この作業は、教育省、文化、スポーツ、科学と技術の日本 (科研費) コンゴ (#15 K 01691) に、マルチメディアモデルシミュレーション (#15 K 08625)、武 (#26461532)、省から難治性疾患プロジェクト研究補助金から研究助成金によって支えられました。健康、労働および福祉 (武 #201510032A)。我々 はエダンズ ・ グループ (www.edanzediting.com/ac) がこの原稿の下書きを編集することをありがちましょう。

使用する前に関連するすべての材料安全データ用紙 (MSDS) を参照してください。皮膚由来の SM によるサンプルの汚染を最小限にするために手袋を着用します。この議定書は 2 mM L10% 牛胎児血清 (FBS) を添加したイーグル最小必須培地で育った HeLa 細胞に適用された-グルタミン、1,000 U/L ペニシリンとストレプトマイシン 100 mg/L。
1. 脂質試料の調製
注:、テフロン ライニングのネジキャップで試験管を含むすべてのガラスは洗剤がないことが重要です。
<ol><li>ブライ ・ ダイアーの方法7を使用して細胞磨砕液からの総脂質の抽出<ol>
<li>文化を削除 (またはエアコン) 10 cm 細胞培養用ディッシュ、6 mL の氷冷 PBS で 2 回リンスからメディア。</li>
		<li>P1000 ピペットで 10 cm の培養皿に 1 mL の氷冷 PBS を追加します。セルスクレーパーで細胞を収穫し、2.0 mL シリコーン プラスチック チューブに収集します。</li>
		<li>遠心分離 (1,000 × g、5 分、4 ° C) 後に、、P1000 ピペットで上澄みを除去します。</li>
		<li>1 mL のメタノールを追加します。渦は簡単にチューブし、200 W 浴型超音波発生装置で 5 分間の超音波。 注: は、細胞ペレットは効率的に均質化されたので浴型超音波発生装置の水位を調整します。</li>
		<li>ピペットで試験管 (13 mm × 100 mm) スクリュー キャップのテフロン ライニングにメタノールで細胞ホモジネートを転送します。</li>
		<li>1 mL のメタノール、1 mL のクロロホルム、ダブル蒸留水 0.8 mL と内部標準 d18:1/(D31) 16 µmol 10/L の 50 μ L を追加: 0 各試験管に SM。</li>
		<li>室温で 5 分間精力的に試験管を渦。 メモ: この時点で単相 (クロロホルム/メタノール/水 = 1/2/0.8 (v/v/v)) が形成されます。</li>
		<li>クロロホルムの 1.0 mL の二重蒸留水 1 mL を追加します。</li>
		<li>室温で 5 分間 2,500 rpm で精力的にボルテックス チューブ。 注: この時点で、水性 (上側) の相と有機 (下側) が分かれています。</li>
		<li>遠心分離 (2,150 × g、5 分、25 ° C) 後を収集し、使い捨てのガラス管 (初期低フェーズ) に下の相を転送します。 注: は、パスツール ピペットと安全ピペット フィルターを用いた低位相を収集します。ピペットの先端を挿入下相、上部段階と、ピペットの先端内部界面の綿毛を提供する 'E' バルブの横に小さな電球を絞る、ピペットに下相を吸い上げます。</li>
		<li>上部段階と界面の綿毛と十分に混合する部屋の温度で 5 分間 2,500 rpm で精力的にテスト チューブと渦にクロロホルムの 2 mL チューブを追加します。</li>
		<li>遠心分離 (2,150 × g、5 分、25 ° C) 後を収集し、1.1.10 の手順に記載されている最初の低い段階で使い捨てのガラス管に変更された下相を転送します。</li>
		<li>窒素気流下におけるガラス管を置き、収集した低い段階で有機溶剤を完全に削除します。</li>
		<li>サンプルの再構成のためのメタノールまたはエタノール 500 μ L、0.02 μ m フィルターでろ過、-20 ° C でガラスの瓶に保存</li>
	</ol>
</li>
	<li>検量線を作成して、メソッドを検証するための試料作製<ol>
<li>0.1、0.5、1、5、10、または 50 µmol/L 標準化合物の 50 μ L を追加 (d18:1/(D9) 18:1 SM) スクリュー キャップのテフロン ライニングが試験管に。</li>
		<li>各試験管に細胞磨砕液を加えて 1 mL にメタノールを追加します。 メモ: マトリックスとしてセルを磨砕液の量は各試験によって異なります。SM 種 10 cm 培養皿の細胞由来サンプルで日常的に分析し、それぞれの試験管内細胞磨砕液の量は 10 cm 培養皿の細胞に近いはずです。</li>
		<li>手順 1.1.6-1.1.14 で説明したように総脂質分画を抽出します。</li>
		<li>手順 1.2.1-1.2.3 で記述としてメソッドを検証するための品質チェック (QC) サンプルを準備します。標準化合物の濃度の異なる 3 つの QC サンプルを準備 (d18:1/(D9) 18:1 SM): 標準曲線 (QC 低、QC L)、1 つの中心近くの下限 × 3 内 1 つ (QC 中間、QC-M)、および 1 つの上部の境界の近く、標準曲線 (QC 高、QC H)。</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. SM-ESI-MS LC/MS による分析
<ol><li>移動相の調製<ol>
<li>溶剤を混ぜる (アセトニ トリル/メタノール/ddH2O 有機相を水相とイソプロパノールの 2/2/1 (v/v/v) を =) でガラスびんスクリュー キャップのテフロン ライニングし、浴型超音波発生装置で 5 分の超音波。</li>
		<li>ギ酸 (最終濃度 26.4 ミリ モル/L) と NH4OH を追加 (14.9 ミリ モル/L) 各移動相に。</li>
	</ol></li>
	<li>LC ESI MS3 SM の質的分析<ol>
<li>高性能液体クロマトグラフィー (高性能液体クロマトグラフィー) システムをアクティブ化、移動相を含むガラス瓶にインレット チューブを入れて、高速液体クロマトグラフィーの行を削除します。C18 HPLC カラム (1.5 mm 内径 × 100 mm 長さ、粒子サイズ 3.0 μ m) を HPLC システムにリンク、カラム オーブンの温度を 50 ° C を維持、100 μ L/分のサンプルを入れ、autosampl でサンプル ラックで溶離液をカラムの条件小胞体。</li>
		<li>トリプル四重極 MS3分析興味の SM 種のイオン最初と 2 番目の前駆体と同様に表 1と表 2に記載されている四重極線形イオン トラップの質量分析システムのパラメーターを設定します。<ol>
<li>データ集録ソフトウェア アイコンをダブルクリック、[ハードウェアの構成] をダブルクリックして、' LC + QTRAP4500 + バルブ ' を選択、プロファイルをアクティブにする」をクリックします。</li>
			<li>新しいサブフォルダーを作成するには、' 新しいサブ プロジェクト ' と 'OK' をクリックします。</li>
			<li>「ファイル」タブをクリックして、'New' し '獲得方式' と 'OK' を選択します。'MS/MS/MS (MS3)' として' 質量仕様 'アイコンと 'MS' タブを選択スキャンの種類をクリックし、スキャン レート分析 (分) に 10,000 Da/s、'負' として極性と全体の時間として' 期間' として。スキャンする範囲として '開始 (Da)' と 'ストップ (Da) のm/zを設定します。対象興味の SM 種の第 1 と第 2 の前駆イオンのm/zを設定します。 注: 複数 SM 種を分析するを強調表示、'-MS3' アイコン、右クリック、「この実験をコピー」を選択しますと 1・2 前駆体のイオン SM の他の種のm/zを入れて。</li>
			<li>'MS' タブを選択し、各パラメーターを次のように設定: 'プロフィール'、0.12 (Da)、解像度 Q1 と Q3 としてステップ サイズとしてスキャン モード 'ユニット'、'明るい'、それぞれ、50 (ms)、1.5 ms としての質量範囲間の一時停止として 0 の設定時間と輝度しきい値を選択' 動的時間を埋める '、8 V、第 3 四半期の参入の障壁と励起時間 25 ms として。</li>
			<li>'MS' タブの 'パラメーターを編集] ボタンをクリックし、選択' ソース/ガス ' タブがカーテン ガス、衝突ガス、ionspray 電圧、温度、イオン ソース gas1 gas2の表 1に記載されているのパラメーターを設定します。その後、選択 '複合'] タブのパラメーターを設定デクラスタ リングの可能性、潜在的な入り口、衝突エネルギー、励起エネルギー、衝突エネルギーを表 2に示すように普及します。</li>
			<li>'統合 Valco バルブ' を強調表示、A として 'ステップ 0 の位置名' を選択し、合計の位置に 'B' を設定時間 5.0 分。また合計の位置として 'A' を設定時間 70.0 分。</li>
			<li>'LC システム' を強調表示します。'ポンプ' タブを選択し、バイナリ フロー、0.28 mL/min と 20.0 MPa 圧力限界の最大値として合計の流れとしてポンプ圧送モードを設定します。'オート' タブを選択し 200 μ L とすすぎのボリュームを設定、針の洗浄速度 35 μ L/s として、サンプリング速度 5.0 μ L/s として 52 mm ストローク、25.0 分として時間をパージ、'前に、と吸引後の 5 秒、すすぎモードとタイムをすすいでください。<ol>
<li>さらに、クーラー ユニットを有効にする、4 ° c のクーラーの温度を設定および制御バイアル針ストローク 52 ミリメートル。 'オーブン' タブを選択して、オーブンを有効にしてオーブンの温度、最高温度を 50 ° C と 85 ° C、それぞれ設定。</li>
