この作品は国立キー研究開発中国プログラム [2017YFD0500102]; からの補助金によって支えられました。[31572544]; 中国の国家自然科学基金[SKLVEB2016KFKT005]; 獣医病因生物学国家重点実験室上海農業技術開発プログラム、中国 [G2016060201] を適用されます。

マウス感染実験研究所動物監視委員会、江蘇省、中国が承認され、研究所動物センター南京農業大学で実行 (許可番号: SYXK (Su) 2017-0007)。
1. 細菌の準備
注:血清血清型 2 型の強毒株 P1/7 だった髄膜炎19罹患豚から分離されました。ひずみ P1/7 トッド ・ ヒューイット ブイヨンで育った (バーツ、1 リットルあたりバーツの数式: 心臓注入、3.1 g neopeptone、20.0 g ブドウ糖、2.0 g; 2.0 g、塩化ナトリウム; リン酸、0.4 g; 2.5 g、炭酸ナトリウム)、トッド ・ ヒューイットの寒天 (THA、1 リットル当たり式メッキター: 心臓注入、3.1 g;neopeptone、20.0 g;ブドウ糖、2.0 g;ナトリウム塩化物、2.0 g;リン酸、0.4 g。炭酸ナトリウム、2.5 g;寒天、15.0 g) 37 ° C および 5% の CO2。
<ol><li>コレクションのひずみ P1/7 浮遊性細胞<ol>
<li>中間ログ相培養から浮遊性細胞の 5 mL を収集 (外径600= 0.6)、8000 × g で 3 分間遠心し、PBS で 3 回を洗浄します。</li>
		<li>バーツ、5 管に分注で 25% グリセリン 5 mL の細胞を再懸濁します、-80 ° C で保存し、</li>
	</ol>
</li>
	<li>コレクションのひずみ P1/7 バイオ フィルム状態細胞<ol>
<li>一晩かけて培養 20 mL を取るし、新鮮なバーツ; 180 mL に追加希薄化後の文化を 10 ラウンド培養皿に均等に分けて 5% CO2の 37 ° C で 24 時間のインキュベーターにプレートを入れる。</li>
		<li>インキュベーション後、 プレート プレート、遵守していない細菌を再懸濁しますを軽く振るし、吸引により上澄みを廃棄します。 注: プレートを軽く振るし、土砂を再を避けるため。</li>
		<li>5 mL の PBS バイオ フィルム状態の細胞を採取し、堆積物を完全に再懸濁します新しいチューブにサンプルを転送を追加します。</li>
		<li>次のパラメーターでの最後のステップからバイオ フィルム状態の細胞を超音波照射: 60 W、4 サイクル、5 s をオフに 10 秒。</li>
		<li>8000 × g で 3 分間遠心し、-80 ° C で上清を保存 注: 清バイオ コンポーネントを格納し、感染動物実験 (ステップ 3) で説明したようの前にバイオ フィルム細菌を再懸濁しますに使用できます。</li>
		<li>バーツで 10 mL 25% グリセロールと土砂を再懸濁します、-80 ° C でバイオ フィルム状態のセルを格納</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 走査電子顕微鏡 (SEM) 分析
<ol><li>収集したバイオ フィルム状態の細胞と浮遊細胞の 4 ° C で 12-24 h の 4% パラホルムアルデヒドを使用して修正します。</li>
	<li>蒸留水を迅速にサンプルをすすぎし、脱水サンプルは順番に各ソリューション内で 30 分間のエタノール (25%、50%、70%、90% と 100%) 濃度が増加。</li>
	<li>両面テープでホルダーを金属、金とパラジウムと蒸発器のそれらを最後にコートに乾きを満たしています。</li>
	<li>次のパラメーターを使用して走査型電子顕微鏡によるサンプルを観察: EHT (余分な高張力) = 10 kV;WD (作動距離) = 7.0 または 8.0 mm;倍率 = 5000 ×;信号 A SE1 を =。</li>
</ol>3. 動物実験します。
<ol><li>SPF 6 週古いを使用して、本研究では女性の BALB/c マウス。感染症の注射部位は前から吻側に位置する 3.5 ミリメートルの頭蓋内クモ膜下ルートを通じてすべてのマウスに感染します。注射部位の定位座標は Chiavoliniら17によって明確に記述されていた。<ol>
<li>病理組織学的解析、マウス (1 グループあたり 5 マウス) の 2 つのグループに感染する状態は、3 × 107コロニー形成単位 (CFU) の用量で細胞浮遊性細胞やバイオ フィルムを使用して、コントロールとして PBS を注入した別 5 マウス。</li>
		<li>状態は TLR2 と脳内では、サイトカインの mRNA 発現の検出感染マウス (グループごと 6 マウス) の 2 つの追加グループの浮遊性細胞やバイオ フィルムを使用してまで 3 × 107 CFU の用量でセルします。</li>
		<li>ターにシリアル希薄をメッキすることによって細菌の数を決定します。</li>
		<li>さらなる研究のため感染 12 時間後にすべてのマウスを安楽死させます。 注: グリセロール ストックの中では感染前に削除する必要があります。浮遊性細胞とバイオ フィルム状態細胞-80 ° C から回復の両方 PBS で 3 回の洗浄は。浮遊性細胞を PBS で再停止され、感染の適切な投与量に希釈する、バイオ フィルム状態の細胞は (ステップ 1.2.5) からストアドの上澄みで再停止される、感染症の適切な投与量に希釈して使用。感染症のためボリュームは以上 50 μ L をしないでください。</li>
	</ol>
</li>
	<li>脳組織における TLR2 およびサイトカインの mRNA の発現を検出<ol>
<li>RNA 抽出キットを用いた脳組織から total RNA を抽出します。<ol>
<li>各マウスの RNA を抽出するため全脳組織を使用します。5 チューブ全脳組織に分割します。100 mg の脳組織にかかるし、キットで提供される lysing のマトリックスを含む各管に溶解溶液 1 mL を追加します。</li>
			<li>40 用ホモジナイザのチューブを処理 6.0、および、遠心管 12000 × g、4 ° C で 5 分間の設定で s。</li>
			<li>遠心分離の後新しい微量遠心チューブに上部の段階を転送します。</li>
			<li>部屋の温度で 5 分間転送のサンプルをインキュベートします。クロロホルム、10 の渦を 300 μ l 添加 s とし、室温で 5 分間インキュベートします。</li>
			<li>12000 × チューブを遠心g と 4 ° C、5 分転送新しい管への上部の段階。</li>
			<li>5 回も反転する前にチューブに冷たいエタノール 500 μ L を追加し、少なくとも 1 時間-20 ° C でサンプルを格納します。</li>
			<li>12000 × チューブを遠心g と 4 ° C、15 分および削除上清。RNase フリー H2o. で冷たい 75% エタノール 500 μ L でペレットを洗う</li>
			<li>削除エタノール、空気乾燥室内の温度、および無料の RNase H2o. の 100 μ L の RNA を再懸濁しますで 5 分のペレット</li>
			<li>室温で 5 分の RNA をインキュベートし、RNA バイオアナライザーを用いた RNA 濃度を決定します。</li>
		</ol>
</li>
		<li>たちの逆のトランスクリプション (RT) 試薬キットを用いたゲノム DNA (gDNA) の除去を含む cDNA 合成を実行します。<ol>
<li>ボリュームに達する 10 μ L. 42 ° C で 2 分間インキュベートまでの 5 x gDNA の除去バッファー管含む 2 μ L、gDNA 除去酵素 RNase フリー H2O の 1 μ L に RNA の 1 μ g を追加します。</li>
			<li>マスター ミックスの 10 μ L を追加 (RT 酵素の 1 μ L ミックス, RT プライマー ミックスの 1 μ L, 5 バッファー 2 倍の 4 μ L と RNase フリー H2O の 4 μ L) 最後から反応液にステップし、優しく混ぜます。RT の反作用をすぐに続行: 37 ° C 15 分してから 85 ° C、5 s。</li>
			<li>SYBR Rt-qpcr キット リアルタイム PCR 装置を用いた定量的リアルタイム PCR (RT qPCR) の解析を実行します。20 μ L の総ボリュームまで 10 μ L の酵素 x 2、前方のプライマー、逆プライマーの 0.8 μ L、ロックス参照色素 II x 50 0.4 μ、cDNA テンプレートと無料の RNase H2O 2 μ L の 0.8 μ L を追加します。</li>
			<li>3 通次熱パラメーターを使用して各サンプルを実行: 30 94 ° c、s に続いて 5 の 40 のサイクル 95 ° c、s、34 60 ° C、15 の最終段階で s 95 ° C、60 ° C で 1 分で s、15 95 ° C で sRT qPCR 用プライマーは、表 1に示します。ハウスキーピング遺伝子B2mと18 s rRNA内部統制として使われていた。</li>
		</ol>
</li>
		<li>2-ΔΔCt法に基づく相対フォールドの変更を計算します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
組織切片の観察
	<ol>
<li>24 h 10% ホルマリンで固定後 2 〜 3 mm でティッシュ部分の適切なサイズに固定脳組織を再構築します。</li>
		<li>埋め込みカセットで組織のピースを置くし、自動真空脱水機で脱水の新しい定着性の溶液に浸します。</li>
		<li>固定ティッシュを取り出して、順番に各ソリューションの 30 分 (70%、80%、95%、95%、100%) エタノール濃度の増加で脱水します。</li>
		<li>15 分のキシレンのサンプルを transparentize、90 分の 60 ° C で液体パラフィンに浸し、埋め込む埋め込みのマシンを使用します。</li>
		<li>パラフィン埋め込まれたブロック組織を 3 μ m のスライスにカット、45 ° c の水にスライスをタイルし、空気で乾かします。</li>
		<li>60 ° C で 3 時間セクションを孵化させなさい、ヘマトキシリンとエオシン (HE) を使用して、メソッドを染色、中立的なガムとシールします。</li>
		<li>脳の病理組織学的変化を光学顕微鏡で観察します。4 ポイントの格付けシステムは、組織学的変化を評価するために使用されました。統計分析のため、対になっていないt検定を使用します。 渋滞/出血:欠席、スコア 0;焦点距離渋滞/出血の小さな領域スコア 1;焦点渋滞/出血の大面積または焦点渋滞/出血の小さい区域の複数のサイトのスコア 2;3 つの大きな焦点渋滞/出血サイトまでスコア 3;渋滞/出血を拡散、4 のスコアします。 壊死:欠席、スコア 0;壊死、スコア 1;1-10 壊死細胞を拡散、スコア 2;合流の壊死巣スコア 3;合流壊死 4 を獲得します。 炎症性細胞浸潤:欠席、スコア 0;数と焦点浸潤、得点 1。多発性浸潤または凝集体の形成を伴う浸潤スコア 2;最大 3 つの集計スコア 3;4 つ以上の集計、スコア 4。</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Gottschalk, M., Xu, J., Calzas, C., Segura, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Streptococcus+suis:+a+new+emerging+or+an+old+neglected+zoonotic+pathogen?.">Streptococcus suis: a new emerging or an old neglected zoonotic pathogen?.</a> Future Microbiology. 5, 371-391 (2010).</li><li>Goyette-Desjardins, G., Auger, J. P., Xu, J., Segura, M., Gottschalk, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Streptococcus+suis,+an+important+pig+pathogen+and+emerging+zoonotic+agent-an+update+on+the+worldwide+distribution+based+on+serotyping+and+sequence+typing.">Streptococcus suis, an important pig pathogen and emerging zoonotic agent-an update on the worldwide distribution based on serotyping and sequence typing.</a> Emerging Microbes &amp; Infections. 3 (6), e45 (2014).</li><li>Kerdsin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emergence+of+Streptococcus+suis+serotype+9+infection+in+humans.">Emergence of Streptococcus suis serotype 9 infection in humans.</a> Journal of Microbiology, Immunology and Infection. 50 (4), 545-546 (2017).</li><li>Hatrongjit, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=First+human+case+report+of+sepsis+due+to+infection+with+Streptococcus+suis+serotype+31+in+Thailand.">First human case report of sepsis due to infection with Streptococcus suis serotype 31 in Thailand.</a> BMC Infect Diseases. 15, 392 (2015).</li><li>Fittipaldi, N., Segura, M., Grenier, D., Gottschalk, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virulence+factors+involved+in+the+pathogenesis+of+the+infection+caused+by+the+swine+pathogen+and+zoonotic+agent+Streptococcus+suis.">Virulence factors involved in the pathogenesis of the infection caused by the swine pathogen and zoonotic agent Streptococcus suis.