosophila embryos or dissected tissues. Using 96-well microtiter plates and tyramide signal amplification, transcripts can be detected at high resolution, sensitivity, and throughput, and at a relatively low cost.

ショウジョウバエの胚とパスチラミドシグナル信号増幅を利用した生体表面の高解像度蛍光In Situハイブリダイゼーション

In our efforts to determine the patterns of expression and subcellular localization of Drosophila RNAs on a genome-wide basis, and in a variety of ...

Real-time Analysis of Transcription Factor Binding, Transcription, Translation, and Turnover to Display Global Events During Cellular Activation

Upon activation, cells rapidly change their functional programs and, thereby, their gene expression profile. Massive changes in gene expression occur, for example, during cellular differentiation, morphogenesis, and functional stimulation (such as activation of immune cells), or after exposure to drugs and other factors from the local environment. Depending on the stimulus and cell type, these changes occur rapidly and at any possible level of gene regulation. Displaying all molecular processes of a responding cell to a certain type of stimulus/drug is one of the hardest tasks in molecular biology. Here, we describe a protocol that enables the simultaneous analysis of multiple layers of gene regulation. We compare, in particular, transcription factor binding (Chromatin-immunoprecipitation-sequencing (ChIP-seq)), de novo transcription (4-thiouridine-sequencing (4sU-seq)), mRNA processing, and turnover as well as translation (ribosome profiling). By combining these methods, it is possible to display a detailed and genome-wide course of action.
Sequencing newly transcribed RNA is especially recommended when analyzing rapidly adapting or changing systems, since this depicts the transcriptional activity of all genes during the time of 4sU exposure (irrespective of whether they are up- or downregulated). The combinatorial use of total RNA-seq and ribosome profiling additionally allows the calculation of RNA turnover and translation rates. Bioinformatic analysis of high-throughput sequencing results allows for many means for analysis and interpretation of the data. The generated data also enables tracking co-transcriptional and alternative splicing, just to mention a few possible outcomes.
The combined approach described here can be applied for different model organisms or cell types, including primary cells. Furthermore, we provide detailed protocols for each method used, including quality controls, and discuss potential problems and pitfalls.

This protocol describes the combinatorial use of ChIP-seq, 4sU-seq, total RNA-seq, and ribosome profiling for cell lines and primary cells. It enables tracking changes in transcription-factor binding, de novo transcription, RNA processing, turnover and translation over time, and displaying the overall course of events in activated and/or rapidly changing cells.

転写因子の結合、細胞活性中に事象を表示する転写、翻訳、回転率のリアルタイム解析

Upon activation, cells rapidly change their functional programs and, thereby, their gene expression profile. Massive changes in gene expression occur, for ...

Visualization of Microbiota in Tick Guts by Whole-mount In Situ Hybridization

Infectious diseases transmitted by arthropod vectors continue to pose a significant threat to human health worldwide. The pathogens causing these diseases, do not exist in isolation when they colonize the vector; rather, they likely engage in interactions with resident microorganisms in the gut lumen. The vector microbiota has been demonstrated to play an important role in pathogen transmission for several vector-borne diseases. Whether resident bacteria in the gut of the Ixodes scapularis tick, the vector of several human pathogens including Borrelia burgdorferi, influence tick transmission of pathogens is not determined. We require methods for characterizing the composition of the bacteria associated with the tick gut to facilitate a better understanding of potential interspecies interactions in the tick gut. Using whole-mount in situ hybridization to visualize RNA transcripts associated with particular bacterial species allows for the collection of qualitative data regarding the abundance and distribution of the microbiota in intact tissue. This technique can be used to examine changes in the gut microbiota milieu over the course of tick feeding and can also be applied to analyze expression of tick genes. Staining of whole tick guts yield information about the gross spatial distribution of target RNA in the tissue without the need for three-dimensional reconstruction and is less affected by environmental contamination, which often confounds the sequencing-based methods frequently used to study complex microbial communities. Overall, this technique is a valuable tool that can be used to better understand vector-pathogen-microbiota interactions and their role in disease transmission.

