本作品は、国立衛生研究所 HD043680、MH106392、DA013137、および NS100624 の健康 (NIH) の補助金によって支えられました。部分的な基金は、医用生体行動科学 NIH T32 のトレーニングの許可によって提供されました。

実験プロトコルは、動物のケアおよび使用委員会 (IACUC)、サウスカロライナ州の大学によって承認された (連邦保証番号: A3049-01)。
1. 新鮮な冷凍脳セクションの準備
<ol><li>N/F344 ラット系統を使用: 各性のラット 3 匹 13 ヵ月齢、本体重量約 320 g。</li>
	<li>5% (セボフルランの過剰摂取) のセボフルラン濃度を調整します。呼吸停止の追加分、後セボフルラン投与を続行します。</li>
	<li>ネズミの首をはねるし、脳を削除します。</li>
	<li>水没 15 液体窒素でラット脳組織収穫の 5 分以内で s。</li>
	<li>1 h 用クライオスタットの-20 ° C と脳を平衡します。</li>
	<li>30 μ m のセクションをカットし、スライド (材料の表を参照してください) に転送します。</li>
	<li>核側坐地域、約 2.76 mm ~ 前14前方 2.28 mm からセクションを選択します。</li>
	<li>継続的にラットの脳定位固定脳の構造によると核側坐地域の嗅球からラット脳をスライスします。</li>
	<li>スライドにサンプルをマウントします。セクションを保つため、-20 ° c で 10 分間乾燥します。</li>
	<li>4 ° C で 1 時間前に冷蔵 4% のパラホルムアルデヒドのスライドをすぐに没頭します。</li>
	<li>室温 (RT) で増加するエタノール勾配にスライドを配置: 50% エタノールに 5 分。70% エタノールに 5 分。100% エタノールに 5 分。</li>
	<li>新鮮な 100% リピート江藤。</li>
	<li>吸水紙の上のスライドを配置し、空気が乾燥。</li>
	<li>バリア ペンで各セクションに障壁を描画 (材料の表を参照してください)。1 分間完全に乾燥バリアができます。</li>
</ol>2. 脳の前処理
<ol><li>オーブンをオンにし、温度を 40 ° C に設定</li>
	<li>4 前処理試薬 3 滴 (90 μ L) を追加 (材料表参照) 各脳セクション (スライドごとの 1 つのセクション) に。</li>
	<li>セクション 30 分室温で孵化させなさい</li>
	<li>新鮮な 1 × PBS で RT。 繰り返し 1 分の 1x PBS でスライドが水没します。 注: スライドに 15 分よりも長く 1x PBS で滞在しないでください。</li>
</ol>3. RNA In Situハイブリダイゼーション蛍光多重アッセイ
<ol><li>暖かい水のお風呂で 40 ° C で 10 分間のターゲット プローブと右に冷却してから</li>
	<li>RNA 試薬の場所 (例えば、アンプ 1 4 FL) 室温</li>
	<li>スライド ラックの背面吸水紙と場所でスライドから余分な液体を削除する (テーブルの材料を参照してください)。</li>
	<li>サンプルのスライスに Drd1α プローブ (C1) の 3 滴 (90 μ L) を追加します。40 ° C で 2 時間インキュベートします。</li>
	<li>洗浄バッファー x 新鮮な 1 としたリピートで 2 分間洗浄バッファー x 1 のスライドが水没します。</li>
	<li>スライド ラックの背面吸水紙と場所でスライドから余分な液体を削除する (テーブルの材料を参照してください)。</li>
	<li>サンプルのスライス上アンプ 1 フロリダの 3 滴 (90 μ L) を追加します。40 ° C で 30 分間インキュベートします。</li>
	<li>新鮮な 1wash バッファーを使用したリピートで 2 分間 1 洗浄バッファーのスライドが水没します。</li>
	<li>スライド ラックの背面吸水紙と場所でスライドから余分な液体を削除する (テーブルの材料を参照してください)。</li>
	<li>サンプルのスライスにアンプ 2 fl (90 μ L) を 3 滴を追加します。40 ° C で 15 分間インキュベートします。</li>
	<li>洗浄バッファー x 新鮮な 1 としたリピートで 2 分間洗浄バッファー x 1 のスライドが水没します。</li>
	<li>スライド ラックの背面吸水紙と場所でスライドから余分な液体を削除する (テーブルの材料を参照してください)。</li>
	<li>サンプルのスライス上アンプ 3 FL の 3 滴 (90 μ L) を追加します。40 ° C で 30 分間インキュベートします。</li>
	<li>洗浄バッファー x 新鮮な 1 としたリピートで 2 分間洗浄バッファー x 1 のスライドが水没します。</li>
	<li>スライド ラックの背面吸水紙と場所でスライドから余分な液体を削除する (テーブルの材料を参照してください)。</li>
	<li>アンプ 4-フロリダ-オルト A サンプルのスライス上の 3 滴 (90 μ L) を追加します。40 ° C で 15 分間インキュベートします。</li>
	<li>洗浄バッファー x 新鮮な 1 としたリピートで 2 分間洗浄バッファー x 1 のスライドが水没します。</li>
	<li>スライドから余分な液体を削除する、すぐに取付試薬 2 滴 (材料表参照) 各セクションに。</li>
	<li>22 mm 22 mm coverslip の場所 (材料表参照) 各脳セクションの上。</li>
	<li>乾燥するまで、2-8 ° C で暗闇の中でスライドを保存します。</li>
	<li>共焦点顕微鏡をオンにし、60 X 目的に切り替えます。</li>
	<li>共焦点顕微鏡画像を Z スタックを取得します。共焦点レーザー顕微鏡の詳細手順の補足のビデオを参照してください。</li>
	<li>Drd1α 核側坐領域内のセルのラベルの画像を取得 (励起: 488 nm;放出: 515/30 nm)。 注: セクションが潜伏ステップ間乾く脳をてはいけないです。</li>
</ol>4. データ解析
<ol><li>染色パターンを半定量的に解析:「不連続な点」。<ol>
<li>イメージから個々 のセルを識別するために DAPI 染色として核マーカーを実行します。しかし、まだそれは細胞の核や細胞の不規則な形状の種類を複数持っているので、脳の特定の部分を分析することは困難です。ここでは、2 つの経験豊富な研究者は個別にセル領域を定義する画像から各セルを割り当てます。</li>
		<li>視覚的に特定の基準 (図 1 b) を使用して、セルごとのドット数に基づく代表的な共焦点画像内の各セルをスコアします。</li>
		<li>各カテゴリーの総細胞数を決定し、すべてのティッシュ セクション (図 2 a) の男女別各部門内のセルのパーセントの周波数を表示する相対頻度グラフを作成する細胞数 x100 で割ります別に (図 2 e)。</li>
		<li>個別にすべてティッシュ セクション (図 2 b) と男性と女性のためのセルの累積度数を確認する細胞数 x100 で事前のすべてのカテゴリ内のセルの合計を除算 (図 2 f)。</li>
	</ol>
</li>
	<li>染色パターン (省略可能)「離散ドット」を統計的に分析します。<ol>
<li>自然 (すなわち、最高の電池式 (9) に最下位セル式 (1) から各ランクのカテゴリに該当するセルの数) の序数は、カテゴリカル変数を提供するセルあたりのドットの数を調べてさらに統計解析。</li>
		<li>記述統計量の検査の後、3 つの主なアプローチを使用: マントルピース Haenszel 統計, マン-ホイットニーの U 検定やクラスカル-ウォリス検定。正確な統計的手法に依存なりますが興味、統計的決定ツリー (図 4) の実験の設計と研究の質問は 1 つの分析的なアプローチに関する意思決定に役立つ可能性があります。</li>
	</ol>
</li>
	<li>染色パターンの利益 (率 ROI) の領域の信号強度の定量化:「クラスター」。<ol>
<li>次の式を使用して各画像の信号強度を計算します。 信号強度 = ROI 画像 - (平均背景強度 × 全体のイメージ領域) の合計強度</li>
		<li>セルあたりおおよそ信号式を計算する投資収益率イメージ内のセルの合計数をカウントします。セル/画像の数と同様、信号強度/画像のグループの違いは、信号式/携帯で見られるグループの相違に貢献するかもしれないメカニズムを考慮する興味のある (図 3B-3 D)。</li>
	</ol>
</li>
	<li>染色パターン (省略可能)「クラスター」統計的に分析。<ol>
