この作品は、アメリカの中心連合からの科学者の開発補助金による部分で支えられました (YD に 14SDG18160021)、米国 NIH R01 付与 HL 81753 と HL 107304 xx、XX にメイヨー財団。

ここで説明したすべての手順を行ったガイドに従ってケアおよび実験動物の使用 (国立アカデミー プレス 2011), とメイヨー クリニック機関動物ケアおよび使用委員会によって承認されました。
1. 大人のゼブラフィッシュの準備
<ol><li>DOX の注入に必要な総魚の 2 倍多くを少なくとも取得するタンクを横切る際に十分な繁殖ペアを設定します。異なる遺伝的背景を持つ魚を比較すると、同じ週に年齢をマッチさせたコントロールを確保するためにすべての魚を繁殖します。</li>
	<li>収集魚胚次の朝、100 mm のペトリ皿に転送、28.5 ° C の定温器でそれらを保ちます。低密度で胚を維持 (< 100 胚/シャーレ)。</li>
	<li>性の不均衡を避けるために胚の水を毎日をリフレッシュし、手動で転送ピペットを使用してタイムリーに死んだ卵を削除します。</li>
	<li>各タンクに胚の同じ数を入れます (たとえば、60 胚/3 L 型中戦車が最初になる) 密度をマッチさせたコントロールを確保するため。</li>
	<li>ゾウリムシの 4 日後受精 (dpf) で供給を開始します。</li>
	<li>幼若期の間に毎日魚を検査します。似たような魚を確保するため必要に応じて魚の数を調整する密度。</li>
	<li>魚が 4 週齢に達したら、さらなる成長のため各新しい 3 L 中型タンクに最大 20 の魚を転送します。ライブに孵化したブラインシュリンプを魚の餌に開始します。</li>
</ol>2. 準備中と DOX 原液の貯蔵
注: DOX は様々 なバイオ企業から購入できます。化合物は、暗い茶色の容器に粉体として通常取得されます。
<ol><li>徹底的に最終濃度 5 mg/mL の原液として、目に見える塊がないように脱イオン水中で DOX 粉を溶解します。DOX 在庫安全ロックにある各 1.5 mL のチューブに分注 1 mL。軽い露出から、DOX を保護するアルミ箔紙に 1.5 mL チューブをラップします。 注: は、化学のフードでこの手順を実行します。</li>
	<li>ストレージのための 4 ° C で DOX 原液を維持します。長期保存のため (> 4 週間) DOX 原液の以下省略可能セクションの 3 を実行します。</li>
</ol>3。 DOX ゼブラフィッシュ胚 (オプション) を使用しての品質管理
注: 拡張ストレージ後 DIC をモデル化するための薬の有効性を失うことができるので、DOX は両方湿気と光感受性、です。DOX は、さまざまな企業、または同じ会社からもさまざまなバッチから購入、成魚の実験を行う前に野生型 (WT) ゼブラフィッシュ胚を用いたその薬効を調整する便利です。このメソッドは、報告されたゼブラフィッシュ胚性 DIC モデル21から派生されます。
<ol><li>魚の少なくとも 2 つのペアから WT ゼブラフィッシュ胚を収集します。マイクロ針と注射器を使用して手動で 24 時間後受精 (hpf) で Dechorionate 胚。また、10 μ g/mL の 30 の ° C の定温器で 10-15 分のための最終的な集中にプロテイナーゼ K を持つ胚を扱います。Dechorionation 後胚水を更新します。死胚を削除し、各バッチの少なくとも 36 の胚を維持します。</li>
	<li>新鮮な胚水 100 μ M の最終的な集中に DOX 原液を希釈します。ソリューションのボリュームは、すべての 3 の胚のため 100 μ L です。渦による DOX 薄めたをミックスします。最終希釈液は、赤色光をする必要があります。</li>
	<li>100 μ L/ウェルの 96 ウェルきれいな透明板を薄めた DOX を追加します。</li>
	<li>3 dechorionated 胚転送プラスチック ピペット、ピペット チップの終わり近くに胚をようにましょう。DOX ソリューションの各ウェルにピペット チップを置きます。胚は井戸に泳ぐことができ、ソリューションに触れる先端の終わりをしましょう。 注: 手動で同様に多くの水を追加し、希薄 DOX 溶液胚を押すことを避けます。</li>
	<li>48 で DOX ソリューションを更新 hpf。この時点で、浮腫を伴う死胚 (ハートビートの停止) または胚を識別するために 10 倍の倍率での顕微鏡の下の井戸を観察します。カウントし、タイムリーなファッションは、それ以外の場合に死胚と液残りの胚がすぐに死ぬことができるだけでなく任意の死胚を削除します。</li>
