名古屋大学直也浅井にありがとう浮遊空腸のセクションの低温抗原検索の開発のための有用な示唆を提供します。この作品は、2012 年 (JP25460493) に Scientific Research (KAKENHI) (C) の補助金によって支えられた、(B) 日本社会科学振興 (JSPS) から 2017 年に (JP17H04065)、A ステップから助成金 (AS251Z02522Q) 2014 年と 2015 年 (AS262Z00715Q) に、日本科学技術振興機構 (JST) と武田先見の明の研究 (修士) に武田科学振興財団から助成 2014 年。

ここで説明したすべてのメソッドは、動物愛護と愛知県発達障害研究所利用委員会によって承認された (出願番号: M-03)。
1. 準備
<ol><li>リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) の 10 L を準備: 32.27 g ナ2HPO4·12H2O、NaH2PO4·2H2O 4.5 g の 80.0 g 塩化ナトリウムの室温 (RT) で 10 l. のストア ソリューションの最終巻に純水に追加。</li>
	<li>手順 1.1 から PBS の最終濃度 0.05% (vol:vol) に polyoxyethylene(10) オクチルフェニル エーテルの 100 μ L との PBS t: 200 mL の 200 mL を準備します。室温ストア</li>
	<li>手袋、眼の保護を着て、ショ糖 15% を 10% 中性ホルマリン溶液 50 mL を準備: 7.5 g ショ糖 10% に追加の 50 mL の最終巻に中性ホルマリン (資材表) をバッファリングします。室温ストア 注意: バッファー 10% 中性ホルマリン中のホルムアルデヒドと吸入または皮膚/眼の接触は危険にできます。慎重に処理します。</li>
	<li>200 単位/ml ファロイジン蛍光染料共役ストック溶液 1.5 mL を準備: ファロイジン蛍光染料共役 (1 バイアル、凍結乾燥固体励起と放射の波長で 300 台: 581 nm と 609 nm、それぞれ) の 1.5 mL で中断メタノール。-20 ° C で暗闇の中のストア ソリューション</li>
	<li>準備 5 mg/mL 4', 6-diamidino-2-phenylindole、塩酸 (DAPI) 在庫ソリューション: N, N-ジメチルホルムアミド (DMF) の 2 mL の DAPI の 10 mg です。-20 ° C で暗闇の中のストア ソリューション</li>
	<li>5% ウシ血清アルブミン (BSA) PBS の準備: 10 mL の PBS の BSA の 0.5 g。4 ° C でのストア</li>
	<li>ニッパーを使わず、18 ゲージ ストレート針の斜めのヒントを削除し、針の内腔 (図 1 a1) を通過する液体を許可するように縦方向に nipped、ピンチャーで端をピンチします。 注: プロトコルはここで一時停止することができます。</li>
</ol>2. 動物解剖と空腸の分離
<ol><li>マウスの灌流固定<ol>
<li>手袋を着用し、換気の良い場所で作業します。</li>
		<li>100 mL ガラス製ビーカーを準備、中性ホルマリン、手術用ツール (ハサミ、鉗子)、金属トレイに 10% がバッファリングされる、6-0 ナイロン切り取り縫合、1.7 のように 18 ゲージ ストレート針 22 g 翼針、20 mL の注射器。</li>
		<li>20 mL シリンジ、ガラス ビーカーから読み込むバッファー 10% 中性ホルマリン溶液 20 mL、22 g 翼針をコンセントに取り付けます。</li>
		<li>ゼラチン粉末 1 g を 20 mL の PBS (最後の 5% のゼラチン) 50 mL 遠心管中に追加することによって液体ゼラチンを準備します。15 分間漬常温を振ることがなく 50 ° C で 15 分間湯せんで孵化させなさい。</li>
		<li>簡単に渦とゼラチンが完全に溶けるまで別の 15 分は 50 ° C で孵化させなさい。RT でチューブを使用するまで残します。</li>
		<li>頚部転位によってアダルト マウスを安楽死させます。</li>
		<li>金属トレイをステップ 2.1.6 からマウスを置き、手術器具を用いて剣軟骨を介して皮膚に小切開を行います。</li>
		<li>胸部、腹部領域公開に両手で切開を展開します。</li>
		<li>横隔膜を公開する腹膜を開き、両側横隔膜を開きます。</li>
		<li>両側、前腋窩線に沿って胸郭をカット、中心部を公開する胸腺の位置で横方向の切削による胸壁を削除します。</li>
		<li>血を排出し、左の心室の頂点に 22 g 翼針を挿入する右のアトリウムの耳介の小切開を確認します。10% 中性ホルマリン溶液で組織を灌流してプランジャーを押してください。</li>
		<li>骨盤内の臓器を公開した後、肛門から直腸の端を切断し、腸間膜を切断することによって腸を本体と切り離します。</li>
		<li>空腸を分離するには、胃前庭部の肛門側から 4 cm で腸をカットします。残存小腸の肛門の半分を破棄します。</li>
		<li>洗浄手順を容易にするために半分に空腸をクリップします。負荷 10 %20 mL は、20 mL の注射器に中性ホルマリンをバッファー、コンセントに 1.7 の手順で準備 18 ゲージ ストレート針を取り付けます。</li>
		<li>切り取られた空腸腸の内容物を洗い流すため、腸内腔表面 (図 1 a2) を修正するための一方の端から 10% 中性ホルマリン溶液を注入します。</li>
		<li>2.1.15 の手順で説明するように、PBS を注入することにより腸の内腔を洗浄します。</li>
		<li>2.1.15 液体ゼラチンで PBS を置き換えるための手順の説明に従って、腸内腔に液体ゼラチンをフラッシュします。</li>
		<li>6-0 ナイロンを使用して縫合結紮によって切り取られた空腸のすぐ片方の端縫合糸をカット、液体ゼラチンで腸を埋めるし、縫合結紮 (図 1 a3) の反対側の端の近きます。</li>
		<li>Cryomold (図 1 a4) の落ち込んでいる部分にソーセージの形をした空腸のセクションに合わせて 4 つの縫合ノットを追加します。 注: 20 mm × 25 mm × 5 mm 落ち込んでセクションで cryomolds 〜 20 mm 空腸ソーセージのようなセクションは望ましいです。</li>
		<li>50 ml の 4 ° C で一晩 10% 中性ホルマリン溶液にショ糖 15% の組織を吸収します。 注: 手順は、ショ糖とタンパク質の固定によってゼラチンと組織のホルマリンによってに対する凍害保護作用をください。室温 4 ° C で非固定糊ゼラチンを溶かすに対し、常温では、ホルマリン ゲル化ゼラチンが溶融しません。</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. ゼラチン充填空腸組織の凍結をスナップします。
<ol><li>縫合ノットで腸を切断することによって両端の結紮とソーセージのような腸 3枚 (図 1 a4) を取得します。凍結組織標本作製化合物の埋め込みを追加するための cryomold のソーセージのような部分を合わせます。</li>
	<li>スナップは凍結液体窒素で冷却イソペンタンで cryomold です。-80 ° c 店 cryomolds 注: プロトコルはここで一時停止することができます。</li>
</ol>4 浮遊凍結切片を用いた細胞の房の蛍光
<ol><li>セクショニング<ol>
<li>クライオスタット チャンバー内温度 (CT) とオブジェクト温度 (OT) の両方を -22 ° c. に設定します。少なくとも 15 分クリオスタットチャンバー内 cryomold で場所、凍結するティッシュのブロックします。</li>
		<li>35 mm ディッシュに 3 mL の PBS を追加します。</li>
		<li>Cryomold から凍結するティッシュのブロックを外し、ブロックを空腸の横断を公開するかみそりの刃で半分にカットします。1 つをマウントしてかみそりの刃で切断面を断面チャック (クライオスタット アダプター) のブロックの半分。</li>
		<li>30 μ m 厚いセクションにゼラチン充填空腸をセクションします。優しく 4.1.2 (図 2 b、右) 準備した 35 mm ディッシュにセクションを転送するための鉗子を冷凍を使用。</li>
	</ol>
</li>
	<li>一次抗体のアプリケーション<ol>
<li>3 回に 3 ml の PBS T 相互シェーカーで穏やかな揺れで各 5 分 35 mm ディッシュの浮遊セクションを洗浄 (約 36 回/分)。</li>
		<li>抗原検索ソリューションを準備: 2.7 mL 純水に抗原検索ソリューション集中 (材料表) の 0.3 mL。浮遊セクションを含む 35 mm ディッシュに抗原検索ソリューションの 3 mL を追加します。</li>
		<li>ふたを閉じ、皿とビニール テープのストリップと蓋の間のギャップをシール、揺れなし 50 ° c 3 時間ハイブリダイゼーション インキュベーターで孵化させなさい。</li>
		<li>インキュベーターと 20 分間常温の涼しいから皿を削除します。ビニール テープを除去した後、5 分各 3 mL の PBS T と穏やかな揺れのための 3 回のセクションを洗います。</li>
		<li>PBS-T を吸引し、セクションにブロッキング液 (材料表) の 5 滴を追加します。RT で穏やかな揺れで 5 分間インキュベートします。</li>
		<li>一次抗体溶液を調製: リン Y1798 (pY1798) を girdin 抗体 (材料表) の 5 μ L の PBS で 5% BSA 495 μ L。(ブロック ソリューションでは、削除する必要はありません) セクションに一次抗体液 500 μ L を追加します。</li>
		<li>加湿インキュベーション室に皿を置き、穏やかな揺れで 4 ° C で一晩インキュベートします。 注: 一晩インキュベートは最大 3 泊まで拡張できます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>二次抗体のアプリケーション<ol>
<li>3 回 5 分間各 3 mL で穏やかな揺れで PBS T のセクションを洗います。</li>
		<li>DAPI の希釈原液を準備: DAPI 原液 (ステップ 1.5) 998 μ L の PBS の 2 μ L。</li>
		<li>二次抗体溶液を作る: 476 μ L の PBS、DAPI 薄めた、ファロイジン蛍光染料共役原液の 12.5 μ、1 μ L ヤギ抗うさぎ IgG 蛍光色素共役の 10.5 μ で 5 %bsa (波長: 励起 496 nm、発光 520 nm)。</li>
		<li>PBS T 後、二次抗体溶液を適用し、穏やかな揺れで 30 分常温遮光インキュベーション室で孵化させなさい。</li>
		<li>5 分各 3 mL の PBS T と穏やかな揺れのための 3 回のセクションを洗います。</li>
		<li>最終的な洗浄後 PBS T を削除し、3 mL の PBS polyoxyethylene(10) オクチルフェニル エーテルを欠けているに置き換えます。実体顕微鏡に皿を転送します。</li>
		<li>白いガラスの MAS コート スライドと転送 1 つ腸セクション P200 ピペット先端部を用いた液滴に皿の中央に液滴の PBS の場所 200 μ。</li>
		<li>実体顕微鏡下のセクションの配置を調整した後に、セクションを囲むすべての残りの PBS を吸い出しなさい。</li>
		<li>水土台メディアの 20 μ L を追加し、メディアの上に 20 × 20 mm coverslip を置きます。</li>
		<li>すぐにキシレン ベース マウント メディアで coverslip エッジをシールします。木製・ マッペにスライドを配置でき、2-3 h の常温固化するキシレン ベース マウント メディア。 注: プロトコルはここで一時停止することができます。2-3 週間室温光シールドのスライド ボックスにスライドを格納できるメディアをキシレン ベース マウントが固化した後</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. 共焦点顕微鏡
<ol><li>共焦点顕微鏡の 63 × 対物にイマージョン オイルを置きます。Coverslip スライドを下げて、ステージにスライドを配置します。</li>
	<li>レーザー波長 405、488、555 nm で取得 TC の画像をデジタル化 (.tiff) tiff 形式で画像を保存します。 注: 蛍光染料の適切な検出フィルター セットを選択 (すなわち、励起/蛍光マキシマ: 358/461 nm、490/525 と 590/617)。</li>
</ol>