<li>さらに統計分析の連続的な変数を提供する信号式/セルを調べます。デザインに含まれる独立したサンプルの t 検定、分散分析 (ANOVA)、被験者間要因の数に基づいてなど、2 つのアプローチを使用します。統計的決定ツリー (図 4) は、最も適切な統計方法についての意思決定に役立つ可能性があります。</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Goldman-Rakic, P. S., Castner, S. A., Svensson, T. H., Siever, L. J., Williams, G. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+the+dopamine+D1+receptor+in+schizophrenia:+insights+for+cognitive+dysfunction.">Targeting the dopamine D1 receptor in schizophrenia: insights for cognitive dysfunction.</a> Psychopharmacology (Berl). 174 (1), 3-16 (2004).</li><li>Beaulieu, J. M., Gainetdinov, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+physiology,+signaling,+and+pharmacology+of+dopamine+receptors.">The physiology, signaling, and pharmacology of dopamine receptors.</a> Pharmacol Rev. 63, 182-217 (2011).</li><li>Zahrt, J., Taylor, J. R., Mathew, R. G., Arnsten, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Supranormal+stimulation+of+D1+dopamine+receptors+in+the+rodent+prefrontal+cortex+impairs+spatial+working+memory+performance.">Supranormal stimulation of D1 dopamine receptors in the rodent prefrontal cortex impairs spatial working memory performance.</a> J Neurosci. 17, 8528-8535 (1997).</li><li>Floresco, S. B., Magyar, O., Ghods-Sharifi, S., Vexelman, C., Tse, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+dopamine+receptor+subtypes+in+the+medial+prefrontal+cortex+of+the+rat+regulate+set-shifting.">Multiple dopamine receptor subtypes in the medial prefrontal cortex of the rat regulate set-shifting.</a> Neuropsychopharmacology. 31, 297-309 (2006).</li><li>Arnsten, A. F., Girgis, R. R., Gray, D. L., Mailman, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+dopamine+therapeutics+for+cognitive+deficits+in+schizophrenia.">Novel dopamine therapeutics for cognitive deficits in schizophrenia.</a> Biol Psychiatry. 81, 67-77 (2017).</li><li>Ellenbroek, B. A., Budde, S., Cools, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prepulse+inhibition+and+latent+inhibition:+the+role+of+dopamine+in+the+medial+prefrontal+cortex.">Prepulse inhibition and latent inhibition: the role of dopamine in the medial prefrontal cortex.</a> Neuroscience. 75 (2), 535-542 (1996).</li><li>Parker, K. L., Alberico, S. L., Miller, A. D., Narayanan, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prefrontal+D1+dopamine+signaling+is+necessary+for+temporal+expectation+during+reaction+time+performance.">Prefrontal D1 dopamine signaling is necessary for temporal expectation during reaction time performance.</a> Neuroscience. 255, 246-254 (2013).</li><li>Manduca, A., Servadio, M., Damsteegt, R., Campolongo, P., Vanderschuren, L. J., Trezza, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dopaminergic+Neurotransmission+in+the+Nucleus+Accumbens+Modulates+Social+Play+Behavior+in+Rats.">Dopaminergic Neurotransmission in the Nucleus Accumbens Modulates Social Play Behavior in Rats.</a> Neuropsychopharmacology. 41 (9), 2215-2223 (2016).</li><li>Okubo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decreased+prefrontal+dopamine+D1+receptors+in+schizophrenia+revealed+by+PET.">Decreased prefrontal dopamine D1 receptors in schizophrenia revealed by PET.</a> Nature. 385 (6617), 634-636 (1997).</li><li>Abi-Dargham, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prefrontal+dopamine+D1+receptors+and+working+memory+in+schizophrenia.">Prefrontal dopamine D1 receptors and working memory in schizophrenia.</a> J Neurosci. 22 (9), 3708-3719 (2002).</li><li>Shinohara, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dopamine+D1+receptor+subtype+mediates+acute+stress-induced+dendritic+growth+in+excitatory+neurons+of+the+medial+prefrontal+cortex+and+contributes+to+suppression+of+stress+susceptibility+in+mice.">Dopamine D1 receptor subtype mediates acute stress-induced dendritic growth in excitatory neurons of the medial prefrontal cortex and contributes to suppression of stress susceptibility in mice.</a> Mol Psychiatry. 19, (2017).</li><li>Okubo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decreased+prefrontal+dopamine+D1+receptors+in+schizophrenia+revealed+by+PET.">Decreased prefrontal dopamine D1 receptors in schizophrenia revealed by PET.</a> Nature. 385, 634-636 (1997).</li><li>Wang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNAscope:+a+novel+in+situ+RNA+analysis+platform+for+formalin-fixed,+paraffin-embedded+tissues.">RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues.</a> J Mol Diagn. 14 (1), 22-29 (2012).</li><li>Paxinos, G., Watson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The rat brain in stereotaxic coordinates. , (2014).</li></ol>

