独立した研究・技術・生産、デンマーク議会許可 #4005-00029

実験のセットアップは倫理的、法的制限を持たず、ロスキレ大学との合意を行った。実験のセットアップの概要については、図 1と図 2の光学カメラの機構の見ることができます。
1. 準備
<ol><li>ベンチ ・実験の開始前に 70% のエタノールとすべての設備をクリーニングして滅菌の層流ベンチですべての手順を実行します。</li>
	<li>セルの最適な条件を確保する 5% CO2と 37 ° C で従来のインキュベーターで光学カメラを配置します。</li>
	<li>10 %fbs と 1 x 抗生物質 (ペニシリンとストレプトマイシン) T75 フラスコ DMEM メディア HaCaT 細胞を成長します。</li>
	<li>1 mL 1 x トリプシンを使用して、セルをデタッチし、サブ細胞の層の上にそれを分散させることによってすべての 3-4 日を育成します。使用する前に部屋の温度に予熱しておく。</li>
</ol>2. HaCaT の単分子膜を生成する細胞の 48 ウェル マイクロ プレート
<ol><li>パスツール ピペット T75 フラスコからメディアを削除します。</li>
	<li>5 mL × 1 滅菌 PBS を T75 フラスコに追加することによってフラスコ内での付着性のセルを洗浄します。 注:PBS はカルシウムとマグネシウムの無料を確認します。</li>
	<li>PBS を循環、パスツール ピペットを取り外します。</li>
	<li>2.2 2.3 の手順を繰り返します。</li>
	<li>フラスコに 1 mL 1 x トリプシンを追加し、細胞層の間で分散します。</li>
	<li>セルを取り外すまでに従来のインキュベーターで 37 ° C でフラスコを孵化させなさい (5-8 分でほとんどの細胞ラインの十分です)。</li>
	<li>顕微鏡下で細胞が分離される場合を表示します。セルを取り外したら、一度追加 10% と通常の培地の 9 mL FBS 1 x トリプシンを不活化します。</li>
	<li>どちらか検定を持つセルをカウント、コールター カウンターまたは似たような。 注:トリパン ブルーは、死んだ細胞を表示する使用できます。ただし、1 x トリプシン HaCaT の生きている細胞はラウンド完全に。</li>
	<li>250 μ L 10 %fbs メディアで 10 の4細胞/ウェル x 7.5 を丸底 48 ウェル培養プレート (標準プレート) に転送します。 注: アッセイは、6、12、24、または 96 ウェル プレート、すべて光学顕微鏡の下で試金することができますをも設定できます。</li>
	<li>優しくように細胞が等しく広げ、井戸の側に側からプレートを移動やセルが井戸の中心に収集されます。光メディアで均等に配分したセルを確認する顕微鏡検査します。</li>
	<li>一晩、またはセルが付いて、井戸の底にまで、37 ° C で従来の CO2インキュベーターに皿を置きます。</li>
</ol>3. 移行性の刺激の追加
<ol><li>井戸光顕微鏡下で 90-95% 合流かどうかを確認します。</li>
	<li>媒体の適切な量のマイトマイシン C の 10 μ g/mL を準備します。 注:本研究では、マイトマイシン C は 4 ° c で 1 mg/mL 原液で保持されます。マイトマイシン C 溶液中で 2-8 ° C で暗闇の中で 1 週間格納できます。</li>
	<li>各ウェルからパスツール ピペット使用済みメディアを削除します。</li>
	<li>各ウェルにマイトマイシン C の 5 μ g/mL の 250 μ L を追加します。</li>
	<li>37 ° C、5% CO2で 2 時間版を孵化させなさい。</li>
	<li>ペプチドの刺激を準備するには、メディアの適切な量でそれらを希釈します。 注:本研究では、両方、人間と牛ラクトフェリンやラクトフェリシンは 250 μ L のボリュームで 25 μ g/mL でテストされました。</li>
	<li>マイトマイシン C パスツール ピペットで培地を削除します。</li>
	<li>1 x 250 μ L の PBS (室温)、削除、パスツールを洗う × 1 ピペット洗浄します。</li>
	<li>1x PBS の 250 μ L を追加し、手動で 200 μ L ピペット チップと垂直の井戸をスクラッチします。各ウェルに新しいピペット チップを使用します。</li>
	<li>PBS を削除し、250 μ L ペプチド刺激を追加します。</li>
	<li>プレートの両側のネジを調整することによって、光学カメラ システムでプレートをマウントします。マイクロタイター プレートに蓋を残します。 注:カメラは、蓋が必要な場合は開いたまま操作できます。</li>
</ol>4. 光学カメラ コンピューター上のプログラムを設定します。
<ol><li>左側のタスクバーを取得をクリックします。</li>
	<li>左上のタスクバーに創傷治癒の関数を選択します。</li>
	<li>プレートの種類を選択するには、以下のプレートの図クリックします。</li>
	<li>マークすることによって、使用ではなく、井戸を選択せず、画面の左上側で [有効] をクリックします。 注:すべての井戸は、既定で選択されます。</li>
	<li>井戸の井戸の 1 つを右クリックして、セルの位置に合わせてレンズの焦点を調整します。 注:板図の右にバーを移動することによって、オート フォーカスを手動で調整もできます。</li>
	<li>画像間隔下画像の時間期間を設定 (例えば(00:30:00))。</li>
	<li>(例えば97 の繰り返し) の希望の期間に合わせて繰り返し数を設定します。</li>
	<li>右下のスタートボタンをクリックして、実行を開始します。</li>
</ol>

