著者は人間を提供するためスタンフォード大学からウィリアム ・ タルボットに感謝の意を表したいと思いますNrg1cDNA とを提供するための UCSD からデボラ ・ Yelon、wea変異体。著者も感謝したいシンシア陳画像の取得で助けるため。この研究は (t. k. Hsiai) に NIH の HL118650 の補助金によって支えられました (t. k. Hsiai) に HL083015、HD069305 (ノースカロライナ州チーと t. k. Hsiai.) に、(t. k. Hsiai、ノースカロライナ州 Chi) に HL111437 (t. k. Hsiai) に HL129727、(r. r. Sevag パッカード) に T32HL007895 (V. メッサーシュ ミット) に HL 134613 と(J. リー) へ星をテキサス州の資金の大学.

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このプロトコルでは、我々 は 4 D イメージングを生体力学的力の変化に対応した骨梁ネットワークの発展を追跡する使用ことができることを示しています。特に、血管内皮細胞による経験豊富な剪断応力は、ノッチ シグナル伝達カスケードは、順番に肉を促進するを開始します。本稿では、我々 は、(1) gata1a MO 注入減少造血、したがってそれは壁面せん断応力を減少、抑制 (2) tnnt2a MO (3) wea と壁面せん断応力を減らすため心室の収縮機能を示されています。変異体を欠いて心房、心室、血行力減少がみられる。心臓壁のせん断応力を減らしては qRT PCR によって Notch シグナルを定量化し、減らされた WSS であることがわかった Notch シグナルを減少します。心内膜に欠けていたclo変異体は梁、さらに我々 の仮説を証明するために形作らないし、そのせん断応力は、Notch シグナル活性化を示した ADAM10 存在と拍動のせん断応力を血管内皮細胞にかけること。
共焦点顕微鏡など他のイメージング技術は、3次元14のイメージ サンプルを使用できます。しかし、この手法など多くの欠点があります。たとえば、共焦点レーザー顕微鏡のサンプルに深く突き通すことができない、軸の低解像度、低速スキャン速度19,42。共焦点レーザー顕微鏡の浸透深さの制限によりゼブラフィッシュ胚などの小さいサンプルだけ完全に視覚化されます。二光子励起共焦点顕微鏡浸透深さを向上しますが、解像度、走査速度が遅いと高コストを作るこの手法の望ましくない13。正常に 2 光子励起顕微鏡と LSFM を組み合わせた研究がされている18、しかし、欠点は、まだ顕著な42。
LSFM、一方では、少なくとも写真漂白と被害13,18,42、高速集録速度、同様の浸透深さ13。さらに、デュアル レンズ、1 つの平面(図 1)の励起のためのバック グラウンド ノイズは大幅に減らされた43です。ただし、サンプルは、体内モデル ゼブラフィッシュ14,17,19以外に適用することは困難になるサンプルの固定化ゲルに埋め込まれる必要があります。また、蛍光灯の光の利用は数ミリに深さの浸透を制限します。にもかかわらず、LSFM は、可視化のための素晴らしい方法です、それは量的データで補われることが重要です。LSFM、質的に限られるために、様々 な解釈の対象となることです。QRT PCR を使用して、LFSM 4 D の画像がライブのサンプルで発生するイベントの正確な表現であることを確認できた。時折より大きいサンプルでストライプと影を画像で形成できます。ただし、両面イルミネーションや mSPIM は、これらの成果物の42を減らすために利用できます。LSFM は汎用性が高く、高解像度と全体的に良い品質の画像をキャプチャの能力は LSFM 約束の未来を作る。以前述べたように、成功したイメージング18,42の他のイメージング システムと LSFM を結合できます。
以前 23 × 10-5 N 1 Hz で 24 h の拍動せん断応力を大幅に適用する upregulates ノッチ シグナル伝達の in vitro(図 4)17デモンストレーションを行った。我々 はさらにせん断力が造血 (gata1a MO)4, 心筋収縮 (tnnt1a MO)5、心房収縮 (wea変異)、心内膜の遺伝的操作による Notch シグナルを活性化することを実証削除 (clo変異体)、および Notch シグナル (Tg [flk:mCherry; tp1:gfp]) のローカリゼーション。ここで述べたいことノッチ関連遺伝子が調整される(図 2 K, L, M)、心室壁のせん断応力を下げることによって。さらに、 Nrg1 mRNA Notch シグナル、復元、肉を救出することができることを証明し、心室短縮率や駆出率を向上させることができました (図 2 e, F, H, K M、図 5).心臓の機能の回復は、Notch シグナル(図 2 KM)を活性化関数を介するの血行力学的力は収縮の増加によって示されました。
せん断応力アクティブ Notch シグナルが心内膜依存性であることも決定。Gata1aミズーリ、 tnnt2a MO、 wea変異体または AG1478 治療を使用して肉が抑制され、Notch シグナルは調整される(図 2 KM)。Nrg1救出肉と Notch シグナルwea変異体でただしとミズーリ州(図 2 D, H, K, L)共同gata1aを注入します。壁せん断応力 (EPO注射) や Notch シグナル (10 pg/nL Nrg1注入) の増加、形態面でEPOグループの変更はなかったが、心室形態異常がNrg1 の存在増量(図 3)。
結論として、私たちは剪断応力のメカノトランスダクションがノッチ シグナル伝達経路を活性化するを示しています。4 D LSFM と遺伝子組換えゼブラフィッシュを用いて開発したモデル システムの重要性の血流を示す形態、収縮性、全体的な機能と心臓の開発中であります。