<ol>
	<li>Kuga, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tyrosine+phosphorylation+of+an+actin-binding+protein+Girdin+specifically+marks+tuft+cells+in+human+and+mouse+gut.">Tyrosine phosphorylation of an actin-binding protein Girdin specifically marks tuft cells in human and mouse gut.</a> J Histochem Cytochem. 65 (6), 347-366 (2017).</li><li>Jarvi, O., Keyrilainen, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+cellular+structures+of+the+epithelial+invasions+in+the+glandular+stomach+of+mice+caused+by+intramural+application+of+20-methylcholantren.">On the cellular structures of the epithelial invasions in the glandular stomach of mice caused by intramural application of 20-methylcholantren.</a> Acta Pathol Microbiol Scand Suppl. 39 (Suppl 111), 72-73 (1956).</li><li>Enomoto, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Akt/PKB+regulates+actin+organization+and+cell+motility+via+Girdin/APE.">Akt/PKB regulates actin organization and cell motility via Girdin/APE.</a> Dev Cell. 9 (3), 389-402 (2005).</li><li>Asai, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Similar+phenotypes+of+Girdin+germ-line+and+conditional+knockout+mice+indicate+a+crucial+role+for+Girdin+in+the+nestin+lineage.">Similar phenotypes of Girdin germ-line and conditional knockout mice indicate a crucial role for Girdin in the nestin lineage.</a> Biochem Biophys Res Commun. 426 (4), 533-538 (2012).</li><li>Kitamura, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+VEGF-mediated+angiogenesis+by+the+Akt/PKB+substrate+Girdin.">Regulation of VEGF-mediated angiogenesis by the Akt/PKB substrate Girdin.</a> Nat Cell Biol. 10 (3), 329-337 (2008).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Girdin+is+an+intrinsic+regulator+of+neuroblast+chain+migration+in+the+rostral+migratory+stream+of+the+postnatal+brain.">Girdin is an intrinsic regulator of neuroblast chain migration in the rostral migratory stream of the postnatal brain.</a> J Neurosci. 31 (22), 8109-8122 (2011).</li><li>Nahorski, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CCDC88A+mutations+cause+PEHO-like+syndrome+in+humans+and+mouse.">CCDC88A mutations cause PEHO-like syndrome in humans and mouse.</a> Brain. 139 (Pt 4), 1036-1044 (2016).</li><li>Lin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tyrosine+Phosphorylation+of+the+G+alpha-Interacting+Protein+GIV+Promotes+Activation+of+Phosphoinositide+3-Kinase+During+Cell+Migration.">Tyrosine Phosphorylation of the G alpha-Interacting Protein GIV Promotes Activation of Phosphoinositide 3-Kinase During Cell Migration.</a> Science signaling. 4 (192), ra64 (2011).</li><li>Omori, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Girdin+is+phosphorylated+on+tyrosine+1798+when+associated+with+structures+required+for+migration.">Girdin is phosphorylated on tyrosine 1798 when associated with structures required for migration.</a> Biochem Biophys Res Commun. 458 (4), 934-940 (2015).</li><li>Goto, H., Inagaki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+a+site-+and+phosphorylation+state-specific+antibody.">Production of a site- and phosphorylation state-specific antibody.</a> Nat Protoc. 2 (10), 2574-2581 (2007).</li><li>Wulf, E., Deboben, A., Bautz, F. A., Faulstich, H., Wieland, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+phallotoxin,+a+tool+for+the+visualization+of+cellular+actin.">Fluorescent phallotoxin, a tool for the visualization of cellular actin.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 76 (9), 4498-4502 (1979).</li><li>Jiao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+and+sensitive+antigen+retrieval+method+for+free-floating+and+slide-mounted+tissue+sections.">A simple and sensitive antigen retrieval method for free-floating and slide-mounted tissue sections.</a> J Neurosci Methods. 93 (2), 149-162 (1999).</li><li>Feltkamp-Vroom, T. M., Boode, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+embedding+and+sectioning+technique+for+immunohistochemical+studies+of+minute+specimens+of+tissue.">An embedding and sectioning technique for immunohistochemical studies of minute specimens of tissue.</a> J Clin Pathol. 23 (2), 188-189 (1970).</li><li>Ushida, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pre-embedding+technique+with+low+melting+temperature+gelatin+for+preparation+of+histological+sections.">Pre-embedding technique with low melting temperature gelatin for preparation of histological sections.</a> Proceeding of the Annual Meeting on Technologies in Biological Research. 36, 66-69 (2014).</li><li>Howitt, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tuft+cells,+taste-chemosensory+cells,+orchestrate+parasite+type+2+immunity+in+the+gut.">Tuft cells, taste-chemosensory cells, orchestrate parasite type 2 immunity in the gut.</a> Science. 351 (6279), 1329-1333 (2016).</li><li>von Moltke, J., Ji, M., Liang, H. E., Locksley, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tuft-cell-derived+IL-25+regulates+an+intestinal+ILC2-epithelial+response+circuit.">Tuft-cell-derived IL-25 regulates an intestinal ILC2-epithelial response circuit.</a> Nature. 529 (7585), 221-225 (2016).</li><li>Gerbe, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+epithelial+tuft+cells+initiate+type+2+mucosal+immunity+to+helminth+parasites.">Intestinal epithelial tuft cells initiate type 2 mucosal immunity to helminth parasites.</a> Nature. 529 (7585), 226-230 (2016).</li></ol>