<ol>
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著者が明らかに何もありません。

開発、創傷治癒、免疫学、癌研究の移行の重要性は移行を検討するいくつかの異なる方法をもたらした。移行は、展開の式またはセルによるギャップの閉鎖することができます。ほとんどの場合傷の閉鎖はテスト細胞単層を成長し、特定のフォーム8細胞を成長させるよりもスクラッチに簡単です。我々 の研究は、テクニックはマスターに簡単・低コスト マニュアル掻くため最適化されたメソッドを示します。DNA 合成阻害剤マイトマイシン C、公開メソッド18、およびスループットの高い研究を可能にする光学カメラの使用と比較してスクラッチを最適化するために余分な洗浄を導入しました。
スクラッチの in vitroアッセイは井戸の底に正しくバインドする付着性のセルの行を必要とし、傷を介して移行を検出、増殖が抑制される必要があります。これらの 2 つの機能は、アッセイのため不可欠です。真の移行を検出するには、いくつかのアプローチは14DMSO、または様々 な阻害剤13,27を掻く前に細胞を飢え、血清濃度を低下させると記載されています。一般に、血清フリー メディアを使用できます、ただし、一部のプライマリ細胞、運動と全体的な生存のための必要性血清などの行セルします。したがって、選択セルの行によるとすべきであります。マニュアル傷はコーティングを乱すようコーティングを必要とする細胞がこのアッセイで問題が発生することができますも。
異なる種類の細胞では、彼らのサイズと成長率に応じてコンフルエント単層を形成する細胞数が異なる必要があります。HaCaT 細胞は約 4-6 時間後付着しますが、一晩中安定した単分子膜を作成する解決に残ります。スクラッチのアッセイの主な欠点の 1 つは不規則な傷8です。本研究では事前 PBS で洗浄し、新しい PBS でスクラッチ傷のエッジに沿って負傷、損傷した細胞の蓄積を減少させることを示します。これは、皮膚の細胞を接続するデスモゾーム結合によってもっともらしく説明できます。接合は、Ca2 +-依存24 PBS を使用して陽イオンが削除され、強力な細胞間接着を弱めることができます。それによって、PBS の使用できるセルのより良い除去個別に傷の端に沿って細胞の少ない蓄積に 。さらに、光学カメラはすべてのプレート サイズで井戸の広い部分を測定し、その 3 つのステップ アルゴリズムを介して最初に bents に適応。それによって、PBS で洗浄し、光学カメラを使用して、手動の傷の欠点は除去されます。正確には、細胞に焦点を当てて画像の z 積み重ねがどのように異なる細胞の種類によって成長、フォーカスの問題をすることができます。細胞が増えるすぎる場合は、アウト フォーカス フォーカスからのカメラのフォーカスがシフトします。したがって、マイトマイシン C を使用しない場合はできる 24 h 以上の実験のセットアップを実行する場合は、少し高いフォーカスを設定する方が好都合。光学カメラ マイクロタイター プレート 6-96 ウェルのプレートを測定することができます直感的なソフトウェアに標準的なコンピューターで動作する簡単なセットアップがあり様々 なテスト セットアップ可能します。撮影する画像の数を選択すると、ほとんどの制限が存在しません。96 ウェル プレートを使用している場合 1 つを得ることができる画像の数は、データ セットの場合、スペースに制限されてが、大きくなるだけ、カメラの速度。それぞれをスキャンする時間が必要として、カメラの動きが制限要因をすることができます多くの写真は、立て続けに必要がある場合も。
光学系はシンプルでありながら強力な監視できます。傷の写真のギャップの閉鎖のプロセスについて分析したが、細胞の形態的特性の使用もできます。ソフトウェアは、黄色セルをマークし、背景色が raw 画像明らかを使用する必要などの出版物のより傷のエッジを視覚化するの標準的な機能としてグレーの葉します。HaCaT 細胞ダイナミック シート28で発生する移行を作る強力な細胞間相互作用があります。この機能では、(図 4) を時間をかけて移行細胞ケラトサイトを参照してください簡単です。
本研究は、タンパク質ラクトフェリンの効果とその派生の N 末端ペプチドの接種、および肯定的な制御として EGF を示します阻害剤や刺激として異なる薬、ペプチドやタンパク質との組み合わせをテストするのに変更される可能性しますが、創傷治癒。スクラッチのアッセイを変更、様々 な細胞および移行に影響することができます化合物に合わせて最適化することができます。一緒に、その低コストと容易な管理性、この試金はほとんどの実験室の非常にアクセス可能です。光学カメラは、阻害剤または移行も増殖刺激の異なる薬をテストする使用できます。