	<li>72 で胚を確認 hpf とそれらを数えます。DOX の治療は、「良い薬効」場合と見なされます > 胚の両方のバッチで 25% 死 (ハートビートの停止) を観察できます。</li>
</ol>4. 事前注入準備
注: 生後 6 ヶ月に 8 週間の魚は、DOX の注入に使用されます。注入する成熟した野生インド核型 (WIK) 魚の体重 (BWs) の範囲から 0.2 0.5 g。
<ol><li>高速で射出する前に 24 時間の魚。</li>
	<li>0.16 mg/mL tricaine を含む胚水で魚を麻酔します。体の両側から水を乾燥してきれいなフィルター ペーパーを使用します。規模でそれぞれの魚の帯域幅を測定します。後注入のために BW で 10% の差で魚をグループ化できます。 注: この手順で作業負荷を最小限に抑える、BW で 10% の差で魚と見なされます同じサイズしたがって、BW の平均によると 1 つの DOX 作業ソリューションを準備します。</li>
	<li>ソリューションの 5 μ L で各の成魚を注入する予定です。魚の数、BWs によると DOX 作業濃度を計算します。 注: を 6 ヶ月間慢性毒性を勉強するには、20 mg/kg の用量で DOX を使用します。DOX の急性心毒性を調査するには、50 mg/kg BW の DOX 線量を増やすことができます。</li>
	<li>1 ハンクの平衡塩溶液 (HBSS) 対応する作業濃度 x DOX 株式を希釈します。ソリューションをミックスする渦。暫時スピンダウンしてソリューションを収集します。</li>
</ol>5. 成魚で DOX 注入
<ol><li>場所きれいな 100 mm ペトリ皿を解剖顕微鏡の下で内部にスポンジは、フォーカスを調整します。魚を保持する長さ約 4 cm の空洞にスポンジをカットします。大きな魚の長い空洞を作る。</li>
	<li>10 μ L マイクロ注射器で 34 G の針を準備します。任意の泡とブロック注射器とチューブから削除する 1 x HBSS バッファーで針をすすいでください。</li>
	<li>2 分 0.16 mg/mL tricaine を含む胚水の成魚を麻酔します。 注: 長期 anesthetization DOX 注入後 5 分以上は簡単に魚を引き起こすことができます死。</li>
	<li>Tricaine、胚水でスポンジを浸し、転送を注射用スポンジ魚。</li>
	<li>
下記 2 つの方法のいずれかで IP DOX の注入を実行します。
	<ol>
<li>古典的な IP 注入29<ol>
<li>スポンジの空洞を腹部に魚を置きます。すぐに挿入針、45 ° 骨盤フィンの間の正中線に角度魚体に浸透約 1 2 ミリメートル。 はゆっくりとすべての DOX ソリューションをリリースします。針を抜く前に待機 5 s。魚の腹に見える赤い色で DOX 配信を確認してください。</li>
		</ol>
</li>
		<li>代替 IP 注入<ol>
<li>横方向を右側に前方にスポンジ魚をプレイス.優しく鈍い端鉗子を使用して、左の手で魚を安定させるし、右手でマイクロ シリンジを保持します。</li>
			<li>上向き傾斜面で骨盤鰭の上横行下針を配置します。45 ° の角度で 7 位置を指して、骨盤とアナルのフィンの間に位置する魚の空洞に 3-4 mm の針を挿入し、ゆっくりとピストンを低下させます。魚の腹に見える赤い色で DOX 配信を確認してください。</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>すばやく回復する魚を許可するように新鮮なシステムで水で満ちているきれいな交差タンクに注入された魚を転送します。注射の間 1 x HBSS バッファーに一度針をすすいでください。</li>
</ol>6. 投与後魚管理
<ol><li>注入後、魚を循環を実行しているシステムに戻ります。可能であれば、循環を共有する別のタンク間のクロス汚染を避けるために、メイン ・ システムから個別に DOX 扱われる魚を維持します。</li>
	<li>回復のための別の 24 時間注入された魚を高速です。最初の週の間に毎日魚を観察します。他の魚への感染を避けるために適切なタイミングで死んだ魚を削除します。 注: 最初の 24 時間以内の魚の死亡は、注射による物理的な病変が原因可能性があります。</li>
	<li>さらに長期観察の DOX 重点を置かれた魚を維持します。タンクの他の魚に感染症を避けるために時間で死んだ魚を削除します。 注: 魚の数は、生存曲線を生成する記載されています。</li>
	<li>表現型心エコー法30、心機能レポーター遺伝子組換え行23、水泳チャレンジ26, と他の病理学的改造の定量化など、DOX 強調した魚に異なる実験的アッセイを使用します。マーカー23。</li>
</ol>