Visualization of Microbiota in Tick Guts by Whole-mount In Situ Hybridization

Here, we present a protocol to spatially and temporally assess the presence of viable microbiota in tick guts using a modified whole-mount in situ hybridization approach.

ホール マウントIn Situハイブリダイゼーションによる目盛りの腸内微生物叢の可視化

Infectious diseases transmitted by arthropod vectors continue to pose a significant threat to human health worldwide. The pathogens causing these ...

Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay

Alternative splicing (AS) occurs in more than 90% of human genes. The expression pattern of an alternatively spliced exon is often regulated in a cell type-specific fashion. AS expression patterns are typically analyzed by RT-PCR and RNA-seq using RNA samples isolated from a population of cells. In situ examination of AS expression patterns for a particular biological structure can be carried out by RNA in situ hybridization (ISH) using exon-specific probes. However, this particular use of ISH has been limited because alternative exons are generally too short to design exon-specific probes. In this report, the use of BaseScope, a recently developed technology that employs short antisense oligonucleotides in RNA ISH, is described to analyze AS expression patterns in mouse brain sections. Exon 23a of neurofibromatosis type 1 (Nf1) is used as an example to illustrate that short exon-exon junction probes exhibit robust hybridization signals with high specificity in RNA ISH analysis on mouse brain sections. More importantly, signals detected with exon inclusion- and skipping-specific probes can be used to reliably calculate the percent spliced in values of Nf1 exon 23a expression in different anatomical areas of a mouse brain. The experimental protocol and calculation method for AS analysis are presented. The results indicate that BaseScope provides a powerful new tool to assess AS expression patterns in situ.

Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay

An in situ hybridization (ISH) protocol that uses short antisense oligonucleotides to detect alternative pre-mRNA splicing patterns in mouse brain sections is described.

代替の Pre-mrna スプライシング RNA In Situハイブリダイゼーション法によるマウス脳のセクションでの定量的解析

Alternative splicing (AS) occurs in more than 90% of human genes. The expression pattern of an alternatively spliced exon is often regulated in a cell ...

Tissue-specific miRNA Expression Profiling in Mouse Heart Sections Using In Situ Hybridization

micro-RNAs (miRNAs) are single-stranded RNA transcripts that bind to messenger RNAs (mRNAs) and inhibit their translation or promote their degradation. To date, miRNAs have been implicated in a large number of biological and disease processes, which has signified the need for the reliable detection methods of miRNA transcripts. Here, we describe a detailed protocol for digoxigenin-labeled (DIG) Locked Nucleic Acid (LNA) probe-based miRNA detection, combined with protein immunostaining on mouse heart sections. First, we performed an in situ hybridization technique using the probe to identify miRNA-182 expression in heart sections from control and cardiac hypertrophy mice. Next, we performed immunostaining for cardiac Troponin T (cTnT) protein, on the same sections, to co-localize miRNA-182 with the cardiomyocyte cells. Using this protocol, we were able to detect miRNA-182 through an alkaline phosphatase based colorimetric assay, and cTnT through fluorescent staining. This protocol can be used to detect the expression of any miRNA of interest through DIG-labeled LNA probes, and relevant protein expression on mouse heart tissue sections.

Tissue-specific miRNA Expression Profiling in Mouse Heart Sections Using In Situ Hybridization

micro-RNAs (miRNAs) are short and highly homologous RNA sequences, serving as post-transcriptional regulators of messenger RNAs (mRNAs). Current miRNA detection methods vary in sensitivity and specificity. We describe a protocol that combines in situ hybridization and immunostaining for concurrent detection of miRNA and protein molecules on mouse heart tissue sections.

マウス心臓のセクションを使用してその場で交配で発現組織固有の miRNA

micro-RNAs (miRNAs) are single-stranded RNA transcripts that bind to messenger RNAs (mRNAs) and inhibit their translation or promote their degradation. To ...