移行は、いくつかの生理学的な側面に影響を与える重要なプロセスです。創傷治癒の移行は皮膚の再上皮の再生を促進します。慢性の傷などのヒーリング以外の傷で日和見細菌が傷口の感染症を引き起こすし、傷口が細菌の成長とバイオ1,2の形成に最適です。バイオ フィルムは、私たちの現代社会3に対する最大の脅威の一つである抵抗力がある細菌の開発の原因の一つです。創傷治癒の免疫細胞は、バイオ フィルムを突き通すことができません。癌、癌細胞の移行は固形腫瘍4,5患者の死亡の主な原因である転移の要となる一歩です。したがって、移行を検討することができることが重要です。
スクラッチの試金はそれは安価で簡単に線維芽細胞、内皮細胞、上皮細胞ライン6,7などの付着性のセルラインに実行できますので、細胞遊走をテストによく使用されます。今日、傷8を実行するためにいくつかの方法が存在して、さまざまな材料が使用される報告されている、つまようじ9、セル スクレーパー10、レーザー11、電流12など。異なる長所と短所があるすべてのメソッドと、メソッドは、細胞の種類、予算、および分析ツールによって決められるべきです。例として使用されているセル型コーティング, 手動圧力除去が必要な場合例えばつまようじまたはピペットの先端と地域内での移行に影響を与える、異なるメソッドを使用してください。本研究では手動さげ仕上に焦点を当てます。
手動削りの欠点は、サイズのバリエーション、傷の形状と傷の端のセルの蓄積です。多くのプロトコルが存在して被引用論文アドバイス増加速度や13をスクラッチした後徹底的に洗浄します。さらに、いくつかの方法は、細胞の増殖が移行から識別することはできません、したがって移行の偽陽性の結果を与える可能性がありますので、増殖を最小限に抑えるために使用されています。いくつか報告方法、血清飢餓スクラッチ14の前と血清15の量を減少させます。但し、どちらの方法は、増殖がないことを保障できます。したがって、移行の真の結果を得るためにマイトマイシン C の細胞の前処理を報告します。マイトマイシン C は、DNA が16を分離することを防ぐ DNA と共有結合を形成することにより DNA 合成を阻害する抗生物質です。マイトマイシン C の前処理してスクラッチ前に PBS で洗浄するには、ギャップの検出された閉鎖は細胞 (図 1) の真の移動を示します。
すべてのメソッドの特徴は、移行17のプロセスを分析するシステムの必要性です。共通して、進捗状況を分析するための安価な方法イメージ ソフトウェア18,19のギャップの閉鎖の分析に続いて、事前に決められた時点で傷の画像を撮影するライト フィールド顕微鏡を使用することです。このメソッドは、時間のかかる、フォーカス、同じ場所で写真を撮ることに関して信頼できないと撮影しながら温度変化のサイクルを強制的にインキュベーターからカメラへの動き。他の方法は、電流の流れを測定することによって移行を検出するために開発されています。現在の変更セルとしてインピー ダンス20の増加として読み込まれる皿の上のより多くのスペースをカバーします。インピー ダンスを測定することにより、細胞の環境に影響がないとメソッドを非侵襲的な考えです。この方法は高価である金電極を用いた特殊なプレートに頼るが、彼らは細胞の付着、増殖、移行、および細胞死などの多くのプロセスの検出を有効にします。この方法の大きな欠点は、温度などの要因が大きな影響を与えるインピー ダンス インピー ダンス測定が直接移行を示されていないことです。データの解析をより難しくして、ソフトウェアによって見直されないいくつかの要因によってインピー ダンスの変化が起こります。したがって、可視化の欠如には、移行を検証する従来の光学顕微鏡が必要です。
利用可能な技術の欠点の多くを克服するためには、リアルタイム自動光学カメラを使用してください。光学カメラ、レンズ、照明ユニット、デジタル カメラと小さなプラットフォームで高スループットの顕微鏡による検出システムです。それが移行および他のものの間で拡散をテストすることができます内蔵のソフトウェアです。移行を検出するには、2 つのアルゴリズムを使用して、成長と細胞増殖および治癒解析、それぞれと呼ばれる移行動態を分析します。増殖解析は細胞に覆われた部分 (黄色で表示) の差を検出するためのテクスチャ解析を適用する 2 段階画像セグメンテーション アルゴリズムに基づいて、空高度なヒストグラム解析による背景のエリア。創傷治癒の分析は、単層細胞を検出し、特定して傷ギャップ ギャップの幅を決定する 3 つのステップ アルゴリズムに基づいています。ユーザーが決定した時点で、次の手順を実施し、カバーエリア、ギャップ幅、およびギャップ領域としてデータを表示します。この機械の大きな利点の 1 つはカメラ21の角度のため液体を付着細胞のイメージングが可能です。確実にフォーカス (図 2)、画像に生成が単一の z 平面の z スタックに予測されているカメラ傾斜 lenstakes イメージです。z スタックは、全体の傷の傷の端に垂直撮影 (例えば40) の写真のシリーズをマージすることによって生成されます。Z スタックは、フォーカスの面と同様、細胞層の深さの傷全体をキャプチャできます。さらに、一連の画像はボタンをクリックすると、画像のビデオ コレクションにまとめることができます。
ケラチノ サイト細胞株 HaCaT 移行の検出のための最適化されたプロトコルを示す.ラクトフェリンとその N 末端ペプチド、同様、人間と牛、抗菌、免疫変調分子22として多数のアプリケーションを持っているこれらの分子が実証されている、移行に及ぼす影響を分析する実験を行った,23します。 4 つの化合物を比較した未処理細胞と上皮成長因子 (EGF) が肯定的な制御として使用されました。