著者が明らかに何もありません。

このプロトコルは、組織経験のない房細胞 (Tc) の信頼性の高い画像を取得する研究者を許可するように設計されました。このプロトコルは 3 つの重要な点: 1) サイトとリン酸化状態固有ウサギに対するポリクローナル抗体の人間 girdin リン酸化チロシン 1798 (pY1798 抗体) で特定の企業 (から得られた使用Immuno-Biological 研究所会社 X の =);空腸; 2) ゼラチン充填・ 3) 低温抗原検索。修飾特異抗体の翻訳後修飾 (リン酸化、メチル化、アセチル化など) の特定の種類を認識として広い意味でリン酸化状態特異的抗体を分類できる、特定のアミノ酸残基のタンパク質。大森らX 社は共同でリン酸化ペプチド、ウサギを免疫して後藤の方法9、に続く非リン酸化ペプチドを用いた固相クロマトグラフィーによる生じる抗体を浄化 pY1798 抗体を生成し、10. pY1798 抗体はチロシン 17989点突然変異の有無によるフルレングス人間 girdin の表現のベクトルを用いたリン酸化アッセイの in vitroで集中的に検証されました。その後、久我らは、会社 X から pY1798 抗体が腸内の TCs1の特定および敏感なマーカーであることを発見しました。したがって、会社 X から pY1798 抗体の包含は、このプロトコルでは重要なポイントです。
ゼラチンは、動物組織から抽出したコラーゲンが含まれているし、長い凍結切片13を使用して組織化学的研究組織標本を埋め込むに使用されています。4 ° C でゲル化、室内温度で溶ける低融点ゼラチンは14を埋め込み中に液体状態でゼラチンを維持するために必要な熱の悪影響を避けるために適用し始めた。このプロトコルでは 4 ° C で、抱水力、RT で溶けるゼラチン パウダーから作られた低融点ゼラチンはマウスの腸の横断凍結切片の形態を維持するために使用されました。このゼラチンは、空腸を完全に埋めるに使用されたときのサンプルが、ホルマリン固定不可逆的な糊化を達成するために。熱による抗原検索は、定着剤のアルデヒドを含む12によってマスクされた抗原を公開する効果的な方法です。ただし、パラフィン切片の解析のために一般的に使用される高温 (95-99 ° C で 30 分間) は、複雑な組織/ゼラチンの形態を損傷することが。ここで抗原の検索と組織形態の保全の両方を可能にする低温抗原検索 (3 h の 50 ° C) を使用しました。
pY1798 抗体マウス腸管のみならず複数の臓器 (胃、回腸、結腸、および胆嚢) マウスとヒト1から TCs にラベルを付けることができます。しかし、このプロトコル任意の組織から取りはずされた組織における pY1798 信号が急速に低下する、ため空腸内腔にフォルマリン含まれています (ステップ 2.1.15。、図 1 a2)。
フローティングの凍結切片の厚さに関連する制限があります。薄い凍結切片は、顕微鏡用透光性の面で有利なことができますが、薄さは物理的に脆弱なこれらのセクションを作る。対照的に、厚い凍結切片は物理的に頑丈ながセクションに低い抗体透磁率があります。このプロトコルでは 30 μ m 厚いセクションが使用された両方物理的に安定して抗体を透過しました。PY1798/ビリン/DAPI 三重染色パラフィン セクション久我らが使用するものと同様のプロトコルが失敗した場合、組織の広範な経験のない研究者の工夫したが実行1である可能性があります。パラフィン セクション F アクチン ファロイジン染色に伴う困難を避けるためには、パラフィン切片がここで使用されませんでした。
アミノ酸チロシン 1798 girdin に隣接する保全のため pY1798 抗体はマウス、ラットなど人間以外の種で TCs を染色に適用できます。このプロトコルで使われるゼラチン充填は、他の中空の臓器も適用できます。確かに、pY1798 や TC、離れてゼラチン充填低温抗原検索の組み合わせは悪名高いマウスの腸内で「難しい」エピトープを明らかにするために役立つことがあります、結果として、多くの研究者の関心の可能性があります。
Girdin の生物学的役割と TCs のリン酸化の意義は不明です。しかし、林らによる研究そのチロシンを示唆 girdin のリン酸化は8F アクチン重合の程度に関連付けられています。一方、久我ら発見それ致命的なアポトーシス誘導剤の用量 (e.g、シスプラチン、x 線放射) と関連付けられるかもしれない彼らが仮定されるマウスの小腸で TCs の相対頻度の大きい増加を引き起こした、。絨毛1girdin のリン酸化と同期の tcs、腸から可能な転換は。この可能性は、将来的にさらに調査が必要です。3 つのグループが最近急速な観察は、TC 周波数以下の寄生虫感染15,16,17になります。したがって、この漠然とした染色は人間の腸内の内視鏡的収集の組織を分析するだけでなく使用できるが、TC 蓄積が人間の腸内寄生虫感染症の診断に役立つ可能性がも。