宣言する利害の対立がないです。

このプロトコルに交配その場で新鮮凍結脳スライス (NAc) 側坐核における Drd1α 受容体の発現と中脳 (SNR) 地域におけるチロシン水酸化酵素 (番目の) 式を評価するための手法について述べる。我々 はまたさまざまな染色パターンのためのデータ分析方法を提供:「離散ドット」または「クラスター」。
交配分析その場で成功した多重蛍光 RNA のための重要なステップが含まれています。ラットを decapitating 脳を外し 5 分内で液体窒素で脳をフリーズ一度、-20 ° C で 4% パラホルムアルデヒドの固定までの脳のセクションを保ちます。4 前処理のインキュベーションの 30 分後 15 分以上 1x PBS でスライドに滞在しないでください。脳のセクションは増幅ステップ間を乾燥をさせてください。共焦点レーザー顕微鏡は、組織サンプルで示す明確な染色信号の高品質の画像を提供するため非常に便利です。ハイブリダイゼーション オーブンを使用して迅速かつ効率的にサンプルにもたらす 40 ° C
NAc Drd1α 受容体発現の個々 の蛍光信号はシングル「ドット、」それぞれセル内の単一の RNA 転写産物として識別されました。重要なは、「ドット」のサイズには、アッセイ条件の違い、サンプル準備と他の要因よりもむしろ Drd1α RNA 発現レベルが反映されます。同様に、個々 の「ドット」の信号強度は Drd1α RNA 発現量に無関係です。この式を「0 - 9」程度と Drd1α 式の変動を評価することができます、セル当たりのドット数に基づく得点半定量分析としてのダイナミック レンジを検討しました。さらに、セル当たりのドット数の検討は、さらに統計分析のカテゴリカル変数を提供します。
次の記述統計量の検討、我々 のプロトコルは、染色パターンは、さらなる分析の序数変数を提供する「離散点」を示す信号の統計的な分析に 3 つの主要なアプローチをお勧めします。具体的には、ノンパラ メトリック ・ マン-ホイットニーの U 検定、ノンパラ メトリック クラスカル-ウォリス検定、協会のマントルピース Haenszel テストをお勧めします。マン ・ ホイットニーの U 検定やクラスカル-ウォリス検定は、最も適切な 1 つだけを調べる被験者間要因 (例えばセックス)。さらに、協会のマントルピース Haenszel テストは、分布の変化を調べるために適切かもしれない。複雑な統計解析を含む一般化推定方程式または一般化線形混合モデルあります適切な追加の要素が含まれる場合です。推奨事項は、網羅されていません、正確な統計的アプローチは実験的なデザインとリサーチ ・ クエスチョンの関心に依存になります。
ただし、トラン スクリプトのコピー数が非常に高い場合、信号はクラスターとして表示できます。ここでは、TH 式 SNR 領域では, 染色パターンは「クラスター」を示した。TH の高発現マーカーを定量化するには、我々 は画像の輝度平均背景強度の上最小輝度しきい値の設定に基づいており、木の細胞 1 個あたり信号として分析を調整T 検定や分散分析のグループを比較する独立したを使って、SNR の TH を統計的に分析できるよう「クラスター」パターンを染色を示す信号をサンプリングします。
この小説の in situハイブリダイゼーション アッセイの RNA の制限があります。「離散ドット", 染色パターンは、個々 のセルをより正確に定義する方法が含まれます。私たちの研究では、イメージから個々 のセルを識別するために行った DAPI 染色として核マーカーしかし、まだそれは細胞の核や細胞の不規則な形状の複数の種類を持っているので、脳の特定の部分を分析することは困難です。ここでは、2 つの経験豊富な研究者は個別にセル領域を定義する画像から各セルを割り当てます。「クラスター」, 染色パターンは特定のソフトウェアはしきい値またはセルの自動認識をセットアップする選択してください。
したがって、蛍光分析法その場で革新的な RNA では、DA 取り込みと DA 放出の両方に同時に影響を及ぼす、線条体ドパミン DA システムの複雑さの理解の向上のメカニズムを調査することができました。全体的にみて、研究者の恩恵の in situハイブリダイゼーション手法 RNA 出現し、脳障害の進行中にドーパミン作動性マーカーに機能不全の変更を調査するとき。

線条体ドーパミン系機能障害は複数の神経認知症にみられる臨床症状の進行に関与しています。ドーパミン D1 受容体が前頭前皮質 (PFC) と脳の線条体領域に存在し、認知1メモリ、一時的な処理、および機関車の動作2,3を含むに大きく影響,4,5,6,7. 以前の研究は、ドパミン D1 受容体の変化は、注意欠陥多動性障害 (ADHD)8、統合失調症9,の神経認知症状の進行と関連付けられたことを解明10ストレス感受性11。具体的には、統合失調症、陽電子放射断層撮影 (PET) 研究に認知障害や陰性症状11の存在する前頭皮質におけるドパミン D1 受容体の結合能が関連性が高いことが示されました。前頭前皮質のドーパミン D1 受容体による規制で興奮性ニューロンの樹枝状結晶の成長には、ストレス感受性が軽減されます。さらに、内側前頭前皮質 (mPFC) ニューロンの D1 受容体のノックダウンは、社会的敗北ストレス誘発性の社会的回避12を高めることができます。
RNAの in situハイブリダイゼーション新鮮凍結組織サンプルでのセルに単一の RNA 分子を可視化する手法を紹介します。現在の技術では、現在の文献内に存在する方法上の複数の利点を持っています。まず、現在のプロシージャは組織の空間的および形態学的コンテキストを保存し、他のプロシージャは、新鮮なを必要とする、非埋め込まれた組織は、現在の方法と組み合わせることができるように新鮮凍結組織サンプルで行った。ホルマリン固定パラフィン包埋組織における同様の手順は、単一の転写の解像度は、RNAの in situハイブリダイゼーション テクニック13を使用して達成することができます説明しています。単一の転写レベルで RNA の検出は、低コピー数の表現だけでなく、核酸検出の他の方法では達成できない細胞レベルでの遺伝子発現を比較する機会に優れた感度を提供しますポリメラーゼの連鎖反応 (PCR) のテクニック」などさらに、現在のメソッドは、単一のターゲット RNA 転写産物にハイブリダイズと検出信号増幅の分子カスケードを順番にバインドされている、非常に特定の RNA プローブを介して高い信号対雑音比の画像を維持します。システム。最後に、現在の技術によるタンパク質検出などのシステム関連マーカーの 1 つだけのクラスに私たちの調査を制限するのではなく、そのターゲット固有の専用プローブでは、複数の生物学的システムを評価する機会を提供します免疫組織化学的方法。
私たちの研究では、側坐核 (NAc) Drd1α 受容体の発現と中脳 (SNR) でチロシン水酸化酵素 (番目の) 式を評価する男性と女性/N の F344 ラットの交配その場で新規 RNA を使いました。交配その場で革新的な RNA では、DA 取り込みと DA 放出の両方に同時に影響を及ぼす、線条体ドパミン DA システムの複雑さの理解を向上させるメカニズムを調査することができました。新鮮凍結脳をスライスし、さまざまな染色パターンのためのデータ分析方法を提供するため、我々 はプロシージャを記述するここでは、:「離散ドット」または「クラスター」。