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/video/57763/light-sheet-fluorescence-microscopy-to-capture-4-dimensional-images">Light-sheet Fluorescence Microscopy to Capture 4-Dimensional Images of the Effects of Modulating Shear Stress on the Developing Zebrafish Heart</a>.&#160;Additional author names were added, and an author affiliation was updated.
The author list was updated from:
Victoria Messerschmidt*1, Zachary Bailey*1, Kyung In Baek2, Richard Bryant1, Rongsong Li2, Tzung K. Hsiai2, Juhyun Lee1
to:
Victoria Messerschmidt*1, Zachary Bailey*1, Kyung In Baek2, Yichen Ding2, Jeffrey J. Hsu2, Richard Bryant1, Rongsong Li2, Tzung K. Hsiai2, Juhyun Lee1
The author affiliation for Rongsong Li was updated from:
Department of Medicine (Cardiology) and Bioengineering, UCLA
to:
College of Health Science and Environmental Engineering, Shenzhen Technology University

An erratum was issued for: <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/video/57763/light-sheet-fluorescence-microscopy-to-capture-4-dimensional-images">Light-sheet Fluorescence Microscopy to Capture 4-Dimensional Images of the Effects of Modulating Shear Stress on the Developing Zebrafish Heart</a>. Additional&#160;author names were&#160;added, and an author affiliation was updated.

Erratum: Light-sheet Fluorescence Microscopy to Capture 4-Dimensional Images of the Effects of Modulating Shear Stress on the Developing Zebrafish Heart

血行動態のせん断応力などの生体力学的力は心臓の形態形成に密接に関与しています。血行動態のせん断力に対し、心筋の隆起部分および溝は房室 (AV) 弁1にわたってせん断応力の方向と配置で波のような骨梁ネットワークで開発します。心臓肉収縮機能と心筋質量2を増加する必要があります。Notch シグナルの突然変異の結果人間および他の脊椎動物3先天性心疾患。たとえば、 gata1a4 、 tnnt2a5 morpholino オリゴヌクレオチド (MO) は、エリスロポエチン (EPO) mRNA6とイソプロテレノール (ISO)7増加赤血球、赤血球を減らすために示されています。セルと心拍数, その壁せん断応力 (WSS)。さらに、ErbB2 下流シグナリング、ノッチ、促進する心筋細胞の増殖と分化、Notch シグナル8,9を起動収縮力を生成します。そのせん断応力が Notch シグナル心室開発の駆動肉を支配するをお勧めします。現在、さらに先天性心臓欠陥 (CHD)10、11,12につながる遺伝的プログラミング イベントを理解しようと多くの研究がありますが、ほとんどの調査はどのように機械力形成の心に影響を与えます。
機械の力を調査するために発達期間中に観察、心内膜に作用を実装する必要があります。しかし生体内で伝統的な顕微鏡13の内属のためサンプルを破っての質の良い画像を取得するために挑戦です。物理的な区分および染色はサンプル内で時間をかけて開発を観察するために、したがって、13,14,15を発生する必要。共焦点顕微鏡画像サンプル14,16の 3次元構造に用い、これらのイメージング システムの取得まだ遅いスキャン速度によって制限されます。
光シート蛍光顕微鏡 (LSFM) は、動的イベント長い作業距離13で生体内での可視化を可能にするユニークなイメージング手法です。この技法は、サンプル17を光学セクションのライト シート蛍光顕微鏡を使用します。サンプルに光の薄いシートのみの照明、写真漂白、写真毒性13,18削減あります。ビューと長作動距離の大きい分野は、大きなサンプル画像13,14,17ありのままそのままをことができます。低倍率で、永い間、イメージを作成する大きい区域は、作動距離厚いサンプル信号対雑音比を損なうことがなくイメージを作成することができます。多くのグループ、画像全体胚17に LSFM を使用して脳14,18筋肉と心19他の組織の中で多様なイメージを作成することができますのサンプルを示します。
前の研究は、ゼブラフィッシュ心臓の流入または流出のトラックを遮蔽して減らされた血行力学的せん断力を実証、情報はもっぱら定性的です。それによって異常な第 3 室、減少心臓ループと障害弁形成20。4 D の LSFM 画像は、心臓組織の開発血行動態のせん断力に影響を与える方法に新しい視点を与えます。これらの機械力が敏感なシグナリング分子をアクティブにし、骨の隆起部分の形成を誘導します。4 D イメージングの追加時間の側面、ためこれまで見過ごされていた新しい啓示につながる可能性がリアルタイムでの変化を追跡することであります。ゼブラフィッシュ イメージング科学者は、細胞間の相互作用だけ対全体の脊椎動物を観察できるための理想的なモデルであります。酸素もなしに行われる血管システムに応じてとは異なり哺乳類の開発の開発を可能にする全体の胚を介して拡散します。ゼブラフィッシュ心臓 4 chambered 中心、肺の器官を欠いているにもかかわらず、ゼブラフィッシュと人間21の間保存されている心臓の遺伝子の数が多いがあります。
本稿では、ゼブラフィッシュの心のさまざまな状況で発展途上の梁をイメージさせるライト シート蛍光顕微鏡を使用する方法をについて説明します。まず、 gata1a4 tnnt2a5の注射 MOs は低血液粘度と WSS に使用されました。心臓の形態を記録しただった。魚の別のグループ、 EPO mRNA6またはイソプロテレノール7を管理することにより、WSS を増やし、結果を観察しました。異なる脈動や振動流量と細胞の調査を実施しました。各グループをイメージング、わかった WSS をノッチによる心内膜で感じたこと開始肉をシグナリングします。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Clontech Hifi PCR pre-mix&#160;</td>
			<td>Takara&#160;</td>
			<td>639298</td>
			<td>PCR mastermix 
			1.1.1.1, 1.1.1.2, 1.1.1.5, 1.1.2.1, 3.1.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Nrg1 cDNA</td>
			<td>Gift from William Talbot, Stanford University, Stanford, California, USA</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Used for trabeculation rescue 
			1.1.1.3, 1.1.1.4, 1.1.2.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CFX Connect&#8482; Real-Time PCR Detection System</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1855201</td>
			<td>PCR Machine 
			1.1.1.5, 1.1.1.6, 1.1.2.2, 1.1.3.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCS2+</td>
			<td>GE Health</td>
			<td></td>
			<td>Plasmid used to synthesize mRNA 
			1.1.2.1, 1.1.2.4, 1.1.2.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nucleospin purification kit&#160;&#160;</td>
			<td>Clontech</td>
			<td>740609.25</td>
			<td>DNA Purification 
			1.1.2.3, 1.1.2.4, 1.1.6.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA ligase&#160;</td>
			<td>Clontech</td>
			<td>2011A</td>
			<td>PCR Ligation solution 
			1.1.2.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stellar competent cells</td>
			<td>Clontech</td>
			<td>636763</td>
			<td>E. coli cells used for transformation 
			1.1.2.6, 1.1.3.1, 1.1.3.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000 transfection reagent</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11668027</td>
			<td>Transfection reagent 
			1.1.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mMessage SP6 kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM1340</td>
			<td>Kit used to synthesize mRNA 
			1.1.6.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aurum Total RNA Mini Kit</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>7326820</td>
			<td>Purifies RNA&#160; 
			1.1.6.4, 3.1.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeneTools 4.3.8</td>
			<td>GeneTools</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Software for primer design 
			1.2.1, 3.1.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EPO cDNA</td>
			<td>Creative Biogene</td>
			<td>CDFH006026</td>
			<td>Increases WSS 
			1.2.2, 1.2.3, 1.1.7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AG1478</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>T4182</td>
			<td>ErbB inhibitor 
			1.3.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E3 medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>To grow embryos 
			1.3.1, 1.3.2, 5.1.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPT</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>D5942</td>
			<td>&#947;-secretase inhibitor 
			1.3.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>A9539</td>
			<td>Used for mounting embryos 
			2.1.1.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ORCA-Flash4.0 LT&#160;Digital CMOS camera</td>
			<td>Hamamatsu Photonics</td>
			<td>C11440-42U</td>
			<td>Used to capture Images 
			2.1.1.2, 2.1.1.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amira Software</td>
			<td>FEI Software</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Visualized and Analysed images into 3D, and 4D 
			2.1.5.1.1-2.1.5.2.8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaone mesylate&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>886-86-2</td>
			<td>Used to humanely sedated or sacrifice embryos 
			3.1.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iScript cDNA Synthesis Kit</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1708890</td>
			<td>Synthesizes cDNA 
			3.1.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf 5424 microcentrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>05-400-005</td>
			<td>Microcentrifuge 
			4.1.1.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GI254023X</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>260264-93-5</td>
			<td>ADAM10 inhibitor 
			4.1.2, 4.1.3&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoprenaline hydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>I5627</td>
			<td>Isoproterenol increases WSS 
			5.1.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB</td>
			<td>Mathworks</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Cardiac mechanics analysis</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