房細胞 (TCs) は、頂房とスプール形の細胞体1によって特徴付けられる消化管上皮細胞のマイナーな散乱コンポーネントです。TCs は 1956年2で最初に説明されたが TC 機能不明で、信頼性の高い TC マーカーの欠如もあって。
榎本らまず girdin3神経系、血管、心臓弁、腱、筋4などの非神経組織に発現するアクチン結合蛋白質を特徴付けられます。Girdin の遺伝的アブレーションを持つマウスは、発育と複数の脳異常4,5,6を表示します。一方、人間 girdin の損失の機能突然変異は進行性脳症、重度障害と早期発症てんかん発作7に関連付けられます。
2011 年は、林らは、動的リン酸化チロシン EGFR と Src8などチロシンキナーゼを介した 1798 で girdin を識別されます。またリン酸 girdin がアクチンの細胞移行8をトリガーする改造のため必要なことを示した。大森らが開発したサイトとリン酸化状態固有人間 girdin 抗体チロシン 1798 (pY1798 抗体) 後藤のプロトコルを次にリン酸化のサイト指示された突然変異誘発を使用して抗体を検証表現のベクトル運ぶフルレングス girdin9,10。2017 年、久我らその pY1798 は、高い特異性と感度の高い1TCs をラベルを報告しました。PY1798 抗体はまだ特性内腔側の先端に「房' を含むセル全体形状 girdin の生物学的役割が明らかに優れたの染色特性に基づく以前の TC マーカー優れたと TC のリン girdin をあることを示した機能は明白でない1を残った。
本研究で説明した方法で蛍光染色、一次抗体標的タンパク質に対してとプライマリに対して蛍光標識二次抗体を使用して組織の特定の蛋白質をマークする組織学的手法は、します。抗体。このメソッドの目的は、組織の限られた経験と高品質の TC の画像を取得する研究者を許可することです。このプロトコルは、フローティングの凍結切片スライド マウントの凍結切片の必要性を避けるため、またはパラフィン セクションを使用します。ただし、浮遊セクションがスライド ガラスからのサポートの欠如のため壊れやすい、切片厚が抗体の透磁率を減らすことができます。このプロトコルには、これらの問題を克服する 2 つのアプローチが含まれています: 1) 浮遊セクション汚損プロシージャ全体の形態を維持するためにゼラチンで全体腸内腔に充満および 2) に低温の抗原検索の使用pY1798 信号を強化します。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Slc:DDY 6-week-old female mice</td>
			<td>Chubu Kagaku Shizai</td>
			<td>Not applicable</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disodium hydrogenphosphate 12-water (Na2HPO412H2O)</td>
			<td>Wako</td>
			<td>196-02835</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dihydroenphosphate Dihydrate (NaH2PO42H2O</td>
			<td>Wako</td>
			<td>199-02825</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>Wako</td>
			<td>199-10665</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100,&#160; Polyoxyethylene(10) octylphenyl ether</td>
			<td>Katayama Chemical</td>
			<td>Not applicable</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Wako</td>
			<td>190-00013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% buffered neutral formalin solution</td>
			<td>Muto Chemical</td>
			<td>20215</td>
			<td>Step 1.3.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin-fluorescent dye conjugate, Alexa Fluor 594 phalloidin</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A12381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>21915-35</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (4&#39;,6-diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N.N-dimethylformamide (DMF)</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>13015-75</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9647-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18-gauge stainless steel straight needle</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>NN-1838R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U.S.P. 6-0, 60 cm nylon cut suture, Crownjun</td>
			<td>Kono Seisakusho</td>
			<td>Not applicable</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>22-gauge winged needle</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>SV-22DLK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 mL TERUMO syringe</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>SS-20ES</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL centrifuge tube</td>
			<td>TPP</td>
			<td>91050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Iwaki centrifuge tubes</td>
			<td>Iwaki</td>
			<td>2325-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL micro test tube</td>
			<td>Star</td>
			<td>RSV-MTT1.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin powder, Gelare-blanc</td>
			<td>Nitta Biolab</td>
			<td>2809</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embedding compound for frozen tissue specimen, O.C.T. Compound 118 mL 12 piece</td>
			<td>Sakura FineTech</td>
			<td>4583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryomold, CRYO DISH No. 3, 125 piece, well size 20 x 25 x 5 (mm)</td>
			<td>Shoei Work&#39;s</td>
			<td>1101-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopentane</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>26404-75</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon cell culture dish 35 x 10mm Easy-Grip</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antigen retrieval solution concentrate, Target Retrieval Solution pH 9 10x</td>
			<td>Dako</td>
			<td>S2367</td>
			<td>Antigen retrieval solution concentrate in step 4.2.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein Block</td>
			<td>Dako</td>
			<td>X0909</td>
			<td>Blocking solution in 4.2.5.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phospho-Y1798 girdin (pY1798) antibodies</td>
			<td>Immuno-Biological Laboratories (IBL) = Company X</td>
			<td>28143</td>
			<td>Phospho-Y1798 girdin antibodies in step 4.2.6.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A11034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aquous mounting media, Prolong Gold Antifade Mountant</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>P36930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips, Matsunami Micro Cover Glass 22 x 22 mm 100 pcs Thickness No.1</td>
			<td>Matsunami Glass</td>
			<td>C022221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Entellan New, xylene-based mounting media for microscopy</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>107961</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MAS-coated slide glass white</td>
			<td>Matsunami Glass</td>
			<td>MI-MAS-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wooden Mappe KO-type</td>
			<td>Shoei Work&#39;s</td>
			<td>99-40007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immersion Oil 518 F Fluorescence Free 20 ml</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>444960</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettes, Pipetman P (P2, P20, P200, P1000)</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F144801, F123600, F123601, F123602</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure water production system</td>
			<td>Advantec</td>
			<td>GS-590</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic glove, Star Nitrile Glove</td>
			<td>Star</td>
			<td>RSU-NGVM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>CM1950</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deep freezer, SANYO Ultra Low</td>
			<td>Sanyo</td>
			<td>MDF-382</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Showcase refrigerator</td>
			<td>Nihon Freezer</td>
			<td>NC-ME50EC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath, Thermominder SDminiN (to dissolve gelatin at 50 C)</td>
			<td>Taitec</td>
			<td>0068750-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hybridization incubator (for antigen retrieval at 50 C)</td>
			<td>Taitec</td>
			<td>HB-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubation chamber for immunostaining</td>
			<td>Cosmo Bio</td>
			<td>10DO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reciprocal shaker for immunohistochemistry (for room temperature)</td>
			<td>Taitec</td>
			<td>NR-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reciprocal shaker for immunohistochemistry (for 4 C)</td>
			<td>Tokyo Rika Kikai</td>
			<td>MMS-3010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereoscopic microscope (for tissue handling)</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>SZ61</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereoscopic microscope (for Figure 1B)</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>M165FC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microscope (for Figure 3)</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>E800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal laser-scanning microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>LSM700</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

use of anti-phospho-girdin antibodies to visualize intestinal tuft cells in free-floating mouse jejunum cryosections

