独立した研究・技術・生産、デンマーク議会許可 #4005-00029

実験のセットアップは倫理的、法的制限を持たず、ロスキレ大学との合意を行った。実験のセットアップの概要については、図 1と図 2の光学カメラの機構の見ることができます。
1. 準備
<ol><li>ベンチ ・実験の開始前に 70% のエタノールとすべての設備をクリーニングして滅菌の層流ベンチですべての手順を実行します。</li>
	<li>セルの最適な条件を確保する 5% CO2と 37 ° C で従来のインキュベーターで光学カメラを配置します。</li>
	<li>10 %fbs と 1 x 抗生物質 (ペニシリンとストレプトマイシン) T75 フラスコ DMEM メディア HaCaT 細胞を成長します。</li>
	<li>1 mL 1 x トリプシンを使用して、セルをデタッチし、サブ細胞の層の上にそれを分散させることによってすべての 3-4 日を育成します。使用する前に部屋の温度に予熱しておく。</li>
</ol>2. HaCaT の単分子膜を生成する細胞の 48 ウェル マイクロ プレート
<ol><li>パスツール ピペット T75 フラスコからメディアを削除します。</li>
	<li>5 mL × 1 滅菌 PBS を T75 フラスコに追加することによってフラスコ内での付着性のセルを洗浄します。 注:PBS はカルシウムとマグネシウムの無料を確認します。</li>
	<li>PBS を循環、パスツール ピペットを取り外します。</li>
	<li>2.2 2.3 の手順を繰り返します。</li>
	<li>フラスコに 1 mL 1 x トリプシンを追加し、細胞層の間で分散します。</li>
	<li>セルを取り外すまでに従来のインキュベーターで 37 ° C でフラスコを孵化させなさい (5-8 分でほとんどの細胞ラインの十分です)。</li>
	<li>顕微鏡下で細胞が分離される場合を表示します。セルを取り外したら、一度追加 10% と通常の培地の 9 mL FBS 1 x トリプシンを不活化します。</li>
	<li>どちらか検定を持つセルをカウント、コールター カウンターまたは似たような。 注:トリパン ブルーは、死んだ細胞を表示する使用できます。ただし、1 x トリプシン HaCaT の生きている細胞はラウンド完全に。</li>
	<li>250 μ L 10 %fbs メディアで 10 の4細胞/ウェル x 7.5 を丸底 48 ウェル培養プレート (標準プレート) に転送します。 注: アッセイは、6、12、24、または 96 ウェル プレート、すべて光学顕微鏡の下で試金することができますをも設定できます。</li>
	<li>優しくように細胞が等しく広げ、井戸の側に側からプレートを移動やセルが井戸の中心に収集されます。光メディアで均等に配分したセルを確認する顕微鏡検査します。</li>
	<li>一晩、またはセルが付いて、井戸の底にまで、37 ° C で従来の CO2インキュベーターに皿を置きます。</li>
</ol>3. 移行性の刺激の追加
<ol><li>井戸光顕微鏡下で 90-95% 合流かどうかを確認します。</li>
	<li>媒体の適切な量のマイトマイシン C の 10 μ g/mL を準備します。 注:本研究では、マイトマイシン C は 4 ° c で 1 mg/mL 原液で保持されます。マイトマイシン C 溶液中で 2-8 ° C で暗闇の中で 1 週間格納できます。</li>
	<li>各ウェルからパスツール ピペット使用済みメディアを削除します。</li>
	<li>各ウェルにマイトマイシン C の 5 μ g/mL の 250 μ L を追加します。</li>
	<li>37 ° C、5% CO2で 2 時間版を孵化させなさい。</li>
	<li>ペプチドの刺激を準備するには、メディアの適切な量でそれらを希釈します。 注:本研究では、両方、人間と牛ラクトフェリンやラクトフェリシンは 250 μ L のボリュームで 25 μ g/mL でテストされました。</li>
	<li>マイトマイシン C パスツール ピペットで培地を削除します。</li>
	<li>1 x 250 μ L の PBS (室温)、削除、パスツールを洗う × 1 ピペット洗浄します。</li>
	<li>1x PBS の 250 μ L を追加し、手動で 200 μ L ピペット チップと垂直の井戸をスクラッチします。各ウェルに新しいピペット チップを使用します。</li>
	<li>PBS を削除し、250 μ L ペプチド刺激を追加します。</li>
	<li>プレートの両側のネジを調整することによって、光学カメラ システムでプレートをマウントします。マイクロタイター プレートに蓋を残します。 注:カメラは、蓋が必要な場合は開いたまま操作できます。</li>
</ol>4. 光学カメラ コンピューター上のプログラムを設定します。
<ol><li>左側のタスクバーを取得をクリックします。</li>
	<li>左上のタスクバーに創傷治癒の関数を選択します。</li>
	<li>プレートの種類を選択するには、以下のプレートの図クリックします。</li>
	<li>マークすることによって、使用ではなく、井戸を選択せず、画面の左上側で [有効] をクリックします。 注:すべての井戸は、既定で選択されます。</li>
	<li>井戸の井戸の 1 つを右クリックして、セルの位置に合わせてレンズの焦点を調整します。 注:板図の右にバーを移動することによって、オート フォーカスを手動で調整もできます。</li>
	<li>画像間隔下画像の時間期間を設定 (例えば(00:30:00))。</li>
	<li>(例えば97 の繰り返し) の希望の期間に合わせて繰り返し数を設定します。</li>
	<li>右下のスタートボタンをクリックして、実行を開始します。</li>
</ol>