<table><tbody><tr><td>oCelloScope</td><td>BioSense Solution ApS</td><td></td><td>Optical camera</td></tr><tr><td>UniExplorer software&amp;nbsp;</td><td>BioSense Solution ApS</td><td></td><td>(8.0.0.7144 (RL3))</td></tr><tr><td>HaCaT cell</td><td></td><td></td><td>Donated from Bispebjerg Hospital</td></tr><tr><td>DMEM (1x) + GlutaMAX</td><td>Gibco</td><td>31966-021</td><td>Medium for HaCaT</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco</td><td>10270</td><td>Fetal bovine serum</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>D837</td><td>Without Mg+ and Ca2+</td></tr><tr><td>Pencillin-Streptomycin</td><td>Sigma</td><td>P0781</td><td>Antibiotics</td></tr><tr><td>Trypsin (10x)</td><td>Sigma</td><td>T3924</td><td></td></tr><tr><td>Mitomycin C</td><td>Tocris</td><td>3258</td><td>Inhibits proliferation</td></tr><tr><td>Microtiter plate</td><td>Greiner Bio-one</td><td>677 180</td><td></td></tr><tr><td>Incubator</td><td>Panasonic</td><td></td><td>37&amp;deg;C, 5% CO2</td></tr><tr><td>Hemocytometer</td><td>Assistent</td><td></td><td>T&amp;uuml;rk (0.1 mm)</td></tr><tr><td>Pipet boy</td><td>Accu-Jet pro</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

optimized scratch assay for in vitro testing of cell migration with an automated optical camera

細胞遊走創傷治癒や、がんなどの健康の多くの側面に影響する重要なプロセスであり、したがって、移行を研究する手法を開発するため非常に重要。スクラッチのアッセイは、その低コストと簡単な手順のため反プロ移行のプロパティを持つ化合物をテストする最も一般的な体外メソッドをずっと。ただし、アッセイのしばしば報告されている問題は傷の端の間で細胞の積み重ねであります。さらに、測定からデータを取得する異なる露出の画像取られなければならない期間にわたって同じ場所で移行の動きを比較します。傷の閉鎖を説明する別の解析プログラムを使用ことができますが、彼らは、労働集約的、不正確なと温度変化の力サイクル。本研究では、テスト移行効果、例えば人間と牛ラクトフェリンの天然の蛋白質およびその N 末端ペプチド ラクトフェリシン上皮細胞線 HaCaT 最適化手法を示す.重要な最適化は、洗浄し、エッジに沿って細胞の前述の蓄積を排除、PBS のスクラッチです。これは、ケラチノ サイトの細胞間の接続に影響を及ぼすことが示されている陽イオンの除去によって説明できます。移行の true 検出するように、マイトマイシン C、DNA 合成阻害剤の前処理は、プロトコルに追加されました。最後に、再現性を向上し、時間をかけて傷の同一断面の解析しながら自動光学カメラ、過度の温度サイクルを排除するスクラッチ閉鎖分析で、肉体労働を示します。