アクチンの様々 な組織の細胞移行をトリガーするための改造に必要なゾル性細胞質蛋白質であるアクチン結合タンパク質 girdin。Girdin は受容体とチロシン 1798 で非受容体チロシンのキナーゼによってリン酸化します。大森ら開発サイトとリン酸化状態特異的抗体チロシン 1798 (pY1798) で人間 girdin に対して特に結合リン酸化チロシンを 1798 年が非リン酸化チロシン-1798。pY1798 抗体は、特に哺乳類の消化管組織に存在する房細胞 (TCs) をラベルに使用されているが、これらの細胞の機能は不明。このプロトコルは、pY1798 抗体、蛍光抗体法を用いた空腸における TCs の堅牢な可視化できます。成功し、単純な TC の可視化を確保するため、このプロトコルは、2 つの組織学的技術を含まれている: ゼラチン充填空腸組織充填した空腸 3 h の 50 ° c の低温抗原検索から浮遊凍結切片の生産ゼラチン浮遊セクション汚損プロシージャ全体の形状を維持は、TCs pY1798 TCs に絨毛先端から分散の染色にこのプロトコルの使用の成功結果から低温抗原検索により、堅牢な信号に対しクリプト。ステンド グラスの TCs スプール形相馬、突出 '房' に対応する内腔側のチップに凝縮する蛍光信号ファロイジン染色 pY1798 陽性 TCs は肥厚したブラシの境界線と, し、TC 房から延びる細根質量に対応します。消化器内視鏡で集められた人間の生検サンプルの TCs を調べるこのプロトコルを使用することができます。また、TCs では寄生虫感染マウスで蓄積する報告された最近、このプロトコルが人間の腸内寄生虫感染症の診断のためのアプリケーションを持っていることを示唆しています。

空腸のゼラチン充填
ゼラチン充填 (図 1 b) の利点は、ゼラチン充填マウス腸の典型的な手順 (図 1 a) を示します。簡単に言えば、18 ゲージ ストレート針の斜めのヒントは、ピアスの腸の壁 (図 1 a1) に対して保護するために削除されました。ゼラチン充填を使用して達成された 10% は液体ゼラチン( で充填する前に切り取られた空腸のセクション腸をフラッシュして腸の内腔の表面 (図 1 a2) を修正するための一方の端から挿入中性ホルマリンをバッファリング図 1 a3)。結果のソーセージのような部分 (図 1 a4) が埋め込まれた、冷凍、そして横で区分クライオスタットで 30 μ m の厚さにスライス。ゼラチンの記入がない場合は、空腸のセクションはキンク、後方スイングする絨毛を許可する (図 1 b、左) に傾向があります。ゼラチン充填はセクションの円形のディスクを保持し、(図 1 b、右) 絨毛の直立位置を維持します。画像は、浮遊空腸のセクションの形態を維持する充填ゼラチンによってもたらされるメリットを明確に示します。
腸内房細胞の成功イメージング
pY1798 抗体は、ドットのしみが付くこと、西部にしみが付くこと、パラフィン セクション染色、染色、雪解けに取り付けられた cryosection またはフローティング cryosection1,9を染色を含む変数免疫染色技術を適用できます。このプロトコルでフローティング凍結切片での蛍光染色の tc pY1798 抗体、ファロイジン、TCs1の構造特性を発揮する染色 DAPI を使用してマウスの腸に着目。一般に、TCs 絨毛先端から地下室1約 1 TC/100 上皮細胞の割合で点在しています。代表的な結果表示、pY1798 が再現性をもってスプール形相馬と堅牢な信号結露が TC1 の ' 房' から突出に対応、強く染色内腔側先端の細胞質膜を含む全体の TCs を delineates (図 2 a-2 b)。一方、ファロイジン ファロトキシン、タマゴテングタケ、キノコから有毒な二環式 heptapeptides の家族あり、アクチン フィラメント (アクチン)、親和性の高い腸刷子縁を形成する絨毛の存在であります。11. ファロイジン 1 x 108 と目立つようにマーク、肥厚した刷子縁房1から伸びる根の質量に対応します。したがって、pY1798 信号 (スプール形相馬、内腔側先端に信号凝縮) 目立つように厚くファロイジン正刷子縁との一貫性のある共局在を示しますこのプロトコルが正常に関係なく、TCs を識別彼らが絨毛で(2 a を図)または(図 2 b)地下室にあるかどうか。
低温抗原検索は浮遊セクションを汚すための効果的です
95-99 ° C で熱による抗原検索はパラフィン切片、凍結切片スライド マウントの分析に広く使用されます。しかし、このようなセクションがスライド12でサポートされているスライド マウントのセクションよりもより一般的に壊れやすいために、ダメージを与えず浮遊セクションにこのアプローチを適用することは難しい。低温抗原検索 (3 h の 50 ° C) から水のお風呂を使用して影響を及ぼさない形態ブラインドの抗原検索の客観的効果を行った予備実験で浮遊空腸のセクションのテストと統計学的に低温の抗原検索(図 3)の有効性を確認しました。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57475/57475fig1.jpg"> 凍結切片の形態学的保全のため空腸部図 1: ゼラチン充填 ゼラチンでマウス腸腔内充填の手順の写真を(A) 。(A1)18 ゲージ ストレート針の斜めのヒントは、腸壁の穿孔を避けるために削除されました。(A2)中性緩衝ホルマリン溶液 (10%) は、腸の内容物をフラッシュおよび腸の内腔表面を修正するクリップされた空腸の一方の端に注入しました。(A3)切り取られた空腸は液体ゼラチンと 6-0 ナイロン縫合糸(黒矢印)を使用して結紮両端でいっぱい。(A4)4 つの縫合ノット(白い矢印)既存の縫合糸の結び目(黒矢印)の間に配置をもたらした 3 つの短い小品。組織は、2 つの示された位置(白い矢印)でソーセージのような 3枚に分けるでしょう。(B)ゼラチン充填のフローティング cryosection 形態に有益な効果。ゼラチン充填なしセクションがちキンク、下位(左); 簡単にスイングする絨毛を許可します。ゼラチン充填、30 μ m 厚いセクション ディスク形状の維持し、腸絨毛の直立位置は保存状態(右)。画像は、ノマルスキー微分干渉コントラストを使用して撮影されました。スケール バー、1 mm.<a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57475/57475fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57475/57475fig2.jpg"> 図 2: マウス腸内の代表的な蛍光画像房細胞 TCs 絨毛(A)や地下室の共焦点の蛍光画像(B)、フローティング マウス腸のセクションで部位特異的に染色し、1798 (チロシンのリン酸化 girdin に対するリン酸化状態特異的抗体pY1798、緑、最適な励起/蛍光波長 490/525 nm)、ファロイジン (赤、590/617 nm), 4, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI、青、358/461 nm)。低倍率の画像 (50 μ m スケール バー) に白いボックスによって囲まれた領域 (尺度バー、10 μ m) 右上で展開されました。pY1798 抗体再現性をもって染色内腔側先端 (矢印)、膜、およびスプール形 TC 相馬の細胞質に存在 ( (A), 絨毛またはクリプト(B)) の場所に関係なく、TCs を染色します。ファロイジン染色 (矢印) で目立つように肥厚したブラシの境界線は TCs の別の独特の記号<a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57475/57475fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57475/57475fig3.jpg"> 図 3: 低温抗原検索を強化 pY1798 蛍光抗体法 実験プロシージャの 2 つのグループは、低温抗原検索の有効性を確認するために比較しました。浮遊空腸のセクション (30 μ m 厚い、n = 13) から単一の冷凍ブロックは 2 つのグループに分け、各グループからのセクションは、完全なプロトコルに従う染色されたや同じプロトコルが欠けている低温の抗原検索 (ステップ 4.2.2)。染色後のセクションは、グループ番号が付いた個々 のスライドに搭載されていた、マスキング テープで覆われていた各スライドにラベルします。すべてのスライドがシャッフル、テープ上の新しい番号でラベル付け、FITC フィルターを蛍光顕微鏡下で観察されました。表示の pY1798 肯定的な TCs の合計数の平均と各グループの棒グラフ (平均 ± 標準偏差) で表示されていた。2 つのグループの間の平均のカウントを比較する両側 t 検定を行った。0.05 以下の P 値が統計的に有意と考えられました。低温抗原検索は、pY1798 蛍光抗体法の有効性を大幅改善。<a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57475/57475fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。