<ol>
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H., Barber, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Doxorubicin-induced+cardiotoxicity.">Doxorubicin-induced cardiotoxicity.</a> N Engl J Med. 333 (20), 1359-1360 (1995).</li><li>Von Hoff, D. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Risk+factors+for+doxorubicin-induced+congestive+heart+failure.">Risk factors for doxorubicin-induced congestive heart failure.</a> Ann Intern Med. 91 (5), 710-717 (1979).</li><li>Pugach, E. K., Li, P., White, R., Zon, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retro-orbital+injection+in+adult+zebrafish.">Retro-orbital injection in adult zebrafish.</a> J Vis Exp. 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著者は利益相反行為を宣言しません。

進歩的な DIC をモデルに DOX の 20 の mg/kg の線量だった魚の死の 1 の wpi がまだ結果の間に重要な魚の死と 4 wpi (図 3および後心機能の低下が発生しない最高の線量として実験的に決定図 4)。この線量はこれらの齧歯動物の DIC モデル (15 〜 25 mg/kg) で頻繁に使用して人間 (550 mg/m2、15 mg/kg に相当) の限界累積投与量に匹敵する4,7,31,32,33。 50 mg/kg、など、DOX の高用量 1 wpi の中に重要な魚の死を示すは、のみ急性毒性に対する心臓の反応 DOX23,28を研究に使用できるようにします。
この DIC モデルの実装時に我々 に気づいた最初同じ結果を再現する新たな研究者のために困難だった。経験豊富な調査官に対しても約 20% 慢性期における死亡率の変化まだ中が含まれる異なる注射 (図 3)、現在のモデルで, 生物学的交絡要因を示します。完璧なモデルよりも少ないにもかかわらず我々 はまだこの現在の DIC モデル音発見次の証拠のために十分であることを信じる。最初に、いくつかのプラクティスの後 DIC モデルからの結果後で登録できます中場合すべてではない調査官。第二に、この DIC モデルに基づいて、4 意味のある遺伝的修飾因子を同定しました。文学のレポートから既存の証拠には、心筋症の遺伝子34,35,36,37としてそれらの 3 がサポートされています。4th 1 つはDnaJ の相同物亜科 B メンバー 6 (DNAJB6)、人間の遺伝学的研究28でサポートされている新しい心筋症遺伝子を証明されています。したがって、現在の形態で DIC モデルが実験間の比較のため信頼性の高いとはいえ厳しく年齢をマッチさせたコントロールを使用して内実験グループに基づいて結果が再現性の高い、まだことが分かった.
可能性があります私たちの現在の DIC モデルにみられる矛盾に貢献する交絡要因次のとおりです: (1) 高齢化や男女差は、DIC38を含む心血管疾患の重要な危険因子とみなされています。 39,40。具体的には我々 のモデルでテストされるまま、両方の仮説れば我々 は高齢魚が DOX 毒性 (データは示されていない) により敏感になる傾向があることを通知しました。両方の IP 方式 (図 3) を用いて観察間のバッチのバリエーションもこれらの 2 つの設立に貢献しました。大規模な動物モデル、大人のゼブラフィッシュのサイズから別の (2) は小さいです。したがって、DOX 注射による局所の損傷はより深刻と変数をすることができます。(中心部だけでなく (例えば、腎毒性)、他の臓器に毒性の DOX から注入された魚の死 3) があります。前作が表現型の変化を減らすの次の注意事項を助けることを示唆しているより注意深く設計されていた実験が前述の交絡因子のそれぞれに対処する必要がある、: 最初に、DOX の有効性を保証するため重要です。DOX 粉は乾燥した暗い場所で常に保たれる必要があります、ソリューションは、光への暴露を減らすために注意して処理する必要があります。DOX 作業ソリューションが新鮮な魚射出する前にするたびにで準備することをお勧めします。通常使わない DOX 原液貯蔵 4 週後。、疑いがあるときは、DOX バッチごとの薬剤の効果を調整するクイックの萌芽期の DIC モデルを使用してこのプロトコルでオプションのセクション 3 を実行します。第二に、成魚の同期は極めて重要です。同じ魚ひずみは、同様の体サイズを確保するため、同じ密度で発生する必要があります。我々 は、事前線量計算と同様 BWs と魚を選択します。この前の選択プロセスの合計の 2 倍以上多く魚を維持するためにそれをお勧めします。すべての魚は、事前選択プロセスの前に 24 時間の絶食します。第三に、常に同じような年齢のその増加率の違いと DOX レスポンスの異なる心臓のため DOX 注入前に魚をセックスの魚を使用することをお勧めします。
我々 は矛盾した結論の大半が疑わしい対照群に起因することに気づいた。したがって、実際の実験を実施する前に練習 DOX 注射 DIC モデルに新しい調査官を勧めます。20 mg/kg DOX は、代替の IP 注入法を用いた注入され、良い注入法は DOX と 2-3 ヶ月ポスト DOX 注射で比較的一貫性のある死亡率の 1 の wpi の間にほぼゼロの魚の死によって示されます。成功モデルの究極の証拠はキャスパー; を使用してエコー25、30、経由で定量化することができる心臓機能のインデックス化Tg(cmlc2:nusDsRed)トランスジェニック ラインまたは前のヴィヴォ新開発を使用して-心機能測定 (データは示されていない) をベースします。
IP 注入、レトロな軌道注入41など他の薬物配送ルートに加えて経口42, と水培養供給もよく大人ゼブラフィッシュで使用されます。私たちは、循環システムには、DOX の赤みが簡単に潜在的な出血によるマスク可能として、薬剤を成功を検証する方法の不足のためにその直接薬物を放出にもかかわらず、レトロな軌道注入アプローチを採用しませんでした。吸収性グルテン42成魚を供給する食事と混ぜた DOX を組み込むことによって口頭配達プロトコルを試みた。残念なことと累積用量 150 mg/kg を 4 週間飼育期間内で使用されるまで我々 を観察しなかった任意の深刻な毒性経口 DOX 配信の非効率を示唆しています。また、経口法は可能性が探検43にあります。また、DOX を含む溶液に魚を浸漬のインキュベーション プロトコルも、将来的にテストすることができる潜在的な配送ルートです。
我々 は、内部の臓器に高度の毒性、局所損傷になる可能性がある単一のボーラス注入法である現在の DIC モデルの主要な制限の 1 つを認めます。このアプローチは、成魚28で高スループットで遺伝学的スクリーニングを行うことができるので、ワークロードを削減し、スループットを向上する設計されました。今後、化学療法癌患者にみられる DIC を要約するだろうがより良いを低用量で DOX の複数の注射でモデルが追求されるべき。