light-sheet fluorescence microscopy to capture 4-dimensional images of the effects of modulating shear stress on the developing zebrafish heart

血行動態の軍によって心臓の影響心臓開発、特に肉は、分岐増生心筋からのネットワークを形成する経験します。ノッチ シグナル伝達カスケードは心室欠損症左室非圧縮の心筋症や左心低形成症候群などに関与しているの欠陥の遺伝的プログラム.このプロトコルを使用して、それを決定できます駆動せん断応力肉と Notch シグナルは互いに関連しています。光シート蛍光顕微鏡を用いたゼブラフィッシュ心臓の開発の可視化は可能だった。本稿では、それは血行力 Notch シグナルによる肉の開始を調節してしたがって、収縮機能に影響を与えるかどうかが評価されたに発生します。質的・量的にせん断応力解析、4 D (3-D + 時間) ゼブラフィッシュ心臓の形態形成時に得られた画像と 4 D 同期統合光シート蛍光顕微鏡は心室拍動を捕獲しました。血液粘度ではそれにより、せん断応力を減少する - morpholino gata1a(MO) のオリゴヌクレオチド マイクロ射出成形を介してダウン調整ノッチ シグナル伝達と減衰の肉が減った。Gata1a MO のNrg1 mRNA の共射出は、肉を復元するノッチ関連遺伝子を救出しました。Notch シグナルを駆動せん断応力影響肉を確認する心筋細胞の収縮はさらにtnnt2a経由で逮捕された -MO、それにより血行力を減らすために非 trabeculated を開発するノッチ標的遺伝子をダウン調整心筋。最後に、せん断応力応答ノッチ遺伝子の発現パターンの確証は、内皮細胞を拍動流に服従させることによって行なわれました。したがって、4 D ライト シート顕微鏡は非圧縮の心筋症に臨床的意義と Notch シグナルと肉を基になる血行力を発見しました。