<table><tbody><tr><td>HybEZ Oven system</td><td>Advanced Cell Diagnostics&amp;nbsp;</td><td>310010</td><td></td></tr><tr><td>RNAscope Probe - Rn-Drd1a</td><td>Advanced Cell Diagnostics&amp;nbsp;</td><td>317031</td><td>Color channel 1, Green</td></tr><tr><td>RNAscope Probe - Rn-Th-C2</td><td>Advanced Cell Diagnostics&amp;nbsp;</td><td>314651-C2</td><td>Color channel 2, Orange</td></tr><tr><td>RNAscope Fluorescent Multiplex Reagent Kit</td><td>Advanced Cell Diagnostics&amp;nbsp;</td><td>320850</td><td></td></tr><tr><td>ImmEdge Hydrophobic Barrier Pen</td><td>Vector Laboratory</td><td>H-4000</td><td></td></tr><tr><td>SuperFrost Plus Slides</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-154%&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>4% paraformaldehyde</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>158127-500G</td><td></td></tr><tr><td>Sevoflurane</td><td>Merritt Veterinary Supply</td><td>347075</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek vertical 24 slide rack</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9837976</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek staining dish</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC0731403</td><td></td></tr><tr><td>Precision General Purpose Baths</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>TSGP28</td><td></td></tr><tr><td>Pretreatment 4</td><td>Advanced Cell Diagnostics&amp;nbsp;</td><td>320850</td><td>parts of kits</td></tr><tr><td>ProLong Gold anti-fade reagent</td><td>Life Technologies</td><td>P36930</td><td></td></tr><tr><td>Amp 1-FL</td><td>Advanced Cell Diagnostics&amp;nbsp;</td><td>320850</td><td>parts of kits</td></tr><tr><td>Amp 2-FL</td><td>Advanced Cell Diagnostics&amp;nbsp;</td><td>320850</td><td>parts of kits</td></tr><tr><td>Amp 3-FL</td><td>Advanced Cell Diagnostics&amp;nbsp;</td><td>320850</td><td>parts of kits</td></tr><tr><td>Amp 4-FL-Alt A</td><td>Advanced Cell Diagnostics&amp;nbsp;</td><td>320850</td><td>parts of kits</td></tr><tr><td>EZ-C1 software package</td><td>Nikon Instruments</td><td></td><td>version 3.81b</td></tr><tr><td>SAS/STAT Software</td><td>SAS Institute, Inc.,</td><td></td><td>version 9.4</td></tr></tbody></table>

identification of dopamine d1-alpha receptor within rodent nucleus accumbens by an innovative rna in situ detection technology

中枢神経系 D1 α サブタイプ受容体 (Drd1α) は最も豊富なドーパミン (DA) の受容体で、神経の成長・発達の調節に重要な役割を果たしています。しかし、Drd1α 受容体異常行動応答を仲介してワーキング メモリ機能の変調メカニズムはまだ明らかではありません。交配アッセイの in situ新規 RNA を使用すると、現在の研究特定 RNA 発現核側坐 (NAc) エリアに位置し中脳領域 (SNR)、DA 関連回路から受容体とチロシン水酸化酵素 (TH) ドーパミン Drd1αそれぞれ。NAc の Drd1α 式は、「離散ドット」染色パターンを示しています。Drd1α 式で明確な性差が認められました。対照的に、第 5 回は、「クラスター化された」染色パターンを示します。番目の式について雌ラットはオスの動物と相対的にセルごとのより高い信号式を表示されます。紹介した方法は、中枢神経系疾患の進行中にドーパミン システムの機能不全の変化を調査するため小説の in situハイブリダイゼーション手法を提供します。