<ol>
	<li>Frykberg, R. G., Banks, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Challenges+in+the+Treatment+of+Chronic+Wounds.">Challenges in the Treatment of Chronic Wounds.</a> Advances in wound care. 4 (9), 560-582 (2015).</li><li>da Silva, L., Carvalho, E., Cruz, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+neuropeptides+in+skin+inflammation+and+its+involvement+in+diabetic+wound+healing.">Role of neuropeptides in skin inflammation and its involvement in diabetic wound healing.</a> Expert opinion on biological therapy. 10 (10), 1427-1439 (2010).</li><li>Vyas, K. S., Wong, L. 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著者が明らかに何もありません。

開発、創傷治癒、免疫学、癌研究の移行の重要性は移行を検討するいくつかの異なる方法をもたらした。移行は、展開の式またはセルによるギャップの閉鎖することができます。ほとんどの場合傷の閉鎖はテスト細胞単層を成長し、特定のフォーム8細胞を成長させるよりもスクラッチに簡単です。我々 の研究は、テクニックはマスターに簡単・低コスト マニュアル掻くため最適化されたメソッドを示します。DNA 合成阻害剤マイトマイシン C、公開メソッド18、およびスループットの高い研究を可能にする光学カメラの使用と比較してスクラッチを最適化するために余分な洗浄を導入しました。
スクラッチの in vitroアッセイは井戸の底に正しくバインドする付着性のセルの行を必要とし、傷を介して移行を検出、増殖が抑制される必要があります。これらの 2 つの機能は、アッセイのため不可欠です。真の移行を検出するには、いくつかのアプローチは14DMSO、または様々 な阻害剤13,27を掻く前に細胞を飢え、血清濃度を低下させると記載されています。一般に、血清フリー メディアを使用できます、ただし、一部のプライマリ細胞、運動と全体的な生存のための必要性血清などの行セルします。したがって、選択セルの行によるとすべきであります。マニュアル傷はコーティングを乱すようコーティングを必要とする細胞がこのアッセイで問題が発生することができますも。
異なる種類の細胞では、彼らのサイズと成長率に応じてコンフルエント単層を形成する細胞数が異なる必要があります。HaCaT 細胞は約 4-6 時間後付着しますが、一晩中安定した単分子膜を作成する解決に残ります。スクラッチのアッセイの主な欠点の 1 つは不規則な傷8です。本研究では事前 PBS で洗浄し、新しい PBS でスクラッチ傷のエッジに沿って負傷、損傷した細胞の蓄積を減少させることを示します。これは、皮膚の細胞を接続するデスモゾーム結合によってもっともらしく説明できます。接合は、Ca2 +-依存24 PBS を使用して陽イオンが削除され、強力な細胞間接着を弱めることができます。それによって、PBS の使用できるセルのより良い除去個別に傷の端に沿って細胞の少ない蓄積に 。さらに、光学カメラはすべてのプレート サイズで井戸の広い部分を測定し、その 3 つのステップ アルゴリズムを介して最初に bents に適応。それによって、PBS で洗浄し、光学カメラを使用して、手動の傷の欠点は除去されます。正確には、細胞に焦点を当てて画像の z 積み重ねがどのように異なる細胞の種類によって成長、フォーカスの問題をすることができます。細胞が増えるすぎる場合は、アウト フォーカス フォーカスからのカメラのフォーカスがシフトします。したがって、マイトマイシン C を使用しない場合はできる 24 h 以上の実験のセットアップを実行する場合は、少し高いフォーカスを設定する方が好都合。光学カメラ マイクロタイター プレート 6-96 ウェルのプレートを測定することができます直感的なソフトウェアに標準的なコンピューターで動作する簡単なセットアップがあり様々 なテスト セットアップ可能します。撮影する画像の数を選択すると、ほとんどの制限が存在しません。96 ウェル プレートを使用している場合 1 つを得ることができる画像の数は、データ セットの場合、スペースに制限されてが、大きくなるだけ、カメラの速度。それぞれをスキャンする時間が必要として、カメラの動きが制限要因をすることができます多くの写真は、立て続けに必要がある場合も。
光学系はシンプルでありながら強力な監視できます。傷の写真のギャップの閉鎖のプロセスについて分析したが、細胞の形態的特性の使用もできます。ソフトウェアは、黄色セルをマークし、背景色が raw 画像明らかを使用する必要などの出版物のより傷のエッジを視覚化するの標準的な機能としてグレーの葉します。HaCaT 細胞ダイナミック シート28で発生する移行を作る強力な細胞間相互作用があります。この機能では、(図 4) を時間をかけて移行細胞ケラトサイトを参照してください簡単です。
本研究は、タンパク質ラクトフェリンの効果とその派生の N 末端ペプチドの接種、および肯定的な制御として EGF を示します阻害剤や刺激として異なる薬、ペプチドやタンパク質との組み合わせをテストするのに変更される可能性しますが、創傷治癒。スクラッチのアッセイを変更、様々 な細胞および移行に影響することができます化合物に合わせて最適化することができます。一緒に、その低コストと容易な管理性、この試金はほとんどの実験室の非常にアクセス可能です。光学カメラは、阻害剤または移行も増殖刺激の異なる薬をテストする使用できます。