				<li>'コント ローラー' タブを選択し、チェック ボックスをオン '電源を入れます'。「時間プログラム」タブを選択し、、溶媒のグラデーションを次のように設定: 溶剤 A 5 分 100/0 の割合で B プログラム 80/20 に線形変更/35/65 の 4 分以上 50 分以上と 25/75 以上 1 分後、25/75, 10 分間し、線形を 100/0 でそれらを保持する 4 分以上。メソッドを保存します。</li>
			</ol>
</li>
		</ol>
</li>
		<li>バッチ ファイルを作成します。<ol>
<li>'ビルド取得バッチ' アイコンをダブルクリックして、「セットを追加」をクリックして「サンプルを追加」、新しいサンプル数を設定し、、'OK' をクリックしますします。</li>
			<li>[メソッド エディター] ボタンをクリックし、使用する方法を選択します。複数のメソッドを 1 つのバッチ ファイルで使用する場合複数のメソッドに使用」のボックスをチェックし、各サンプルの取得メソッドを選択します。'サンプル名' の名前を変更 'バイアル位置' の適切な数を設定し、注入量の量を入れてください。その後、バッチ ファイルを保存します。</li>
		</ol>
</li>
		<li>LC ESI MS3分析によって MS3製品の関心の SM 種のイオン スペクトルを得します。<ol>
<li>バッチ ファイルに 'Submit' タブを選択、分析されるサンプルの行を強調表示 'Submit' ボタンをクリックします。</li>
			<li>クリックして、' ビュー Quene' 'Equilibrate' アイコンを選択手法を使用する、1 分に時間を設定し、'OK' をクリックします。</li>
			<li>対応するアイコンをクリックして 'チューニング予備楽器' を非アクティブ化します。その後、' 開始サンプル ' アイコンをクリックしてバッチ シーケンスを実行します。</li>
		</ol>
</li>
		<li>イオン スペクトル製品の比率 (m/z) を充電する量と、スフィンゴイドの正確な量を比較することにより各 MS3 SM のプロダクト イオン スペクトルを割り当てる LCB とN-興味のアシル部位。数炭素の二重結合、スフィンゴイド LCB とNを決定する-対応する製品イオンによるとアシル部位。<ol>
<li>適切なサブ プロジェクトのフォルダーが選択されていることを確認、' データ ファイルを開く」のアイコンをダブルクリックし、分析するサンプルを選択します。各ターゲット SM 種のクロマト グラムのピークをドラッグして、ダブルクリックをクリックします。ドラッグした領域内で得られた MS3のプロダクト イオンのスペクトルが表示されます。</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>ESI MS/LCMS による SM の定量的解析<ol>
<li>2.1 と 2.2.1 の手順の説明に従って、移動相と HPLC カラムを設定します。</li>
		<li>トリプル四重極四重極線形イオン トラップ質量分析システム監視 (MRM) 分析表 1と表 2に記載されている複数の反作用のためのパラメーターを設定します。<ol>
<li>2.2.2.1 と 2.2.2.2 の手順で説明するように、手順を行います。</li>
			<li>「ファイル」タブをクリックして、'New' し '獲得方式' と 'OK' を選択します。「MRM'、'正' として極性として「固まり Spec' アイコンと 'MS' タブを選択スキャン種類をクリックします。分析する全体の時間として '期間' を設定します。それぞれ、『 Q1 ミサ (Da) 』 と 『 第 3 四半期ミサ (Da) 』 SM 種、興味の対象の [M + H]+のm/zと 184 を設定してください。10 ms とターゲット SM 種の名前として ' ID' '時間' を設定します。</li>
			<li>' MS' タブを選択し、各パラメーターを次のように設定: 解像度第 1 四半期の両方の 'ユニット'、0、輝度しきい値として Q3 0 (ms) として時間の設定と 5 ms としての質量範囲間で一時停止します。</li>
			<li>'MS' タブの 'パラメーターを編集] ボタンをクリックし、カーテン ガス、衝突ガス、ionspray 電圧、温度、イオン ソース gas1 gas2の表 1に記載されているパラメーターを置く' ソース/ガス ' タブを選択します。電位、入り口の可能性、衝突エネルギーと衝突セル出口電位表 2に記載されている・ デクラスタ リングのパラメーターを置く '複合' タブを選択します。</li>
			<li>2.2.2.6 の手順で説明するようにバルブを設定します。</li>
			<li>2.2.2.7 の手順で説明するように、LC 条件を設定します。メソッドを保存します。</li>
		</ol>
</li>
		<li>2.2.3 の手順で説明するよう、バッチ ファイルを作成します。</li>
		<li>ESI MS/LCMS 分析 2.2.4 の手順で説明するように各 SM 種の MRM データを取得します。</li>
		<li>データ統合のためのソフトウェアを使用して MRM データを処理し、各 SM 種抽出したイオン ・ クロマト グラムのピーク面積のデータを取得します。<ol>
<li>定量分析におけるデータ統合ソフトウェア アイコンをダブルクリック、[編集] タブをクリックし、ユーザー統合のデフォルト値を選択します。1.0 ポイントとしてガウス滑らかな幅を設定し、「OK」をクリックします。[編集] タブをクリックし、「新しい結果表」を選択します。統合される、矢印ボタンをクリックして、'Next' をクリックするサンプルを選択します。'新しいメソッドの作成' を選択、メソッドの名前を設定し、「次へ」をクリックして。'Next' をクリックし、d18:1/(D31) 16 のボックスをチェック: 0 ですので、SM 'Next' をクリックして、[完了] をクリックします。</li>
			<li>'ピークのレビューが表示されます' をクリックし、クロマト グラム ピークが適切に認識されることを確認します。注意してください d18:1/(D31) 16 の保持時間: SM は通常小さいによって 0 〜 34 1 SM のものと比較して 0.3 分 (通常は d18:1 の/16:0 SM で構成されています)。</li>
		</ol>
</li>
		<li>D18:1/(D31) 16 各 SM 種のピークの比率に従って各 SM 種を定量化: 0 SM 内部標準。<ol>
<li>「ファイル」タブをクリックして、[エクスポート] を選択、「結果表」を選択、'MultiQuant'、列 'すべて列をエクスポート' としてフォーマットを確認、'それらの明示的に隠された以外のすべての行をエクスポート' と、'OK' をクリック行。</li>
			<li>ソフトウェアを Excel でエクスポートされたファイルを開きます。正規化は地域によるターゲット SM 種地域 (d18:1/(D31) 16:0 SM)。ターゲットに注入されたサンプル SM 種の量を計算する注入されたサンプルでは理論量を乗算します。</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>標準曲線を構築します。<ol>
<li>D18:1/(D9) 18 の MRM データを取得: 1 SM と d18:1/(D31) 16:0 ステップ 2.3.1-2.3.4 に記載されている LC-ESI-タンデム質量分析法による標準曲線を構築するためのサンプルの SM。</li>
		<li>D18:1/(D9) 18 のピーク面積のデータを取得: 1 SM と d18:1/(D31) 16:0 SM 2.3.5 の手順で説明されているようです。</li>
		<li>D18:1/(D9) 18 の量を計算: 1 に記載されている手順 2.3.6 として注入されたサンプルの SM。</li>
		<li>/(D9) 18 の名目額と計算量 d18:1 x 軸と y 軸を設定することにより、近似曲線を構築: 1 SM し、近似曲線の数式を取得します。</li>
	</ol></li>
	<li>Excel のソフトウェアを使用して量的な方法の検証<ol>
<li>D18:1/(D9) 18 の量を定量化手法の検証: 1 SM と d18:1/(D31) 16:0 QC の SM サンプル各 QC を分析することによって 1 日に少なくとも 3 回サンプルし、ステップ 2.3.1-2.3.4 で説明したように少なくとも 3 日間を繰り返します。</li>
		<li>D18:1/(D9) 18 の量を計算してピーク面積データを取得: 1 に記載されているステップ 2.3.5 と 2.3.6 として注入されたサンプルの SM。</li>
		<li>校正曲線から得られる、d18:1/(D9) 18 の量を計算: 1 注入されたサンプルの SM。</li>
		<li>精度の評価<ol>
<li>平均と d18:1/(D9) 18 の量の標準偏差を計算: 1 SM ステップ 2.5.3 内日のデータセットで得られた、間日の Excel ソフトウェアを使用しています。</li>
			<li>2.5.4.1 のステップで得られる平均値は標準偏差で割った値、% として表されます。</li>
		</ol>
</li>
		<li>精度の評価<ol>
<li>各データの正確性を次のように計算します。 [(計算量 2.5.3 の手順で取得します。)/(名目額) - 1] × 100(%)</li>
			<li>日中間の日のデータセットの精度の絶対値の平均を計算します。</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol>