</a> Future Microbiology. 7 (2), 259-279 (2012).</li><li>Hall-Stoodley, L., Costerton, J. W., Stoodley, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+biofilms:+from+the+natural+environment+to+infectious+diseases.">Bacterial biofilms: from the natural environment to infectious diseases.</a> Nature Reviews Microbiology. 2 (2), 95-108 (2004).</li><li>Fuxman Bass, J. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+DNA:+a+major+proinflammatory+component+of+Pseudomonas+aeruginosa+biofilms.">Extracellular DNA: a major proinflammatory component of Pseudomonas aeruginosa biofilms.</a> Journal of Immunology. 184 (11), 6386-6395 (2010).</li><li>Isiaku, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofilm+is+associated+with+chronic+streptococcal+meningoencephalitis+in+fish.">Biofilm is associated with chronic streptococcal meningoencephalitis in fish.</a> Microbial Pathogenesis. 102, 59-68 (2017).</li><li>Oggioni, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Switch+from+planktonic+to+sessile+life:+a+major+event+in+pneumococcal+pathogenesis.">Switch from planktonic to sessile life: a major event in pneumococcal pathogenesis.</a> Molecular Microbiology. 61 (5), 1196-1210 (2006).</li><li>Xiao, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Streptococcus+suis+small+RNA+rss04+contributes+to+the+induction+of+meningitis+by+regulating+capsule+synthesis+and+by+inducing+biofilm+formation+in+a+mouse+infection+model.">Streptococcus suis small RNA rss04 contributes to the induction of meningitis by regulating capsule synthesis and by inducing biofilm formation in a mouse infection model.</a> Veterinary Microbiology. 199, 111-119 (2017).</li><li>Dominguez-Punaro, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Streptococcus+suis+serotype+2,+an+important+swine+and+human+pathogen,+induces+strong+systemic+and+cerebral+inflammatory+responses+in+a+mouse+model+of+infection.">Streptococcus suis serotype 2, an important swine and human pathogen, induces strong systemic and cerebral inflammatory responses in a mouse model of infection.</a> Journal of Immunology. 179 (3), 1842-1854 (2007).</li><li>Seitz, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+intranasal+mouse+model+for+mucosal+colonization+by+Streptococcus+suis+serotype+2.">A novel intranasal mouse model for mucosal colonization by Streptococcus suis serotype 2.</a> Journal of Medical Microbiology. 61 (Pt 9), 1311-1318 (2012).</li><li>Busque, P., Higgins, R., Caya, F., Quessy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunization+of+pigs+against+Streptococcus+suis+serotype+2+infection+using+a+live+avirulent+strain.">Immunization of pigs against Streptococcus suis serotype 2 infection using a live avirulent strain.</a> Canadian Journal of Veterinary Research. 61 (4), 275-279 (1997).</li><li>Williams, A. E., Blakemore, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathology+of+Streptococcal+meningitis+following+intravenous+intracisternal+and+natural+routes+of+infection.">Pathology of Streptococcal meningitis following intravenous intracisternal and natural routes of infection.</a> Neuropathology and Applied Neurobiology. 4 (4), 345-356 (1990).</li><li>Dominguez-Punaro, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Severe+cochlear+inflammation+and+vestibular+syndrome+in+an+experimental+model+of+Streptococcus+suis+infection+in+mice.">Severe cochlear inflammation and vestibular syndrome in an experimental model of Streptococcus suis infection in mice.</a> European Journal of Clinical Microbiology &amp; Infectious Diseases. 31 (9), 2391-2400 (2012).</li><li>Auger, J. P., Fittipaldi, N., Benoit-Biancamano, M. O., Segura, M., Gottschalk, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virulence+Studies+of+Different+Sequence+Types+and+Geographical+Origins+of+Streptococcus+suis+Serotype+2+in+a+Mouse+Model+of+Infection.">Virulence Studies of Different Sequence Types and Geographical Origins of Streptococcus suis Serotype 2 in a Mouse Model of Infection.</a> Pathogens. 5 (3), (2016).</li><li>Chiavolini, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Method+for+inducing+experimental+pneumococcal+meningitis+in+outbred+mice.">Method for inducing experimental pneumococcal meningitis in outbred mice.</a> BMC Microbiology. 4, 36 (2004).</li><li>Madsen, L. W., Svensmark, B., Elvestad, K., Jensen, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Otitis+interna+is+a+frequent+sequela+to+Streptococcus+suis+meningitis+in+pigs.">Otitis interna is a frequent sequela to Streptococcus suis meningitis in pigs.</a> Veterinary Pathology. 38 (2), 190-195 (2001).</li><li>Holden, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+evolution+of+virulence+and+drug+resistance+in+the+emerging+zoonotic+pathogen+Streptococcus+suis.">Rapid evolution of virulence and drug resistance in the emerging zoonotic pathogen Streptococcus suis.</a> PLoS One. 4 (7), e6072 (2009).</li><li>Dominguez-Punaro Mde, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+characterization+of+the+microglial+inflammatory+response+to+Streptococcus+suis,+an+important+emerging+zoonotic+agent+of+meningitis.">In vitro characterization of the microglial inflammatory response to Streptococcus suis, an important emerging zoonotic agent of meningitis.</a> Infection and Immunity. 78 (12), 5074-5085 (2010).</li><li>Hassan, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+different+detection+methods+of+biofilm+formation+in+the+clinical+isolates.">Evaluation of different detection methods of biofilm formation in the clinical isolates.</a> Brazilian Journal of Infectious Diseases. 15 (4), 305-311 (2011).</li><li>Vanier, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+putative+virulence+factors+of+Streptococcus+suis+involved+in+invasion+of+porcine+brain+microvascular+endothelial+cells.">New putative virulence factors of Streptococcus suis involved in invasion of porcine brain microvascular endothelial cells.</a> Microbial Pathogenesis. 46 (1), 13-20 (2009).</li><li>Takeuchi, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+contribution+of+suilysin+to+the+pathogenesis+of+Streptococcus+suis+meningitis.">The contribution of suilysin to the pathogenesis of Streptococcus suis meningitis.</a> Journal of Infectious Diseases. 209 (10), 1509-1519 (2014).</li><li>Tenenbaum, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polar+bacterial+invasion+and+translocation+of+Streptococcus+suis+across+the+blood-cerebrospinal+fluid+barrier+in+vitro.">Polar bacterial invasion and translocation of Streptococcus suis across the blood-cerebrospinal fluid barrier in vitro.</a> Cellular Microbiology. 11 (2), 323-336 (2009).</li></ol>

