これらの方法は、眼科の分野での、例:ペリサイトの増殖や移動などの重要な質問に答える助けとなる。これらの手順の主な利点は、さまざまな視覚化オプションを提供することです。手順を実証するのは、カリン・ドレイシグとフランク・W・ブリクスト、私たちの研究室での2つのポストドキュメントです。
眼を引き起こすには、まずメスを使ってラットのまぶたに約0.5センチメートルの後部および前部スリットを作ります。鉗子で目をつかみ、周囲の組織を露出させるために慎重に側面に傾けます。結合組織と筋肉組織の解剖ハサミで切り傷を作ることによって目を引き起こす。
目を4%ホルムアルデヒドとリン酸緩衝生理食塩分に1~2分間短時間入れます。メスの先端に軽い圧力をかけることで角膜の手足に穴を開ける前に、ナトリウムバッファーで短時間すすぐるみます。角膜の手足を解剖用はさみで切り、角膜とレンズを鉗子で取り除きます。
残りの組織を4%ホルムアルデヒドで2〜4時間PBSに残りの組織を浸す。クライオは、10%スクロースを含むソレンソンのリン酸緩衝液に浸漬し、その後25%スクロースを浸すことによって組織を保護する。容器の底に沈んだ組織を移す。
豚皮から3%ゼラチン、鶏卵白から30%アルブミンを調製したヤズラ培地に埋め込みます。次に、ゼラチン埋め込み型レチナの垂直凍結分を視神経に切断する。ガラススライドの上に凍結セクションを置き、最低1時間乾燥させます。
乾いたら、スライドを0.25%Triton-X 100で15分間浸します。次に、PBSTの1:100 PDGF受容体ベータと1:500 NG2一次抗体と1%BSAの混合物を凍結切除部に滴下し、一晩摂氏4度で湿ったチャンバーに入れます。翌日、スライドをPBSTに2回15分間浸漬して切片を洗浄する。
その後、1:100抗マウスアレクサFluor 594リンクと1:100の抗ウサギFITCリンク二次抗体の混合物をPBSTで希釈し、3%BSAを凍結セクションに滴下し、暗闇の中で1時間インキュベートします。インキュベーション後、PBSTでガラススライドを15分間2回すすいでください。DAPIとカバースリップを含むアンチフェージングマウントメディアで染色されたクライオセクションをマウントします。
第2のレチン組織調製技術は、全マウントである。角膜の除去に続いて、鉗子の小さな開口部の動きを使用して網膜を網膜色素上皮から視神経に向かって分離する。解剖はさみで視神経のレチナを解放し、視神経の頭部に向かって数ミリメートルの長さの3〜4つのスリットを作る。
ガラススライドにレティナを広げ、5〜10分間乾燥させます。4%ホルムアルデヒドをレティナにドリップし、20〜30分間固定します。固定後、PBSでリンスします。
最適な結果を得るには、リンス直後に免疫染色剤を使用してください。まず、PBSTを全マウントに滴下し、室温で15分間インキュベートします。PBSTを注ぎ、一次抗体溶液を加え、一晩摂氏4度の湿ったチャンバーにインキュベートします。
翌日、一次抗体を注ぎ、PBSTに滴下し、毎回15分間2回レチナをすすいだ。2回目の洗浄を流した後、二次抗体溶液をレティナに滴下し、暗闇の中で室温で湿ったチャンバーに1時間インキュベートします。二次抗体インキュベーションに続き、PBSTで以前のように2回洗浄する。
DAPIとカバースリップを含むアンチフェージングマウントメディアで染色された全マウントをマウントします。全型のレチナを取り付ける代わりに、低調性分離によって血管系の残性を分離することができる。まず、24ウェルプレートに1ミリリットルの脱イオン水にレチナを入れ、室温で1.5ミリメートルの振動軌道で200rpmで振り、次に200単位のDNAse 1を加えて、レチナル血管構造からリセド細胞の破片を解離し、室温でさらに30分間振ります。