	<li>Huitema, K., van den Dikkenberg, J., Brouwers, J. F., Holthuis, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+family+of+animal+sphingomyelin+synthases.">Identification of a family of animal sphingomyelin synthases.</a> EMBO J. 23 (1), 33-44 (2004).</li><li>Kihara, Y., Mizuno, H., Chun, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lysophospholipid+receptors+in+drug+discovery.">Lysophospholipid receptors in drug discovery.</a> Exp Cell Res. 333 (2), 171-177 (2015).</li><li>Kihara, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+and+degradation+pathways,+functions,+and+pathology+of+ceramides+and+epidermal+acylceramides.">Synthesis and degradation pathways, functions, and pathology of ceramides and epidermal acylceramides.</a> Prog Lipid Res. 63, 50-69 (2016).</li><li>Merrill, A. H., Sullards, M. C., Allegood, J. C., Kelly, S., Wang, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sphingolipidomics:+high-throughput,+structure-specific,+and+quantitative+analysis+of+sphingolipids+by+liquid+chromatography+tandem+mass+spectrometry.">Sphingolipidomics: high-throughput, structure-specific, and quantitative analysis of sphingolipids by liquid chromatography tandem mass spectrometry.</a> Methods. 36 (2), 207-224 (2005).</li><li>Houjou, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+selective+identification+of+molecular+species+in+phosphatidylcholine+and+sphingomyelin+by+conditional+neutral+loss+scanning+and+MS3.">Rapid and selective identification of molecular species in phosphatidylcholine and sphingomyelin by conditional neutral loss scanning and MS3.</a> Rapid Commun Mass Spectrom. 18 (24), 3123-3130 (2004).</li><li>Hama, K., Fujiwara, Y., Tabata, H., Takahashi, H., Yokoyama, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+Quantitation+Using+Two+Stable+Isotopically+Labeled+Species+and+Direct+Detection+of+N-Acyl+Moiety+of+Sphingomyelin.">Comprehensive Quantitation Using Two Stable Isotopically Labeled Species and Direct Detection of N-Acyl Moiety of Sphingomyelin.</a> Lipids. , (2017).</li><li>Bligh, E. G., Dyer, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+method+of+total+lipid+extraction+and+purification.">A rapid method of total lipid extraction and purification.</a> Can. J. Biochem. Physiol. 37, 911-917 (1959).</li><li>Gu, H., Liu, G., Wang, J., Aubry, A. F., Arnold, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selecting+the+correct+weighting+factors+for+linear+and+quadratic+calibration+curves+with+least-squares+regression+algorithm+in+bioanalytical+LC-MS/MS+assays+and+impacts+of+using+incorrect+weighting+factors+on+curve+stability,+data+quality,+and+assay+performance.">Selecting the correct weighting factors for linear and quadratic calibration curves with least-squares regression algorithm in bioanalytical LC-MS/MS assays and impacts of using incorrect weighting factors on curve stability, data quality, and assay performance.</a> Anal Chem. 86 (18), 8959-8966 (2014).</li><li>Folch, J., Lees, M., Sloane Stanley, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+the+isolation+and+purification+of+total+lipides+from+animal+tissues.">A simple method for the isolation and purification of total lipides from animal tissues.</a> J Biol Chem. 226 (1), 497-509 (1957).</li><li>Thomas, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ozone-induced+dissociation:+elucidation+of+double+bond+position+within+mass-selected+lipid+ions.">Ozone-induced dissociation: elucidation of double bond position within mass-selected lipid ions.</a> Anal Chem. 80 (1), 303-311 (2008).</li><li>Baba, T., Campbell, J. L., Le Blanc, J. C., Baker, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-depth+sphingomyelin+characterization+using+electron+impact+excitation+of+ions+from+organics+and+mass+spectrometry.">In-depth sphingomyelin characterization using electron impact excitation of ions from organics and mass spectrometry.</a> J Lipid Res. 57 (5), 858-867 (2016).</li><li>Ryan, E., Nguyen, C. Q. N., Shiea, C., Reid, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detailed+Structural+Characterization+of+Sphingolipids+via+193+nm+Ultraviolet+Photodissociation+and+Ultra+High+Resolution+Tandem+Mass+Spectrometry.">Detailed Structural Characterization of Sphingolipids via 193 nm Ultraviolet Photodissociation and Ultra High Resolution Tandem Mass Spectrometry.</a> J Am Soc Mass Spectrom. , (2017).</li><li>Pham, H. T., Ly, T., Trevitt, A. J., Mitchell, T. W., Blanksby, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+complex+lipid+isomers+by+radical-directed+dissociation+mass+spectrometry.">Differentiation of complex lipid isomers by radical-directed dissociation mass spectrometry.</a> Anal Chem. 84 (17), 7525-7532 (2012).</li></ol>