1960 年代1,2以来抗腫瘍薬として開発されたドキソルビシン (DOX)、アドリアマイシンとも呼ばれます。それが今はまだ腫瘍の広範なスペクトルの重要な化学療法薬として積極的に使用します。しかし、DOX の臨床応用は、その用量毒性によって妨げられた、心毒性特に無症候性の心電図変化から心膜炎に至るまで可変の症状によって特徴づけられる、心筋症の時1,2活性酸素種 (ROS)1,3,4、5、トポイソメラーゼ II β (の抑制を含む DIC を説明するまでに、少なくとも 3 つの主要な仮説を提起されている。TOP2β)6、7、および細胞内カルシウムの変調は、1,8,9をリリースします。また DIC10、11,12,13の極めて重要なリスク因子として遺伝的素因を示唆証拠の蓄積します。しかしこれらの DIC の素因に関連する遺伝子のアイデンティティ、主不明のまま。Dexrazoxane は追加を識別する必要性を強調、唯一のアジュバント エージェント、DIC の治療に米国食品医薬品局 (FDA) が限定的に実施14,15,16, 承認治療戦略。DIC の動物モデルはこれらの目的のため検討されます。そのアクセシビリティとシンプルさに、DIC モデルの解明いる可能性のある広範な影響心筋症の他の種類の: 一般的な病因共有可能性があります別の病因による心筋症の中で特に後病理学的ステージ17,18,19,20。
DIC の齧歯動物モデルに加えてより高いスループットのゼブラフィッシュ DIC モデルは新しい遺伝的要因と治療法の探索を容易にするために発達しました。21治療化合物をスクリーニングするための透明の zebrafish の胚の胚の DIC モデルを設置します。心筋症には、進歩的な病因と成人発症疾患がされますが、モデルがされている大人のゼブラフィッシュ心筋症は22,23,24,25,26を開発しました。我々 は、心筋症による慢性貧血24、続いて DIC アダルト ゼブラフィッシュ232 番目の取得した心筋症モデルとしての最初の獲得モデルを生成されます。アダルト ゼブラフィッシュに DOX の単一ボーラス注入が続いて心筋症の慢性期 6 ヶ月投与後に投与後 1 週間 (wpi) 内ほぼ急性期から成る心毒性を誘導することがわかった。ラパマイシンの機構のターゲットのハプロ不全により中(mtor) 心筋症の改善も慢性の段階でそれは誇張魚死亡率急性期でステージ依存を識別する大人の DIC モデルの値を強調します。機構23。我々 はさらに大人の DIC モデルを挿入変異のトランスポゾン ベース アプローチ27経由で生成されているゼブラフィッシュ挿入の心臓 (ジック) 変異のコレクションを強調する使用ことができることを実証しました。パイロット画面識別 DnaJ (Hsp40) の相同物、亜科 B、およびメンバーの 6 b と同様に、3 の知られている心筋症遺伝子 (dnajb6b) として新しい DIC 感受性遺伝子28。したがって、ゼブラフィッシュの大人の DIC モデルの生成は、体系的に DIC は、既存のゲノム広い連合の調査 (GWAS) と量的形質遺伝子座 (QTL を補完の遺伝的修飾因子の同定を可能にする新しい方法論につながった) 分析。
世代と成人ゼブラフィッシュ DIC モデルの実装は、我々 は別の研究者の間でおよび/または同じ調査官によって実行される別の注射の中でも大きな変化に気づいた。モデルの縦の性質は、別の捜査官からの結果を登録して、連続するトラブルシューティング プロセスに課題を課しています。この単純な心筋症を誘発するストレスによる研究コミュニティの使用を容易にするには、我々 のプロトコルの詳細、IP 注入の存在の 2 つのタイプと異なる研究者のばらつきを減らすための考慮事項について説明.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Crossing tank</td>
			<td>Aquaneering</td>
			<td>ZHCT100</td>
			<td>Fish breeding</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td></td>
			<td>Maintaining embryo</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 L medium tank</td>
			<td>Aquaneering</td>
			<td>ZT280</td>
			<td>Maintaining fish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paramecia</td>
			<td>Carolina</td>
			<td>131560</td>
			<td>Food for juvenile fish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Live hatched brine shrimp</td>
			<td>in house</td>
			<td></td>
			<td>Food for adult fish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Doxorubicin hydrochloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D1515-10MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 ml safe-lock tube</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>No. 022363204</td>
			<td>For drug storage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum foil paper</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>1213104</td>
			<td>For preventing light exposure</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>Roche</td>
			<td>No. 03115887001</td>
			<td>For dechorionating embryo</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#39;s balanced salt solution (HBBS)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>14025076</td>
			<td>Vehicle for DOX</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm petri dish</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>431741</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 &#956;L NanoFil micro-syringe</td>
			<td>WPI</td>
			<td>NANOFIL</td>
			<td>For injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>34 gauge needle&#160;</td>
			<td>WPI</td>
			<td>NF34BV-2</td>
			<td>For injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine</td>
			<td>Argent</td>
			<td>MS-222</td>
			<td>Anesthetizing fish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well plate</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3539</td>
			<td>For embryo drug treatment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer pipette</td>
			<td>Bel-art product</td>
			<td>F37898</td>
			<td>For transfering embryo</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a doxorubicin-induced cardiomyopathy model in adult zebrafish

遺伝的にアクセスできるアダルト ゼブラフィッシュ (動脈分布) は、心筋症などの疾患を理解するため脊椎動物モデルとしてますます使用されています。利便性、こうしてハイスループット遺伝子操作のため取得した心筋症モデルの生成アダルト ゼブラフィッシュのドキソルビシン誘発心筋症 (DIC) モデルなどは扉を開いて、新しい研究手段に前方遺伝学的スクリーニングを介して心筋症修飾子の発見を含みます。ゼブラフィッシュ胚の DIC モデルとは異なり、急性初期と後で慢性期心筋症決定できますアダルト ゼブラフィッシュ DIC モデルでは、ステージ依存性シグナル伝達機構と治療戦略の研究を有効にします。ただし、現在のモデルでは、経験豊富な研究者の手にも変数の結果を取得できます。DIC モデルの将来の実装を容易にするには、大人のゼブラフィッシュのこの DIC モデルを生成および腹腔内 (IP) 投与の 2 つの代替方法について説明する方法で詳細なプロトコルを紹介します。我々 はさらに信頼性の高い結果を取得し、結果を適切に解釈する方法に関する提案を提供する変化を少なくための方法について説明します。