移行は、いくつかの生理学的な側面に影響を与える重要なプロセスです。創傷治癒の移行は皮膚の再上皮の再生を促進します。慢性の傷などのヒーリング以外の傷で日和見細菌が傷口の感染症を引き起こすし、傷口が細菌の成長とバイオ1,2の形成に最適です。バイオ フィルムは、私たちの現代社会3に対する最大の脅威の一つである抵抗力がある細菌の開発の原因の一つです。創傷治癒の免疫細胞は、バイオ フィルムを突き通すことができません。癌、癌細胞の移行は固形腫瘍4,5患者の死亡の主な原因である転移の要となる一歩です。したがって、移行を検討することができることが重要です。
スクラッチの試金はそれは安価で簡単に線維芽細胞、内皮細胞、上皮細胞ライン6,7などの付着性のセルラインに実行できますので、細胞遊走をテストによく使用されます。今日、傷8を実行するためにいくつかの方法が存在して、さまざまな材料が使用される報告されている、つまようじ9、セル スクレーパー10、レーザー11、電流12など。異なる長所と短所があるすべてのメソッドと、メソッドは、細胞の種類、予算、および分析ツールによって決められるべきです。例として使用されているセル型コーティング, 手動圧力除去が必要な場合例えばつまようじまたはピペットの先端と地域内での移行に影響を与える、異なるメソッドを使用してください。本研究では手動さげ仕上に焦点を当てます。
手動削りの欠点は、サイズのバリエーション、傷の形状と傷の端のセルの蓄積です。多くのプロトコルが存在して被引用論文アドバイス増加速度や13をスクラッチした後徹底的に洗浄します。さらに、いくつかの方法は、細胞の増殖が移行から識別することはできません、したがって移行の偽陽性の結果を与える可能性がありますので、増殖を最小限に抑えるために使用されています。いくつか報告方法、血清飢餓スクラッチ14の前と血清15の量を減少させます。但し、どちらの方法は、増殖がないことを保障できます。したがって、移行の真の結果を得るためにマイトマイシン C の細胞の前処理を報告します。マイトマイシン C は、DNA が16を分離することを防ぐ DNA と共有結合を形成することにより DNA 合成を阻害する抗生物質です。マイトマイシン C の前処理してスクラッチ前に PBS で洗浄するには、ギャップの検出された閉鎖は細胞 (図 1) の真の移動を示します。
すべてのメソッドの特徴は、移行17のプロセスを分析するシステムの必要性です。共通して、進捗状況を分析するための安価な方法イメージ ソフトウェア18,19のギャップの閉鎖の分析に続いて、事前に決められた時点で傷の画像を撮影するライト フィールド顕微鏡を使用することです。このメソッドは、時間のかかる、フォーカス、同じ場所で写真を撮ることに関して信頼できないと撮影しながら温度変化のサイクルを強制的にインキュベーターからカメラへの動き。他の方法は、電流の流れを測定することによって移行を検出するために開発されています。現在の変更セルとしてインピー ダンス20の増加として読み込まれる皿の上のより多くのスペースをカバーします。インピー ダンスを測定することにより、細胞の環境に影響がないとメソッドを非侵襲的な考えです。この方法は高価である金電極を用いた特殊なプレートに頼るが、彼らは細胞の付着、増殖、移行、および細胞死などの多くのプロセスの検出を有効にします。この方法の大きな欠点は、温度などの要因が大きな影響を与えるインピー ダンス インピー ダンス測定が直接移行を示されていないことです。データの解析をより難しくして、ソフトウェアによって見直されないいくつかの要因によってインピー ダンスの変化が起こります。したがって、可視化の欠如には、移行を検証する従来の光学顕微鏡が必要です。
利用可能な技術の欠点の多くを克服するためには、リアルタイム自動光学カメラを使用してください。光学カメラ、レンズ、照明ユニット、デジタル カメラと小さなプラットフォームで高スループットの顕微鏡による検出システムです。それが移行および他のものの間で拡散をテストすることができます内蔵のソフトウェアです。移行を検出するには、2 つのアルゴリズムを使用して、成長と細胞増殖および治癒解析、それぞれと呼ばれる移行動態を分析します。増殖解析は細胞に覆われた部分 (黄色で表示) の差を検出するためのテクスチャ解析を適用する 2 段階画像セグメンテーション アルゴリズムに基づいて、空高度なヒストグラム解析による背景のエリア。創傷治癒の分析は、単層細胞を検出し、特定して傷ギャップ ギャップの幅を決定する 3 つのステップ アルゴリズムに基づいています。ユーザーが決定した時点で、次の手順を実施し、カバーエリア、ギャップ幅、およびギャップ領域としてデータを表示します。この機械の大きな利点の 1 つはカメラ21の角度のため液体を付着細胞のイメージングが可能です。確実にフォーカス (図 2)、画像に生成が単一の z 平面の z スタックに予測されているカメラ傾斜 lenstakes イメージです。z スタックは、全体の傷の傷の端に垂直撮影 (例えば40) の写真のシリーズをマージすることによって生成されます。Z スタックは、フォーカスの面と同様、細胞層の深さの傷全体をキャプチャできます。さらに、一連の画像はボタンをクリックすると、画像のビデオ コレクションにまとめることができます。
ケラチノ サイト細胞株 HaCaT 移行の検出のための最適化されたプロトコルを示す.ラクトフェリンとその N 末端ペプチド、同様、人間と牛、抗菌、免疫変調分子22として多数のアプリケーションを持っているこれらの分子が実証されている、移行に及ぼす影響を分析する実験を行った,23します。 4 つの化合物を比較した未処理細胞と上皮成長因子 (EGF) が肯定的な制御として使用されました。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="712">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">oCelloScope</td>
			<td style="width:156px;">BioSense Solution ApS</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:221px;">Optical camera</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">UniExplorer software&#160;</td>
			<td style="width:156px;">BioSense Solution ApS</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>(8.0.0.7144 (RL3))</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">HaCaT cell</td>
			<td style="width:156px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Donated from Bispebjerg Hospital</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DMEM (1x) + GlutaMAX</td>
			<td style="width:156px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">31966-021</td>
			<td>Medium for HaCaT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">FBS</td>
			<td style="width:156px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">10270</td>
			<td>Fetal bovine serum</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">PBS</td>
			<td style="width:156px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">D837</td>
			<td>Without Mg+ and Ca2+</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Pencillin-Streptomycin</td>
			<td style="width:156px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P0781</td>
			<td>Antibiotics</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Trypsin (10x)</td>
			<td style="width:156px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">T3924</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Mitomycin C</td>
			<td style="width:156px;">Tocris</td>
			<td style="width:119px;">3258</td>
			<td>Inhibits proliferation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Microtiter plate</td>
			<td style="width:156px;">Greiner Bio-one</td>
			<td style="width:119px;">677 180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Incubator</td>
			<td style="width:156px;">Panasonic</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>37&#176;C, 5% CO2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Hemocytometer</td>
			<td style="width:156px;">Assistent</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>T&#252;rk (0.1 mm)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Pipet boy</td>
			<td style="width:156px;">Accu-Jet pro</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