著者は、利害の対立があるないことを宣言します。

現在の質的な方法で我々 は MS3 SPC とNのプロダクト イオンを得られる-アシル部位。SPC とNの両方を正しく割り当てることが重要です-アシル部位。このため、他ホスホリルコリン含む分子は MS3製品イオンとしても検出することができますが注意する必要があります。ジアシル ホスファチジルコリン (PC) およびプラズマローゲン PC が哺乳類セルの豊富に存在し、疎水性、SM のような。したがって、前記ジアシル PC とプラズマローゲン PC 同位体 (通常13C) と理論的に検出できます同時に SM で。我々 の実験では、プラズマローゲン PC の MS3製品イオン同時に SM 分析で観察されました。SPC のスペクトル強度が SM Nのそれよりも大きいことを知っている SM の MS3プロダクト イオンを正しく選択すると便利です-アシル部位 (図 1AとB)。一方、脂肪酸アシル基の強度はより大きい (またはほぼ同じ) demethylated lysoplasmalogen パソコン (データは示されていない) のこと。
本定量法で正確に検量線を作成して、メソッドの検証のサンプルを準備するが重要です。また、重み係数が正しく校正曲線を構築する使用する必要があります。特に低濃度でカーブフィッティングを改善するために便利です。我々 は、異なる重み係数を用いた較正曲線を比較しました。低濃度でカーブフィッティングされた重み係数を用いた改善が明確に 1 を =/その重み係数を使用した場合に比べて2 x = 1 または 1/x (図 2B)。精度と確度の値は ± 15% 以内にする必要があります。QC-L の濃度は標準曲線 (定量下限値) の下限と同一、± 208内にあるはずです。
本研究では培養細胞から総脂質分画を抽出するブライ ・ ダイアーのメソッドを採用しました。Folch 法などの脂質の抽出のための他の方法は、また役に立つ9ですです。それは量および/またはサンプルの特性に応じて適切なメソッドを使用して脂質を抽出することが重要です。各注入で分析し同時に SM 種数が大きすぎてデータ集録ソフトウェアを過負荷を避けるためにしないでください。スケジュールされた MRM は同時に SM 種数を量的に表わすため役に立つでしょう。
MS3解析を用いた本手法は炭素数と二重結合の LCB とNを推測する便利な-追加デバイスなし SM のアシル部位。ただし、形状 (直鎖又は分岐)、異性体 (cisまたはトランス)、二重結合の位置など他の構造情報を取得できません。高いエネルギーを使用してプロダクト イオンと追加の楽器10、11,12,13を使用してその構造情報を取得する必要があります。Nに対応する製品のイオンの分子式-アシル鎖だった [RCO2]-イオン窒素が含まれていません。どのように衝突誘起解離収入かは、現在不明です。
3分析、衝突エネルギー (CE) と MS3断片化 (ExT) の励磁時間のパラメーターを調整することが重要です。高い CE は過剰な断片化が発生し、2ndの前駆イオンとして demethylated SM のプロダクト イオンの強度を減らします。また、断片化パターンは、内線に大きく依存実験では, 前に CE と ExT demethylated SM、SPC、およびNのプロダクト イオンの強度を最大化する適切な条件を決定することが望ましいです-合成 SM を注ぎこむことによってアシル基が移動相に溶解します。
私たち使用 d18:1/(D9) 18:1 SM と d18:1/(D31) 16:0 SM は 2 つの同位体標識 SM 種、検量線を作成します。電離の効率は、SM 種と移動相の条件によって異なります。したがって、興味の SM の数が限られている場合より正確な定量のための興味の同位体標識 SM 種を準備することをお勧めします。
SM 構造前駆イオンと脱 SPC に対応する製品のイオンによると、これまで決定しました。さらに、それは時々 興味のターゲット化合物サンプル マトリックスに豊富に存在していたので存在サンプル マトリックスに定量の下限値を正確に判断する妨げられました。
本研究は炭素と、LCB とNの二重結合の数を推定するために便利-アシル基が MS3実験追加楽器なしで、対応する製品のイオンに基づきます。加えて、我々 は SM の種を使用して 2 つ安定同位体ラベル付き SM、SM の定量に使用範囲を決定するを容易に定量分析法を提示します。本手法は様々 な様々 な生物学的サンプルや工業製品でユニークな SM 種を特徴付けること役に立つでしょう。

スフィンゴミエリン (SM) は、哺乳類細胞における一般的なスフィンゴ脂質です。SM は合成の1細胞内と他のスフィンゴ脂質の前駆体として現在セルの人身売買と皮膚のバリア恒常性は、それぞれ2、スフィンゴシン-1-リン酸と、セラミド、免疫の重要な役割があるよう 3。したがって、SM 代謝の正確な分析は、スフィンゴ脂質の生理的および病態的役割を解明するため重要です。
SM は、セラミドとさらに、スフィンゴシンとNで構成されているセラミドの 1-ヒドロキシ グループにリンクされているホスホリルコリンから成る-アシル部位。スフィンゴシンとNの両方で炭素との二重結合の数の様々 な-アシル部位数・ セラミド (SM) 種の結果します。LC-MS/MS の最近の進歩は、SM4、5の量的・質的分析を可能にしました。定性分析の炭素数と二重結合のスフィンゴイド LCB の SM された LCB のプロダクト イオン スペクトルを割り当てることによって識別されます。しかし、 Nの構造情報-アシル基がその対応するプロダクト イオンは報告されていないので直接得られず、したがってN-アシル鎖前駆イオン間の差分解析によって推定したと両方の正と負のイオン モード4,5LCB に対応する製品のイオン。本報告では、LCB のNプロダクト イオンを検出する手法を提案する-トリプル四重極および正確な構造を容易に四重極線形イオン トラップの質量分析を使用して MS3モードで同時にアシル基各 SM 種6の思惑。
生体試料中のマトリックスによって引き起こされるイオン抑制 (または拡張) 効果, LC ESI 質量分析で定量の正確さを妨げる、したがって、同じマトリックスへの関心のすべての分析のための検量線を作成することが望ましいです。生体試料。ただし、この戦略は実現可能な包括的な分析を中心に、生体試料中のすべての SM 種を準備するはほとんど不可能です。したがって、校正曲線を組み立てるし、SM の代表種生物学的試料中のスパイクを使用して量的な範囲を決定するは実用的です。校正曲線を構築する 2 つの同位体標識 SM 種を使いました。1 つは、内部標準と標準物質の他に使われました。生体試料中のスパイクし、較正曲線と6の定量範囲は正常に取得標準化合物として同位体標識 SM 種の少量を検出しました。

<table><tbody><tr><td>PBS</td><td>ThermoFisher</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>100 mm tissue culture dish</td><td>IWAKI</td><td>3020-100</td><td></td></tr><tr><td>Cell scraper</td><td>IWAKI</td><td>9000-220</td><td></td></tr><tr><td>Siliconized 2.0 mL tube</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-681-321</td><td></td></tr><tr><td>Test tube</td><td>IWAKI</td><td>TST SCR 16-100</td><td></td></tr><tr><td>Teflon-lined screw cap</td><td>IWAKI</td><td>9998CAP415-15</td><td></td></tr><tr><td>Disposable glass tube</td><td>IWAKI</td><td>9832-1310</td><td></td></tr><tr><td>CAPCELL PAK C18 ACR 3 &amp;micro;m 1.5 mm I.D. x 100 mm</td><td>Shiseido</td><td>92223</td><td>Guard cartridge is inserted into cartridge holder, and linked to C18 column</td></tr><tr><td>CAPCELL C18 MGII S-3 2.0 mm x 10 mm GUARD CARTRIDGE</td><td>Shiseido</td><td>12197</td><td></td></tr><tr><td>Cartridge holder</td><td>Shiseido</td><td>12415</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitrile</td><td>Wako</td><td>018-19853</td><td></td></tr><tr><td>2-Propanol (Isopropyl Alcohol)</td><td>Wako</td><td>161-09163</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Wako</td><td>134-14523</td><td></td></tr><tr><td>Formic acid</td><td>Wako</td><td>066-00466</td><td></td></tr><tr><td>28% Ammonia water</td><td>Wako</td><td>016-03146</td><td></td></tr><tr><td>Sonicator (bath type)</td><td>SHARP</td><td>UT-206H</td><td></td></tr><tr><td>Vortex mixer for glass test tube</td><td>TAITEC</td><td>Mix-EVR</td><td></td></tr><tr><td>1.4 mL glass vial</td><td>Tomsic</td><td>500-1982</td><td>Samples are stored in 1.4 mL glass vial sealed with screw cap and 8 mm septum at -20&amp;deg;C</td></tr><tr><td>8 mm septum</td><td>Tomsic</td><td>200-3322</td><td>When samples are analyzed, screw caps are replaced with screw caps with slit septum</td></tr><tr><td>Screw cap for 1.4 mm glass vial</td><td>Tomsic</td><td>500-2762</td><td></td></tr><tr><td>Screw cap with slit septum</td><td>Shimadzu GLC</td><td>GLCTV-803</td><td></td></tr><tr><td>PVDF 0.22 &amp;micro;m filter</td><td>Millipore</td><td>SLGVR04NL</td><td></td></tr><tr><td>Triple quadrupole and quadrupole linear ion trap mass spectrometry</td><td>SCIEX</td><td>QTRAP4500</td><td></td></tr><tr><td>The software for data acquisition and analysis of product ion spectra</td><td>SCIEX</td><td>Analyst</td><td></td></tr><tr><td>The software for data integration in quantitative analysis</td><td>SCIEX</td><td>MultiQuant</td><td></td></tr><tr><td>HPLC system</td><td>Shimadzu</td><td>Nexera</td><td></td></tr><tr><td>Glass bottle</td><td>Sansyo</td><td>85-0002</td><td></td></tr><tr><td>d18:1/24:0 sphingomyelin</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>860592P</td><td></td></tr><tr><td>Sphingosylphosphorylcholine</td><td>Merck</td><td>567735</td><td></td></tr><tr><td>Fetal bovine serum</td><td>ThermoFisher&amp;nbsp;</td><td>26140079</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamine</td><td>ThermoFisher&amp;nbsp;</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin and streptomycin</td><td>Sigma</td><td>P4333</td><td></td></tr><tr><td>Eagle&amp;rsquo;s minimum essential medium</td><td>Sigma</td><td>M4655</td><td></td></tr></tbody></table>