Watch this Scientific Journal Video about Use of Anti-phospho-girdin Antibodies to Visualize Intestinal Tuft Cells in Free-Floating Mouse Jejunum Cryosections at JoVE.com

Use of Anti-phospho-girdin Antibodies to Visualize Intestinal Tuft Cells in Free-Floating Mouse Jejunum Cryosections

フローティング マウス腸凍結切片で腸内房細胞を可視化する抗リン girdin 抗体の使用

久我らはリン酸化状態アクチン結合タンパク質 girdin チロシン 1798 (pY1798) のリン酸化などに対する特異抗体できる房細胞 (TCs) をラベルに使用することを発見しました。このプロトコルは、pY1798 抗体を用いた浮遊空腸凍結切片の免疫蛍光染色を使用して Tc の堅牢な可視化できます。

The actin binding protein girdin is a cytosolic protein that is required for actin remodeling to trigger cell migration in various tissues. Girdin is ...

use-anti-phospho-girdin-antibodies-to-visualize-intestinal-tuft-cells

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

11.3K ビュー.  Aichi Human Service Center. 久我らはリン酸化状態アクチン結合タンパク質 girdin チロシン 1798 (pY1798) のリン酸化などに対する特異抗体できる房細胞 (TCs) をラベルに使用することを発見しました。このプロトコルは、pY1798 抗体を用いた浮遊空腸凍結切片の免疫蛍光染色を使用して Tc の堅牢な可視化できます。

ビデオ: Use of Anti-phospho-girdin Antibodies to Visualize Intestinal Tuft Cells in Free-Floating Mouse Jejunum Cryosections

Catheterization of Intestinal Loops in Ruminants

The intestine is a complex structure that is involved not only in absorption of nutrients, but also acts as a barrier between the individual and the outside world. As such, the intestine plays a pivotal role in immunosurveillance and protection from enteric pathogens. Investigating intestinal physiology and immunology commonly employs 'intestinal loops' as an experimental model. The majority of these loop models are non-recovery surgical procedures that study short-term (&lt;24 hr) changes in the intestine (1-3). We previously created a recovery intestinal loop model to specifically measure long-term (&lt;6 mo) immunological changes in the intestine of sheep following exposure to vaccines, adjuvants, and viruses (4). This procedure localized treatments to a specific 'loop', allowing us to sample this area of the intestine. A significant drawback of this method is the single window of opportunity to administer treatments (i.e. at the time of surgery). Furthermore, samples of both the intestinal mucosa and luminal contents can only be taken at the termination of the project. Other salient limitations of the above model are that the surgical manipulation and requisite post-operative measures (e.g. administration of antibiotics and analgesics) can directly affect the treatment itself and/or alter immune function, thereby confounding results. Therefore, we modified our intestinal loop model by inserting long-term catheters into the loops. Sheep recover fully from the procedure, and are unaffected by the exteriorized catheters. Notably, the establishment of catheters in loops allows us to introduce multiple treatments over an extended interval, following recovery from surgery and clearance of drugs administered during surgery and the post-operative period.

We describe a novel surgical method for catheterizing 'intestinal loops' within the ileum of sheep. Once animals have recovered from surgery and have cleared antibiotics and analgesics, multiple treatments can be deposited directly in loops via the catheters.

反芻動物の腸ループのカテーテル

The intestine is a complex structure that is involved not only in absorption of nutrients, but also acts as a barrier between the individual and the ...

生物学

A Technique to Simultaneously Visualize Virus-Specific CD8+ T Cells and Virus-Infected Cells In situ

The numbers and locations of virus-specific CD8+ T cells relative to the numbers and locations of their infected cell targets is thought to be critical in determining outcomes that range from clearance to chronic persistent infections. We describe here a method for assessing the spatial and quantitative relationships between immune effector (E) virus-specific CD8+ T cells and infected targets (T) that combines in situ tetramer (IST) staining to detect virus-specific CD8+ T cells and in situ hybridization (ISH) to detect viral-RNA+ cells in the tissues where the battle between immune defenses and infection takes place. The combination of IST staining and ISH, abbreviated ISTH, enables visualization and mapping of the locations of immune effector cells and targets, and facile determination of E:T ratios.  These parameters in turn can then be used to determine the relationships between spatial proximity, and the timing and magnitude of the immune response that predict outcomes in early infection.

A Technique to Simultaneously Visualize Virus-Specific CD8+ T Cells and Virus-Infected Cells In situ

A technique combining in situ tetramer staining and in situ hybridization (ISTH) enables visualization, mapping and analysis of the spatial proximity of virus-specific CD8+ T cells to their virus-infected targets, and determination of the quantitative relationships between these immune effectors and targets to infection outcomes.

同時にウイルス特異的CD8 + T細胞やウイルス感染細胞を可視化するテクニックその場で</em

The numbers and locations of virus-specific CD8+ T cells relative to the numbers and locations of their infected cell targets is thought to be critical in ...

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

Human cancer and response to therapy is better represented in orthotopic animal models. This paper describes the development of an orthotopic mouse model of ovarian cancer, treatment of cancer via oral delivery of drugs, and monitoring of tumor cell behavior in response to drug treatment in real time using in vivo imaging system. In this orthotopic model, ovarian tumor cells expressing luciferase are applied topically by injecting them directly into the mouse bursa where each ovary is enclosed. Upon injection of D-luciferin, a substrate of firefly luciferase, luciferase-expressing cells generate bioluminescence signals. This signal is detected by the in vivo imaging system and allows for a non-invasive means of monitoring tumor growth, distribution, and regression in individual animals. Drug administration via oral gavage allows for a maximum dosing volume of 10 mL/kg body weight to be delivered directly to the stomach and closely resembles delivery of drugs in clinical treatments. Therefore, techniques described here, development of an orthotopic mouse model of ovarian cancer, oral delivery of drugs, and in vivo imaging, are useful for better understanding of human ovarian cancer and treatment and will improve targeting this disease.