HaCaT はケラチノ サイト細胞ライン、皮膚の最も豊富なセル型の 1 つです。傷が発生すると、皮膚細胞は増殖し、傷のベッド (図 3) 傷を閉じるために移行を開始します。両方のプロセスは、したがって、適切な治療のため非常に重要です。
光学カメラは、リアルタイムでの両方のプロセスに従うことができます。移行のシステムは 3 つのデータのセットを与える: セルに領域、ギャップ幅およびギャップ領域が覆われています。ラクトフェリンやラクトフェリシン EGF で処理する傷を監視、光学顕微鏡により時間をかけてこれらの 3 つのパラメーターを監視できます。48 時間培養後、EGF は 95% (図 3 a) 無処理の 38% 閉鎖に比べると、傷の閉鎖をもたらした遵守します。ラクトフェリンやラクトフェリシンの異なるバージョンは、親のタンパク質よりもより強力なされているペプチドと 33% と 62% の傷口の閉鎖の間配置されます。最初の最初からの間隔の変化から決定の創傷閉鎖の割合ができます (図 3 b) をプロットします。
細胞がある強い細胞間相互作用と細胞が移行すると、一連の手順が必要な24。まもなく、先頭のセルは、接着の彼らのサイトを混乱させるし、突出、25に移動する細胞骨格を契約します。主要な細胞の突起は、光学カメラ (図 4) を簡単に表示できます。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57691/57691fig1.jpg"> 図 1: 光学カメラへの移行をテストするのにはスクラッチのアッセイの概略フローチャートです。HaCaT 細胞は 48 ウェル プレートにメッキ、24 h の従うこと。細胞を増殖を抑制する 2 h のマイトマイシン C 併用処理済みとスクラッチを行いペプチド刺激の付加によって続いた。光学カメラのユニットにプレートを挿入し、移行が 48 時間続きます。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57691/57691fig2.jpg"> 図 2: 光のカメラのスキャン技術。自動化された光学カメラの光学レンズ ユニットは細菌や携帯電話ソリューションなど多彩なソリューションをスキャンを有効にする水平方向の平面に 6.25 ° します。取得した一連画像にはには、すべての焦点を当てて、アウト フォーカスとセルでフォーカスを持つ画像を確保するために、フォーカスでの画像のスタックが含まれています。26から変更。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57691/57691fig3.jpg"> 図 3: 48 時間以上前処理マイトマイシン C HaCaT 細胞の移行。(A)移行が 48 時間半時間ごとの自動光学カメラで検出されました。マイトマイシン C の増殖を阻害することで細胞を処理済み。セルは、思いやりのある- またはウシ ・ ラクトフェリン (H LF または B LF) または - ラクトフェリシン (H LFcin、B LFcin) の 25 μ G/ml と扱われます。上皮成長因子 (EGF) は、500 ng/mL で肯定的な制御として使用されます。未処理細胞は、コントロールとして使用されます。(B)の治療法の移行の図。3 つの独立した動作の代表であり、初期傷の割合閉鎖として結果が与えられる結果 * p < 0.05 * * p < 0.01 * * * p < 0.001。
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57691/57691fig4.jpg"> 図 4: HaCaT 細胞を扱う突出のケラトサイト。ケラトサイト HaCaT 細胞は黒の矢印で示されます。HaCaT の強力な細胞間相互作用は細胞のダイナミックな動きで結果と移行容易に時間をかけて観察することができます。

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Optimized Scratch Assay for In Vitro Testing of Cell Migration with an Automated Optical Camera

ここで自動光学カメラ顕微鏡を用いた細胞移行、生体外でテストする手順をについて説明します。スクラッチのアッセイは、傷の閉鎖が一定期間続いている広く使用されています。光学顕微鏡は細胞遊走の信頼性の高い、格安の検出を可能にします。

スクラッチのアッセイの in Vitro細胞遊走の自動光学カメラのテストのために最適化されました。

Cell migration is an important process that influences many aspects of health, such as wound healing and cancer, and it is, therefore, crucial for ...

optimized-scratch-assay-for-vitro-testing-cell-migration-with-an

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

Optimized Scratch Assay for In Vitro Testing of Cell Migration with an Automated Optical Camera

22.9K ビュー.  Roskilde University. ここで自動光学カメラ顕微鏡を用いた細胞移行、生体外でテストする手順をについて説明します。スクラッチのアッセイは、傷の閉鎖が一定期間続いている広く使用されています。光学顕微鏡は細胞遊走の信頼性の高い、格安の検出を可能にします。

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Evaluation of the Cell Invasion and Migration Process: A Comparison of the Video Microscope-based Scratch Wound Assay and the Boyden Chamber Assay

The invasion and migration abilities of tumor cells are main contributors to cancer progression and recurrence. Many studies have explored the migration and invasion abilities to understand how cancer cells disseminate, with the aim of developing new treatment strategies. Analysis of the cellular and molecular basis of these abilities has led to the characterization of cell mobility and the physicochemical properties of the cytoskeleton and cellular microenvironment. For many years, the Boyden chamber assay and the scratch wound assay have been the standard techniques to study cell invasion and migration. However, these two techniques have limitations. The Boyden chamber assay is difficult and time consuming, and the scratch wound assay has low reproducibility. Development of modern technologies, especially in microscopy, has increased the reproducibility of the scratch wound assay. Using powerful analysis systems, an &#34;in-incubator&#34; video microscope can be used to provide automatic and real-time analysis of cell migration and invasion. The aim of this paper is to report and compare the two assays used to study cell invasion and migration: the Boyden chamber assay and an optimized in vitro video microscope-based scratch wound assay.