著者が明らかに何もありません。

ここで説明した感染症の頭蓋内クモ膜下ルート感染の他のルートに比べて明らかな利点があります。ホスト細菌相互作用や中枢神経に細菌の入口を模倣、直接脳内の宿主の免疫応答におよぼす細菌成分を研究する研究者をことができます。したがって、感染症のこのルートは他の細菌によって引き起こされる髄膜炎のメカニズムを調査するため拡張できます。さらに、細菌性髄膜炎の治療薬の有効性をテストも使用することができます。
このモデルを使用して良い結果を得るために次の重要な手順が明確であります。バイオ フィルム形成は、実験条件下で検査する必要があります。現在の研究では、走査型電子顕微鏡を用いたそれを調べた。組織培養プレート法、チューブ法21など、バイオ フィルム形成を調べる他の方法を使用もできます。感染、前日浮遊性細胞とバイオ フィルム状態細胞の両方の因数 CFU を決定する-80 ° C から解凍する必要があります。次の日、細菌は感染 CFU によると適切な投与量を希釈する必要があります。モック感染の群に含まれる PBS ニーズとモック感染制御グループからマウスに注入する必要がありますを示さない症状感染実験の期間中。異なる系統があります異なる感染用量予備実験は適切な感染用量を決定する強くお勧めします。本研究では 3 × 107 CFU 感染症のための投与量は、予備実験に基づく使用されました。バイオ フィルム形成細菌の投与量は髄膜炎および予備実験では感染後すべて 5 マウス 48 h のそれに続く死の深刻な徴候を誘発することができます。
脳血または血清によって血液脳脊髄流動障壁の中断は、髄膜炎22,23,24の原因で重要なステップです。感染症の頭蓋内クモ膜下ルートはこれらの障壁を打破する血清の能力を評価するため適していません。I. p.、静脈、i.n などの感染症の他のルートは、この目標を達成するために使用できます。
ここでは、まず血清バイオ フィルムが髄膜炎感染の頭蓋内クモ膜下ルートを使用しての誘導に寄与することを示す.この感染モデルだけでなくさらに血清髄膜炎のメカニズムを理解するのに役立ちますも他の細菌と細菌性髄膜炎に対する新しい薬の効果によって引き起こされる髄膜炎の病因を調査のために適しています。