ここでは、大人のゼブラフィッシュ モデル DIC への IP の注入を実行する 2 つの方法が掲載されています。古典的な確立された IP 注入法29を使用している間注入 DOX ソリューション (赤い色) が針が浸透した場所から時々 にじみでていることが指摘されました。代替の IP 注入は腹膜から 3-4 mm、DOX のリリース、針の浸透のため別の場所で使用 (図 1 a)、効果的に (図 1 b 1 C) 漏れを防止します。両方の方法の腹膜に DOX の配信の成功は、射出座の反対側に表示される魚の腹の中で赤い色の迅速な配布によって証明されます。
DOX の代替 IP 法を用いた 50 mg/kg 投与の注射は、魚の大半が (図 2) の 1 週間死ぬ重篤な毒性に します。対照的に、DOX の注入 (図 3 a) 4 wpi で最初の 2 週間の間にほぼの魚死と ~ 10% 魚死代替 IP メソッドによってを使用して 20 の mg/kg で投与。DOX の古典的な IP 法を用いた 20 mg/kg 投与の注射展示 〜 30% 魚死 4 wpi (図 3)。魚のいずれかの方法で注入 10 wpi (図 3 b, D) に 4 wpi からの類似 ~ 20% の魚の死を展示します。
キャスパー; を活用します。Tg(cmlc2:nusDsRed)魚ディックで心機能低下の進行を評価するモデル (図 4 a)23。透明体により収縮期 (図 4 b)、蛍光顕微鏡下で拡張期 (図 4) 段階で赤いハートのマニュアルです。20 mg/kg DOX 代替 IP メソッドを使用しての注入後、4 wpi (図 4) から始まって心室機能低下を検出できます。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57567/57567fig1.jpg"> 図 1: 注射ルート。(A) メソッド (1 a) 古典的な IP 注入 (b) の回路図と代替 IP 注入。赤い円は、一般的な DOX 2 注入のサイトのリリースを示します。緑の円は、針侵入部位を示しています。距離、重さ約 0.3 g. (1 b 1 C) 代表結果腹腔内投与の 2 つの方法を使用して、DOX 配信の成功を示す大人の WIK 魚に基づいて推定されます。大人の魚の腹の中の赤みは、注入後すぐに明記します。注入された魚は新鮮なシステム水で 5 分回復後に再度チェックしました。HBSS: 1 x ハンクの平衡塩溶液。WT WIK ゼブラフィッシュを用いて.スケール バー: 5 mm.<a href="/files/ftp_upload/57567/57567fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57567/57567fig2.jpg"> 図 2: 次の 50 mg/kg DOX 吹出し DOX ストレス大人のゼブラフィッシュの代表的な生存曲線。表示は、生後 3-6 ヶ月で WT 成魚の異なるバッチの DOX 注射の 3 セットです。合計 n = 24 n と 1 x HBSS 制御グループに採用された魚 = 8 魚は DOX と注入された各バッチで採用されました。2 つの噴射方法の間魚の生存率の差はみられなかった。WT WIK ゼブラフィッシュを用いて.<a href="/files/ftp_upload/57567/57567fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57567/57567fig3.jpg"> 図 3: 大人ゼブラフィッシュ 2 つの腹腔内投与方法 20 mg/kg DOX 注入との比較で DOX ストレスを次の代表的な生存曲線。0-4 古典的な腹腔内投与によって数週間以下 DOX 配信内 (3 a) 魚の生存。% 魚数週 0 が 100% として見なされていた。(3 b) 古典的な腹腔内投与による 4 週間郵便を DOX 配達後の魚の生存。% 魚数週 4 は 100% と見なされていた。0-4 週以下代替腹腔内注入による DOX 配信内 (3 C) 魚の生存。% 魚数週 0 が 100% として見なされていた。(3 D) 魚の代替の腹腔内投与による 4 週間 DOX 配信後の生存。% 魚数週 4 は 100% と見なされていた。(3 a) で示されているデータと (3 b) には、年齢の 3-6 ヶ月合計 223 注入された魚から DOX 注入の 9 つのバッチ。(3 C) に表示されるデータと (3 D) には、年齢の 2-6 ヶ月合計 335 注入された魚から DOX 注入の 14 の異なるバッチ。生きている魚の数は毎週記録されます。誤差範囲は、各週異なるバッチの間で生存率の標準偏差を表します。WT WIK ゼブラフィッシュを用いて.<a href="/files/ftp_upload/57567/57567fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57567/57567fig4.jpg"> DOX ストレスキャスパー; を使用して、次の図 4: 代表的な心機能評価Tg(cmlc2:nusDsRed)魚。 大人の写真 (4 a) のキャスパー。Tg(cmlc2:nusDsRed)魚。スケール バー = 1 cm (4 b) 代表的な画像赤心室の成熟キャスパー; 収縮末期Tg(cmlc2:nusDsRed)魚。破線は、最後の収縮期径 (ESD) を表します。成熟したキャスパー; 拡張末期で赤い心室の代表 (4 C) 画像Tg(cmlc2:nusDsRed)魚。(4 b) のイメージと (4 C) は、6.3 倍の倍率を用いた蛍光解剖顕微鏡で撮影した心臓の鼓動のムービーから抽出されました。破線は、最後の拡張期径 (EDD) を表します。スケール バー = 1 mm. (4 D) 代表的な心機能測定キャスパー;Tg(cmlc2:nuDsRed) 20 mg/kg DOX 注射後大人ゼブラフィッシュ。エドと ESD を行った (4 b) のように、(4 C) 一部短縮が (EDD − ESD) の式で計算される個々 の魚のと心室/EDD。大幅短縮心室の低下の割合は、4 週間、その後に検出されました。腹腔内投与方法が使用されました。値は、平均 ± 標準誤差として表示されます。各グループに n ≥ 3。スチューデントt検定は、2 つのグループの比較のため使用されました。p < 0.05。これらの数字は、鼎らから変更されています。23<a href="/files/ftp_upload/57567/57567fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。

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A Doxorubicin-induced Cardiomyopathy Model in Adult Zebrafish

大人のゼブラフィッシュのドキソルビシン誘発心筋症モデル

アダルト ゼブラフィッシュ (動脈分布) のドキソルビシン誘発心筋症モデルを生成する方法を次に紹介します。腹腔内投与の 2 つの方法を提示し、さまざまな実験グループのばらつきを減らすための条件について説明。

The genetically accessible adult zebrafish (Danio rerio) has been increasingly used as a vertebrate model for understanding human diseases such as ...

a-doxorubicin-induced-cardiomyopathy-model-in-adult-zebrafish

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Medicine

9.7K ビュー.  Mayo Clinic Graduate School of Biomedical Sciences. アダルト ゼブラフィッシュ (動脈分布) のドキソルビシン誘発心筋症モデルを生成する方法を次に紹介します。腹腔内投与の 2 つの方法を提示し、さまざまな実験グループのばらつきを減らすための条件について説明。

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Induction of Myocardial Infarction in Adult Zebrafish Using Cryoinjury