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

Orthotopic animal models of ovarian cancer replicate better human disease and therefore enhance our understanding of cancer progression and tumor response to therapy. A mouse model receives an intrabursal injection of luciferase-expressing ovarian tumor cells. Treatment is administered via oral gavage. Tumor growth is monitored by in vivo imaging system.

生体イメージングおよび卵巣癌の同所性マウスモデルにおける治療的処置の

Human cancer and response to therapy is better represented in orthotopic animal models.  This paper describes the development of an orthotopic mouse model ...

Analysis of Pluripotent Stem Cells by using Cryosections of Embryoid Bodies

Embryonic stem (ES) cells are pluripotent cells derived from the inner cell mass of blastocyst-stage early mammalian embryos 1. A crucial stage in the differentiation of ES cells is the formation of embryoid bodies (EBs) aggregates 2, 3. EB formation is based on spontaneous aggregation when ES cells are cultured in non adherent plates. Three-dimensional EB recapitulates many aspects of early mammalian embryogenesis and differentiate into the three germ layers: ectoderm, mesoderm and endoderm 4.
Immunofluorescence and in situ hybridization are widely used techniques for the detection of target proteins and mRNA present in cells of a tissue section 5, 6, 7. Here we present a simple technique to generate high quality cryosections of embryoid bodies. This approach relies on the spatial orientation of EB embedding in OCT followed by the cryosection technique. The resulting sections can be subjected to a wide variety of analytical procedures in order to characterize populations of cells containing certain proteins, RNA or DNA. In this sense, the preparation of EB cryosections (10&mu;m) are essential tools for histology staining analysis (e.g. Hematoxilin and Eosin, DAPI), immunofluorescence (e.g. Oct4, nestin) or in situ hybridization. This technique can also help to understand aspects of embryogenesis with regards to the maintenance of the tri-dimensional spherical structure of EBs.

Pluripotent stem cells growing in suspension differentiate into embryoid bodies (EBs). Here we demonstrate how to obtain high quality EB cryosections useful for studying cellular and molecular aspects of embryogenesis, while preserving their organization as aggregates.

胚様体の凍結切片を使用して、多能性幹細胞の解析

Embryonic stem (ES) cells are pluripotent cells derived from the inner cell mass of blastocyst-stage early mammalian embryos 1. A crucial stage in the ...

Generation of Mice Derived from Induced Pluripotent Stem Cells

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also produce a source of patient-matched cells for regenerative therapies. iPSCs may be generated using multiple protocols and derived from multiple cell sources. Once generated, iPSCs are tested using a variety of assays including immunostaining for pluripotency markers, generation of three germ layers in embryoid bodies and teratomas, comparisons of gene expression with embryonic stem cells (ESCs) and production of chimeric mice with or without germline contribution2. Importantly, iPSC lines that pass these tests still vary in their capacity to produce different differentiated cell types2. This has made it difficult to establish which iPSC derivation protocols, donor cell sources or selection methods are most useful for different applications.
The most stringent test of whether a stem cell line has sufficient developmental potential to generate all tissues required for survival of an organism (termed full pluripotency) is tetraploid embryo complementation (TEC)3-5. Technically, TEC involves electrofusion of two-cell embryos to generate tetraploid (4n) one-cell embryos that can be cultured in vitro to the blastocyst stage6. Diploid (2n) pluripotent stem cells (e.g. ESCs or iPSCs) are then injected into the blastocoel cavity of the tetraploid blastocyst and transferred to a recipient female for gestation (see Figure 1). The tetraploid component of the complemented embryo contributes almost exclusively to the extraembryonic tissues (placenta, yolk sac), whereas the diploid cells constitute the embryo proper, resulting in a fetus derived entirely from the injected stem cell line.
Recently, we reported the derivation of iPSC lines that reproducibly generate adult mice via TEC1. These iPSC lines give rise to viable pups with efficiencies of 5-13%, which is comparable to ESCs3,4,7 and higher than that reported for most other iPSC lines8-12. These reports show that direct reprogramming can produce fully pluripotent iPSCs that match ESCs in their developmental potential and efficiency of generating pups in TEC tests. At present, it is not clear what distinguishes between fully pluripotent iPSCs and less potent lines13-15. Nor is it clear which reprogramming methods will produce these lines with the highest efficiency. Here we describe one method that produces fully pluripotent iPSCs and "all- iPSC" mice, which may be helpful for investigators wishing to compare the pluripotency of iPSC lines or establish the equivalence of different reprogramming methods.

Generating induced pluripotent stem cell (iPSC) lines produces lines of differing developmental potential even when they pass standard tests for pluripotency. Here we describe a protocol to produce mice derived entirely from iPSCs, which defines the iPSC lines as possessing full pluripotency1.

人工多能性幹細胞に由来するマウスの作製

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also ...

Use of LysoTracker to Detect Programmed Cell Death in Embryos and Differentiating Embryonic Stem Cells

Programmed cell death (PCD) occurs in adults to maintain normal tissue homeostasis and during embryological development to shape tissues and organs1,2,6,7. During development, toxic chemicals or genetic alterations can cause an increase in PCD or change PCD patterns resulting in developmental abnormalities and birth defects3-5. To understand the etiology of these defects, the study of embryos can be complemented with in vitro assays that use differentiating embryonic stem (ES) cells.
Apoptosis is a well-studied form of PCD that involves both intrinsic and extrinsic signaling to activate the caspase enzyme cascade. Characteristic cell changes include membrane blebbing, nuclear shrinking, and DNA fragmentation. Other forms of PCD do not involve caspase activation and may be the end-result of prolonged autophagy. Regardless of the PCD pathway, dying cells need to be removed. In adults, the immune cells perform this function, while in embryos, where the immune system has not yet developed, removal occurs by an alternative mechanism. This mechanism involves neighboring cells (called "non-professional phagocytes") taking on a phagocytic role-they recognize the 'eat me' signal on the surface of the dying cell and engulf it8-10. After engulfment, the debris is brought to the lysosome for degradation. Thus regardless of PCD mechanism, an increase in lysosomal activity can be correlated with increased cell death.
To study PCD, a simple assay to visualize lysosomes in thick tissues and multilayer differentiating cultures can be useful. LysoTracker dye is a highly soluble small molecule that is retained in acidic subcellular compartments such as the lysosome11-13. The dye is taken up by diffusion and through the circulation. Since penetration is not a hindrance, visualization of PCD in thick tissues and multi-layer cultures is possible12,13. In contrast, TUNEL (Terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling) analysis14, is limited to small samples, histological sections, and monolayer cultures because the procedure requires the entry/permeability of a terminal transferase.
In contrast to Aniline blue, which diffuses and is dissolved by solvents, LysoTracker Red DND-99 is fixable, bright, and stable. Staining can be visualized with standard fluorescent or confocal microscopy in whole-mount or section using aqueous or solvent-based mounting media12,13. Here we describe protocols using this dye to look at PCD in normal and sonic hedgehog null mouse embryos. In addition, we demonstrate analysis of PCD in differentiating ES cell cultures and present a simple quantification method. In summary, LysoTracker staining can be a great complement to other methods of detecting PCD.

We present a simple protocol to visualize regions of programmed cell death (PCD) in mouse embryos and differentiating embryonic stem (ES) cell cultures using a highly soluble dye called LysoTracker.