optimized scratch assay for in vitro testing of cell migration with an automated optical camera

細胞遊走創傷治癒や、がんなどの健康の多くの側面に影響する重要なプロセスであり、したがって、移行を研究する手法を開発するため非常に重要。スクラッチのアッセイは、その低コストと簡単な手順のため反プロ移行のプロパティを持つ化合物をテストする最も一般的な体外メソッドをずっと。ただし、アッセイのしばしば報告されている問題は傷の端の間で細胞の積み重ねであります。さらに、測定からデータを取得する異なる露出の画像取られなければならない期間にわたって同じ場所で移行の動きを比較します。傷の閉鎖を説明する別の解析プログラムを使用ことができますが、彼らは、労働集約的、不正確なと温度変化の力サイクル。本研究では、テスト移行効果、例えば人間と牛ラクトフェリンの天然の蛋白質およびその N 末端ペプチド ラクトフェリシン上皮細胞線 HaCaT 最適化手法を示す.重要な最適化は、洗浄し、エッジに沿って細胞の前述の蓄積を排除、PBS のスクラッチです。これは、ケラチノ サイトの細胞間の接続に影響を及ぼすことが示されている陽イオンの除去によって説明できます。移行の true 検出するように、マイトマイシン C、DNA 合成阻害剤の前処理は、プロトコルに追加されました。最後に、再現性を向上し、時間をかけて傷の同一断面の解析しながら自動光学カメラ、過度の温度サイクルを排除するスクラッチ閉鎖分析で、肉体労働を示します。