quantitative and qualitative method for sphingomyelin by lc-ms using two stable isotopically labeled sphingomyelin species

液体クロマトグラフィー-エレクトロ スプレー イオン化タンデム質量分析法 (ESI-MS/LC-MS) による定量的スフィンゴミエリン (SM) の質的分析の手法を提案します。SM は、それぞれ親水性と疎水性のコンポーネントとして、ホスホリルコリンとセラミドで構成される一般的なスフィンゴ脂質です。SM 種数はスフィンゴイド長いチェーンの基本 (LCB) の変化のための哺乳類の細胞内に存在し、 N-セラミドのアシル部位。本報告では、炭素と、LCB とNの二重結合の数を推定する方法を示す-アシル基が MS ・ MS/MS (MS3) 実験で、対応する製品のイオンに基づきます。加えて、我々 は SM の種を使用して 2 つ安定同位体ラベル付き SM、SM の定量に使用範囲を決定するを容易に定量分析法を提示します。本手法は、様々 な生体試料や化粧品などの工業製品で SM 種を特徴付けること役に立つでしょう。

化学的に合成した d18:1/24:0 SM (図 1A)、d18:1 LC ESI MS3 [M + 尿素]-を採用し、[M CH3] 24:0 SM HeLa 細胞 (図 1B) から抽出した脂質サンプルで行ったところ/-最初と 2 番目の前駆イオンとしてそれぞれ。脱スフィンゴシルフォスフォリルコリン (SPC) (449m/z ) のスペクトル強度が SM Nのより大きいことに注意してください-アシル基 (378m/z )。さらに、[M-コリン-CH3 (スフィンゴシン-1-リン酸)] に対応するスペクトル-は SM の LCB を割り当てると便利ですも。また脱-SPC (449m/z ) のスペクトルが d18:1 MS3分析 (図 1C) の条件下で SPC から主に生成されることを確認しました。
2 同位体ラベル付き SM 種を使用して検量線を図 2Aに示した。近似曲線は、1/2加重係数として x を適用することによって得られました。残差分析の結果は、図 2Bに示した。1 を適用することによって/重み係数と2x は、小さかったの定量 (本研究において 0.1 pmol) の下限に近い残留値に注意してください。
検証の結果得られた検量線のパラメーターは、表 3に示されていた。精度と確度の値は、今回 LC MS8を使用して定量法として基準を満たしていることを示す、± 15% 以内でした。
SM 種 HeLa 細胞の量を表 4に示した。HeLa 細胞は、10% を含む培地で栽培された FBS と収穫。d18:1/16:0 SM と d18:1/24:1 SM がほとんどと 2 番目の最も豊富な SM の種の構造が決定され、それぞれ 54% と 14% 合計 SM の構成
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57293/57293fig1.jpg"> 図 1.HeLa 細胞における SM の特定z/z は m信号の MS スペクトル。D18:1 と MS3スペクトル化学合成 d18:1 の/24:0 SM (A)/24:0 SM HeLa 細胞 (B) から抽出した脂質のサンプルが表示されます。結果は浜らから合わせられました。6 SPC のスペクトル強度はNのより大きいことに注意してください-SM. MS3スペクトル化学合成 d18:1 SPC のアシル基は同じ m ・ z イオンを用いた (C) に表示されます ([M + 尿素]-m/z 499) 1・2 の前駆イオンとして。<a href="https://cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57293/57293fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57293/57293fig2.jpg"> 図 2.2 同位体標識 SM 種を使用して SM の較正曲線。(A) を使用して校正曲線 2 同位体ラベル SM 種 (d18:1/(D9) 18:1 SM と d18:1/(D31) 16:0 SM)。検量線は重み係数を使用して建設された = 1/2x。検証の結果は、表 3のとおりです。(B) 作成された較正曲線の良さの評価のための残留分析。重み係数を用いた検量線の残差 = 1/2 x は重み係数を用いたものよりも小さい = 1/x または d18:1/(D9) 18 のより低い量で特に 1:1 これの拡大版を表示する SM.<a href="https://cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57293/57293fig2large.jpg" target="_blank">をここでクリックしてください図.</a>
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td colspan="6">条件設定</td>
		</tr>
<tr>
<td>モード</td>
			<td>カーテン ガス (psi)</td>
			<td>衝突ガス</td>
			<td>イオン スプレー電圧 (V)</td>
			<td>温度 (° C)</td>
			<td>イオン ソース ガス 1 (psi)</td>
			<td>イオン ソース ガス 2 (psi)</td>
		</tr>
<tr>
<td>MS3
</td>
			<td>40</td>
			<td>高</td>
			<td>-4500</td>
			<td>200</td>
			<td>40</td>
			<td>80</td>
		</tr>
<tr>
<td>MRM</td>
			<td>40</td>
			<td>10</td>
			<td>5500</td>
			<td>300</td>
			<td>40</td>
			<td>80</td>
		</tr>
</tbody></table>テーブル 1。定性・定量分析に使用されるエレクトロ スプレー イオン源の条件。このテーブルは浜らから適応されました。6
<table fo:font-size="6" fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>モード</td>
			<td>極性</td>
			<td>前駆物質イオン (Q1)</td>
			<td>製品イオンまたは第 2 の前駆イオン (第 3 四半期)</td>
			<td>デクラスタ リング電位 (V)</td>
			<td>潜在的な入り口 (V)</td>
			<td>衝突エネルギー (V)</td>
			<td>衝突セル出口電位 (V)</td>
			<td>衝突のエネルギーの広がり (V)</td>
			<td>励起時間 (ミリ秒)</td>
			<td>速度 (Da/秒)</td>
			<td>時間 (秒)</td>
			<td>解像度</td>
		</tr>
<tr>
<td>MRM</td>
			<td>肯定的です</td>
			<td>【 M + H 】+
</td>
			<td>184</td>
			<td>1</td>
			<td>10</td>
			<td>35</td>
			<td>12</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>5.364</td>
			<td>ユニット</td>
		</tr>
<tr>
<td>MS3
</td>
			<td>否定的です</td>
			<td>[M + 尿素]-
</td>
			<td>M-15</td>
			<td>-26</td>
			<td>-10</td>
			<td>-40</td>
			<td>-</td>
			<td>0</td>
			<td>25</td>
			<td>10000</td>
			<td>自動的にして算出しております</td>
			<td>ユニット</td>
		</tr>
</tbody></table>表 2。MS3とトリプル四重極四重極線形イオン トラップの MRM モードのパラメーター質量分析法による定性・定量分析をそれぞれ使用します。このテーブルは浜らから適応されました。6
<img alt="Table 3" src="/files/ftp_upload/57293/57293table3.jpg"> 表 3。検証の結果得られた検量線のパラメーターです。結果は浜らから合わせられました。6
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>SM の分子種</td>
			<td>量 (pmol/mg タンパク質)</td>
		</tr>
<tr>
<td>d18:1/14:0</td>
			<td>115.5</td>
		</tr>
<tr>
<td>d16:1/16:0</td>
			<td>115.5</td>
		</tr>
<tr>
<td>d17:1/16:0</td>
			<td>239.8</td>
		</tr>
<tr>
<td>d18:2/16:0</td>
			<td>449.9</td>
		</tr>
<tr>
<td>d18:1/16:0</td>
			<td>3355.1</td>
		</tr>
<tr>
<td>d18:0/16:0</td>
			<td>203.8</td>
		</tr>
<tr>
<td>d18:1/17:0</td>
			<td>106.3</td>
		</tr>
<tr>
<td>d18:2/18:0</td>
			<td>26.5</td>
		</tr>
<tr>
<td>d20:0/16:1</td>
			<td>94.9</td>
		</tr>
<tr>
<td>d18:1/18:0</td>
			<td>94.9</td>
		</tr>
<tr>
<td>d18:2/22:0</td>
			<td>102.3</td>
		</tr>
<tr>
<td>d18:1/22:0</td>
			<td>235</td>
		</tr>
<tr>
<td>d18:1/23:1</td>
			<td>83.3</td>
		</tr>
<tr>
<td>d18:1/23:0</td>
			<td>23.9</td>
		</tr>
<tr>
<td>d18:1/24:2</td>
			<td>286.5</td>
		</tr>
<tr>
<td>d18:2/24:1</td>
			<td>286.5</td>
		</tr>
<tr>
<td>d18:1/24:1</td>
			<td>853.2</td>
		</tr>
<tr>
<td>d18:1/24:0</td>
			<td>94.6</td>
		</tr>
<tr>
<td>d18:1/25: 1</td>
			<td>12.9</td>
		</tr>
</tbody></table>表 4。SM 種 HeLa 細胞の量。HeLa 細胞は、10% を含む培地で栽培された FBS。セルが収穫された、および総脂質はブライ ・ ダイアーの方法によって抽出されました。結果は浜らから合わせられました。6