レンサ球菌性(血清) は、髄膜炎、肺炎、敗血症、心内膜炎、関節炎1を含む深刻な病気を引き起こし豚、世界中の主要な細菌の病原体です。また、新興人獣共通感染エージェントです。これまでのところ、9 つの血清型が 2、4、5、9、14、16、21、24、および 31 は血清型2,3、4を含む人間の感染症を引き起こすことができますが報告されています。人間と豚、髄膜炎はs ・性感染症の主な臨床症状であります。ベトナムやタイの血清は大人5で髄膜炎の主要な原因です。微生物バイオ フィルムは、微生物を互いに遵守し、インターフェイスに集中しています。彼らは細菌の病原性、多様な環境および抗生物質耐性5の生存に不可欠です。バイオ フィルムは、一般的に多糖類、蛋白質および DNA の6を含む細胞外マトリックスによって通常囲まれています。後者は、宿主の炎症性反応とサイトカイン生産7を引き出すことができます。バイオ フィルム形成は、先行研究のレンサ球菌性髄膜炎に関与する報告されています。ティラピア魚モデルにおけるシアリルラクトサミン連鎖球菌髄膜炎に貢献するバイオ フィルムとバイオ フィルム形成脳組織内で明らかにされているし体内から腹腔内接種8表面の硬膜のまわり。中に髄膜炎、肺炎連鎖球菌は、バイオ フィルムのような状態と細菌バイオ フィルムのような状態でマウス感染モデル9で髄膜炎を誘発するのに効果的であった。さらに、私たちの以前の研究は、生存分析10細菌の病原性に貢献するバイオ フィルム状態がマウス脳における血清に関連付けられています。ただし、血清性髄膜炎におけるバイオ フィルム関与の直接的な証拠はさらに調査が必要です。
S ・性感染症の動物モデルをマウス腹腔11、鼻腔内 (i.n と)12、静脈13、および感染症14,の大槽内ステロイド (i.c.) ルートを使用して開発されています。15,16します。 ただし、i. p.、i.n と、静脈感染経路、直接脳内性髄膜炎における血清表面部品の役割を勉強に適しています。バイオ フィルムからの細胞外マトリックスが含まれます。I.c. 接種は感染症血清使用、正確な注射部位はないこれらの論文で記載されています。対照的に、頭蓋内クモ膜下接種の注射部位の定位座標は以前研究17で明確に記載されています。これは接種のポイントとより多くの単純な実験的プロトコルの簡単な認識を許可しました。さらに、感染症の頭蓋内クモ膜下ルートは、副鼻腔や中耳の17中間耳および血清によって引き起こされる髄膜炎の関係から中枢神経系に細菌の入り口を模倣します。マドセンら18によって実証されています。また、感染マウスの脳クモ膜下ルートを適用すると、我々 は血清小さな RNA rss04 が私たちの以前の研究10で髄膜炎に寄与することを実証しました。
本研究で、感染症の頭蓋内クモ膜下ルートは血清性髄膜炎におけるバイオ フィルムの役割を調査するためマウスで使用されました。マウスは、この感染経路による浮遊性細胞や血清のバイオ フィルム状態の細胞に感染していた。病理組織学的解析と TLR2 とバイオ フィルム状態の細胞を注入したマウスの脳組織からのサイトカインの mRNA 発現の増加、血清バイオ フィルムが髄膜炎に貢献することに明示します。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:828px;" width="827">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr>
			<td height="46">Todd Hewitt Broth(THB)</td>
			<td style="width:225px;">Becton, Dickinson and Company</td>
			<td style="width:115px;">DF0492078</td>
			<td style="width:304px;">Dissolve 30 g of the powder in 1 L of purified water. Autoclave at 121&#176; for 15 min.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td style="width:225px;">DSBIO</td>
			<td style="width:115px;">16C0050</td>
			<td style="width:304px;">Dissolve 15 g of the powder in 1 L of THB. Autoclave at 121&#176; for 15 min.</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:184px;">Milli-Q Reference Water Purification System</td>
			<td style="width:225px;">Merck KGaA</td>
			<td style="width:115px;">Z00QSVCUS</td>
			<td style="width:304px;">Without Dnase/ Rnase</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td>NaCl</td>
			<td style="width:225px;">Tianjin Kemiou Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td style="width:115px;">10019318</td>
			<td style="width:304px;">Dissolve 8 g NaCl, 0.2 g KCl, 1.42 g Na2HPO3 , 0.27 g KH2PO4 in 1 L of purified water. Autoclave at 121&#176; for 15 min. Use KOH to adjust pH to 7.4.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td>Na2HPO3</td>
			<td style="width:225px;">Xilong Scientific Co., Ltd</td>
			<td style="width:115px;">9009012-01-09</td>
			<td style="width:304px;">Dissolve 8 g NaCl, 0.2 g KCl, 1.42 g Na2HPO3 , 0.27 g KH2PO4 in 1 L of purified water. Autoclave at 121&#176; for 15 min. Use KOH to adjust pH to 7.4.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td>KCl</td>
			<td style="width:225px;">Xilong Scientific Co., Ltd</td>
			<td style="width:115px;">9009017-01-09</td>
			<td style="width:304px;">Dissolve 8 g NaCl, 0.2 g KCl, 1.42 g Na2HPO3 , 0.27 g KH2PO4 in 1 L of purified water. Autoclave at 121&#176; for 15 min. Use KOH to adjust pH to 7.4.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td>KH2PO4</td>
			<td style="width:225px;">Xilong Scientific Co., Ltd</td>
			<td style="width:115px;">9009019-01-09</td>
			<td style="width:304px;">Dissolve 8 g NaCl, 0.2 g KCl, 1.42 g Na2HPO3 , 0.27 g KH2PO4 in 1 L of purified water. Autoclave at 121&#176; for 15 min. Use KOH to adjust pH to 7.4.</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td>KOH</td>
			<td style="width:225px;">Xilong Scientific Co., Ltd</td>
			<td style="width:115px;">9009014-01-09</td>
			<td style="width:304px;">Dissolve 8 g NaCl, 0.2 g KCl, 1.42 g Na2HPO3 , 0.27 g KH2PO4 in 1 L of purified water. Autoclave at 121&#176; for 15 min. Use KOH to adjust pH to 7.4.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td>Glycerol</td>
			<td style="width:225px;">Sionpharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td style="width:115px;">10010618</td>
			<td style="width:304px;">Diluted with equal volumu of purified water, autoclave at 121&#176; for 15 min</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:184px;">4% paraformaldehyde</td>
			<td style="width:225px;">Sionpharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td style="width:115px;">80096675</td>
			<td style="width:304px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:184px;">25% Glutaraldehyde</td>
			<td style="width:225px;">Sionpharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td style="width:115px;">30092436</td>
			<td style="width:304px;">10-fold diluted with purified water for fixation.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:184px;">Ethanol</td>
			<td style="width:225px;">Sionpharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td style="width:115px;">10009218</td>
			<td style="width:304px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Chloroform</td>
			<td style="width:225px;">Sionpharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td style="width:115px;">10006818</td>
			<td style="width:304px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Spctrophotometre</td>
			<td style="width:225px;">DeNovix Inc.</td>
			<td style="width:115px;">DS-11+</td>
			<td style="width:304px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:184px;">Ultrasound cell crusher</td>
			<td style="width:225px;">NingBo Scientz Biotechnology Co.,Ltd</td>
			<td style="width:115px;">JY96-IIN</td>
			<td style="width:304px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:184px;">Centrifuge</td>
			<td style="width:225px;">Hitachi Koki Co., Ltd</td>
			<td style="width:115px;">CT15RE</td>
			<td style="width:304px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:184px;">Refrigerator</td>
			<td style="width:225px;">Aucma Co., Ltd</td>
			<td style="width:115px;">DW-86L500</td>
			<td style="width:304px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:184px;">Scanning electron microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td style="width:115px;">EVO-LS10</td>
			<td style="width:304px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FastRNA Pro Green Kit</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td style="width:115px;">#6045-050</td>
			<td style="width:304px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FastPrep-24 Instrument</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td style="width:115px;">116005500</td>
			<td style="width:304px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:184px;">Instrument for PCR</td>
			<td style="width:225px;">SensoQuest GmbH</td>
			<td style="width:115px;">1124310110</td>
			<td style="width:304px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">QuantStudio 6 Flex</td>
			<td style="width:225px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:115px;">4485689</td>
			<td style="width:304px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:184px;">SYBR Premix Ex Taq II</td>
			<td style="width:225px;">Takara Biomedical Technology (Beijing) Co., Ltd</td>
			<td style="width:115px;">RR820A</td>
			<td style="width:304px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:184px;">PrimeScript RT reagent kit with gDNA Eraser</td>
			<td style="width:225px;">Takara Biomedical Technology (Beijing) Co., Ltd</td>
			<td style="width:115px;">RR047A</td>
			<td style="width:304px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:184px;">Fully Enclosed Tissue Processor</td>
			<td style="width:225px;">Leica Biosystems Nussloch GmbH</td>
			<td style="width:115px;">ASP200S</td>
			<td style="width:304px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:184px;">Heated Paraffin Embedding Module</td>
			<td style="width:225px;">Leica Biosystems Nussloch GmbH</td>
			<td style="width:115px;">EG1150H</td>
			<td style="width:304px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:184px;">Semi-Automated Rotary Microtome</td>
			<td style="width:225px;">Leica Biosystems Nussloch GmbH</td>
			<td style="width:115px;">RM2245</td>
			<td style="width:304px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:184px;">Water bath for paraffin sections</td>
			<td style="width:225px;">Leica Biosystems Nussloch GmbH</td>
			<td style="width:115px;">HI1210</td>
			<td style="width:304px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:184px;">Autostainer XL</td>
			<td style="width:225px;">Leica Biosystems Nussloch GmbH</td>
			<td style="width:115px;">ST5010</td>
			<td style="width:304px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:184px;">Agilent 2100</td>
			<td style="width:225px;">Agilent Technologies</td>
			<td style="width:115px;">G2939A</td>
			<td style="width:304px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:184px;">Optical microscope</td>
			<td style="width:225px;">Olympus</td>
			<td style="width:115px;">BX51</td>
			<td style="width:304px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

intracranial subarachnoidal route of infection for investigating roles of streptococcus suis biofilms in meningitis in a mouse infection model