150~300rpmで揺れ、それぞれ5分間、脱イオン水でレチナを3回リンスし、神経細胞の破片を取り除きます。レチナは、神経細胞の破片の除去を示す、各すすいで、より透明になるはずです。洗い込んだ後、4%パラホルムアルデヒドの1ミリリットルにレチナを固定し、室温で10分間PBSを行います。
PBSで3回リンスします。免疫染色に進む場合は、100rpmで振盪してPBSで1時間希釈した10%ロバ血清の500マイクロリットルで低張性単離血管系をブロックします。ブロッキング後、1:100 PDGF受容体ベータおよび10%ロバ血清およびPBSで希釈された1:500 NG2一次抗体からなる一次抗体溶液の600マイクロリットルで一晩レティナをインキュベートする。
翌日、PBSでレチナルネットワークを毎回5分間3回洗い流し、1:100抗マウスアレクサフルオール594thリンクと1:100抗ウサギFITCリンク二次抗体でインキュベートし、10%ロバ血清とPBSで10%のロバ血清とPBSで希釈し、室温で100rpmで暗中に100rpmで揺れます。PBSTで5分間の洗浄に続き、0.2ナノグラム/ミリリットルDAPIとPBSTで15分間インキュベートします。光から保護しながらPBSTで5分間3回洗浄します。
次に、プラスチック製のパスツールピペットの先端を切ります。ピペットチップを使用して鋭いエッジを取り除き、PBSTでパスツールピペットを湿らせ、その後、ピペットにレチナル血管系を吸引し、4ウェルガラスチャンバースライドに分配します。湿潤ステップは、パスツールピペットの内側に付着する眼管炎を避けるために重要です。
チャンバースライドを前後に傾けることで、レティナル血管構造を配置します。チャンバースライドの井戸から培地を取り外します。液体の表面張力は、スライドの底に脈管を平らにします。
必要に応じて、液体の滴を眼管の血管系に滴下して展開する。チャンバースライドからプラスチック井戸を取り外す前に、顕微鏡下で正しく展開することを確認してください。アンチフェージング実装媒体とカバースリップで染色された血管系を取り付けます。
NG2免疫検査は、内の正の血管を明らかにする。矢印は、血管内の円形および馬蹄形の免疫反応性を示す。矢印は縦方向に切断された容器を指しています。
PDGF受容体ベータ免疫体化学はNG2と同様の免疫反応性を示す。再び矢印と矢頭は血管内の免疫反応性を示す。この画像は、緑色のNG2、赤のPDGF受容体ベータ、および青色のDAPIの結合を示しています。
3つの異なるフィルタを重ね合わせることにより、NG2とPDGF受容体ベータが共局化することが明らかになっている。この画像は、NG2染色を赤色で行った免疫染色型全実装製剤を示す。免疫反応性は、アブルミナルペリサイトで強烈な染色を伴う表面血管ネットワークに沿って見える。
ニューロン細胞は、NG2染色された微小血管間のDAPI青色核として可視である。この画像は、緑色でNG2とPDGF受容体βで赤色で染色された低張性単離されたラットのレチナル血管ネットワークを示す。完全なネットワークはNG2免疫反応性を示した。
PDGF受容体ベータ免疫反応性は細胞ソマで発見された。より高い倍率では、PDGF受容体ベータ染色が血管ネットワーク内の細胞ソマにのみ見られることは明らかであり、ペリサイト免疫反応性を示す。NG2およびPDGF受容体ベータと共にDAPI染色を含むこの高倍率画像における2つの未定義の血管壁細胞における3つのペリサイトを明らかにする。
これらの手順に従って、平滑筋細胞または内皮染色のような他の免疫染色は、追加の質問に答えるために使用することができる。例えば、家管系の細胞は虚血に続いてどのように見えるのでしょうか?