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Quantitative and Qualitative Method for Sphingomyelin by LC-MS Using Two Stable Isotopically Labeled Sphingomyelin Species

同位体 2 つの安定を用いる液体クロマトグラフィー質量によってスフィンゴミエリンの定量的および定性的な方法ラベル スフィンゴミエリン種

ここでは、提案する定量化および複数反応モニタリングを用いた各スフィンゴミエリン種を対象に、プロトコルと MS、MS、MS モード、それぞれ。

We present a method of analyzing sphingomyelin (SM) qualitatively and quantitatively by liquid chromatography-electrospray Ionization-tandem mass ...

quantitative-qualitative-method-for-sphingomyelin-lc-ms-using-two

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biochemistry

9.7K ビュー.  Teikyo University. ここでは、提案する定量化および複数反応モニタリングを用いた各スフィンゴミエリン種を対象に、プロトコルと MS、MS、MS モード、それぞれ。

ビデオ: Quantitative and Qualitative Method for Sphingomyelin by LC-MS Using Two Stable Isotopically Labeled Sphingomyelin Species

An Efficient Method for the Isolation of Highly Purified RNA from Seeds for Use in Quantitative Transcriptome Analysis

Plant seeds accumulate large amounts of storage reserves comprising biodegradable organic matter. Humans rely on seed storage reserves for food and as industrial materials. Gene expression profiles are powerful tools for investigating metabolic regulation in plant cells. Therefore, detailed, accurate gene expression profiles during seed development are required for crop breeding. Acquiring highly purified RNA is essential for producing these profiles. Efficient methods are needed to isolate highly purified RNA from seeds. Here, we describe a method for isolating RNA from seeds containing large amounts of oils, proteins, and polyphenols, which have inhibitory effects on high-purity RNA isolation. Our method enables highly purified RNA to be obtained from seeds without the use of phenol, chloroform, or additional processes for RNA purification. This method is applicable to Arabidopsis, rapeseed, and soybean seeds. Our method will be useful for monitoring the expression patterns of low level transcripts in developing and mature seeds.

We have succeeded in establishing a method for RNA isolation from plant seeds containing large amounts of oils, proteins, and polyphenols, which have inhibitory effects on high-purity RNA isolation. Our method is suitable for monitoring the expression of genes with low level transcripts in seeds.

定量的トランスクリプトーム解析に使用するための種子から高度に精製されたRNAの単離のための効率的な方法

Plant seeds accumulate large amounts of storage reserves comprising biodegradable organic matter. Humans rely on seed storage reserves for food and as ...

生化学

A Method for Measuring Metabolism in Sorted Subpopulations of Complex Cell Communities Using Stable Isotope Tracing

Mammalian cell types exhibit specialized metabolism, and there is ample evidence that various co-existing cell types engage in metabolic cooperation. Moreover, even cultures of a single cell type may contain cells in distinct metabolic states, such as resting or cycling cells. Methods for measuring metabolic activities of such subpopulations are valuable tools for understanding cellular metabolism. Complex cell populations are most commonly separated using a cell sorter, and subpopulations isolated by this method can be analyzed by metabolomics methods. However, a problem with this approach is that the cell sorting procedure subjects cells to stresses that may distort their metabolism.
To overcome these issues, we reasoned that the mass isotopomer distributions (MIDs) of metabolites from cells cultured with stable isotope-labeled nutrients are likely to be more stable than absolute metabolite concentrations, because MIDs are formed over longer time scales and should be less affected by short-term exposure to cell sorting conditions. Here, we describe a method based on this principle, combining cell sorting with liquid chromatography-high resolution mass spectrometry (LC-HRMS). The procedure involves analyzing three types of samples: (1) metabolite extracts obtained directly from the complex population; (2) extracts of "mock sorted" cells passed through the cell sorter instrument without gating any specific population; and (3) extracts of the actual sorted populations. The mock sorted cells are compared against direct extraction to verify that MIDs are indeed not altered by the cell sorting procedure itself, prior to analyzing the actual sorted populations. We show example results from HeLa cells sorted according to cell cycle phase, revealing changes in nucleotide metabolism.

This article describes a method for studying cellular metabolism in complex communities of multiple cell types, using a combination of stable isotope tracing, cell sorting to isolate specific cell types, and mass spectrometry.

安定同位体のトレースを使用した複雑な細胞のコミュニティのソートされた亜集団で代謝を測定する方法

Mammalian cell types exhibit specialized metabolism, and there is ample evidence that various co-existing cell types engage in metabolic cooperation. ...