HaCaT はケラチノ サイト細胞ライン、皮膚の最も豊富なセル型の 1 つです。傷が発生すると、皮膚細胞は増殖し、傷のベッド (図 3) 傷を閉じるために移行を開始します。両方のプロセスは、したがって、適切な治療のため非常に重要です。
光学カメラは、リアルタイムでの両方のプロセスに従うことができます。移行のシステムは 3 つのデータのセットを与える: セルに領域、ギャップ幅およびギャップ領域が覆われています。ラクトフェリンやラクトフェリシン EGF で処理する傷を監視、光学顕微鏡により時間をかけてこれらの 3 つのパラメーターを監視できます。48 時間培養後、EGF は 95% (図 3 a) 無処理の 38% 閉鎖に比べると、傷の閉鎖をもたらした遵守します。ラクトフェリンやラクトフェリシンの異なるバージョンは、親のタンパク質よりもより強力なされているペプチドと 33% と 62% の傷口の閉鎖の間配置されます。最初の最初からの間隔の変化から決定の創傷閉鎖の割合ができます (図 3 b) をプロットします。
細胞がある強い細胞間相互作用と細胞が移行すると、一連の手順が必要な24。まもなく、先頭のセルは、接着の彼らのサイトを混乱させるし、突出、25に移動する細胞骨格を契約します。主要な細胞の突起は、光学カメラ (図 4) を簡単に表示できます。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57691/57691fig1.jpg"> 図 1: 光学カメラへの移行をテストするのにはスクラッチのアッセイの概略フローチャートです。HaCaT 細胞は 48 ウェル プレートにメッキ、24 h の従うこと。細胞を増殖を抑制する 2 h のマイトマイシン C 併用処理済みとスクラッチを行いペプチド刺激の付加によって続いた。光学カメラのユニットにプレートを挿入し、移行が 48 時間続きます。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57691/57691fig2.jpg"> 図 2: 光のカメラのスキャン技術。自動化された光学カメラの光学レンズ ユニットは細菌や携帯電話ソリューションなど多彩なソリューションをスキャンを有効にする水平方向の平面に 6.25 ° します。取得した一連画像にはには、すべての焦点を当てて、アウト フォーカスとセルでフォーカスを持つ画像を確保するために、フォーカスでの画像のスタックが含まれています。26から変更。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57691/57691fig3.jpg"> 図 3: 48 時間以上前処理マイトマイシン C HaCaT 細胞の移行。(A)移行が 48 時間半時間ごとの自動光学カメラで検出されました。マイトマイシン C の増殖を阻害することで細胞を処理済み。セルは、思いやりのある- またはウシ ・ ラクトフェリン (H LF または B LF) または - ラクトフェリシン (H LFcin、B LFcin) の 25 μ G/ml と扱われます。上皮成長因子 (EGF) は、500 ng/mL で肯定的な制御として使用されます。未処理細胞は、コントロールとして使用されます。(B)の治療法の移行の図。3 つの独立した動作の代表であり、初期傷の割合閉鎖として結果が与えられる結果 * p < 0.05 * * p < 0.01 * * * p < 0.001。
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57691/57691fig4.jpg"> 図 4: HaCaT 細胞を扱う突出のケラトサイト。ケラトサイト HaCaT 細胞は黒の矢印で示されます。HaCaT の強力な細胞間相互作用は細胞のダイナミックな動きで結果と移行容易に時間をかけて観察することができます。

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Optimized Scratch Assay for In Vitro Testing of Cell Migration with an Automated Optical Camera

ここで自動光学カメラ顕微鏡を用いた細胞移行、生体外でテストする手順をについて説明します。スクラッチのアッセイは、傷の閉鎖が一定期間続いている広く使用されています。光学顕微鏡は細胞遊走の信頼性の高い、格安の検出を可能にします。

スクラッチのアッセイの in Vitro細胞遊走の自動光学カメラのテストのために最適化されました。

Cell migration is an important process that influences many aspects of health, such as wound healing and cancer, and it is, therefore, crucial for ...

optimized-scratch-assay-for-vitro-testing-cell-migration-with-an

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

Optimized Scratch Assay for In Vitro Testing of Cell Migration with an Automated Optical Camera

22.9K ビュー.  Roskilde University. ここで自動光学カメラ顕微鏡を用いた細胞移行、生体外でテストする手順をについて説明します。スクラッチのアッセイは、傷の閉鎖が一定期間続いている広く使用されています。光学顕微鏡は細胞遊走の信頼性の高い、格安の検出を可能にします。

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Semi-automated Optical Heartbeat Analysis of Small Hearts

We have developed a method for analyzing high speed optical recordings from Drosophila, zebrafish and embryonic mouse hearts (Fink, et. al., 2009). Our Semi-automatic Optical Heartbeat Analysis (SOHA) uses a novel movement detection algorithm that is able to detect cardiac movements associated with individual contractile and relaxation events. The program provides a host of physiologically relevant readouts including systolic and diastolic intervals, heart rate, as well as qualitative and quantitative measures of heartbeat arrhythmicity. The program also calculates heart diameter measurements during both diastole and systole from which fractional shortening and fractional area changes are calculated. Output is provided as a digital file compatible with most spreadsheet programs. Measurements are made for every heartbeat in a record increasing the statistical power of the output. We demonstrate each of the steps where user input is required and show the application of our methodology to the analysis of heart function in all three genetically tractable heart models.

We have developed a Semi-automated Optical Heartbeat Analysis method (SOHA) for analyzing high speed optical recordings from Drosophila, zebrafish and embryonic mouse hearts. We demonstrate the application of our methodology to the analysis of heart function in fruit fly and embryonic mouse hearts.

スモールハーツの半自動光ビート解析

We have developed a method for analyzing high speed optical recordings from Drosophila, zebrafish and embryonic mouse hearts (Fink, et. al., 2009). Our ...