The mammalian heart is incapable of significant regeneration following an acute injury such as myocardial infarction1. By contrast, urodele amphibians and teleost fish retain a remarkable capacity for cardiac regeneration with little or no scarring throughout life2,3. It is not known why only some non-mammalian vertebrates can recreate a complete organ from remnant tissues4,5. To understand the molecular and cellular differences between regenerative responses in different species, we need to use similar approaches for inducing acute injuries.
In mammals, the most frequently used model to study cardiac repair has been acute ischemia after a ligation of the coronary artery or tissue destruction after cryoinjury6,7. The cardiac regeneration in newts and zebrafish has been predominantly studied after a partial resection of the ventricular apex2,3. Recently, several groups have established the cryoinjury technique in adult zebrafish8-10. This method has a great potential because it allows a comparative discussion of the results obtained from the mammalian and non-mammalian species.
Here, we present a method to induce a reproducible disc-shaped infarct of the zebrafish ventricle by cryoinjury. This injury model is based on rapid freezing-thawing tissue, which results in massive cell death of about 20% of cardiomyocytes of the ventricular wall. First, a small incision was made through the chest with iridectomy scissors to access the heart. The ventricular wall was directly frozen by applying for 23-25 seconds a stainless steel cryoprobe precooled in liquid nitrogen. To stop the freezing of the heart, fish water at room temperature was dropped on the tip of the cryoprobe. The procedure is well tolerated by animals, with a survival rate of 95%.
To characterize the regenerative process, the hearts were collected and fixed at different days after cryoinjury. Subsequently, the specimen were embedded for cryosectioning. The slides with sections were processed for histological analysis, in situ hybridization and immunofluorescence. This undertaking enhances our understanding of the factors that are required for the regenerative plasticity in the zebrafish, and provide new insights into the machinery of cardiac regeneration. A conceptual and molecular understanding of heart regeneration in zebrafish will impact both developmental biology and regenerative medicine.

Zebrafish represents a valuable model to study the mechanisms of heart regeneration in vertebrates. Here, we present a protocol for induction of a heart infarct in adult zebrafish using cryoinjury. This method results in massive cell death within 20% of the ventricular wall, similar to that observed in mammalian infarcts.

Cryoinjuryを使用した大人のゼブラフィッシュにおける心筋梗塞の誘発

The mammalian heart is incapable of significant regeneration following an acute injury such as myocardial infarction1. By contrast, urodele amphibians and ...

医学

Assessing Teratogenic Changes in a Zebrafish Model of Fetal Alcohol Exposure

Fetal alcohol syndrome (FAS) is a severe manifestation of embryonic exposure to ethanol. It presents with characteristic defects to the face and organs, including mental retardation due to disordered and damaged brain development. Fetal alcohol spectrum disorder (FASD) is a term used to cover a continuum of birth defects that occur due to maternal alcohol consumption, and occurs in approximately 4% of children born in the United States. With 50% of child-bearing age women reporting consumption of alcohol, and half of all pregnancies being unplanned, unintentional exposure is a continuing issue2. In order to best understand the damage produced by ethanol, plus produce a model with which to test potential interventions, we developed a model of developmental ethanol exposure using the zebrafish embryo. Zebrafish are ideal for this kind of teratogen study3-8. Each pair lays hundreds of eggs, which can then be collected without harming the adult fish. The zebrafish embryo is transparent and can be readily imaged with any number of stains. Analysis of these embryos after exposure to ethanol at different doses and times of duration and application shows that the gross developmental defects produced by ethanol are consistent with the human birth defect. Described here are the basic techniques used to study and manipulate the zebrafish FAS model.

In order to understand the molecular mechanisms of the ethanol-induced developmental damage, we have developed a zebrafish model of ethanol exposure and are exploring the physical, cellular, and genetic alterations that occur after ethanol exposure1. We then seek to find potential interventions and rapidly test them in this animal model.

胎児性アルコール暴露のゼブラフィッシュモデルの催奇形性変化を評価する

Fetal alcohol syndrome (FAS) is a severe manifestation of embryonic exposure to ethanol. It presents with characteristic defects to the face and organs, ...

Screening for Melanoma Modifiers using a Zebrafish Autochthonous Tumor Model

Genomic studies of human cancers have yielded a wealth of information about genes that are altered in tumors1,2,3. A challenge arising from these studies is that many genes are altered, and it can be difficult to distinguish genetic alterations that drove tumorigenesis from that those arose incidentally during transformation. To draw this distinction it is beneficial to have an assay that can quantitatively measure the effect of an altered gene on tumor initiation and other processes that enable tumors to persist and disseminate. Here we present a rapid means to screen large numbers of candidate melanoma modifiers in zebrafish using an autochthonous tumor model4 that encompasses steps required for melanoma initiation and maintenance. A key reagent in this assay is the miniCoopR vector, which couples a wild-type copy of the mitfa melanocyte specification factor to a Gateway recombination cassette into which candidate melanoma genes can be recombined5. The miniCoopR vector has a mitfa rescuing minigene which contains the promoter, open reading frame and 3'-untranslated region of the wild-type mitfa gene. It allows us to make constructs using full-length open reading frames of candidate melanoma modifiers. These individual clones can then be injected into single cell Tg(mitfa:BRAFV600E);p53(lf);mitfa(lf)zebrafish embryos. The miniCoopR vector gets integrated by Tol2-mediated transgenesis6 and rescues melanocytes. Because they are physically coupled to the mitfa rescuing minigene, candidate genes are expressed in rescued melanocytes, some of which will transform and develop into tumors. The effect of a candidate gene on melanoma initiation and melanoma cell properties can be measured using melanoma-free survival curves, invasion assays, antibody staining and transplantation assays.

A rapid way to screen for melanoma modifiers using a zebrafish autochthonous tumor model is presented. It takes advantage of the miniCoopR vector which allows for expression of candidate melanoma genes in melanocytes. A method to obtain melanoma-free survival curves, an invasion assay, a protocol for antibody staining of scale melanocytes and a melanoma transplantation assay are described.