現在の研究は観察/N の F344 ラット (図 1 a) で NAc のドーパミン D1-アルファ受容体 (Drd1α) における RNA 発現のパターンを汚す「離散ドット」です。個々 の蛍光信号は容易に識別された、セル内の 1 つの RNA 転写産物を表す単一の「ドット」として見ることができます。「離散ドット」染色パターンを表示する、NAc からイメージの半定量分析 (図 1 a図 2 a・ 2 b) を使用して、式のダイナミック レンジを評価しました。各セル「0-9」セルあたりのドットの数に基づいてからの得点だった。この「交配させられた信号」-スコア (H スコア) 法評価できる従って範囲と Drd1α 式の変動個々 セルの間で。
染色パターン「離散ドット」の半定量的な手法は、さらに統計分析 (すなわち、最高 (9) に (1) 最低ランクから細胞あたりのドット数) 自然序数は、カテゴリカル変数を提供します。本研究では 1 つの被験者間因子 (すなわちセックス) の NAc Drd1α 発現に及ぼす影響を調べることに興味があるができました。入れ子になったデータ構造 (すなわち、それぞれの動物の標識の NAc 細胞 Drd1α の 2 つの Z スタック画像を得た) のために、平均カウントの値がカテゴリごとに計算し、統計分析のために使用 (男性: n= 3、女性: n= 3)。マン ・ ホイットニーの U 検定、2 つのグループ (すなわち男性、女性) 1 つの被験者間因子 (すなわちセックス) の違いを明らかに我々 の関心与えられた中間細胞数 (図 2 D) の違いを評価するためにテストを行った。マン ・ ホイットニーの U 検定は、オスの動物の相対的な減少は中央細胞の点数を表示する女性の動物とのセックス [z= 5.8 p≤0.001]、有意な主効果を明らかにしました。図 2 eおよび2 fを示す 2 つのメソッドを使用して各カテゴリ内のセルの周波数: 相対度数、累積度数。メスは、オスの動物に対する低い順序カテゴリの細胞のより高い頻度の分布の大きな変化を表示されます。統計的に明らかにセックスの重要な影響、分布を調べる会マントルピース Haenszel テストを行いました [χ2MH(1) = 67.3、 p≤0.001]。したがって、全体的にみて、結果は、NAc の Drd1α 式で明確な性差をお勧めします。
トラン スクリプトのコピー数が非常に高い場合、信号はクラスターとして表示できます。ここでは、snr のチロシン水酸化酵素の発現 (番目の), 染色パターン (図 3 a) は「クラスター」を示した。この高表現マーカーを定量化するには、最初に 8 つの異なる背景領域から背景の強度を平均しました。目のセル当たり信号として分析だった調整画像の輝度平均背景強度の上最小輝度しきい値を設定した後
1 つの被験者間因子 (すなわちセックス) を調べることで我々 の関心を与え、独立したサンプルの t 検定は、適切な統計的手法です。解析、データのログ変換されました。入れ子になったデータ構造 (すなわち、それぞれの動物の標識 sn 細胞番目の 2 つの Z スタック画像を得た) のために、平均値を算出し、統計分析のために使用 (男性: n= 2、女性: n= 3)。メスは平均信号強度 (図 3 b)、オスの動物に対する合計の TH 式のより高いレベルの挑発的な大幅な増加を表示 (t(3) = 3.3 p0.05)。ただし、重要な性の差は認められなかったどちらかのイメージあたりのセル数 (t(3) 2.0 では、 p= > 0.05;図 3)または信号のセルごとの式の平均 (t(3) 2.0 では、 p= > 0.05;図 3 D)。被験者内要因として 3 つの対策を考慮した混合設計の分散分析はまたセックスの有意な主効果を明らかにした [F (1, 3) = 10.6, p0.05]。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57444/57444fig1.jpg"> 図 1: 染色パターンのセルあたりのドットの数の平均値の半定量的解析の条件:「離散ドット」.A.代表的な共焦点画像 (60 X) の異なるスコアで Drd1α 式 (250% 元のサイズを基準にして尺度を増幅) b.各基準の特定「スコア」カテゴリ。<a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57444/57444fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57444/57444fig2.jpg"> 図 2: N/F344 ラットの側坐核領域のドーパミン D1-アルファ受容体 (Drd1α) の RNA レベル。A.各「スコア」カテゴリの相対度数 %。B.シグモイド用量反応曲線を提供よく説明フィット (r2= 0.99) 95% 信頼区間と (CI; 点線で示される)「スコア」カテゴリごとの累積度数 % にぴったりだった。C.代表的な共焦点画像 (60 X), 染色パターンは「離散ドット」のある男性と女性のラットにおける Drd1α 式の。+雄および雌ラットでセルの平均スコアの代表的なグラフ。誤差範囲 (SEM) の平均の標準誤差の略します。E.雄および雌ラット組織における発現を比較する「スコア」カテゴリごとの相対頻度 %。F.シグモイド用量反応曲線を提供よく説明フィット (r2s = 0.99) 雄および雌ラット間の「スコア」カテゴリごとの累積度数 % 95% 信頼区間とします。<a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57444/57444fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57444/57444fig3.jpg"> 図 3: N/F344 ラットの中脳 (SNR) 地域におけるチロシン水酸化酵素 RNA レベル (TH).A.代表的な共焦点画像 (60 X;励起: 543 nm;放出: 590/50 nm) の雄および雌ラットで、日式の「クラスター」パターンを染色があります。B dセルごとの信号強度の代表的な分析。式の信号/セルは、(背景の上の強度の閾値の設定) を使用してイメージの信号強度を定量化し、画像内のセルの数で割ってから派生することができます。誤差範囲 (SEM) 平均値の標準誤差を表しています。<a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57444/57444fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57444/57444fig4.jpg"> 図 4: 推奨される統計的なツリーを決定します。デシジョン ツリーは、統計的分析は興味のある研究質問に最適を決定するためのガイドラインを示します。ディシジョン ツリーが完全ではない、いくつかのケースで、他の分析は適切かもしれない。<a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57444/57444fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。

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Identification of Dopamine D1-Alpha Receptor Within Rodent Nucleus Accumbens by an Innovative RNA In Situ Detection Technology

検出技術その場で革新的な RNA 側坐齧歯動物の核内ドーパミン D1-アルファ受容体の同定

側坐核ドーパミン D1-アルファ受容体の同定は、中枢神経系疾患の中に D1 受容体の機能不全を明らかにするため重要です。特定の脳領域の RNA 分子を可視化する交配アッセイの in situ新規 RNA を行った。

In the central nervous system, the D1-alpha subtype receptor (Drd1&#945;) is the most abundant dopamine (DA) receptor, which plays a vital role in ...

identification-dopamine-d1-alpha-receptor-within-rodent-nucleus

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Identification of Dopamine D1-Alpha Receptor Within Rodent Nucleus Accumbens by an Innovative RNA In Situ Detection Technology

8.5K ビュー.  University of South Carolina. 側坐核ドーパミン D1-アルファ受容体の同定は、中枢神経系疾患の中に D1 受容体の機能不全を明らかにするため重要です。特定の脳領域の RNA 分子を可視化する交配アッセイの in situ新規 RNA を行った。

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Comprehensive Profiling of Dopamine Regulation in Substantia Nigra and Ventral Tegmental Area

Dopamine is a vigorously studied neurotransmitter in the CNS. Indeed, its involvement in locomotor activity and reward-related behaviour has fostered five decades of inquiry into the molecular deficiencies associated with dopamine regulation. The majority of these inquiries of dopamine regulation in the brain focus upon the molecular basis for its regulation in the terminal field regions of the nigrostriatal and mesoaccumbens pathways; striatum and nucleus accumbens. Furthermore, such studies have concentrated on analysis of dopamine tissue content with normalization to only wet tissue weight. Investigation of the proteins that regulate dopamine, such as tyrosine hydroxylase (TH) protein, TH phosphorylation, dopamine transporter (DAT), and vesicular monoamine transporter 2 (VMAT2) protein often do not include analysis of dopamine tissue content in the same sample. The ability to analyze both dopamine tissue content and its regulating proteins (including post-translational modifications) not only gives inherent power to interpreting the relationship of dopamine with the protein level and function of TH, DAT, or VMAT2, but also extends sample economy. This translates into less cost, and yet produces insights into the molecular regulation of dopamine in virtually any paradigm of the investigators' choice.
We focus the analyses in the midbrain. Although the SN and VTA are typically neglected in most studies of dopamine regulation, these nuclei are easily dissected with practice. A comprehensive readout of dopamine tissue content and TH, DAT, or VMAT2 can be conducted. There is burgeoning literature on the impact of dopamine function in the SN and VTA on behavior, and the impingements of exogenous substances or disease processes therein 1-5. Furthermore, compounds such as growth factors have a profound effect on dopamine and dopamine-regulating proteins, to a comparatively greater extent in the SN or VTA 6-8. Therefore, this methodology is presented for reference to laboratories that want to extend their inquiries on how specific treatments modulate behaviour and dopamine regulation. Here, a multi-step method is presented for the analyses of dopamine tissue content, the protein levels of TH, DAT, or VMAT2, and TH phosphorylation from the substantia nigra and VTA from rodent midbrain. The analysis of TH phosphorylation can yield significant insights into not only how TH activity is regulated, but also the signaling cascades affected in the somatodendritic nuclei in a given paradigm.
We will illustrate the dissection technique to segregate these two nuclei and the sample processing of dissected tissue that produces a profile revealing molecular mechanisms of dopamine regulation in vivo, specific for each nuclei (Figure 1).