Cellular Lipid Extraction for Targeted Stable Isotope Dilution Liquid Chromatography-Mass Spectrometry Analysis

The metabolism of fatty acids, such as arachidonic acid (AA) and linoleic acid (LA), results in the formation of oxidized bioactive lipids, including numerous stereoisomers1,2. These metabolites can be formed from free or esterified fatty acids. Many of these oxidized metabolites have biological activity and have been implicated in various diseases including cardiovascular and neurodegenerative diseases, asthma, and cancer3-7. Oxidized bioactive lipids can be formed enzymatically or by reactive oxygen species (ROS). Enzymes that metabolize fatty acids include cyclooxygenase (COX), lipoxygenase (LO), and cytochromes P450 (CYPs)1,8. Enzymatic metabolism results in enantioselective formation whereas ROS oxidation results in the racemic formation of products.
While this protocol focuses primarily on the analysis of AA- and some LA-derived bioactive metabolites; it could be easily applied to metabolites of other fatty acids. Bioactive lipids are extracted from cell lysate or media using liquid-liquid (l-l) extraction. At the beginning of the l-l extraction process, stable isotope internal standards are added to account for errors during sample preparation. Stable isotope dilution (SID) also accounts for any differences, such as ion suppression, that metabolites may experience during the mass spectrometry (MS) analysis9. After the extraction, derivatization with an electron capture (EC) reagent, pentafluorylbenzyl bromide (PFB) is employed to increase detection sensitivity10,11. Multiple reaction monitoring (MRM) is used to increase the selectivity of the MS analysis. Before MS analysis, lipids are separated using chiral normal phase high performance liquid chromatography (HPLC). The HPLC conditions are optimized to separate the enantiomers and various stereoisomers of the monitored lipids12. This specific LC-MS method monitors prostaglandins (PGs), isoprostanes (isoPs), hydroxyeicosatetraenoic acids (HETEs), hydroxyoctadecadienoic acids (HODEs), oxoeicosatetraenoic acids (oxoETEs) and oxooctadecadienoic acids (oxoODEs); however, the HPLC and MS parameters can be optimized to include any fatty acid metabolites13.
Most of the currently available bioanalytical methods do not take into account the separate quantification of enantiomers. This is extremely important when trying to deduce whether or not the metabolites were formed enzymatically or by ROS. Additionally, the ratios of the enantiomers may provide evidence for a specific enzymatic pathway of formation. The use of SID allows for accurate quantification of metabolites and accounts for any sample loss during preparation as well as the differences experienced during ionization. Using the PFB electron capture reagent increases the sensitivity of detection by two orders of magnitude over conventional APCI methods. Overall, this method, SID-LC-EC-atmospheric pressure chemical ionization APCI-MRM/MS, is one of the most sensitive, selective, and accurate methods of quantification for bioactive lipids.

This protocol will demonstrate the extraction and analysis of free and esterified bioactive fatty acids from cells. Fatty acids are accurately quantified using stable isotope dilution, chiral liquid chromatography, electron capture atmospheric chemical ionization multiple reaction monitoring mass spectrometry (SID-LC-ECAPCI-MRM/MS).

ターゲット安定同位体希釈液体クロマトグラフィー - 質量分析のための細胞の脂質の抽出

The metabolism of fatty acids, such as arachidonic acid (AA) and linoleic acid (LA), results in the formation of oxidized bioactive lipids, including ...

生物工学

Lipid Droplet Isolation for Quantitative Mass Spectrometry Analysis

Lipid droplets are vital to the replication of a variety of different pathogens, most prominently the Hepatitis C Virus (HCV), as the putative site of virion morphogenesis. Quantitative lipid droplet proteome analysis can be used to identify proteins that localize to or are displaced from lipid droplets under conditions such as virus infections. Here, we describe a protocol that has been successfully used to characterize the changes in the lipid droplet proteome following infection with HCV. We use Stable Isotope Labeling with Amino Acids in Cell Culture (SILAC) and thus label the complete proteome of one population of cells with &#34;heavy&#34; amino acids to quantitate the proteins by mass spectrometry. For lipid droplet isolation, the two cell populations (i.e.&#160;HCV-infected/&#34;light&#34; amino acids and uninfected control/&#34;heavy&#34; amino acids) are mixed 1:1 and lysed mechanically in hypotonic buffer. After removing the nuclei and cell debris by low speed centrifugation, lipid droplet-associated proteins are enriched by two subsequent ultracentrifugation steps followed by three washing steps in isotonic buffer. The purity of the lipid droplet fractions is analyzed by western blotting with antibodies recognizing different subcellular compartments. Lipid droplet-associated proteins are then separated by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) followed by Coomassie staining. After tryptic digest, the peptides are quantified by liquid chromatography-electrospray ionization-tandem mass spectrometry (LC-ESI-MS/MS). Using this method, we identified proteins recruited to lipid droplets upon HCV infection that might represent pro- or antiviral host factors. Our method can be applied to a variety of different cells and culture conditions, such as infection with pathogens, environmental stress, or drug treatment.

Lipid droplets are important organelles for the replication of several pathogens, including the Hepatitis C Virus (HCV). We describe a method to isolate lipid droplets for quantitative mass spectrometry of associated proteins; it can be used under a variety of conditions, such as virus infection, environmental stress, or drug treatment.

定量的質量分析のための脂肪滴の分離

Lipid droplets are vital to the replication of a variety of different pathogens, most prominently the Hepatitis C Virus (HCV), as the putative site of ...

LC-MS Analysis of Human Platelets as a Platform for Studying Mitochondrial Metabolism

Perturbed mitochondrial metabolism has received renewed interest as playing a causative role in a range of diseases. Probing alterations to metabolic pathways requires a model in which external factors can be well controlled, allowing for reproducible and meaningful results. Many studies employ transformed cellular models for these purposes; however, metabolic reprogramming that occurs in many cancer cell lines may introduce confounding variables. For this reason primary cells are desirable, though attaining adequate biomass for metabolic studies can be challenging. Here we show that human platelets can be utilized as a platform to carry out metabolic studies in combination with liquid chromatography-tandem mass spectrometry analysis. This approach is amenable to relative quantification and isotopic labeling to probe the activity of specific metabolic pathways. Availability of platelets from individual donors or from blood banks makes this model system applicable to clinical studies and feasible to scale up. Here we utilize isolated platelets to confirm previously identified compensatory metabolic shifts in response to the complex I inhibitor rotenone. More specifically, a decrease in glycolysis is accompanied by an increase in fatty acid oxidation to maintain acetyl-CoA levels. Our results show that platelets can be used as an easily accessible and medically relevant model to probe the effects of xenobiotics on cellular metabolism.

Here we show isolated human platelets can be used as an accessible ex vivo model to study metabolic adaptations in response to the complex I inhibitor rotenone. This approach employs isotopic tracing and relative quantification by liquid chromatography-mass spectrometry and can be applied to a variety of study designs.

ミトコンドリア代謝を研究するためのプラットフォームとしてのヒト血小板のLC-MS分析

Perturbed mitochondrial metabolism has received renewed interest as playing a causative role in a range of diseases. Probing alterations to metabolic ...

環境学

Mass Spectrometric Analysis of Glycosphingolipid Antigens

Glycosphingolipids (GSL's) belong to the glycoconjugate class of biomacromolecules, which bear structural information for significant biological processes such as embryonic development, signal transduction, and immune receptor recognition1-2. They contain complex sugar moieties in the form of isomers, and lipid moieties with variations including fatty acyl chain length, unsaturation, and hydroxylation. Both carbohydrate and ceramide portions may be basis of biological significance. For example, tri-hexosylceramides include globotriaosylceramide (Gal&alpha;4Gal&beta;4Glc&beta;1Cer) and isoglobotriaosylceramide (Gal&alpha;3Gal&beta;4Glc&beta;1Cer), which have identical molecular masses but distinct sugar linkages of carbohydrate moiety, responsible for completely different biological functions3-4. In another example, it has been demonstrated that modification of the ceramide part of alpha-galactosylceramide, a potent agonist ligand for invariant NKT cells, changes their cytokine secretion profiles and function in animal models of cancer and auto-immune diseases5. The difficulty in performing a structural analysis of isomers in immune organs and cells serve as a barrier for determining many biological functions6.
Here, we present a visualized version of a method for relatively simple, rapid, and sensitive analysis of glycosphingolipid profiles in immune cells7-9. This method is based on extraction and chemical modification (permethylation, see below Figure 5A, all OH groups of hexose were replaced by MeO after permethylation reaction) of glycosphingolipids10-15, followed by subsequent analysis using matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF/MS) and ion trap mass spectrometry. This method requires 50 million immune cells for a complete analysis. The experiments can be completed within a week. The relative abundance of the various glycosphingolipids can be delineated by comparison to synthetic standards. This method has a sensitivity of measuring 1% iGb3 among Gb3 isomers, when 2 fmol of total iGb3/Gb3 mixture is present9.
Ion trap mass spectrometry can be used to analyze isomers. For example, to analyze the presence of globotriaosylceramide and isoglobtriaosylceramide in the same sample, one can use the fragmentation of glycosphingolipid molecules to structurally discriminate between the two (see below Figure 5). Furthermore, chemical modification of the sugar moieties (through a permethylation reaction) improves the ionization and fragmentation efficiencies for higher sensitivity and specificity, and increases the stability of sialic acid residues. The extraction and chemical modification of glycosphingolipids can be performed in a classic certified chemical hood, and the mass spectrometry can be performed by core facilities with ion trap MS instruments.