ゼブラ土着腫瘍モデルを用いたメラノーマの修飾のためのスクリーニング

Genomic studies of  human cancers have yielded a wealth of information about genes that are altered  in tumors1,2,3. A challenge arising from these ...

A Zebrafish Model of Diabetes Mellitus and Metabolic Memory

Diabetes mellitus currently affects 346 million individuals and this is projected to increase to 400 million by 2030. Evidence from both the laboratory and large scale clinical trials has revealed that diabetic complications progress unimpeded via the phenomenon of metabolic memory even when glycemic control is pharmaceutically achieved. Gene expression can be stably altered through epigenetic changes which not only allow cells and organisms to quickly respond to changing environmental stimuli but also confer the ability of the cell to "memorize" these encounters once the stimulus is removed. As such, the roles that these mechanisms play in the metabolic memory phenomenon are currently being examined.
We have recently reported the development of a zebrafish model of type I diabetes mellitus and characterized this model to show that diabetic zebrafish not only display the known secondary complications including the changes associated with diabetic retinopathy, diabetic nephropathy and impaired wound healing but also exhibit impaired caudal fin regeneration. This model is unique in that the zebrafish is capable to regenerate its damaged pancreas and restore a euglycemic state similar to what would be expected in post-transplant human patients. Moreover, multiple rounds of caudal fin amputation allow for the separation and study of pure epigenetic effects in an in vivo system without potential complicating factors from the previous diabetic state. Although euglycemia is achieved following pancreatic regeneration, the diabetic secondary complication of fin regeneration and skin wound healing persists indefinitely. In the case of impaired fin regeneration, this pathology is retained even after multiple rounds of fin regeneration in the daughter fin tissues. These observations point to an underlying epigenetic process existing in the metabolic memory state. Here we present the methods needed to successfully generate the diabetic and metabolic memory groups of fish and discuss the advantages of this model.

Metabolic memory is the phenomenon by which diabetic complications persist and progress unimpeded even after euglycemia is achieved pharmaceutically. Here we describe a diabetes mellitus zebrafish model which is unique in that it allows for the examination of the mitotically transmissible epigenetic components of metabolic memory in vivo.

糖尿病とメタボリックメモリーのゼブラフィッシュモデル

Diabetes mellitus currently affects 346 million individuals and this is projected to increase to 400 million by 2030. Evidence from both the laboratory ...

A Possible Zebrafish Model of Polycystic Kidney Disease: Knockdown of wnt5a Causes Cysts in Zebrafish Kidneys

Polycystic kidney disease (PKD) is one of the most common causes of end-stage kidney disease, a devastating disease for which there is no cure. The molecular mechanisms leading to cyst formation in PKD remain somewhat unclear, but many genes are thought to be involved. Wnt5a is a non-canonical glycoprotein that regulates a wide range of developmental processes. Wnt5a works through the planar cell polarity (PCP) pathway that regulates oriented cell division during renal tubular cell elongation. Defects of the PCP pathway have been found to cause kidney cyst formation. Our paper describes a method for developing a zebrafish cystic kidney disease model by knockdown of the wnt5a gene with wnt5a antisense morpholino (MO) oligonucleotides. Tg(wt1b:GFP) transgenic zebrafish were used to visualize kidney structure and kidney cysts following wnt5a knockdown. Two distinct antisense MOs (AUG - and splice-site) were used and both resulted in curly tail down phenotype and cyst formation after wnt5a knockdown. Injection of mouse Wnt5a mRNA, resistant to the MOs due to a difference in primary base pair structure, rescued the abnormal phenotype, demonstrating that the phenotype was not due to &#8220;off-target&#8221; effects of the morpholino. This work supports the validity of using a zebrafish model to study wnt5a function in the kidney.

A Possible Zebrafish Model of Polycystic Kidney Disease: Knockdown of wnt5a Causes Cysts in Zebrafish Kidneys

We describe a method of generating a possible zebrafish model of polycystic kidney disease. We used Tg(wt1b:GFP) fish to visualize kidney structure. Knockdown of wnt5a was by morpholino injection. Pronephric cyst formation after wnt5a knockdown was observed in this GFP transgenic zebrafish.

多発性嚢胞腎疾患の可能性のあるゼブラフィッシュモデル：のノックダウン<em&gt; WNT5A</em&gt;ゼブラフィッシュ腎臓で嚢胞を引き起こす

Polycystic kidney disease (PKD) is one of the most common causes of end-stage kidney disease, a devastating disease for which there is no cure. The ...

Tachycardia-Induced Cardiomyopathy As a Chronic Heart Failure Model in Swine

A stable and reliable model of chronic heart failure is required for many experiments to understand hemodynamics or to test effects of new treatment methods. Here, we present such a model by tachycardia-induced cardiomyopathy, which can be produced by rapid cardiac pacing in swine.
A single pacing lead is introduced transvenously into fully anaesthetized healthy swine, to the apex of the right ventricle, and fixated. Its other end is then tunneled dorsally to the paravertebral region. There, it is connected to an in-house modified heart pacemaker unit that is then implanted in a subcutaneous pocket. 
After 4 - 8 weeks of rapid ventricular pacing at rates of 200 - 240 beats/min, physical examination revealed signs of severe heart failure - tachypnea, spontaneous sinus tachycardia, and fatigue. Echocardiography and X-ray showed dilation of all heart chambers, effusions, and severe systolic dysfunction. These findings correspond well to decompensated dilated cardiomyopathy and are also preserved after the cessation of pacing.
This model of tachycardia-induced cardiomyopathy can be used for studying the pathophysiology of progressive chronic heart failure, especially hemodynamic changes caused by new treatment modalities like mechanical circulatory supports. This methodology is easy to perform and the results are robust and reproducible.

Here, we present a protocol to produce tachycardia-induced cardiomyopathy in swine. This model represents a potent way to study the hemodynamics of progressive chronic heart failure and the effects of applied treatment.

豚の慢性心不全モデルとして頻拍誘発性心筋

A stable and reliable model of chronic heart failure is required for many experiments to understand hemodynamics or to test effects of new treatment ...