胚におけるプログラム細胞死を検出するためのLysoTrackerの使用は、胚性幹細胞を分化

Programmed cell death (PCD) occurs in adults to maintain normal tissue homeostasis and during embryological development to shape tissues and ...

Use of Time Lapse Microscopy to Visualize Anoxia-induced Suspended Animation in C. elegans Embryos

Caenorhabdits elegans has been used extensively in the study of stress resistance, which is facilitated by the transparency of the adult and embryo stages as well as by the availability of genetic mutants and transgenic strains expressing a myriad of fusion proteins1-4. In addition, dynamic processes such as cell division can be viewed using fluorescently labeled reporter proteins. The study of mitosis can be facilitated through the use of time-lapse experiments in various systems including intact organisms; thus the early C. elegans embryo is well suited for this study. Presented here is a technique by which in vivo imaging of sub-cellular structures in response to anoxic (99.999% N2; &lt;2 ppm O2) stress is possible using a simple gas flow through setup on a high-powered microscope. A microincubation chamber is used in conjunction with nitrogen gas flow through and a spinning disc confocal microscope to create a controlled environment in which animals can be imaged in vivo. Using GFP-tagged gamma tubulin and histone, the dynamics and arrest of cell division can be monitored before, during and after exposure to an oxygen-deprived environment. The results of this technique are high resolution, detailed videos and images of cellular structures within blastomeres of embryos exposed to oxygen deprivation.

Use of Time Lapse Microscopy to Visualize Anoxia-induced Suspended Animation in C. elegans Embryos

Described here is an in vivo technique to image sub-cellular structures in animals exposed to anoxia using a gas flow through microincubation chamber in conjunction with a spinning disc confocal microscope. This method is straightforward and flexible enough to suit a variety of experimental parameters and model systems.

における酸素欠乏によって誘導された仮死状態を可視化するために時間の経過顕微​​鏡の使用<em&gt; Cエレガンス</em&gt;胚

Caenorhabdits elegans has been used extensively in the study of stress resistance, which is facilitated by the transparency of the adult and embryo stages ...

Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition

Epithelial to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during development. Misregulation of this process has been implicated as a key event in fibrosis and the progression of carcinomas to a metastatic state. Understanding the processes that underlie EMT is imperative for the early diagnosis and clinical control of these disease states. Reliable induction of EMT in vitro is a useful tool for drug discovery as well as to identify common gene expression signatures for diagnostic purposes. Here we demonstrate a straightforward method for the induction of EMT in a variety of cell types. Methods for the analysis of cells pre- and post-EMT induction by immunocytochemistry are also included. Additionally, we demonstrate the effectiveness of this method through antibody-based array analysis and migration/invasion assays.

A straightforward method is described for the induction of epithelial to mesenchymal transition (EMT) in a variety of cell types. Methods for the analysis of cells in EMT states by immunocytochemistry are included.

間葉転換を誘導し、上皮の分析

Epithelial  to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during  development. Misregulation of this  process has been implicated ...

Nephrotoxin Microinjection in Zebrafish to Model Acute Kidney Injury

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid decline in renal function and development of the clinical syndrome known as acute kidney injury (AKI). Pharmacological agents used to treat medical circumstances ranging from bacterial infection to cancer, when administered individually or in combination with other drugs, can initiate AKI. Zebrafish are a useful animal model to study the chemical effects on renal function in vivo, as they form an embryonic kidney comprised of nephron functional units that are conserved with higher vertebrates, including humans. Further, zebrafish can be utilized to perform genetic and chemical screens, which provide opportunities to elucidate the cellular and molecular facets of AKI and develop therapeutic strategies such as the identification of nephroprotective molecules. Here, we demonstrate how microinjection into the zebrafish embryo can be utilized as a paradigm for nephrotoxin studies.

Renal injuries incurred from nephrotoxins, which include drugs ranging from antibiotics to chemotherapeutics, can result in complex disorders whose pathogenesis remains incompletely understood. This protocol demonstrates how zebrafish can be used for disease modeling of these conditions, which can be applied to the identification of renoprotective measures.

ゼブラフィッシュにおける腎毒素マイクロインジェクションは急性腎障害をモデルに

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid ...

A Graphical User Interface for Software-assisted Tracking of Protein Concentration in Dynamic Cellular Protrusions

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex signaling mechanisms underlying filopodial initiation, elongation and subsequent stabilization or retraction, it is crucial to determine the spatio-temporal protein activity in these dynamic structures. To analyze protein function in filopodia, we recently developed a semi-automated tracking algorithm that adapts to filopodial shape-changes, thus allowing parallel analysis of protrusion dynamics and relative protein concentration along the whole filopodial length. Here, we present a detailed step-by-step protocol for optimized cell handling, image acquisition and software analysis. We further provide instructions for the use of optional features during image analysis and data representation, as well as troubleshooting guidelines for all critical steps along the way. Finally, we also include a comparison of the described image analysis software with other programs available for filopodia quantification. Together, the presented protocol provides a framework for accurate analysis of protein dynamics in filopodial protrusions using image analysis software.

We present a software solution for semi-automated tracking of relative protein concentration along the length of dynamic cellular protrusions.

動的細胞突起におけるソフトウェア支援トラッキングのためのグラフィカルユーザインタフェース

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex ...

フローティングマウス腸凍結切片で腸内房細胞を可視化する抗リン girdin 抗体の使用

要約

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この動画の章

反芻動物の腸ループのカテーテル

同時にウイルス特異的CD8 + T細胞やウイルス感染細胞を可視化するテクニックその場で

生体イメージングおよび卵巣癌の同所性マウスモデルにおける治療的処置の

胚様体の凍結切片を使用して、多能性幹細胞の解析

人工多能性幹細胞に由来するマウスの作製

胚におけるプログラム細胞死を検出するためのLysoTrackerの使用は、胚性幹細胞を分化

における酸素欠乏によって誘導された仮死状態を可視化するために時間の経過顕微鏡の使用

間葉転換を誘導し、上皮の分析

ゼブラフィッシュにおける腎毒素マイクロインジェクションは急性腎障害をモデルに

動的細胞突起におけるソフトウェア支援トラッキングのためのグラフィカルユーザインタフェース

フローティング マウス腸凍結切片で腸内房細胞を可視化する抗リン girdin 抗体の使用

要約

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反芻動物の腸ループのカテーテル

同時にウイルス特異的CD8 + T細胞やウイルス感染細胞を可視化するテクニックその場で

生体イメージングおよび卵巣癌の同所性マウスモデルにおける治療的処置の

胚様体の凍結切片を使用して、多能性幹細胞の解析

人工多能性幹細胞に由来するマウスの作製

胚におけるプログラム細胞死を検出するためのLysoTrackerの使用は、胚性幹細胞を分化

における酸素欠乏によって誘導された仮死状態を可視化するために時間の経過顕微​​鏡の使用

間葉転換を誘導し、上皮の分析

ゼブラフィッシュにおける腎毒素マイクロインジェクションは急性腎障害をモデルに

動的細胞突起におけるソフトウェア支援トラッキングのためのグラフィカルユーザインタフェース

フローティングマウス腸凍結切片で腸内房細胞を可視化する抗リン girdin 抗体の使用

における酸素欠乏によって誘導された仮死状態を可視化するために時間の経過顕微鏡の使用