LSFM は、高解像度の 2 D と 3 D の画像を取得するためにこの原稿で使用されました。図 1 aおよび1 bに見られるように照明レンズはサンプルで光シートを指示します。光シートの薄さ、ため 1 つの平面だけが点灯します。検出レンズ照明レンズに垂直に配置されたは、照らされた面 (図 1 b) に焦点を当てた。照明レンズから光のシートは、左から右 (図 1) のサンプルを検索します。スキャン写真漂白、写真-毒性となっており低い信号対雑音比。
LSFM は急速なスキャン (> 30 s) ボクセル解像度を持つ × 0.65 0.65 の x 1 μ m 単一平面照明のためによりTg(cmlc2a:gfp)胚全体の心臓構造34を視覚化するために適用された、バック グラウンド ノイズが大幅に減少(図 1)。海綿の尾根が 75 で心室内腔へ突出 hpf と骨梁ネットワーク明確に 100 で示された hpf (図 2 aB)。Gata1aMO マイクロ射出成形は、造血、粘度を 904,35減。この減少の粘性減衰せん断応力、血行力学的遅延の開始および 75 の骨梁ネットワークの密度で hpf と 100 hpf (図 2 Cは、D) の制御グループと比較されたとき。さらに、ワンランク上の配位子 (Dll4、 Jag1、およびJag2) の受容体 (Notch1b)、下流のシグナル伝達コンポーネント (Nrg1とErbB2) gata1a MO に対して調整されます。インジェクション (p < 0.05、n = 5) (図 2 K)2,8,36。Gata1a MO Nrg1 mRNA をノッチ シグナル伝達関連遺伝子発現と救出の骨梁形成の 5 μ M と 75 の共射出 hpf と 100 hpf (図 2 e F K)。したがって、 gata1a MO はNrg1 mRNA 救助ノッチ関連遺伝子に対し、シグナル、ダウン規制につながる血行力を低下し、肉を再開始。
私たちの血行動態変化を強制する仮説そしてこうして Notch シグナル、 wea変異導入による肉をさらに証明するためにそれは非収縮アトリウム37を開発しています。心室流入と心房収縮期に血行力学的力のない場合は、 wea変異表現 Notch シグナル コンポーネント遺伝子の低い心臓 mrna と標的遺伝子のコントロールを比較し、ハーバーの非 trabeculated、小さく、弱く(図 2、 L) の心室を収縮します。ただし、 wea変異体にNrg1 mRNA マイクロインジェクション調整にもかかわらず、非収縮アトリウム (より顕著な収縮心室につながるノッチ シグナル伝達経路、海綿の尾根の部分的な救助を伴う図 2 H, L)2。このコンテキストでは、 wea変異体は Notch シグナルによる肉の血行力学的変調を強調する非収縮のアトリウムと非 trabeculated 心室の関係を確証しました。
Tnnt2aMO は、心筋トロポニン T38,39を阻害することによって心筋収縮を停止に配信されました。Tnnt2a MO 注入魚が完全に循環と大幅ダウン規制のノッチ シグナル伝達、コントロール グループ(図 2 i, M) と比較されたとき心室表面壁滑らかにつながるため心室 WSS を欠いています。.心内膜に WSS が肉のための要件かどうか調べるために、また、心内膜と心臓の内皮細胞膜を開発しない40,41クロッシュ(clo) 変異体があります。Clo変異心臓梁の開発に失敗しより小さい大きさで分類された心室を示し, 不完全な心(図 2 j)をループします。したがって、心内膜のライニングは意味血行力学的せん断応力 Notch シグナル(図 2 M)をアクティブにする必要は。しかし、造血やイソプロテレノール収縮力を高めるための治療を増やすことによって血行動態の剪断応力の増加、ノッチ関連遺伝子の発現量が増加していないと骨梁ネットワーク形態が変化しなかった(図 3)。
せん断応力と Notch シグナルの関係をさらに示すためには、HAECsの in vitroテストのために使用されました。拍動流で合流細胞内皮細胞による血行動態のせん断応力をシミュレートするために行使されました。それは静的と比較して拍動培養(図 4)ノッチ関連遺伝子の発現が増加することが表示されます。さらに、ADAM10 阻害剤による治療は、Notch シグナル(図 4)を大幅削減。
次に、心室の小数ショートニングと心室野生型gata1aミズーリ、AG1478、時間をかけてボリュームの増減を計算した、それらは 50 Nrg1注入グループによって救出 hpf、75 hpf と 100 hpf (図 5 aC).ErbBシグナル伝達阻害剤、AG1478、治療は大幅に遅延し、100 で心室の拡張期に短縮率を削減 hpf (図 5 a)。Gata1a MO と AG1478 の治療は、4 D LSFM (図 5 e, F)の変化により評価した収縮では、心室のサイズを削減しました。両方のグループは、野生型と比較して増加終わりシストリックおよび diastolic ボリュームを開発しました。Gata1a MO のNrg1 mRNA の共射出は、野生型の方、短縮率、駆出分画を復元しました。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57763/57763fig1.jpg"> 図 1: 蛍光シートの概要を光します。(A)代表者 LSFM システム照明レンズ (IL) から光シートの交差点と検出レンズ (DL) の検出パスのサンプルを配置する場所。(B) IL の背後にある円筒のレンズは、ミクロン サイズ光内のシート (紫) サンプルでは、サンプルの薄いシートを刺激を作成します。受光レンズは、放出される蛍光信号を記録します。(C)左に右に移動するゼブラフィッシュ胚を光学セクショニング薄いレーザー シート (紫) の模式図。この図は、李ら17から変更されています。<a href="/files/ftp_upload/57763/57763fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57763/57763fig2.jpg"> 図 2: 心室の形態の遺伝的操作Tg(cmlc:gfp)ゼブラフィッシュ ノッチ リガンド、受容体、ターゲット遺伝子の発現と。(A) 75 に海綿のネットワークが表示されますコントロール ゼブラフィッシュの hpf。(B) 100 で骨梁ネットワーク コントロール ゼブラフィッシュの hpf。(C) 1-4 細胞期でgata1a MO の注入を 75 でない肉に少し示した hpf。(D) gata1aゼブラフィッシュに MO の注入は、海綿のネットワーク形成を遅れていた。(E) gata1a MO および人間のNrg1 mRNA の共射出が 75 で肉を部分的に復元 hpf。(F) gata1a MO および人間のNrg1 mRNA の共射出ほぼ完全に復元 100 で骨梁ネットワーク hpf。100 (G) wea変異ない肉と滑らかな心室壁に hpf が示しています。(H)注入wea変異ゼブラフィッシュ人間Nrg1部分的に復元 100 で肉 hpf。