連鎖球菌性は、豚の世界の主要な細菌の病原体だけでなく、新興の人獣共通感染エージェントです。人間と豚は、髄膜炎がs ・性感染症の主な症状です。適切な感染症モデルは、病原体によって引き起こされる病気のメカニズムを理解するために不可欠なツールです。感染マウスのいくつかのルートは、 s ・性感染症の病因を研究して開発されています。ただし、感染症、鼻腔内、腹腔内、静脈内のルートは、バイオ フィルムから細胞外のマトリックスのような頭脳に直接性髄膜炎における血清表面部材における役割を研究するため適していません。S ・性感染症の大槽内ステロイド接種が使用されているが正確な注射部位が記載されていません。ここでは、感染症の頭蓋内クモ膜下ルートは、血清性髄膜炎におけるバイオ フィルムの役割を調査するためマウス モデルで記述されていた。血清浮遊性細胞やバイオ フィルム状態細胞直接 3.5 mm 前から吻側に位置する注射部位を介してマウスのくも膜下腔に注入されました。病理組織学的解析とバイオ フィルム状態の細胞を注入したマウス脳組織のサイトカインと TLR2 の mRNA 発現の増加、血清バイオ フィルムが血清髄膜炎に決定的な役割を果たしていることに明示します。この感染経路がホスト細菌の相互作用の研究をできるように、感染症の他のルートに比べて明らかな利点です。さらに、それはできます、評価される脳で直接ホスト免疫反応におよぼす細菌成分と中枢神経に細菌の入口を模倣します。この感染経路は、他の細菌によって引き起こされる髄膜炎のメカニズムを調査するために拡張できます。さらに、細菌性髄膜炎の治療薬の有効性をテストも使用することができます。

実験条件下でのバイオ フィルム形成を検討する SEM 分析を行った。図 1のように、浮遊性細胞 (図 1A) とバイオ フィルム状態 (図 1B) のバイオ フィルム形成に重要な違いがあります。SEM 分析はバイオ フィルム形成細菌の塊、浮遊性バクテリアが大いにより少なく密で主に分散した個別に、複数のレイヤーとそれら細胞外マトリックスに包まれたことを示した。
バイオ、DNA などの細胞外マトリックスのコンポーネントは、宿主の炎症性反応、サイトカイン産生を誘発することができます。TLR2 とサイトカイン CCL2、以来、il-6, TNF-α は脳炎症反応前研究10、11、20、これらの遺伝子の発現を比較した mRNA によると髄膜炎に関連するに関与しています。生体内で浮遊性細胞感染マウスとバイオ フィルム状態の細胞に感染している人のため。これはマウスの脳組織の炎症反応にバイオ フィルムの効果を調べるために行われました。12 h 後感染の CCL2、TLR2 の発現 IL-6、図 2に示すよう感染マウスの脳から TNF α がバイオ フィルム状態細胞浮遊性細胞と比較して有意に高く。
バイオ フィルム細菌感染マウスよりも浮遊性細菌に感染して髄膜炎 (剛体の姿勢、運動失調や痙攣) のはるかに深刻な兆候を示した。P1/7 髄膜や大脳皮質、脳室、間脳 (図 3) に渋滞/出血、壊死と炎症性細胞浸潤を示した血清株感染マウスの脳組織の組織学的検討.12 h バイオ フィルム形成細菌 (図 3A ~ D) 感染マウスから脳組織の感染後、はるかに深刻な病理学的変化が観察された (図 3E H)、浮遊性細菌に感染するマウスと比較して渋滞/出血、壊死、または強烈な炎症細胞浸潤の大部分を含みます。浮遊性に感染したマウス脳で総体の病理学的変化とバイオ フィルム細菌は表 2に記録されました。病理学的変化も神経学的症状は、PBS 投与マウスから観察されました。一緒に取られて、これらのデータが明らかに血清バイオ フィルムが髄膜炎の誘導に貢献します。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57658/57658fig1.jpg"> 図 1:の SEM 画像ひずみ P1/7 浮遊性細胞とバイオ フィルム状態細胞。細菌は、バーツの培地で培養しました。SEM 分析を示した浮遊性細胞 (A) 間があったことに比べて、主に分散、個別に塊でクラスター化されたバイオ フィルム細菌 (B) と複数のレイヤーおよび彼らは細胞外マトリックスに包まれました。<a href="/files/ftp_upload/57658/57658fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57658/57658fig2.jpg"> 図 2:バイオ フィルム、CCL2 の mRNA の発現をアクティブに il-6、TNF-α、およびマウス脳組織における TLR2 体内グループごとの六つの BALB/c マウスは、それぞれ 3 × 107 CFU による浮遊性細胞やバイオ フィルム状態の細胞の感染症の頭蓋内クモ膜下ルートを通じて注入されました。マウスは感染後 12 h で安楽死されました。倍はマウスの感染を受けた細胞が浮遊性細胞感染マウスと比較してバイオ フィルム状態における mRNA 発現の変化と結果が掲載されています。( B2mが参照の遺伝子として使用された A) 遺伝子(B) 遺伝子18s rRNA参照の遺伝子として使われていた。対になっていないt-テストは統計分析のために使用されました。* * p ≤0.01、* p 0.05。<a href="/files/ftp_upload/57658/57658fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57658/57658fig3.jpg"> 図 3: P1/7 株感染マウスの脳組織の組織学的解析浮遊性細菌やバイオ フィルム状態細菌。A ~ D、バイオ フィルム状態細菌感染マウスから脳サンプル浮遊性細菌感染マウスから E H、脳サンプル。A、B、E、および f: 髄膜と大脳皮質。C と g: 心室;D と h: 間脳。Δ、渋滞/出血;□、壊死;○: 炎症細胞浸潤。倍率 = 200 X;スケールバー = 100 μ m.<a href="/files/ftp_upload/57658/57658fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>プライマー名</td>
			<td>シーケンス (5' 3')</td>
			<td>遺伝子シンボル</td>
		</tr>
<tr>
<td>今後の IL-6</td>
			<td>CTTCCATCCAGTTGCCTTCT</td>
			<td>Il6</td>
		</tr>
<tr>
<td>IL 6 逆</td>
			<td>CTCCGACTTGTGAAGTGGTATAG</td>
			<td>Il6</td>
		</tr>
<tr>
<td>TLR2 前方</td>
			<td>CACTATCCGGAGGTTGCATATC</td>
			<td>Tlr2</td>
		</tr>
<tr>
<td>TLR2 リバース</td>
			<td>GGAAGACCTTGCTGTTCTCTAC</td>
			<td>Tlr2</td>
		</tr>
<tr>
<td>前方 CCL2</td>
			<td>CTCACCTGCTGCTACTCATTC</td>
			<td>Ccl2</td>
		</tr>
<tr>
<td>逆 CCL2</td>
			<td>ACTACAGCTTCTTTGGGACAC</td>
			<td>Ccl2</td>
		</tr>
<tr>
<td>TNF α の楽しみ</td>
			<td>TTGTCTACTCCCAGGTTCTCT</td>
			<td>Tnf</td>
		</tr>
<tr>
<td>TNF α の逆</td>
			<td>GAGGTTGACTTTCTCCTGGTATG</td>
			<td>Tnf</td>
		</tr>
<tr>
<td>Β2m 楽しみ</td>
			<td>GGTCTTTCTGGTGCTTGTCT</td>
			<td>B2m</td>
		</tr>
<tr>
<td>Β2m リバース</td>
			<td>TATGTTCGGCTTCCCATTCTC</td>
			<td>B2m</td>
		</tr>
<tr>
<td>18 秒前方</td>
			<td>GTAACCCGTTGAACCCCATT</td>
			<td>18s rRNA</td>
		</tr>
<tr>
<td>18 歳の逆</td>
			<td>CCATCCAATCGGTAGTAGCG</td>
			<td>18s rRNA</td>
		</tr>
</tbody></table>表 1:RT qPCR 用プライマー 。
<img alt="Table 1" src="/files/ftp_upload/57658/57658tbl2.jpg"> 表 2: 感染マウスから脳の総病理組織変化血清 P1/7 をひずみ。4 ポイントの格付けシステムは、セクション 3.3.7 プロトコルで説明されているように組織学的変化を評価する使用されました。合計スコアはさまざまな病理組織学的変化からスコアの合計として計算されます。平均は、マウス数/合計スコアとして算出しました。対になっていないt-テストは統計分析のために使用されました。* * p ≤0.01。