Characterizing Histone Post-translational Modification Alterations in Yeast Neurodegenerative Proteinopathy Models

Neurodegenerative diseases, such as amyotrophic lateral sclerosis (ALS) and Parkinson&#39;s disease (PD), cause the loss of hundreds of thousands of lives each year. Effective treatment options able to halt disease progression are lacking. Despite the extensive sequencing efforts in large patient populations, the majority of ALS and PD cases remain unexplained by genetic mutations alone. Epigenetics mechanisms, such as the post-translational modification of histone proteins, may be involved in neurodegenerative disease etiology and progression and lead to new targets for pharmaceutical intervention. Mammalian in vivo and in vitro models of ALS and PD are costly and often require prolonged and laborious experimental protocols. Here, we outline a practical, fast, and cost-effective approach to determining genome-wide alterations in histone modification levels using Saccharomyces cerevisiae as a model system. This protocol allows for comprehensive investigations into epigenetic changes connected to neurodegenerative proteinopathies that corroborate previous findings in different model systems while significantly expanding our knowledge of the neurodegenerative disease epigenome.

This protocol outlines experimental procedures to characterize genome-wide changes in the levels of histone post-translational modifications (PTM) occurring in connection with the overexpression of proteins associated with ALS and Parkinson&#39;s disease in Saccharomyces cerevisiae models. After SDS-PAGE separation, individual histone PTM levels are detected with modification-specific antibodies via Western blotting.

酵母神経変性認知症予備モデルにおけるヒストン翻訳後修飾変化の特性

Neurodegenerative diseases, such as amyotrophic lateral sclerosis (ALS) and Parkinson&#39;s disease (PD), cause the loss of hundreds of thousands of lives ...

Use of Single Molecule Fluorescent In Situ Hybridization (SM-FISH) to Quantify and Localize mRNAs in Murine Oocytes

Current methods routinely used to quantify mRNA in oocytes and embryos include digital reverse-transcription polymerase chain reaction (dPCR), quantitative, real-time RT-PCR (RT-qPCR) and RNA sequencing. When these techniques are performed using a single oocyte or embryo, low-copy mRNAs are not reliably detected. To overcome this problem, oocytes or embryos can be pooled together for analysis; however, this often leads to high variability amongst samples. In this protocol, we describe the use of fluorescence in situ hybridization (FISH) using branched DNA chemistry. This technique identifies the spatial pattern of mRNAs in individual cells. When the technique is coupled with Spot Finding and Tracking&#160;computer software, the abundance of mRNAs in the cell can also be quantified. Using this technique, there is reduced variability within an experimental group and fewer oocytes and embryos are required to detect significant differences between experimental groups. Commercially available branched-DNA SM-FISH kits have been optimized to detect mRNAs in sectioned tissues or adherent cells on slides. However, oocytes do not effectively adhere to slides and some reagents in the kit were too harsh resulting in oocyte lysis. To prevent this lysis, several modifications were made to the FISH kit. Specifically, oocyte permeabilization and wash&#160;buffers designed for the immunofluorescence of oocytes and embryos replaced the proprietary buffers. The permeabilization, washes, and incubations with probes and amplifier were performed in 6-well plates and oocytes were placed on slides at the end of the protocol using mounting media. These modifications were able to overcome the limitations of the commercially available kit, in particular, the oocyte lysis. To accurately and reproducibly count the number of mRNAs in individual oocytes, computer software was used. Together, this protocol represents an alternative to PCR and sequencing to compare the expression of specific transcripts in single cells.

Use of Single Molecule Fluorescent In Situ Hybridization SM-FISH to Quantify and Localize mRNAs in Murine Oocytes

To reproducibly count the numbers of mRNAs in individual oocytes, single molecule RNA fluorescence in situ hybridization (RNA-FISH) was optimized for non-adherent cells. Oocytes were collected, hybridized with the transcript specific probes, and quantified using an image quantification software.