(I)注入tnnt2a 75 で肉を示さなかった MO の hpf (図示せず) と 100 hpf。(J)100 で肉を示さなかったclo変異 hpf。(K) gata1a MO の注射削減notch1 遺伝子、Nrg1、およびJag2の mRNA 発現 (t 検定、* P < 0.05、n = 制御対 5)。Gata1a MO および人間のNrg1 mRNA の共射出Jag1、ErbB、Nrg1 Notch1bコントロールと比較して発現が増大。(L) wea変異株が大幅に低いノッチ関連遺伝子発現 (t 検定、* P < 0.05、n = 制御対 5)。人間Nrg1の注入ノッチ関連遺伝子の発現の増強Jag1とJag2されたコントロールに比べて有意に高かった。(M) tnnt2a MO 注入とclo変異を示したノッチ関連遺伝子発現が有意に低かった (t 検定、* P < 0.05、n = 制御対 5)。スケール バー: 50 μ m。データは、平均の標準偏差として表示されます。この図は、李ら17から変更されています。<a href="/files/ftp_upload/57763/57763fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57763/57763fig3.jpg"> 図 3: 操作で WSS の増加Tg(cmlc:gfp)ノッチのリガンド、受容体、ターゲット遺伝子の発現とゼブラフィッシュ生体内で. EPO(A)の注射または心拍数の増加を介して ISO (B)の追加と造血の過剰発現を介して WSS を増加して肉を増加しなかった、コントロールに似た海綿ネットワークを持っていた。(C) EPO mRNA またはイソプロテレノール注入にはノッチ リガンド、受容体、ターゲット遺伝子の発現を変わりませんでした (t 検定、* P < 0.05、n = 制御対 5)。この図は、李ら17から変更されています。<a href="/files/ftp_upload/57763/57763fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57763/57763fig4.jpg"> 図 4: 振動や脈動のせん断応力を受ける内皮細胞体外.拍動せん断応力 τ平均の対象 HAECs = 30 x 10-5 1 Hz で N/s ADAM10 阻害剤が適用されたとき誘導ノッチ関連遺伝子の発現とノッチ関連遺伝子の発現のダウンレギュ レートがあった (t 検定、* P < 0.05、n = 5対コントロール)。この図は、李ら17から変更されています。<a href="/files/ftp_upload/57763/57763fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57763/57763fig5.jpg"> 図 5: 小数短縮と駆出分画の肉の効果。(A ~ C)AG1478 とgata1a MO 添加減少 100 で小数の短縮 hpf が人間のNrg1 ・ gata1a MO 共射出はそれを改善しました。100 で、短縮率が減少(D) gata1a注入と AG1478 hpf (t 検定、* P < 0.05、n = 制御対 5)。Gata1aとNrg1 mRNA 共射出は、小数の短縮を改善しました。(E ・ F)AG1478 とgata1a MO が 75 で終わりシストリックおよび diastolic ボリュームを増加したことを示した LSFM と 4 D 同期アルゴリズムを統合する hpf (E)と 100 hpf (F)。データは、平均の標準偏差として表示されます。この図は、李ら17から変更されています。<a href="/files/ftp_upload/57763/57763fig5large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td rowspan="2">ゼブラフィッシュ Jag1</td>
			<td>フォワード</td>
			<td>CCGCGTATGTTTGAAGGAGTATCAGTCG</td>
		</tr>
<tr>
<td>下位</td>
			<td>CAGCACGATCCGGGTTTTGTCG</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">ゼブラフィッシュ Jag2</td>
			<td>フォワード</td>
			<td>AGCCCTAGCAAAACGAGCGACG</td>
		</tr>
<tr>
<td>下位</td>
			<td>GCGTGAATGTGCCGTTCGATCAA</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">ゼブラフィッシュ Dll4</td>
			<td>フォワード</td>
			<td>CAAAGTGGGAAGCAGACAGAGCTAAGG</td>
		</tr>
<tr>
<td>下位</td>
			<td>CGGTCATCCCTGGGTGTGCATT</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">ゼブラフィッシュ BMP10</td>
			<td>フォワード</td>
			<td>GCATCAAGGGGCCACTCGTGTAGA</td>
		</tr>
<tr>
<td>下位</td>
			<td>TCGTCTCACTCCACTAGGTCCCATACTG</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">ゼブラフィッシュ ErBb2</td>
			<td>フォワード</td>
			<td>GATCAGGACTGCCAAACATTGACGTCT</td>
		</tr>
<tr>
<td>下位</td>
			<td>AGCAGCACACTGAACATGGCAGCA</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">ゼブラフィッシュ エナジー 1</td>
			<td>フォワード</td>
			<td>GTGTGTTTGTCCCTGTGGACGCGT</td>
		</tr>
<tr>
<td>下位</td>
			<td>CCTCCTGGAGCTTCCCCTCAAACA</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">ゼブラフィッシュ Notch1b</td>
			<td>フォワード</td>
			<td>CAGAGAGTGGAGGCACAGTGCAATCC</td>
		</tr>
<tr>
<td>下位</td>
			<td>GCCGTCCCATTCACACTCTGCATT</td>
		</tr>
</tbody></table>表 3: プライマー ゼブラフィッシュ スクリーニングに使用します。