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Intracranial Subarachnoidal Route of Infection for Investigating Roles of Streptococcus suis Biofilms in Meningitis in a Mouse Infection Model

ここでは、連鎖球菌性髄膜炎でのバイオ フィルムの役割を研究するマウスにおける感染症の頭蓋内クモ膜下ルートをについて説明します。この感染モデルもその他の細菌性髄膜炎の病態と細菌性髄膜炎の新しい治療薬の有効性を研究するために最適です。

感染マウス感染モデルにおける髄膜炎の連鎖球菌性バイオ フィルムの役割の調査のための頭蓋内クモ膜下ルート

Streptococcus suis is not only a major bacterial pathogen of pigs worldwide but also an emerging zoonotic agent. In humans and pigs, meningitis is a major ...

intracranial-subarachnoidal-route-infection-for-investigating-roles

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Intracranial Subarachnoidal Route of Infection for Investigating Roles of Streptococcus suis Biofilms in Meningitis in a Mouse Infection Model

7.2K ビュー.  Nanjing Agricultural University. ここでは、連鎖球菌性髄膜炎でのバイオ フィルムの役割を研究するマウスにおける感染症の頭蓋内クモ膜下ルートをについて説明します。この感染モデルもその他の細菌性髄膜炎の病態と細菌性髄膜炎の新しい治療薬の有効性を研究するために最適です。

ビデオ: Intracranial Subarachnoidal Route of Infection for Investigating Roles of Streptococcus suis Biofilms in Meningitis in a Mouse Infection Model

Genotypic Inference of HIV-1 Tropism Using Population-based Sequencing of V3

Background: Prior to receiving a drug from CCR5-antagonist class in HIV therapy, a patient must undergo an HIV tropism test to confirm that his or her viral population uses the CCR5 coreceptor for cellular entry, and not an alternative coreceptor. One approach to tropism testing is to examine the sequence of the V3 region of the HIV envelope, which interacts with the coreceptor.
Methods: Viral RNA is extracted from blood plasma. The V3 region is amplified in triplicate with nested reverse transcriptase-PCR. The amplifications are then sequenced and analyzed using the software, RE_Call. Sequences are then submitted to a bioinformatic algorithm such as geno2pheno to infer viral tropism from the V3 region. Sequences are inferred to be non-R5 if their geno2pheno false positive rate falls below 5.75%. If any one of the three sequences from a sample is inferred to be non-R5, the patient is unlikely to respond to a CCR5-antagonist.

HIV tropism can be inferred from the V3 region of the viral envelope. V3 is PCR amplified in triplicate using nested RT-PCR, sequenced, and interpreted using bioinformatic software. Samples with with 1 or more sequence(s) with low g2P scores are classified as non-R5 virus.

V3の人口ベースのシーケンシングを用いたHIV - 1トロピズムの遺伝子型推論

Background: Prior to receiving a drug from CCR5-antagonist class in HIV therapy, a patient must undergo an HIV tropism test to confirm that his or her ...

免疫・感染学

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the initial and determining step of the pathogenesis. Although experimentally adhesion is mostly studied in static conditions adhesion actually takes place in the presence of flowing liquid. First encounters between bacteria and their host often occur at the mucosal level, mouth, lung, gut, eye, etc. where mucus flows along the surface of epithelial cells. Later in infection, pathogens occasionally access the blood circulation causing life-threatening illnesses such as septicemia, sepsis and meningitis. A defining feature of these infections is the ability of these pathogens to interact with endothelial cells in presence of circulating blood. The presence of flowing liquid, mucus or blood for instance, determines adhesion because it generates a mechanical force on the pathogen. To characterize the effect of flowing liquid one usually refers to the notion of shear stress, which is the tangential force exerted per unit area by a fluid moving near a stationary wall, expressed in dynes/cm2. Intensities of shear stress vary widely according to the different vessels type, size, organ, location etc. (0-100 dynes/cm2). Circulation in capillaries can reach very low shear stress values and even temporarily stop during periods ranging between a few seconds to several minutes 1. On the other end of the spectrum shear stress in arterioles can reach 100 dynes/cm2 2. The impact of shear stress on different biological processes has been clearly demonstrated as for instance during the interaction of leukocytes with the endothelium 3. To take into account this mechanical parameter in the process of bacterial adhesion we took advantage of an experimental procedure based on the use of a disposable flow chamber 4. Host cells are grown in the flow chamber and fluorescent bacteria are introduced in the flow controlled by a syringe pump. We initially focused our investigations on the bacterial pathogen Neisseria meningitidis, a Gram-negative bacterium responsible for septicemia and meningitis. The procedure described here allowed us to study the impact of shear stress on the ability of the bacteria to: adhere to cells 1, to proliferate on the cell surface 5and to detach to colonize new sites 6 (Figure 1). Complementary technical information can be found in reference 7. Shear stress values presented here were chosen based on our previous experience1 and to represent values found in the literature. The protocol should be applicable to a wide range of pathogens with specific adjustments depending on the objectives of the study.

During the infection process, a key step is the adhesion of pathogens with host cells. In most instances this adhesion step occurs in the presence of mechanical stress generated by flowing liquid. We describe a technique that introduces shear stress as an important parameter in the study of bacterial adhesion.