生物学

An In vitro FluoroBlok Tumor Invasion Assay

The hallmark of metastatic cells is their ability to invade through the basement membrane and migrate to other parts of the body. Cells must be able to both secrete proteases that break down the basement membrane as well as migrate in order to be invasive. BD BioCoat Tumor Invasion System provides cells with conditions that allow assessment of their invasive property in vitro1,2. It consists of a BD Falcon FluoroBlok 24-Multiwell Insert Plate with an 8.0 micron pore size PET membrane that has been uniformly coated with BD Matrigel Matrix. This uniform layer of BD Matrigel Matrix serves as a reconstituted basement membrane in vitro providing a true barrier to non-invasive cells while presenting an appropriate protein structure to study invasion. The coating process occludes the pores of the membrane, blocking non-invasive cells from migrating through the membrane. In contrast, invasive cells are able to detach themselves from and migrate through the coated membrane. Quantitation of cell invasion can be achieved by either pre- or post-cell invasion labeling with a fluorescent dye such as DiIC12(3) or calcein AM, respectively, and measuring the fluorescence of invading cells. Since the BD FluoroBlok membrane effectively blocks the passage of light from 490-700 nm at &gt;99% efficiency, fluorescently-labeled cells that have not invaded are not detected by a bottom-reading fluorescence plate reader. However, cells that have invaded to the underside of the membrane are no longer shielded from the light source and are detected with the respective plate reader. This video demonstrates an endpoint cell invasion assay, using calcein AM to detect invaded cells.

An In vitro FluoroBlok Tumor Invasion Assay

This video demonstrates how to measure cell invasion through cell culture inserts using a fluorescence-based methodology.

アン試験管内でフルオロブロックの腫瘍の浸潤アッセイ

The hallmark of metastatic cells is their ability to invade through the basement membrane and migrate to other parts of the body. Cells must be able to ...

Induction and Testing of Hypoxia in Cell Culture

Hypoxia is defined as the reduction or lack of oxygen in organs, tissues, or cells. This decrease of oxygen tension can be due to a reduced supply in oxygen (causes include insufficient blood vessel network, defective blood vessel, and anemia) or to an increased consumption of oxygen relative to the supply (caused by a sudden higher cell proliferation rate). Hypoxia can be physiologic or pathologic such as in solid cancers 1-3, rheumatoid arthritis, atherosclerosis etc&#x2026; Each tissues and cells have a different ability to adapt to this new condition. During hypoxia, hypoxia inducible factor alpha (HIF) is stabilized and regulates various genes such as those involved in angiogenesis or transport of oxygen 4. The stabilization of this protein is a hallmark of hypoxia, therefore detecting HIF is routinely used to screen for hypoxia 5-7. 
In this article, we propose two simple methods to induce hypoxia in mammalian cell cultures and simple tests to evaluate the hypoxic status of these cells.

Here we propose simple methods to induce hypoxia in cell cultures and simple tests to evaluate the hypoxic status of the cultures.

細胞培養で誘導し、低酸素のテスト

Hypoxia is defined as the reduction or lack of oxygen in organs, tissues, or cells.  This decrease of oxygen tension can be due to a reduced supply in ...

In vitro Cell Migration and Invasion Assays

Migration is a key property of live cells and critical for normal development, immune response, and disease processes such as cancer metastasis and inflammation. Methods to examine cell migration are very useful and important for a wide range of biomedical research such as cancer biology, immunology, vascular biology, cell biology and developmental biology. Here we use tumor cell migration and invasion as an example and describe two related assays to illustrate the commonly used, easily accessible methods to measure these processes. The first method is the cell culture wound closure assay in which a scratch is generated on a confluent cell monolayer. The speed of wound closure and cell migration can be quantified by taking snapshot pictures with a regular inverted microscope at several time intervals. More detailed cell migratory behavior can be documented using the time-lapse microscopy system. The second method described in this paper is the transwell cell migration and invasion assay that measures the capacity of cell motility and invasiveness toward a chemo-attractant gradient. It is our goal to describe these methods in a highly accessible manner so that the procedures can be successfully performed in research laboratories even just with basic cell biology setup.

In vitro Cell Migration and Invasion Assays

Commonly used, highly accessible methods for examining cell migration and invasion in vitro are described. The first method is the cell wound closure assay that measures cell motility. The second method is the transwell migration and invasion assay that assesses the chemotactic and invasive capacity of cells.

インビトロでの細胞遊走および浸潤アッセイにおける

Migration is a key property of live cells and critical for normal development, immune response, and disease processes such as cancer metastasis and ...

Endothelial Cell Tube Formation Assay for the In Vitro Study of Angiogenesis

Angiogenesis is a vital process for normal tissue development and wound healing, but is also associated with a variety of pathological conditions. Using this protocol, angiogenesis may be measured in vitro in a fast, quantifiable manner. Primary or immortalized endothelial cells are mixed with conditioned media and plated on basement membrane matrix. The endothelial cells form capillary like structures in response to angiogenic signals found in conditioned media. The tube formation occurs quickly with endothelial cells beginning to align themselves within 1&#160;hr and lumen-containing tubules beginning to appear within 2 hr. Tubes can be visualized using a phase contrast inverted microscope, or the cells can be treated with calcein AM prior to the assay and tubes visualized through fluorescence or confocal microscopy. The number of branch sites/nodes, loops/meshes, or number or length of tubes formed can be easily quantified as a measure of in vitro angiogenesis. In summary, this assay can be used to identify genes and pathways that are involved in the promotion or inhibition of angiogenesis in a rapid, reproducible, and quantitative manner.