This study reports two different methods for the analysis of cell invasion and migration: the Boyden chamber assay and the in vitro video microscope-based wound-healing assay. The protocols for these two experiments are described, and their benefits and disadvantages are compared.

細胞浸潤および移行プロセスの評価: ビデオ顕微鏡ベースのスクラッチの比較創傷アッセイと boyden 教授区域の試金

The invasion and migration abilities of tumor cells are main contributors to cancer progression and recurrence. Many studies have explored the migration ...

がん研究

Optimization of the Wound Scratch Assay to Detect Changes in Murine Mesenchymal Stromal Cell Migration After Damage by Soluble Cigarette Smoke Extract

Cell migration is vital to many physiological and pathological processes including tissue development, repair, and regeneration, cancer metastasis, and inflammatory responses. Given the current interest in the role of mesenchymal stromal cells in mediating tissue repair, we are interested in quantifying the migratory capacity of these cells, and understanding how migratory capacity may be altered after damage. Optimization of a rigorously quantitative migration assay that is both easy to customize and cost-effective to perform is key to answering questions concerning alterations in cell migration in response to various stimuli. Current methods for quantifying cell migration, including scratch assays, trans-well migration assays (Boyden chambers), micropillar arrays, and cell exclusion zone assays, possess a range of limitations in reproducibility, customizability, quantification, and cost-effectiveness. Despite its prominent use, the scratch assay is confounded by issues with reproducibility related to damage of the cell microenvironment, impediments to cell migration, influence of neighboring senescent cells, and cell proliferation, as well as lack of rigorous quantification. The optimized scratch assay described here demonstrates robust outcomes, quantifiable and image-based analysis capabilities, cost-effectiveness, and adaptability to other applications.

The capacity to migrate is a key function of many different cell types, including mesenchymal stromal cells (MSCs). However, quantifying alterations in migratory capacity after damage is challenging. This protocol describes an easily adaptable migration assay that uses rigorous statistics to quantify changes in MSC migratory capacity after damage.

可溶性タバコの煙抽出物によって損傷した後のマウス間葉系幹細胞の移動の変化を検出するために創傷スクラッチアッセイの最適化

Cell migration is vital to many physiological and pathological processes including tissue development, repair, and regeneration, cancer metastasis, and ...

発生生物学

A Simple Migration/Invasion Workflow Using an Automated Live-cell Imager

Cancer cell mobility is crucial for the initiation of metastasis. Therefore, investigation of the cell movement and invasive capacity is of great significance. Migration assays provide basic insight of cell movement at a 2D level, whereas invasion assays are more physiologically relevant, mimicking in vivo cancer cell dislodgment from the original site and invading through the extracellular matrix. The current protocol provides a single workflow for migration and invasion assays. Together with the integrated automated microscopic camera for real-time HD images and built-in analysis module, it gives researchers a time-efficient, simple and reproducible experimental option. This protocol also includes substitutions for the consumables and alternative analysis methods for users to choose from.

The current protocol describes an integrated method investigating cancer cell migration and invasion on a single platform in real-time, providing an easily reproducible and time-efficient option to study cell mobility and morphology.

自動生細胞固体撮像素子を使用して単純な移行/侵略ワークフロー

Cancer cell mobility is crucial for the initiation of metastasis. Therefore, investigation of the cell movement and invasive capacity is of great ...

In Vitro Scratch Assay to Demonstrate Effects of Arsenic on Skin Cell Migration

Understanding the physiologic mechanisms of wound healing has been the focus of ongoing research for many years. This research directly translates into changes in clinical standards used for treating wounds and decreasing morbidity and mortality for patients. Wound healing is a complex process that requires strategic cell and tissue interaction and function. One of the many critically important functions of wound healing is individual and collective cellular migration. Upon injury, various cells from the blood, surrounding connective, and epithelial tissues rapidly migrate to the wound site by way of chemical and/or physical stimuli. This migration response can largely dictate the outcomes and success of a healing wound. Understanding this specific cellular function is important for translational medicine that can lead to improved wound healing outcomes. Here, we describe a protocol used to better understand cellular migration as it pertains to wound healing, and how changes to the cellular environment can significantly alter this process. In this example study, dermal fibroblasts were grown in media supplemented with fetal bovine serum (FBS) as monolayer cultures in tissue culture flasks. Cells were aseptically transferred into tissue culture treated 12-well plates and grown to 100% confluence. Upon reaching confluence, the cells in the monolayer were vertically scratched using a p200 pipet tip. Arsenic diluted in culture media supplemented with FBS was added to individual wells at environmentally relevant doses ranging 0.1-10 &#956;M. Images were captured every 4 hours (h) over a 24 h period using an inverted light microscope to observe cellular migration (wound closure). Images were individually analyzed using image analysis software, and percent wound closure was calculated. Results demonstrate that arsenic slows down wound healing. This technique provides a rapid and inexpensive first screen for evaluation of the effects of contaminants on wound healing.