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Light-sheet Fluorescence Microscopy to Capture 4-Dimensional Images of the Effects of Modulating Shear Stress on the Developing Zebrafish Heart

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光シート蛍光顕微鏡のゼブラフィッシュ心臓の開発上のせん断応力を変調効果の 4次元画像をキャプチャするには

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8.2K ビュー.  The University of Texas at Arlington. 4 次元 (4-d) ゼブラフィッシュで心の開発を視覚化するためのプロトコルを紹介します。4 D イメージング、光シート蛍光顕微鏡 (LSFM) は、開発の心を再構築する時間を 3 次元 (3 D) 画像を引き継ぎます。質的にも量的そのせん断応力が心臓の肉を推進室開発時に心内膜 Notch シグナルをアクティブに示します。

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Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic valve leaflets are composed of interstitial cells suspended within an extracellular matrix (ECM) and are lined with an endothelial cell monolayer. The valve withstands a harsh, dynamic environment and is constantly exposed to shear, flexion, tension, and compression. Research has shown calcific lesions in diseased valves occur in areas of high mechanical stress as a result of endothelial disruption or interstitial matrix damage1-3. Hence, it is not surprising that epidemiological studies have shown high blood pressure to be a leading risk factor in the onset of aortic valve disease4. 
The only treatment option currently available for valve disease is surgical replacement of the diseased valve with a bioprosthetic or mechanical valve5. Improved understanding of valve biology in response to physical stresses would help elucidate the mechanisms of valve pathogenesis. In turn, this could help in the development of non-invasive therapies such as pharmaceutical intervention or prevention. Several bioreactors have been previously developed to study the mechanobiology of native or engineered heart valves6-9. Pulsatile bioreactors have also been developed to study a range of tissues including cartilage10, bone11 and bladder12. The aim of this work was to develop a cyclic pressure system that could be used to elucidate the biological response of aortic valve leaflets to increased pressure loads. 
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Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

A cyclic pressure bioreactor capable of subjecting heart valve tissue to physiological and pathological pressure conditions has been designed. A LabVIEW program allows users to control pressure magnitude, amplitude and frequency. This device can be used to study the mechanobiology of heart valve tissue or isolated cells.

のための周期的圧力のバイオリアクターの設計生体外で</em大動脈心臓弁の>研究

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Low Molecular Weight Protein Enrichment on Mesoporous Silica Thin Films for Biomarker Discovery

The identification of circulating biomarkers holds great potential for non invasive approaches in early diagnosis and prognosis, as well as for the monitoring of therapeutic efficiency.1-3 The circulating low molecular weight proteome (LMWP) composed of small proteins shed from tissues and cells or peptide fragments derived from the proteolytic degradation of larger proteins, has been associated with the pathological condition in patients and likely reflects the state of disease.4,5 Despite these potential clinical applications, the use of Mass Spectrometry (MS) to profile the LMWP from biological fluids has proven to be very challenging due to the large dynamic range of protein and peptide concentrations in serum.6 Without sample pre-treatment, some of the more highly abundant proteins obscure the detection of low-abundance species in serum/plasma. Current proteomic-based approaches, such as two-dimensional polyacrylamide gel-electrophoresis (2D-PAGE) and shotgun proteomics methods are labor-intensive, low throughput and offer limited suitability for clinical applications.7-9 Therefore, a more effective strategy is needed to isolate LMWP from blood and allow the high throughput screening of clinical samples. 
Here, we present a fast, efficient and reliable multi-fractionation system based on mesoporous silica chips to specifically target and enrich LMWP.10,11 Mesoporous silica (MPS) thin films with tunable features at the nanoscale were fabricated using the triblock copolymer template pathway. Using different polymer templates and polymer concentrations in the precursor solution, various pore size distributions, pore structures, connectivity and surface properties were determined and applied for selective recovery of low mass proteins. The selective parsing of the enriched peptides into different subclasses according to their physicochemical properties will enhance the efficiency of recovery and detection of low abundance species. In combination with mass spectrometry and statistic analysis, we demonstrated the correlation between the nanophase characteristics of the mesoporous silica thin films and the specificity and efficacy of low mass proteome harvesting. The results presented herein reveal the potential of the nanotechnology-based technology to provide a powerful alternative to conventional methods for LMWP harvesting from complex biological fluids. Because of the ability to tune the material properties, the capability for low-cost production, the simplicity and rapidity of sample collection, and the greatly reduced sample requirements for analysis, this novel nanotechnology will substantially impact the field of proteomic biomarker research and clinical proteomic assessment.

We developed a technology based on mesoporous silica thin film for the selective recovery of low molecular weight proteins and peptides from human serum. The physico-chemical properties of our mesoporous chips were finely tuned to provide substantial control in peptide enrichment and consequently profile the serum proteome for diagnostic purposes.

バイオマーカー探索のためのメソポーラスシリカ薄膜の低分子量蛋白質の濃縮

The identification of circulating biomarkers holds great potential for non invasive approaches in early diagnosis and prognosis, as well as for the ...

Patient-specific Modeling of the Heart: Estimation of Ventricular Fiber Orientations

Patient-specific simulations of heart (dys)function aimed at personalizing cardiac therapy are hampered by the absence of in vivo imaging technology for clinically acquiring myocardial fiber orientations. The objective of this project was to develop a methodology to estimate cardiac fiber orientations from in vivo images of patient heart geometries. An accurate representation of ventricular geometry and fiber orientations was reconstructed, respectively, from high-resolution ex vivo structural magnetic resonance (MR) and diffusion tensor (DT) MR images of a normal human heart, referred to as the atlas. Ventricular geometry of a patient heart was extracted, via semiautomatic segmentation, from an in vivo computed tomography (CT) image. Using image transformation algorithms, the atlas ventricular geometry was deformed to match that of the patient. Finally, the deformation field was applied to the atlas fiber orientations to obtain an estimate of patient fiber orientations. The accuracy of the fiber estimates was assessed using six normal and three failing canine hearts. The mean absolute difference between inclination angles of acquired and estimated fiber orientations was 15.4 &deg;. Computational simulations of ventricular activation maps and pseudo-ECGs in sinus rhythm and ventricular tachycardia indicated that there are no significant differences between estimated and acquired fiber orientations at a clinically observable level.The new insights obtained from the project will pave the way for the development of patient-specific models of the heart that can aid physicians in personalized diagnosis and decisions regarding electrophysiological interventions.

A methodology to estimate ventricular fiber orientations from in vivo images of patient heart geometries for personalized modeling is described. Validation of the methodology performed using normal and failing canine hearts demonstrate that that there are no significant differences between estimated and acquired fiber orientations at a clinically observable level.

ハートの患者固有のモデリング：心室繊維配向の推定

Patient-specific  simulations of heart (dys)function aimed at personalizing cardiac therapy are hampered  by the absence of in vivo imaging technology for ...