Dopamine is distinctly regulated in the midbrain nuclei, which contain the cell bodies and dendrites of the dopamine neurons. Here we describe a dissection and sample-handling approach to maximize results, and thus conclusions and insights, on dopamine regulation in the midbrain nuclei of the substantia nigra (SN) and ventral tegmental area (VTA) in rodents.

黒質や腹側被蓋野のドーパミン規制の包括的なプロファイリング

Dopamine is a vigorously studied neurotransmitter in the CNS. Indeed, its involvement in locomotor activity and reward-related behaviour has fostered five ...

神経科学

Detection of Axonally Localized mRNAs in Brain Sections Using High-Resolution In Situ Hybridization

mRNAs are frequently localized to vertebrate axons and their local translation is required for axon pathfinding or branching during development and for maintenance, repair or neurodegeneration in postdevelopmental periods. High throughput analyses have recently revealed that axons have a more dynamic and complex transcriptome than previously expected. These analysis, however have been mostly done in cultured neurons where axons can be isolated from the somato-dendritic compartments. It is virtually impossible to achieve such isolation in whole tissues in vivo. Thus, in order to verify the recruitment of mRNAs and their functional relevance in a whole animal, transcriptome analyses should ideally be combined with techniques that allow the visualization of mRNAs in situ. Recently, novel ISH technologies that detect RNAs at a single-molecule level have been developed. This is especially important when analyzing the subcellular localization of mRNA, since localized RNAs are typically found at low levels. Here we describe two protocols for the detection of axonally-localized mRNAs using a novel ultrasensitive RNA ISH technology. We have combined RNAscope ISH with axonal counterstain using fluorescence immunohistochemistry or histological dyes to verify the recruitment of Atf4 mRNA to axons in vivo in the mature mouse and human brains.

Detection of Axonally Localized mRNAs in Brain Sections Using High-Resolution In Situ Hybridization

RNA in situ hybridization (ISH) enables the visualization of RNAs in cells and tissues. Here we show how combination of RNAscope ISH with immunohistochemistry or histological dyes can be successfully used to detect mRNAs localized to axons in sections of mouse and human brains.

高解像度を使用した脳切片における軸索のローカライズされたmRNAの検出<em&gt;その場での</em&gt;ハイブリダイゼーション

mRNAs are frequently localized to vertebrate axons and their local translation is required for axon pathfinding or branching during development and for ...

Rapid In Situ Hybridization using Oligonucleotide Probes on Paraformaldehyde-prefixed Brain of Rats with Serotonin Syndrome

3,4-Methylenedioxymethamphetamine (MDMA; ecstasy) toxicity may cause region-specific changes in serotonergic mRNA expression due to acute serotonin (5-hydroxytryptamine; 5-HT) syndrome. This hypothesis can be tested using in situ hybridization to detect the serotonin 5-HT2A receptor gene htr2a. In the past, such procedures, utilizing radioactive riboprobe, were difficult because of the complicated workflow that needs several days to perform and the added difficulty that the technique required the use of fresh frozen tissues maintained in an RNase-free environment. Recently, the development of short oligonucleotide probes has simplified in situ hybridization procedures and allowed the use of paraformaldehyde-prefixed brain sections, which are more widely available in laboratories. Here, we describe a detailed protocol using non-radioactive oligonucleotide probes on the prefixed brain tissues. Hybridization probes used for this study include dapB (a bacterial gene coding for dihydrodipicolinate reductase), ppiB (a housekeeping gene coding for peptidylprolyl isomerase B), and htr2a (a serotonin gene coding for 5-HT2A receptors). This method is relatively simply, cheap, reproducible and requires less than two days to complete.

Rapid In Situ Hybridization using Oligonucleotide Probes on Paraformaldehyde-prefixed Brain of Rats with Serotonin Syndrome

This protocol describes a rapid and simplified in situ hybridization method ideal forparaformaldehyde-prefixed brain, thus reducing the need for prolonged complex steps while using fresh frozen tissues. The method is validated using the identification of the serotonin 5-HT2A receptor gene htr2a in rats.

ラピッド<em&gt;その場で</emセロトニン症候群のラットのパラホルムアルデヒド接頭辞脳にオリゴヌクレオチドプローブを使用して&gt;ハイブリダイゼーション

3,4-Methylenedioxymethamphetamine (MDMA; ecstasy) toxicity may cause region-specific changes in serotonergic mRNA expression due to acute serotonin ...

Reliable Identification of Living Dopaminergic Neurons in Midbrain Cultures Using RNA Sequencing and TH-promoter-driven eGFP Expression

In Parkinson&#39;s Disease (PD) there is widespread neuronal loss throughout the brain with pronounced degeneration of dopaminergic neurons in the SNc, leading to bradykinesia, rigidity, and tremor. The identification of living dopaminergic neurons in primary Ventral Mesencephalic (VM) cultures using a fluorescent marker provides an alternative way to study the selective vulnerability of these neurons without relying on the immunostaining of fixed cells. Here, we isolate, dissociate, and culture mouse VM neurons for 3 weeks. We then identify dopaminergic neurons in the cultures using eGFP fluorescence (driven by a Tyrosine Hydroxylase (TH) promoter). Individual neurons are harvested into microcentrifuge tubes using glass micropipettes. Next, we lyse the harvested cells, and conduct cDNA synthesis and transposon-mediated &#34;tagmentation&#34; to produce single cell RNA-Seq libraries1,2,3,4,5. After passing a quality-control check, single-cell libraries are sequenced and subsequent analysis is carried out to measure gene expression. We report transcriptome results for individual dopaminergic and GABAergic neurons isolated from midbrain cultures. We report that 100% of the live TH-eGFP cells that were harvested and sequenced were dopaminergic neurons. These techniques will have widespread applications in neuroscience and molecular biology.