In Vitro Scratch Assay to Demonstrate Effects of Arsenic on Skin Cell Migration

This study focuses on an in vitro model of wound healing (scratch assay) as a mechanism for determining how environmental contaminants such as arsenic influence cellular migration. The results demonstrate that this in vitro assay provides rapid and early indications of changes to cellular migration prior to in vivo experimentation.

体外皮膚細胞移動へのヒ素の効果を発揮するアッセイをスクラッチします。

Understanding the physiologic mechanisms of wound healing has been the focus of ongoing research for many years. This research directly translates into ...

環境学

In Vitro Assays to Evaluate the Migration, Invasion, and Proliferation of Immortalized Human First-trimester Trophoblast Cell Lines

Cell movement is a critical property of trophoblasts during placental development and early pregnancy. The significance of proper trophoblast migration and invasion is demonstrated by pregnancy disorders such as pre-eclampsia and intrauterine growth restriction, which are associated with inadequate trophoblast invasion of the maternal vasculature. Unfortunately, our understanding of the mechanisms by which the placenta develops from migrating trophoblasts is limited. In vitro analysis of cell migration via the scratch assay is a useful tool in identifying factors that regulate trophoblast migratory capacity. However, this assay alone does not define the cellular changes that can result in altered cell migration. This protocol describes three different in vitro assays that are used collectively to evaluate trophoblast cell movement: the scratch assay, the invasion assay, and the proliferation assay. The protocols described here may also be modified for use in other cell lines to quantify cell movement in response to stimuli. These methods allow investigators to identify individual factors that contribute to the cell movement and provide a thorough examination of potential mechanisms underlying apparent changes in cell migration.

Here, we present a highly accessible protocol for evaluating the cell movement in human trophoblast cells using three in vitro assays: the scratch assay, the transwell invasion assay, and the cell proliferation assay.

移行, 侵略, と不死化妊娠初期絨毛細胞の増殖を評価する生体外の試金

Cell movement is a critical property of trophoblasts during placental development and early pregnancy. The significance of proper trophoblast migration ...

Microscopy Based Methods for the Assessment of Epithelial Cell Migration During In Vitro Wound Healing

Cell migration is a mandatory aspect for wound healing. Creating artificial wounds on research animal models often results in costly and complicated experimental procedures, while potentially lacking in precision. In vitro culture of epithelial cell lines provides a suitable platform for researching the cell migratory behavior in wound healing and the impact of treatments on these cells. The physiology of epithelial cells is often studied in non-confluent conditions; however, this approach may not resemble natural wound healing conditions. Disrupting the epithelium integrity by mechanical means generates a realistic model, but may impede the application of molecular techniques. Consequently, microscopy based techniques are optimal for studying epithelial cell migration in vitro. Here we detail two specific methods, the artificial wound scratch assay and the artificial migration front assay, that can obtain quantitative and qualitative data, respectively, on the migratory performance of epithelial cells.

Microscopy Based Methods for the Assessment of Epithelial Cell Migration During  In Vitro Wound Healing

This manuscript describes how incision-like lesions made on cultured epithelial cell monolayers conveniently model wound healing in vitro, allowing for imaging by confocal or laser scanning microscopy, and which can provide high-quality quantitative and qualitative data for studying both cell behavior and the mechanisms involved in migration.

顕微鏡法によるIn Vitro創傷が治癒過程における上皮移行の評価

Cell migration is a mandatory aspect for wound healing. Creating artificial wounds on research animal models often results in costly and complicated ...

医学

In vitro Cell Migration and Invasion Assays

Migration is a key property of live cells and critical for normal development, immune response, and disease processes such as cancer metastasis and inflammation. Methods to examine cell migration are very useful and important for a wide range of biomedical research such as cancer biology, immunology, vascular biology, cell biology and developmental biology. Here we use tumor cell migration and invasion as an example and describe two related assays to illustrate the commonly used, easily accessible methods to measure these processes. The first method is the cell culture wound closure assay in which a scratch is generated on a confluent cell monolayer. The speed of wound closure and cell migration can be quantified by taking snapshot pictures with a regular inverted microscope at several time intervals. More detailed cell migratory behavior can be documented using the time-lapse microscopy system. The second method described in this paper is the transwell cell migration and invasion assay that measures the capacity of cell motility and invasiveness toward a chemo-attractant gradient. It is our goal to describe these methods in a highly accessible manner so that the procedures can be successfully performed in research laboratories even just with basic cell biology setup.

In vitro Cell Migration and Invasion Assays

Commonly used, highly accessible methods for examining cell migration and invasion in vitro are described. The first method is the cell wound closure assay that measures cell motility. The second method is the transwell migration and invasion assay that assesses the chemotactic and invasive capacity of cells.

インビトロでの細胞遊走および浸潤アッセイにおける

Migration is a key property of live cells and critical for normal development, immune response, and disease processes such as cancer metastasis and ...