細菌付着の研究ではせん断応力を導入する

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

Single-cell Analysis of Bacillus subtilis Biofilms Using Fluorescence Microscopy and Flow Cytometry

Biofilm formation is a general attribute to almost all bacteria 1-6. When bacteria form biofilms, cells are encased in extracellular matrix that is mostly constituted by proteins and exopolysaccharides, among other factors 7-10. The microbial community encased within the biofilm often shows the differentiation of distinct subpopulation of specialized cells 11-17. These subpopulations coexist and often show spatial and temporal organization within the biofilm 18-21.
Biofilm formation in the model organism Bacillus subtilis requires the differentiation of distinct subpopulations of specialized cells. Among them, the subpopulation of matrix producers, responsible to produce and secrete the extracellular matrix of the biofilm is essential for biofilm formation 11,19. Hence, differentiation of matrix producers is a hallmark of biofilm formation in B. subtilis.
We have used fluorescent reporters to visualize and quantify the subpopulation of matrix producers in biofilms of B. subtilis 15,19,22-24. Concretely, we have observed that the subpopulation of matrix producers differentiates in response to the presence of self-produced extracellular signal surfactin 25. Interestingly, surfactin is produced by a subpopulation of specialized cells different from the subpopulation of matrix producers 15.
We have detailed in this report the technical approach necessary to visualize and quantify the subpopulation of matrix producers and surfactin producers within the biofilms of B. subtilis. To do this, fluorescent reporters of genes required for matrix production and surfactin production are inserted into the chromosome of B. subtilis. Reporters are expressed only in a subpopulation of specialized cells. Then, the subpopulations can be monitored using fluorescence microscopy and flow cytometry (See Fig 1).
The fact that different subpopulations of specialized cells coexist within multicellular communities of bacteria gives us a different perspective about the regulation of gene expression in prokaryotes. This protocol addresses this phenomenon experimentally and it can be easily adapted to any other working model, to elucidate the molecular mechanisms underlying phenotypic heterogeneity within a microbial community.

Single-cell Analysis of Bacillus subtilis Biofilms Using Fluorescence Microscopy and Flow Cytometry

Microbial biofilms are generally constituted by distinct subpopulations of specialized cells. Single-cell analysis of these subpopulations requires the use of fluorescent reporters. Here we describe a protocol to visualize and monitor several subpopulationswithin B. subtilis biofilms using fluorescence microscopy and flow cytometry.

の単一細胞解析枯草菌</em蛍光顕微鏡とフローサイトメトリーを用いて>バイオフィルム

Biofilm formation is a general attribute to almost all bacteria 1-6. When bacteria form biofilms, cells are encased in extracellular matrix that is mostly ...

Total Protein Extraction and 2-D Gel Electrophoresis Methods for Burkholderia Species

The investigation of the intracellular protein levels of bacterial species is of importance to understanding the pathogenic mechanisms of diseases caused by these organisms. Here we describe a procedure for protein extraction from Burkholderia species based on mechanical lysis using glass beads in the presence of ethylenediamine tetraacetic acid and phenylmethylsulfonyl fluoride in phosphate buffered saline. This method can be used for different Burkholderia species, for different growth conditions, and it is likely suitable for the use in proteomic studies of other bacteria. Following protein extraction, a two-dimensional (2-D) gel electrophoresis proteomic technique is described to study global changes in the proteomes of these organisms. This method consists of the separation of proteins according to their isoelectric point by isoelectric focusing in the first dimension, followed by separation on the basis of molecular weight by acrylamide gel electrophoresis in the second dimension. Visualization of separated proteins is carried out by silver staining.

Total Protein Extraction and 2-D Gel Electrophoresis Methods for Burkholderia Species

Members of the Burkholderia genus are pathogens of clinical importance. We describe a method for total bacterial protein extraction, using mechanical disruption, and 2-D gel electrophoresis for subsequent proteomic analysis.

全タンパク質の抽出および2次元ゲル電気泳動法のための<em&gt;バークホルデリア</em&gt;種

The investigation of  the intracellular protein levels of bacterial species is of importance to  understanding the pathogenic mechanisms of diseases ...

Monitoring Changes in Membrane Polarity, Membrane Integrity, and Intracellular Ion Concentrations in Streptococcus pneumoniae Using Fluorescent Dyes

Membrane depolarization and ion fluxes are events that have been studied extensively in biological systems due to their ability to profoundly impact cellular functions, including energetics and signal transductions. While both fluorescent and electrophysiological methods, including electrode usage and patch-clamping, have been well developed for measuring these events in eukaryotic cells, methodology for measuring similar events in microorganisms have proven more challenging to develop given their small size in combination with the more complex outer surface of bacteria shielding the membrane. During our studies of death-initiation in Streptococcus pneumoniae (pneumococcus), we wanted to elucidate the role of membrane events, including changes in polarity, integrity, and intracellular ion concentrations. Searching the literature, we found that very few studies exist. Other investigators had monitored radioisotope uptake or equilibrium to measure ion fluxes and membrane potential and a limited number of studies, mostly in Gram-negative organisms, had seen some success using carbocyanine or oxonol fluorescent dyes to measure membrane potential, or loading bacteria with cell-permeant acetoxymethyl (AM) ester versions of ion-sensitive fluorescent indicator dyes. We therefore established and optimized protocols for measuring membrane potential, rupture, and ion-transport in the Gram-positive organism S. pneumoniae. We developed protocols using the bis-oxonol dye DiBAC4(3) and the cell-impermeant dye propidium iodide to measure membrane depolarization and rupture, respectively, as well as methods to optimally load the pneumococci with the AM esters of the ratiometric dyes Fura-2, PBFI, and BCECF to detect changes in intracellular concentrations of Ca2+, K+, and H+, respectively, using a fluorescence-detection plate reader. These protocols are the first of their kind for the pneumococcus and the majority of these dyes have not been used in any other bacterial species. Though our protocols have been optimized for S. pneumoniae, we believe these approaches should form an excellent starting-point for similar studies in other bacterial species.

Monitoring Changes in Membrane Polarity, Membrane Integrity, and Intracellular Ion Concentrations in Streptococcus pneumoniae Using Fluorescent Dyes

Unlike that seen for eukaryotes, there is a paucity of studies that detail membrane depolarization and ion concentration changes in bacteria, primarily as their small size makes conventional methods of measurement difficult. Here, we detail protocols for monitoring such events in the significant Gram-positive pathogen Streptococcus pneumoniae utilizing fluorescence techniques.

メンブレン極性膜完全性、細胞内イオン濃度の監視の変更<em&gt;肺炎球菌</em&gt;蛍光染料を使用

Membrane depolarization and ion fluxes are events that have been studied extensively in biological systems due to their ability to profoundly impact ...

Capsular Serotyping of Streptococcus pneumoniae by Latex Agglutination

Latex agglutination reagents are widely used in microbial diagnosis, identification and serotyping. Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus) is a major cause of morbidity and mortality world-wide. Current vaccines target the pneumococcal capsule, and there are over 90 capsular serotypes. Serotyping pneumococcal isolates is therefore important for assessing the impact of vaccination programs and for epidemiological purposes. The World Health Organization has recommended latex agglutination as an alternative method to the &#8216;gold standard&#8217; Quellung test for serotyping pneumococci. Latex agglutination is a relatively simple, quick and inexpensive method; and is therefore suitable for resource-poor settings as well as laboratories with high-volume workloads. Latex agglutination reagents can be prepared in-house utilizing commercially-sourced antibodies that are passively attached to latex particles. This manuscript describes a method of production and quality control of latex agglutination reagents, and details a sequential testing approach which is time- and cost-effective. 
This method of production and quality control may also be suitable for other testing purposes.

Capsular Serotyping of Streptococcus pneumoniae by Latex Agglutination

Latex agglutination testing is a simple, rapid and inexpensive method for serotyping Streptococcus pneumoniae, and has also been widely applied in diagnostic microbiology. This manuscript describes the in-house production of latex agglutination reagents, quality control procedures and the application of this technique to pneumococcal serotyping.

の莢膜血清型<em&gt;肺炎球菌</em&gt;ラテックス凝集による

Latex agglutination reagents are widely used in microbial diagnosis, identification and serotyping. Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus) is a major ...