In Parkinson&#39;s Disease (PD), Substantia Nigra (SNc) dopaminergic neurons degenerate, leading to motor dysfunction. Here we report a protocol for culturing ventral midbrain neurons from a mouse expressing eGFP driven by a Tyrosine Hydroxylase (TH) promoter sequence, harvesting individual fluorescent neurons from the cultures, and measuring their transcriptome using RNA-seq.

RNA配列決定およびTH-プロモーター駆動EGFP発現を使用して中脳培養における生活ドーパミン作動性ニューロンの信頼性の高い同定

In Parkinson&#39;s Disease (PD) there is widespread neuronal loss throughout the brain with pronounced degeneration of dopaminergic neurons in the SNc, ...

3D Particle Tracking for Noninvasive In Vivo Analysis of Synaptic Microtubule Dynamics in Dendrites and Neuromuscular Junctions of Drosophila

Microtubules (MTs) play critical roles in neuronal development, but many questions remain about the molecular mechanisms of their regulation and function. Furthermore, despite progress in understanding postsynaptic MTs, much less is known about the contributions of presynaptic MTs to neuronal morphogenesis. In particular, studies of in vivo MT dynamics in Drosophila sensory dendrites yielded significant insights into polymer-level behavior. However, the technical and analytical challenges associated with live imaging of the fly neuromuscular junction (NMJ) have limited comparable studies of presynaptic MT dynamics. Moreover, while there are many highly effective software strategies for automated analysis of MT dynamics in vitro and ex vivo, in vivo data often necessitate significant operator input or entirely manual analysis due to inherently inferior signal-to-noise ratio in images and complex cellular morphology. &#160;To address this, this study optimized a new software platform for automated and unbiased in vivo particle detection. Multiparametric analysis of live time-lapse confocal images of EB1-GFP labeled MTs was performed in both dendrites and the NMJ of Drosophila larvae and found striking differences in MT behaviors. MT dynamics were furthermore analyzed following knockdown of the MT-associated protein (MAP) dTACC, a key regulator of Drosophila synapse development, and identified statistically significant changes in MT dynamics compared to wild type. These results demonstrate that this novel strategy for the automated multiparametric analysis of both pre- and postsynaptic MT dynamics at the polymer-level significantly reduces human-in-the-loop criteria. The study furthermore shows the utility of this method in detecting distinct MT behaviors upon dTACC-knockdown, indicating a possible future application for functional screens of factors that regulate MT dynamics in vivo. Future applications of this method may also focus on elucidating cell type and/or compartment-specific MT behaviors, and multicolor correlative imaging of EB1-GFP with other cellular and subcellular markers of interest.&#160;

This study presents a noninvasive intravital neuronal imaging strategy combined with a new software strategy to achieve automated, unbiased tracking and analysis of in vivo microtubule (MT) plus-end dynamics in the sensory dendrites and the neuromuscular junctions of Drosophila.

Microtubules (MTs) play critical roles in neuronal development, but many questions remain about the molecular mechanisms of their regulation and function. ...

Semi-Quantitative Determination of Dopaminergic Neuron Density in the Substantia Nigra of Rodent Models using Automated Image Analysis

Estimation of the number of dopaminergic neurons in the substantia nigra is a key method in pre-clinical Parkinson's disease research. Currently, unbiased stereological counting is the standard for quantification of these cells, but it remains a laborious and time-consuming process, which may not be feasible for all projects. Here, we describe the use of an image analysis platform, which can accurately estimate the quantity of labeled cells in a pre-defined region of interest. We describe a step-by-step protocol for this method of analysis in rat brain and demonstrate it can identify a significant reduction in tyrosine hydroxylase positive neurons due to expression of mutant &#945;-synuclein in the substantia nigra. We validated this methodology by comparing with results obtained by unbiased stereology. Taken together, this method provides a time-efficient and accurate process for detecting changes in dopaminergic neuron number, and thus is suitable for efficient determination of the effect of interventions on cell survival.

Here we present an automated method for semi-quantitative determination of dopaminergic neuron number in the rat substantia nigra pars compacta.

自動画像解析を用いたげっ歯類モデルのサブスタチングニグラにおけるドーパミン作動性ニューロン密度の半定量的決定

Estimation of the number of dopaminergic neurons in the substantia nigra is a key method in pre-clinical Parkinson's disease research. Currently, unbiased ...

Enhanced Northern Blot Detection of Small RNA Species in Drosophila Melanogaster

The last decades have witnessed the explosion of scientific interest around gene expression control mechanisms at the RNA level. This branch of molecular biology has been greatly fueled by the discovery of noncoding RNAs as major players in post-transcriptional regulation. Such a revolutionary perspective has been accompanied and triggered by the development of powerful technologies for profiling short RNAs expression, both at the high-throughput level (genome-wide identification) or as single-candidate analysis (steady state accumulation of specific species). Although several state-of-art strategies are currently available for dosing or visualizing such fleeing molecules, Northern Blot assay remains the eligible approach in molecular biology for immediate and accurate evaluation of RNA expression. It represents a first step toward the application of more sophisticated, costly technologies and, in many cases, remains a preferential method to easily gain insights into RNA biology. Here we overview an efficient protocol (Enhanced Northern Blot) for detecting weakly expressed microRNAs (or other small regulatory RNA species) from Drosophila melanogaster whole embryos, manually dissected larval/adult tissues or in vitro cultured cells. A very limited amount of RNA is required and the use of material from flow cytometry-isolated cells can be also envisaged.

Enhanced Northern Blot Detection of Small RNA Species in Drosophila Melanogaster

The aim of this publication is to visualize and discuss the operative steps of an Enhanced Northern Blot protocol on RNA extracted from Drosophila melanogaster embryos, cells, and tissues. This protocol is particularly useful for the efficient detection of small RNA species.

低分子RNA種のノーザンブロット検出における強化<em&gt;キイロショウジョウバエ</em

The last decades have witnessed the explosion of scientific interest around gene expression control mechanisms at the RNA level. This branch of molecular ...

生物学

Detection of G Protein-coupled Receptor Expression in Mouse Vagal Afferent Neurons using Multiplex In Situ Hybridization

This study describes a protocol for the multiplex in situ hybridization (ISH) of the mouse jugular-nodose ganglia, with a particular emphasis on detecting the expression of G protein-coupled receptors (GPCRs). Formalin-fixed jugular-nodose ganglia were processed with the RNAscope technology to simultaneously detect the expression of two representative GPCRs (cholecystokinin and ghrelin receptors) in combination with one marker gene of either nodose (paired-like homeobox 2b, Phox2b) or jugular afferent neurons (PR domain zinc finger protein 12, Prdm12). Labeled ganglia were imaged using confocal microscopy to determine the distribution and expression patterns of the aforementioned transcripts. Briefly, Phox2b afferent neurons were found to abundantly express the cholecystokinin receptor (Cck1r) but not the ghrelin receptor (Ghsr). A small subset of Prdm12 afferent neurons was also found to express Ghsr and/or Cck1r. Potential technical caveats in the design, processing, and interpretation of multiplex ISH are discussed. The approach described in this article may help scientists in generating accurate maps of the transcriptional profiles of vagal afferent neurons.