生物学

Scratch Migration Assay and Dorsal Skinfold Chamber for In Vitro and In Vivo Analysis of Wound Healing

Impaired cutaneous wound healing is a major concern for patients suffering from diabetes and for elderly people, and there is a need for an effective treatment. Appropriate in vitro and in vivo approaches are essential for the identification of new target molecules for drug treatments to improve the skin wound healing process. We identified the &#946;3 subunit of voltage-gated calcium channels (Cav&#946;3) as a potential target molecule to influence the wound healing in two independent assays, i.e., the in vitro scratch migration assay and the in vivo dorsal skinfold chamber model. Primary mouse embryonic fibroblasts (MEFs) acutely isolated from wild-type (WT) and Cav&#946;3-deficient mice (Cav&#946;3 KO) or fibroblasts acutely isolated from WT mice treated with siRNA to down-regulate the expression of the Cacnb3 gene, encoding Cav&#946;3, were used. A scratch was applied on a confluent cell monolayer and the gap closure was followed by taking microscopic images at defined time points until complete repopulation of the gap by the migrating cells. These images were analyzed, and the cell migration rate was determined for each condition. In an in vivo assay, we implanted a dorsal skinfold chamber on WT and Cav&#946;3 KO mice, applied a defined circular wound of 2 mm diameter, covered the wound with a glass coverslip to protect it from infections and desiccation, and monitored the macroscopic wound closure over time. Wound closure was significantly faster in Cacnb3-gene-deficient mice. Because the results of the in vivo and the in vitro assays correlate well, the in vitro assay may be useful for the high-throughput screening before validating the in vitro hits by the in vivo wound healing model. What we have shown here for wild-type and Cav&#946;3-deficient mice or cells might also be applicable for specific molecules other than Cav&#946;3.

Here, we present a protocol for an in vitro scratch assay using primary fibroblasts and for an in vivo skin wound healing assay in mice. Both assays are straightforward methods to assess in vitro and in vivo wound healing.

インビトロおよび創傷治癒の生体内分析のためのスクラッチ移行アッセイとドーサルスキンフォールドチャンバー

Impaired cutaneous wound healing is a major concern for patients suffering from diabetes and for elderly people, and there is a need for an effective ...

T細胞動態の解明:リアルタイム移動解析の方法

Real-Time In Vitro Migration Assay for Primary Murine CD8+ T Cells

The adaptive immune response is reliant on a T cell&#39;s ability to migrate through blood, lymph, and tissue&#160;in response to pathogens and foreign bodies. T cell migration is a complex process that requires the coordination of many signal inputs from the environment and local immune cells, including chemokines, chemokine receptors, and adhesion molecules. Furthermore, T cell motility is influenced by dynamic surrounding environmental cues, which can alter activation state, transcriptional landscape, adhesion molecule expression, and more. In vivo, the complexity of these seemingly intertwined factors makes it difficult to distinguish individual signals that contribute to T cell migration. This protocol provides a string of methods from T cell isolation to computer-aided analysis to assess T cell migration in real-time&#160;under highly specific environmental conditions.&#160;These conditions&#160;may help&#160;elucidate mechanisms that regulate migration, improving our&#160;understanding of T cell kinetics and providing&#160;strong mechanistic evidence that is difficult&#160;to attain through animal experiments. A deeper understanding of the&#160;molecular interactions that impact cell&#160;migration is important to develop improved therapeutics.

著者スポットライト:T細胞遊走のリアルタイム解析による疾患メカニズムの理解

This protocol providesa method of primary murine T cell isolation and time-lapse microscopy of T cell migration under specific environmental conditions with quantitative analysis.

マウス初代CD8+ T細胞のリアルタイムin vitro遊走アッセイ

The adaptive immune response is reliant on a T cell&#39;s ability to migrate through blood, lymph, and tissue&#160;in response to pathogens and foreign ...

スクラッチのアッセイの in Vitro細胞遊走の自動光学カメラのテストのために最適化されました。

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細胞浸潤および移行プロセスの評価: ビデオ顕微鏡ベースのスクラッチの比較創傷アッセイと boyden 教授区域の試金

可溶性タバコの煙抽出物によって損傷した後のマウス間葉系幹細胞の移動の変化を検出するために創傷スクラッチアッセイの最適化

自動生細胞固体撮像素子を使用して単純な移行/侵略ワークフロー

体外皮膚細胞移動へのヒ素の効果を発揮するアッセイをスクラッチします。

移行, 侵略, と不死化妊娠初期絨毛細胞の増殖を評価する生体外の試金

顕微鏡法によるIn Vitro創傷が治癒過程における上皮移行の評価

インビトロでの細胞遊走および浸潤アッセイにおける

インビトロおよび創傷治癒の生体内分析のためのスクラッチ移行アッセイとドーサルスキンフォールドチャンバー

マウス初代CD8+ T細胞のリアルタイムin vitro遊走アッセイ

マウス初代CD8+ T細胞のリアルタイムin vitro遊走アッセイ