Creating Adhesive and Soluble Gradients for Imaging Cell Migration with Fluorescence Microscopy

Cells can sense and migrate towards higher concentrations of adhesive cues such as the glycoproteins of the extracellular matrix and soluble cues such as growth factors. Here, we outline a method to create opposing gradients of adhesive and soluble cues in a microfluidic chamber, which is compatible with live cell imaging. A copolymer of poly-L-lysine and polyethylene glycol (PLL-PEG) is employed to passivate glass coverslips and prevent non-specific adsorption of biomolecules and cells. Next, microcontact printing or dip pen lithography are used to create tracks of streptavidin on the passivated surfaces to serve as anchoring points for the biotinylated peptide arginine-glycine-aspartic acid (RGD) as the adhesive cue. A microfluidic device is placed onto the modified surface and used to create the gradient of adhesive cues (100% RGD to 0% RGD) on the streptavidin tracks. Finally, the same microfluidic device is used to create a gradient of a chemoattractant such as fetal bovine serum (FBS), as the soluble cue in the opposite direction of the gradient of adhesive cues.

A method for the assembly of adhesive and soluble gradients in a microscopy chamber for live cell migration studies is described. The engineered environment combines antifouling surfaces and adhesive tracks with solution gradients and therefore allows one to determine the relative importance of guidance cues.

蛍光顕微鏡を用いたイメージング細胞遊走用接着剤及び可溶性グラデーションを作成する

Cells can sense and migrate towards higher concentrations of adhesive cues such as the glycoproteins of the extracellular matrix and soluble cues such as ...

3D Orbital Tracking in a Modified Two-photon Microscope: An Application to the Tracking of Intracellular Vesicles

The objective of this video protocol is to discuss how to perform and analyze a three-dimensional fluorescent orbital particle tracking experiment using a modified two-photon microscope1. As opposed to conventional approaches (raster scan or wide field based on a stack of frames), the 3D orbital tracking allows to localize and follow with a high spatial (10 nm accuracy) and temporal resolution (50 Hz frequency response) the 3D displacement of a moving fluorescent particle on length-scales of hundreds of microns2. The method is based on a feedback algorithm that controls the hardware of a two-photon laser scanning microscope in order to perform a circular orbit around the object to be tracked: the feedback mechanism will maintain the fluorescent object in the center by controlling the displacement of the scanning beam3-5. To demonstrate the advantages of this technique, we followed a fast moving organelle, the lysosome, within a living cell6,7. Cells were plated according to standard protocols, and stained using a commercially lysosome dye. We discuss briefly the hardware configuration and in more detail the control software, to perform a 3D orbital tracking experiment inside living cells. We discuss in detail the parameters required in order to control the scanning microscope and enable the motion of the beam in a closed orbit around the particle. We conclude by demonstrating how this method can be effectively used to track the fast motion of a labeled lysosome along microtubules in 3D within a live cell. Lysosomes can move with speeds in the range of 0.4-0.5 &#181;m/sec, typically displaying a directed motion along the microtubule network8.

In this video protocol we track - at high speed and in three dimensions - fluorescently labeled lysosomes within living cells, using the orbital tracking method in a modified two-photon microscope.

細胞内小胞の追跡への応用：変形二光子顕微鏡での3d軌道の追跡

The objective of this video protocol is to discuss how to perform and analyze a three-dimensional fluorescent orbital particle tracking experiment using a ...

Single Molecule Fluorescence Microscopy on Planar Supported Bilayers

In the course of a single decade single molecule microscopy has changed from being a secluded domain shared merely by physicists with a strong background in optics and laser physics to a discipline that is now enjoying vivid attention by life-scientists of all venues 1. This is because single molecule imaging has the unique potential to reveal protein behavior in situ in living cells and uncover cellular organization with unprecedented resolution below the diffraction limit of visible light 2. Glass-supported planar lipid bilayers (SLBs) are a powerful tool to bring cells otherwise growing in suspension in close enough proximity to the glass slide so that they can be readily imaged in noise-reduced Total Internal Reflection illumination mode 3,4. They are very useful to study the protein dynamics in plasma membrane-associated events as diverse as cell-cell contact formation, endocytosis, exocytosis and immune recognition. Simple procedures are presented how to generate highly mobile protein-functionalized SLBs in a reproducible manner, how to determine protein mobility within and how to measure protein densities with the use of single molecule detection. It is shown how to construct a cost-efficient single molecule microscopy system with TIRF illumination capabilities and how to operate it in the experiment.

Preparation of protein-functionalized planar glass-supported lipid bilayers, determination of protein mobility within and measurement of protein densities is shown here. A roadmap to building a noise-reduced Total Internal Reflection microscope is outlined, which allows visualizing single bilayer-resident fluorochromes with high spatiotemporal resolution.

平面支持された二分子層​​上の単一分子蛍光顕微鏡

In the course of a single decade single molecule microscopy has changed from being a secluded domain shared merely by physicists with a strong background ...

Light-sheet Fluorescence Microscopy for the Study of the Murine Heart

Light-sheet fluorescence microscopy has been widely used for rapid image acquisition with a high axial resolution from micrometer to millimeter scale. Traditional light-sheet techniques involve the use of a single illumination beam directed orthogonally at sample tissue. Images of large samples that are produced using a single illumination beam contain stripes or artifacts and suffer from a reduced resolution due to the scattering and absorption of light by the tissue. This study uses a dual-sided illumination beam and a simplified CLARITY optical clearing technique for the murine heart. These techniques allow for deeper imaging by removing lipids from the heart and produce a large field of imaging, greater than 10 x 10 x 10 mm3. As a result, this strategy enables us to quantify the ventricular dimensions, track the cardiac lineage, and localize the spatial distribution of cardiac-specific proteins and ion-channels from the post-natal to adult mouse hearts with sufficient contrast and resolution.

This study uses a dual-sided illumination light-sheet fluorescence microscopy (LSFM) technique combined with optical clearing to study the murine heart.