Endothelial Cell Tube Formation Assay for the In Vitro Study of Angiogenesis

The tube formation assay is a fast, quantifiable method for measuring in vitro angiogenesis. Endothelial cells are combined with conditioned media and plated on basement membrane extract. Tube formation occurs within hours and newly formed tubules easily quantified.

のための内皮細胞チューブ形成アッセイ<em&gt;体外</em&gt;血管新生に関する研究

Angiogenesis is a vital process for normal tissue development and wound healing, but is also associated with a variety of pathological conditions. Using ...

An Assay for Lateral Line Regeneration in Adult Zebrafish

Due to the clinical importance of hearing and balance disorders in man, model organisms such as the zebrafish have been used to study lateral line development and regeneration. The zebrafish is particularly attractive for such studies because of its rapid development time and its high regenerative capacity. To date, zebrafish studies of lateral line regeneration have mainly utilized fish of the embryonic and larval stages because of the lower number of neuromasts at these stages. This has made quantitative analysis of lateral line regeneration/and or development easier in the earlier developmental stages. Because many zebrafish models of neurological and non-neurological diseases are studied in the adult fish and not in the embryo/larvae, we focused on developing a quantitative lateral line regenerative assay in adult zebrafish so that an assay was available that could be applied to current adult zebrafish disease models. Building on previous studies by Van Trump et al.17&#160;that described procedures for ablation of hair cells in adult Mexican blind cave fish and zebrafish (Danio rerio), our assay was designed to allow quantitative comparison between control and experimental groups. This was accomplished by developing a regenerative neuromast standard curve based on the percent of neuromast reappearance over a 24 hr time period following gentamicin-induced necrosis of hair cells in a defined region of the lateral line. The assay was also designed to allow extension of the analysis to the individual hair cell level when a higher level of resolution is required.

Because many zebrafish models of neurological and non-neurological diseases are studied in the adult fish rather than the embryo/larvae, we developed a quantitative lateral line regenerative assay that can be applied to adult zebrafish disease models. The assay involved resolution at the 1) neuromast and 2) individual hair cell levels.

アダルトゼブラフィッシュ側線再生のためのアッセイ

Due to the clinical importance of hearing and balance disorders in man, model organisms such as the zebrafish have been used to study lateral line ...

Imaging Intermediate Filaments and Microtubules with 2-dimensional Direct Stochastic Optical Reconstruction Microscopy

The cytoskeleton, composed of actin microfilaments, microtubules, and intermediate filaments (IF), plays a key role in the control of cell shape, polarity, and motility. The organization of the actin and microtubule networks has been extensively studied but that of IFs is not yet fully characterized. IFs have an average diameter of 10 nm and form a network extending throughout the cell cytoplasm. They are physically associated with actin and microtubules through molecular motors and cytoskeletal linkers. This tight association is at the heart of the regulatory mechanisms that ensure the coordinated regulation of the three cytoskeletal networks required for most cell functions. It is therefore crucial to visualize IFs alone and also together with each of the other cytoskeletal networks. However, IF networks are extremely dense in most cell types, especially in glial cells, which makes its resolution very difficult to achieve with standard fluorescence microscopy (lateral resolution of ~250 nm). Direct STochastic Optical Reconstruction Microscopy (dSTORM) is a technique allowing a gain in lateral resolution of one order of magnitude. Here, we show that lateral dSTORM resolution is sufficient to resolve the dense organization of the IF networks and, in particular, of IF bundles surrounding microtubules. Such tight association is likely to participate in the coordinated regulation of these two networks and may, explain how vimentin IFs template and stabilize microtubule organization as well as could influence microtubule dependent vesicular trafficking. More generally, we show how the observation of two cytoskeletal components with dual-color dSTORM technique brings new insight into their mutual interaction.

The overall goal of this methodology is to give the optimal experimental conditions from sample preparation to image acquisition and reconstruction in order to perform 2D dual color dSTORM images of microtubules and intermediate filaments in fixed cells

中間径フィラメントと微小管 2次元直接確率光再構成顕微鏡イメージング

The cytoskeleton, composed of actin microfilaments, microtubules, and intermediate filaments (IF), plays a key role in the control of cell shape, ...