Detection of G Protein-coupled Receptor Expression in Mouse Vagal Afferent Neurons using Multiplex In Situ Hybridization

Multiplex in situ hybridization (ISH) was employed to simultaneously visualize the transcripts for two G protein-coupled receptors and one transcription factor in the entire vagal ganglionic complex of the adult mouse. This protocol could be used to generate accurate maps of the transcriptional profiles of vagal afferent neurons.

マウスバガル・アファレントニューロンにおけるGタンパク質結合受容体発現 の 検出

This study describes a protocol for the multiplex in situ hybridization (ISH) of the mouse jugular-nodose ganglia, with a particular emphasis on detecting ...

Visualizing and Tracking Endogenous mRNAs in Live Drosophila melanogaster Egg Chambers

Fluorescence-based imaging techniques, in combination with developments in light microscopy, have revolutionized how cell biologists conduct live cell imaging studies. Methods for detecting RNAs have expanded greatly since seminal studies linked site-specific mRNA localization to gene expression regulation. Dynamic mRNA processes can now be visualized via approaches that detect mRNAs, coupled with microscopy set-ups that are fast enough to capture the dynamic range of molecular behavior. The molecular beacon technology is a hybridization-based approach capable of direct detection of endogenous transcripts in living cells. Molecular beacons are hairpin-shaped, internally quenched, single-nucleotide discriminating nucleic acid probes, which fluoresce only upon hybridization to a unique target sequence. When coupled with advanced fluorescence microscopy and high-resolution imaging, they enable one to perform spatial and temporal tracking of intracellular movement of mRNAs. Although this technology is the only method capable of detecting endogenous transcripts, cell biologists have not yet fully embraced this technology due to difficulties in designing such probes for live cell imaging. A new software application, PinMol, allows for enhanced and rapid design of probes best suited to efficiently hybridize to mRNA target regions within a living cell. In addition, high-resolution, real-time image acquisition and current, open source image analysis software allow for a refined data output, leading to a finer evaluation of the complexity underlying the dynamic processes involved in the mRNA&#39;s life cycle.
Here we present a comprehensive protocol for designing and delivering molecular beacons into Drosophila melanogaster egg chambers. Direct and highly specific detection and visualization of endogenous maternal mRNAs is performed via spinning disc confocal microscopy. Imaging data is processed and analyzed using object detection and tracking in Icy software to obtain details about the dynamic movement of mRNAs, which are transported and localized to specialized regions within the oocyte.

Visualizing and Tracking Endogenous mRNAs in Live Drosophila melanogaster Egg Chambers

Here, we present a protocol for the visualization, detection, analysis and tracking of endogenous mRNA trafficking in live Drosophila melanogaster egg chamber using molecular beacons, spinning disc confocal microscopy, and open-source analysis software.

ライブショウジョウバエメラノガスター卵室における内因性mRNAの可視化と追跡

Fluorescence-based imaging techniques, in combination with developments in light microscopy, have revolutionized how cell biologists conduct live cell ...

Monitoring Dopamine Release in a Rat Model with VTA Dopaminergic Neuron Receptor Manipulation

Source: Wickham, R. J., et al. <a href="https://app-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/v/60886">Combined Infusion and Stimulation with Fast-Scan Cyclic Voltammetry (CIS-FSCV) to Assess Ventral Tegmental Area Receptor Regulation of Phasic Dopamine.</a> J. Vis. Exp. (2020).
This video demonstrates the implantation of electrodes and cannulas in an anesthetized rat to measure dopamine release in the nucleus accumbens using a potentiostat and the infusion of drugs to modulate dopaminergic activity in the ventral tegmental area.

VTAドーパミン作動性ニューロン受容体操作によるラットモデルにおけるドーパミン放出のモニタリング

All procedures involving animal models have been reviewed by the local institutional animal care committee and the JoVE veterinary review board.
1. ...

検出技術その場で革新的な RNA 側坐齧歯動物の核内ドーパミン D1-アルファ受容体の同定

要約

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黒質や腹側被蓋野のドーパミン規制の包括的なプロファイリング

高解像度を使用した脳切片における軸索のローカライズされたmRNAの検出

ラピッド

RNA配列決定およびTH-プロモーター駆動EGFP発現を使用して中脳培養における生活ドーパミン作動性ニューロンの信頼性の高い同定

3D Particle Tracking for Noninvasive In Vivo Analysis of Synaptic Microtubule Dynamics in Dendrites and Neuromuscular Junctions of Drosophila

自動画像解析を用いたげっ歯類モデルのサブスタチングニグラにおけるドーパミン作動性ニューロン密度の半定量的決定

低分子RNA種のノーザンブロット検出における強化

マウスバガル・アファレントニューロンにおけるGタンパク質結合受容体発現の検出

ライブショウジョウバエメラノガスター卵室における内因性mRNAの可視化と追跡

VTAドーパミン作動性ニューロン受容体操作によるラットモデルにおけるドーパミン放出のモニタリング

検出技術その場で革新的な RNA 側坐齧歯動物の核内ドーパミン D1-アルファ受容体の同定

要約

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黒質や腹側被蓋野のドーパミン規制の包括的なプロファイリング

高解像度を使用した脳切片における軸索のローカライズされたmRNAの検出

ラピッド

RNA配列決定およびTH-プロモーター駆動EGFP発現を使用して中脳培養における生活ドーパミン作動性ニューロンの信頼性の高い同定

3D Particle Tracking for Noninvasive In Vivo Analysis of Synaptic Microtubule Dynamics in Dendrites and Neuromuscular Junctions of Drosophila

自動画像解析を用いたげっ歯類モデルのサブスタチングニグラにおけるドーパミン作動性ニューロン密度の半定量的決定

低分子RNA種のノーザンブロット検出における強化

マウスバガル・アファレントニューロンにおけるGタンパク質結合受容体発現 の 検出

ライブショウジョウバエメラノガスター卵室における内因性mRNAの可視化と追跡

VTAドーパミン作動性ニューロン受容体操作によるラットモデルにおけるドーパミン放出のモニタリング

マウスバガル・アファレントニューロンにおけるGタンパク質結合受容体発現の検出