Non-invasive Imaging of the Innate Immune Response in a Zebrafish Larval Model of Streptococcus iniae Infection

The aquatic pathogen, Streptococcus iniae, is responsible for over 100 million dollars in annual losses for the aquaculture industry and is capable of causing systemic disease in both fish and humans. A better understanding of S. iniae disease pathogenesis requires an appropriate model system. The genetic tractability and the optical transparency of the early developmental stages of zebrafish allow for the generation and non-invasive imaging of transgenic lines with fluorescently tagged immune cells. The adaptive immune system is not fully functional until several weeks post fertilization, but zebrafish larvae have a conserved vertebrate innate immune system with both neutrophils and macrophages. Thus, the generation of a larval infection model allows the study of the specific contribution of innate immunity in controlling S. iniae infection.
The site of microinjection will determine whether an infection is systemic or initially localized. Here, we present our protocols for otic vesicle injection of zebrafish aged 2-3 days post fertilization as well as our techniques for fluorescent confocal imaging of infection. A localized infection site allows observation of initial microbe invasion, recruitment of host cells and dissemination of infection. Our findings using the zebrafish larval model of S. iniae infection indicate that zebrafish can be used to examine the differing contributions of host neutrophils and macrophages in localized bacterial infections. In addition, we describe how photolabeling of immune cells can be used to track individual host cell fate during the course of infection.

Non-invasive Imaging of the Innate Immune Response in a Zebrafish Larval Model of Streptococcus iniae Infection

Here, we present a protocol for the generation and imaging of a localized bacterial infection in the zebrafish otic vesicle.

のゼブラフィッシュ幼生モデルにおける先天性免疫応答の非侵襲的イメージング<em&gt;ストレプトコッカスイニエ</em&gt;感染

The aquatic pathogen, Streptococcus iniae, is responsible for over 100 million dollars in annual losses for the aquaculture industry and is capable of ...

A Murine Model of Group B Streptococcus Vaginal Colonization

Streptococcus agalactiae (group B Streptococcus, GBS), is a Gram-positive, asymptomatic colonizer of the human gastrointestinal tract and vaginal tract of 10 - 30% of adults. In immune-compromised individuals, including neonates, pregnant women, and the elderly, GBS may switch to an invasive pathogen causing sepsis, arthritis, pneumonia, and meningitis. Because GBS is a leading bacterial pathogen of neonates, current prophylaxis is comprised of late gestation screening for GBS vaginal colonization and subsequent peripartum antibiotic treatment of GBS-positive mothers. Heavy GBS vaginal burden is a risk factor for both neonatal disease and colonization. Unfortunately, little is known about the host and bacterial factors that promote or permit GBS vaginal colonization. This protocol describes a technique for establishing persistent GBS vaginal colonization using a single &#946;-estradiol pre-treatment and daily sampling to determine bacterial load. It further details methods to administer additional therapies or reagents of interest and to collect vaginal lavage fluid and reproductive tract tissues. This mouse model will further the understanding of the GBS-host interaction within the vaginal environment, which will lead to potential therapeutic targets to control maternal vaginal colonization during pregnancy and to prevent transmission to the vulnerable newborn. It will also be of interest to increase our understanding of general bacterial-host interactions in the female vaginal tract.

A Murine Model of Group B Streptococcus Vaginal Colonization

The purpose of this protocol is to imitate human group B Streptococcus (GBS) vaginal colonization in a murine model. This method may be used to investigate host immune responses and bacterial factors contributing to GBS vaginal persistence, as well as to test therapeutic strategies.

グループBのマウスモデル<em&gt;連鎖球菌</em&gt;膣植民地化

Streptococcus agalactiae (group B Streptococcus, GBS), is a Gram-positive, asymptomatic colonizer of the human gastrointestinal tract and vaginal tract of ...

Influenza A Virus Studies in a Mouse Model of Infection

Influenza viruses cause over 500,000 deaths worldwide1 and are associated with an annual cost of 12 - 14 billion USD in the United States alone considering direct medical and hospitalization expenses and work absenteeism2. Animal models are crucial in Influenza A virus (IAV) studies to evaluate viral pathogenesis, host-pathogen interactions, immune responses, and the efficacy of current and/or novel vaccine approaches as well as antivirals. Mice are an advantageous small animal model because their immune system is evolutionarily similar to that found in humans, they are available from commercial vendors as genetically identical subjects, there are multiple strains that can be exploited to evaluate the genetic basis of infections, and they are relatively inexpensive and easy to manipulate. To recapitulate IAV infection in humans via the airways, mice are first anesthetized prior to intranasal inoculation with infectious IAVs under proper biosafety containment. After infection, the pathogenesis of IAVs is determined by monitoring daily the morbidity (body weight loss) and mortality (survival) rate. In addition, viral pathogenesis can also be evaluated by assessing virus replication in the upper (nasal mucosa) or lower (lungs) respiratory tract of infected mice. Humoral responses upon IAV infection can be rapidly evaluated by non-invasive bleeding and secondary antibody detection assays aimed at detecting the presence of total or neutralizing antibodies. Here, we describe the common methods used to infect mice intranasally (i.n) with IAV and evaluate pathogenesis, humoral immune responses and protection efficacy.

Influenza A viruses (IAVs) are important human respiratory pathogens. To understand the pathogenicity of IAVs and to perform preclinical testing of novel vaccine approaches, animal models mimicking human physiology are required. Here, we describe techniques to evaluate IAV pathogenesis, humoral responses and vaccine efficacy using a mouse model of infection.

感染症のマウスモデルでの A 型インフルエンザ ウイルス研究

Influenza viruses cause over 500,000 deaths worldwide1 and are associated with an annual cost of 12 - 14 billion USD in the United States alone ...

Constructing Mutants in Serotype 1 Streptococcus pneumoniae strain 519/43

Streptococcus pneumoniae serotype 1 remains a huge problem in low-and-middle income countries, particularly in sub-Saharan Africa. Despite its importance, studies in this serotype have been hindered by the lack of genetic tools to modify it. In this study, we describe a method to genetically modify a serotype 1 clinical isolate (strain 519/43). Interestingly, this was achieved by exploiting the Pneumococcus&#8217; ability to naturally acquire DNA. However, unlike most pneumococci, the use of linear DNA was not successful; to mutate this important strain, a suicide plasmid had to be used. This methodology has provided the means for a deeper understanding of this elusive serotype, both in terms of its biology and pathogenicity. To validate the method, the major known pneumococcal toxin, pneumolysin, was mutated because it has a well-known and easy to follow phenotype. We showed that the mutant, as expected, lost its ability to lyse red blood cells. By being able to mutate an important gene in the serotype of interest, we were able to observe different phenotypes for loss of function mutants upon intraperitoneal and intranasal infections from the ones observed for other serotypes. In summary, this study proves that strain 519/43 (serotype 1) can be genetically modified.

Constructing Mutants in Serotype 1 Streptococcus pneumoniae strain 519/43

Here, we describe a S. pneumoniae serotype 1 strain 519/43 that can be genetically modified by using its ability to naturally acquire DNA and a suicide-plasmid. As proof of principle, an isogenic mutant in the pneumolysin (ply) gene was made.

血清型1肺 炎球 菌519/43株における変異体の構築

Streptococcus pneumoniae serotype 1 remains a huge problem in low-and-middle income countries, particularly in sub-Saharan Africa. Despite its importance, ...

感染マウス感染モデルにおける髄膜炎の連鎖球菌性バイオ フィルムの役割の調査のための頭蓋内クモ膜下ルート

感染マウス感染モデルにおける髄膜炎の連鎖球菌性バイオフィルムの役割の調査のための頭蓋内クモ膜下ルート