Preparation of Cell Extracts by Cryogrinding in an Automated Freezer Mill

The ease of genetic manipulation and the strong evolutionary conservation of eukaryotic cellular machinery in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae has made it a pre-eminent genetic model organism. However, since efficient protein isolation depends upon optimal disruption of cells, the use of yeast for biochemical analysis of cellular proteins is hampered by its cell wall which is expensive to digest enzymatically (using lyticase or zymolyase), and difficult to disrupt mechanically (using a traditional bead beater, a French press or a coffee grinder) without causing heating of samples, which in turn causes protein denaturation and degradation. Although manual grinding of yeast cells under liquid nitrogen (LN2) using a mortar and pestle avoids overheating of samples, it is labor intensive and subject to variability in cell lysis between operators. For many years, we have been successfully preparing high quality yeast extracts using cryogrinding of cells in an automated freezer mill. The temperature of -196 &#176;C achieved with the use of LN2 protects the biological material from degradation by proteases and nucleases, allowing the retrieval of intact proteins, nucleic acids and other macromolecules. Here we describe this technique in detail for budding yeast cells which involves first freezing a suspension of cells in a lysis buffer through its dropwise addition into LN2 to generate frozen droplets of cells known as "popcorn". This popcorn is then pulverized under LN2 in a freezer mill to generate a frozen "powdered" extract which is thawed slowly and clarified by centrifugation to remove insoluble debris. The resulting extracts are ready for downstream applications, such as protein or nucleic acid purification, proteomic analyses, or co-immunoprecipitation studies. This technique is widely applicable for cell extract preparation from a variety of microorganisms, plant and animal tissues, marine specimens including corals, as well as isolating DNA/RNA from forensic and permafrost fossil specimens.

We describe a reliable method for the preparation of whole cell extracts from yeast or other cells using a cryogenic freezer mill that minimizes degradation and denaturation of proteins. The cell extracts are suitable for purification of functional protein complexes, proteomic analyses, co-immunoprecipitation studies and detection of labile protein modifications.

自動冷凍工場におけるクライオグラインによる細胞抽出物の調製

The ease of genetic manipulation and the strong evolutionary conservation of eukaryotic cellular machinery in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae ...

A Cost Effective and Adaptable Scratch Migration Assay

Cell migration is a key component in both physiological and pathological events. Normal cell migration is required for essential functions such as development and mounting an immune response. When a defect or alteration occurs with the cell migration process, it can have detrimental outcomes (i.e., cancer metastasis, wound healing, and scar formation). Due to the importance of cell migration, it is necessary to have access to a cell migration assay that is affordable, adaptable, and repeatable. Utilizing the common scratch migration assay, we have developed a new approach to analyzing cell migration that uses general laboratory equipment. The method described uses visual markers that allow for recapturing specific areas of interest without the use of time-lapse microscopy. In addition, it provides flexibility in the experimental design, ranging from altering the migration matrix substrate to the addition of pharmacological modifiers. Furthermore, this protocol outlines a way to account for the area of cell migration, which is not considered by several methods when examining cell migration. This new approach offers a scratch migration assay to a larger audience and will provide greater opportunity for researchers to examine the physiological and pathophysiological impact of cell migration.

We present a cost-effective method to the scratch migration assay that provides a new approach for determining cell migration without the use of equipment-intensive methods. While fibroblasts were used in this protocol, it can be adapted and utilized to study additional cell types and influences on cell migration.

コスト効率と適応性のあるスクラッチ移行アッセイ

Cell migration is a key component in both physiological and pathological events. Normal cell migration is required for essential functions such as ...

Imaging Molecular Adhesion in Cell Rolling by Adhesion Footprint Assay

Rolling adhesion, facilitated by selectin-mediated interactions, is a highly dynamic, passive motility in recruiting leukocytes to the site of inflammation. This phenomenon occurs in postcapillary venules, where blood flow pushes leukocytes in a rolling motion on the endothelial cells. Stable rolling requires a delicate balance between adhesion bond formation and their mechanically-driven dissociation, allowing the cell to remain attached to the surface while rolling in the direction of flow. Unlike other adhesion processes occurring in relatively static environments, rolling adhesion is highly dynamic as the rolling cells travel over thousands of microns at tens of microns per second. Consequently, conventional mechanobiology methods such as traction force microscopy are unsuitable for measuring the individual adhesion events and the associated molecular forces due to the short timescale and high sensitivity required. Here, we describe our latest implementation of the adhesion footprint assay to image the P-selectin: PSGL-1 interactions in rolling adhesion at the molecular level. This method utilizes irreversible DNA-based tension gauge tethers to produce a permanent history of molecular adhesion events in the form of fluorescence tracks. These tracks can be imaged in two ways: (1) stitching together thousands of diffraction-limited images to produce a large field of view, enabling the extraction of adhesion footprint of each rolling cell over thousands of microns in length, (2) performing DNA-PAINT to reconstruct super-resolution images of the fluorescence tracks within a small field of view. In this study, the adhesion footprint assay was used to study HL-60 cells rolling at different shear stresses. In doing so, we were able to image the spatial distribution of the P-selectin: PSGL-1 interaction and gain insight into their molecular forces through fluorescence intensity. Thus, this method provides the groundwork for the quantitative investigation of the various cell-surface interactions involved in rolling adhesion at the molecular level.

This protocol presents the experimental procedures to perform the adhesion footprint assay to image the adhesion events during fast cell rolling adhesion.