マウス心臓の研究のための光シート蛍光顕微鏡

Light-sheet fluorescence microscopy has been widely used for rapid image acquisition with a high axial resolution from micrometer to millimeter scale. ...

Gene Expression Analysis of Endothelial Cells Exposed to Shear Stress Using Multiple Parallel-plate Flow Chambers

We describe a workflow for the analysis of gene expression from endothelial cells subject to a steady laminar flow using multiple monitored parallel-plate flow chambers. Endothelial cells form the inner cellular lining of blood vessels and are chronically exposed to the frictional force of blood flow called shear stress. Under physiological conditions, endothelial cells function in the presence of various shear stress conditions. Thus, the application of shear stress conditions in in vitro models can provide greater insight into endothelial responses in vivo. The parallel-plate flow chamber previously published by Lane et al.9 is adapted to study endothelial gene regulation in the presence and absence of steady (non-pulsatile) laminar flow. Key adaptations in the set-up for laminar flow as presented here include a large, dedicated environment to house concurrent flow circuits, the monitoring of flow rates in real-time, and the inclusion of an exogenous reference RNA for the normalization of quantitative real-time PCR data. To assess multiple treatments/conditions with the application of shear stress, multiple flow circuits and pumps are used simultaneously within the same heated and humidified incubator. The flow rate of each flow circuit is measured continuously in real-time to standardize shear stress conditions throughout the experiments. Because these experiments have multiple conditions, we also use an exogenous reference RNA that is spiked-in at the time of RNA extraction for the normalization of RNA extraction and first-strand cDNA synthesis efficiencies. These steps minimize the variability between samples. This strategy is employed in our pipeline for the gene expression analysis with shear stress experiments using the parallel-plate flow chamber, but parts of this strategy, such as the exogenous reference RNA spike-in, can easily and cost-effectively be used for other applications.

Here, a workflow for the culture and gene expression analysis of endothelial cells under fluid shear stress is presented. Included is a physical arrangement for simultaneously housing and monitoring multiple flow chambers in a controlled environment and the use of an exogenous reference RNA for quantitative PCR.

剪断応力の複数の平行平板流チャンバーを使用して内皮細胞の遺伝子発現解析

We describe a workflow for the analysis of gene expression from endothelial cells subject to a steady laminar flow using multiple monitored parallel-plate ...

Live Cell Analysis of Shear Stress on Pseudomonas aeruginosa Using an Automated Higher-Throughput Microfluidic System

A higher-throughput microfluidic in vitro bioreactor coupled with fluorescence microscopy has been used to study bacterial biofilm growth and morphology, including Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa). Here, we will describe how the system can be used to study the growth kinetics and the morphological properties such as the surface roughness and textural entropy of P. aeruginosa strain PA01 that expresses an enhanced green fluorescent protein (PA01-EGFP). A detailed protocol will describe how to grow and seed PA01-EGFP cultures, how to set up the microscope and autorun, and conduct the image analysis to determine growth rate and morphological properties using a variety of shear forces that are controlled by the microfluidic device. This article will provide a detailed description of a technique to improve the study of PA01-EGFP biofilms which eventually can be applied towards other strains of bacteria, fungi, or algae biofilms using the microfluidic platform.

Live Cell Analysis of Shear Stress on Pseudomonas aeruginosa Using an Automated Higher-Throughput Microfluidic System

Here, we describe the use of a higher-throughput microfluidic bioreactor coupled with a fluorescent microscope for the analysis of shear stress effects on Pseudomonas aeruginosa biofilms expressing green fluorescent proteins, including instrument set up, the determination of biofilm coverage, growth rate, and morphological properties.

緑膿菌自動の高スループット マイクロ流体システムを使用して上のせん断応力のライブ細胞解析

A higher-throughput microfluidic in vitro bioreactor coupled with fluorescence microscopy has been used to study bacterial biofilm growth and morphology, ...

Biaxial Mechanical Characterizations of Atrioventricular Heart Valves

Extensive biaxial mechanical testing of the atrioventricular heart valve leaflets can be utilized to derive&#160;optimal parameters used in constitutive models, which provide a mathematical representation of the mechanical function of those structures. This presented biaxial mechanical testing protocol involves (i) tissue acquisition, (ii) the preparation of tissue specimens, (iii) biaxial mechanical testing, and (iv) postprocessing of the acquired data. First, tissue acquisition requires obtaining porcine or ovine hearts from a local Food and Drug Administration-approved abattoir for later dissection to retrieve the valve leaflets. Second, tissue preparation requires using tissue specimen cutters on the leaflet tissue to extract a clear zone for testing. Third, biaxial mechanical testing of the leaflet specimen requires the use of a commercial biaxial mechanical tester, which consists of force-controlled, displacement-controlled, and stress-relaxation testing protocols to characterize the leaflet tissue&#39;s mechanical properties. Finally, post-processing requires the use of data image correlation techniques and force and displacement readings to summarize the tissue&#39;s mechanical behaviors in response to external loading. In general, results from biaxial testing demonstrate that the leaflet tissues yield a nonlinear, anisotropic mechanical response. The presented biaxial testing procedure is advantageous to other methods since the method presented here allows for a more comprehensive characterization of the valve leaflet tissue under one unified testing scheme, as opposed to separate testing protocols on different tissue specimens. The proposed testing method has its limitations in that shear stress is potentially present in the tissue sample. However, any potential shear is presumed negligible.

This protocol involves characterizations of atrioventricular valve leaflets with force-controlled, displacement-controlled, and stress-relaxation biaxial mechanical testing procedures. Results acquired with this protocol can be used for constitutive model development to simulate the mechanical behavior of functioning valves under a finite element simulation framework.

房室弁の二軸の機械特性

Extensive biaxial mechanical testing of the atrioventricular heart valve leaflets can be utilized to derive&#160;optimal parameters used in constitutive ...