Isometric Contractility Measurement of the Mouse Mesenteric Artery Using Wire Myography

The wire myograph technique is used to assess the contractility of vascular smooth muscles in response to depolarization, GPCR agonists/inhibitors and drugs. It is widely used in many studies on the physiological functions of vascular smooth muscle, the pathogenesis of vascular diseases such as hypertension, and the development of smooth muscle relaxant drugs. The mouse is a widely used model animal with a large pool of disease models and genetically modified strains. We introduced this method to measure the isometric contraction of mouse mesenteric artery in detail. A 1.4-mm segment of mouse mesenteric resistance artery was isolated and mounted on a myograph chamber by passing two steel wires through its lumen. After equilibration and normalization steps, the vessel segment was potentiated by a high-K+ solution twice prior to the contraction assay. As an example of the application of this method in drug development, we measured the relaxant effect of a novel natural substance, neoliensinine, isolated from a Chinese herb, embryos of the lotus seed (Nelumbo nucifera Gaertn.) on mouse mesenteric arteries. The vessel segments mounted on the myograph chamber were stimulated with a high-K+ solution. When the force tension reached a stable sustained phase, cumulative doses of neoliensinine were added to the chamber. We found that neoliensinine had a dose-dependent relaxant effect on smooth muscle contraction, thus suggesting that it bears potential activity against hypertension. In addition, as the vessel segment can survive at least 4 hours after mounting and maintain contractility induced by the high-K+ solution for many times, we suggest that the wire myograph system may be used for the time-consuming process of drug screening.

The wire myograph technique is used to investigate vascular smooth muscle functions and screen new drugs. We report a detailed protocol for measuring the isometric contractility of the mouse mesenteric artery and for screening new relaxants of vascular smooth muscle.

ワイヤー図法を使用してマウスの腸間膜動脈の等尺性収縮力測定

The wire myograph technique is used to assess the contractility of vascular smooth muscles in response to depolarization, GPCR agonists/inhibitors and ...

Isolation of Atrial Myocytes from Adult Mice

The electrophysiological properties of atrial myocytes importantly affect overall cardiac function. Alterations in the underlying ionic currents responsible for the action potential can cause pro-arrhythmic substrates that underlie arrhythmias, such as atrial fibrillation, which are highly prevalent in many conditions and disease states. Isolating adult mouse atrial cardiomyocytes for use in patch-clamp experiments has greatly advanced our knowledge and understanding of the cellular electrophysiology in the healthy atrial myocardium and in the setting of atrial pathophysiology. In addition, studies using genetic mouse models have elucidated the role of a vast array of proteins in regulating atrial electrophysiology. Here we provide a detailed protocol for the isolation of cardiomyocytes from the atrial appendages of adult mice using a combination of enzymatic digestion and mechanical dissociation of these tissues. This approach consistently and reliably yields isolated atrial cardiomyocytes that can then be used to characterize cellular electrophysiology by measuring action potentials and ionic currents in patch-clamp experiments under a number of experimental conditions.

This protocol is used to isolate single atrial cardiomyocytes from the adult mouse heart using a chunk digestion approach. This approach is used to isolate right or left atrial myocytes that can be used to characterize atrial myocyte electrophysiology in patch-clamp studies.

成体マウスからの心房筋細胞の単離

The electrophysiological properties of atrial myocytes importantly affect overall cardiac function. Alterations in the underlying ionic currents ...

Murine Myocardial Infarction Model using Permanent Ligation of Left Anterior Descending Coronary Artery

Myocardial infarction (MI) and acute coronary diseases are among the most prominent causes of death in population with western lifestyle. The murine models of MI with permanent ligation of left-anterior descending (LAD) coronary artery closely mimics MI in humans. Murine models benefit from the extensive genetic engineering available nowadays. Here we propose a reproducible murine surgical model of myocardial infarction by permanent LAD coronary ligation. Our technique comprises anesthesia with ketamine/xylazine that can be rapidly reversed by administration of an antagonist, intubation without tracheotomy for mechanical-assisted ventilation, ventilation with application of extrinsic positive end-expiratory pressure (PEEP) to avoid alveolar collapse, a thoracotomy method limiting to the minimum surgical lesions made to skeletal muscles, and lung inflation without thoracentesis. This method is sparsely invasive, reproducible and reduces post-surgery mortality and complications.

Herein we describe a surgical procedure showing how to achieve permanent ligation of the left-anterior descending coronary artery in mice. This model is of high relevance to investigate the pathophysiology of myocardial infarction and the concomitant biological processes.

左前皮下冠動脈の永久的なライゲーションを用いたマウス心筋梗塞モデル

Myocardial infarction (MI) and acute coronary diseases are among the most prominent causes of death in population with western lifestyle. The murine ...

A Doxorubicin-Induced Murine Model of Dilated Cardiomyopathy In Vivo

Dilated cardiomyopathy (DCM) refers to a spectrum of heterogeneous myocardial disorders characterized by ventricular dilation and depressed cardiac performance in the absence of hypertension, valvular, congenital, or ischemic heart diseases, and which may be related to infection, autoimmune or metabolic abnormalities, or family inheritance. It can progress into congestive heart failure with a poor prognosis. Doxorubicin (Dox) is widely employed as a chemotherapeutic drug, but its use is limited because it causes DCM-like changes of the myocardium. Its myocardial toxicity is attributed to oxidative stress, chronic inflammation, and cardiomyocyte apoptosis. A model of DCM exploiting these Dox-induced DCM symptoms has not been established.

Described is a protocol to establish a Doxorubicin-induced dilated cardiomyopathy (DCM) model in mice via long-term intraperitoneal injection of Doxorubicin.

インビボにおける拡張型心筋症のドキソルビシン誘発性マウスモデル

Dilated cardiomyopathy (DCM) refers to a spectrum of heterogeneous myocardial disorders characterized by ventricular dilation and depressed cardiac ...