A specific and sensitive method to gain insight into the expression profile of glycosphingolipid antigens in immune organs and cells is described. The method takes advantage of the ion trap mass spectrometry allowing step-wise fragmentation of glycosphingolipid molecules for structural analysis in comparison to chemically synthesized standards.

スフィンゴ糖脂質抗原の質量分析

Glycosphingolipids (GSL's) belong to the glycoconjugate class of biomacromolecules, which bear structural information for significant biological processes ...

免疫・感染学

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Lipids are structurally diverse amphipathic molecules that are insoluble in water. Lipids are essential contributors to the organization and function of biological membranes, energy storage and production, cellular signaling, vesicular transport of proteins, organelle biogenesis, and regulated cell death. Because the budding yeast Saccharomyces cerevisiae is a unicellular eukaryote amenable to thorough molecular analyses, its use as a model organism helped uncover mechanisms linking lipid metabolism and intracellular transport to complex biological processes within eukaryotic cells. The availability of a versatile analytical method for the robust, sensitive, and accurate quantitative assessment of major classes of lipids within a yeast cell is crucial for getting deep insights into these mechanisms. Here we present a protocol to use liquid chromatography coupled with tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) for the quantitative analysis of major cellular lipids of S. cerevisiae. The LC-MS/MS method described is versatile and robust. It enables the identification and quantification of numerous species (including different isobaric or isomeric forms) within each of the 10 lipid classes. This method is sensitive and allows identification and quantitation of some lipid species at concentrations as low as 0.2 pmol/&#181;L. The method has been successfully applied to assessing lipidomes of whole yeast cells and their purified organelles. The use of alternative mobile phase additives for electrospray ionization mass spectrometry in this method can increase the efficiency of ionization for some lipid species and can be therefore used to improve their identification and quantitation.

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

We present a protocol using liquid chromatography coupled with tandem mass spectrometry to identify and quantify major cellular lipids in Saccharomyces cerevisiae. The described method for a quantitative assessment of major lipid classes within a yeast cell is versatile, robust, and sensitive.

液体クロマトグラフィーとタンデム質量分析法を用いたサッカロミセス・セレビシエ細胞リピドームの定量的解析

Lipids are structurally diverse amphipathic molecules that are insoluble in water. Lipids are essential contributors to the organization and function of ...

Preparation of Human Tissues Embedded in Optimal Cutting Temperature Compound for Mass Spectrometry Analysis

Sphingolipids are cellular components that have well-established roles in human metabolism and disease. Mass spectrometry can be used to determine whether sphingolipids are altered in a disease and investigate whether sphingolipids can be targeted clinically. However, properly powered prospective studies that acquire tissues directly from the surgical suite can be time consuming, and technically, logistically, and administratively challenging. In contrast, retrospective studies can take advantage of cryopreserved human specimens already available, usually in large numbers, at tissue biorepositories. Other advantages of procuring tissues from biorepositories include access to information associated with the tissue specimens including histology, pathology, and in some instances clinicopathological variables, all of which can be used to examine correlations with lipidomics data. However, technical limitations related to the incompatibility of optimal cutting temperature compound (OCT) used in the cryopreservation and mass spectrometry is a technical barrier for the analysis of lipids. However, we have previously shown that OCT can be easily removed from human biorepository specimens through cycles of washes and centrifugation without altering their sphingolipid content. We have also previously established that sphingolipids in human tissues cryopreserved in OCT are stable for up to 16 years. In this report, we outline the steps and workflow to analyze sphingolipids in human tissue specimens that are embedded in OCT, including washing tissues, weighing tissues for data normalization, the extraction of lipids, preparation of samples for analysis by liquid chromatography electrospray ionization tandem mass spectrometry (LC-ESI-MS/MS), mass spectrometry data integration, data normalization, and data analysis.

Sphingolipids are bioactive metabolites with well-established roles in human disease. Characterizing alterations in tissues with mass-spectrometry can reveal roles in disease etiology or identify therapeutic targets. However, the OCT-compound used for cryopreservation in biorepositories interferes with mass-spectrometry. We outline methods to analyze sphingolipids in human tissues embedded in OCT with LC-ESI-MS/MS.

質量分析のための最適な切削温度化合物に包埋されたヒト組織の調製

Sphingolipids are cellular components that have well-established roles in human metabolism and disease. Mass spectrometry can be used to determine whether ...

がん研究

安定同位体標識を用いた脂質構造のスクリーニング

Tracing de novo Lipids using Stable Isotope Labeling LC-TIMS-TOF MS/MS

Lipids are highly diverse, and small changes in lipid structures and composition can have profound effects on critical biological functions. Stable isotope labeling (SIL) offers several advantages for the study of lipid distribution, mobilization, and metabolism, as well as de novo lipid synthesis. The successful implementation of the SIL technique requires the removal of interferences from endogenous molecules. In the present work, we describe a high-throughput analytical protocol for the screening of SIL lipids from biological samples; examples will be shown of lipid de novo identification during mosquito ovary development. The use of complementary liquid chromatography trapped ion mobility spectrometry and mass spectrometry allows for the separation and lipids assignment from a single sample in a single scan (&lt;1 h). The described approach takes advantage of recent developments in data-dependent acquisition and data-independent acquisition, using parallel accumulation in the mobility trap followed by sequential fragmentation and collision-induced dissociation. The measurement of SIL at the fatty acid chain level reveals changes in lipid dynamics during the ovary development of mosquitoes. The lipids de novo structures are confidently assigned based on their retention time, mobility, and fragmentation pattern.

著者スポットライト:安定同位体標識を用いた複雑なリピドームサンプルの定量(英語)

Presented here is a method for screening lipid structures through stable isotope labeling by using their retention time, mobility, and fragmentation.

安定同位体標識 LC-TIMS-TOF MS/MS を用いた de novo 脂質の追跡

Lipids are highly diverse, and small changes in lipid structures and composition can have profound effects on critical biological functions. Stable ...

同位体 2 つの安定を用いる液体クロマトグラフィー質量によってスフィンゴミエリンの定量的および定性的な方法ラベルスフィンゴミエリン種

要約

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定量的トランスクリプトーム解析に使用するための種子から高度に精製されたRNAの単離のための効率的な方法

安定同位体のトレースを使用した複雑な細胞のコミュニティのソートされた亜集団で代謝を測定する方法

ターゲット安定同位体希釈液体クロマトグラフィー - 質量分析のための細胞の脂質の抽出

定量的質量分析のための脂肪滴の分離

ミトコンドリア代謝を研究するためのプラットフォームとしてのヒト血小板のLC-MS分析

スフィンゴ糖脂質抗原の質量分析

液体クロマトグラフィーとタンデム質量分析法を用いたサッカロミセス・セレビシエ細胞リピドームの定量的解析

質量分析のための最適な切削温度化合物に包埋されたヒト組織の調製

安定同位体標識 LC-TIMS-TOF MS/MS を用いた de novo 脂質の追跡

安定同位体標識 LC-TIMS-TOF MS/MS を用いた de novo 脂質の追跡

同位体 2 つの安定を用いる液体クロマトグラフィー質量によってスフィンゴミエリンの定量的および定性的な方法ラベル スフィンゴミエリン種

要約

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定量的トランスクリプトーム解析に使用するための種子から高度に精製されたRNAの単離のための効率的な方法

安定同位体のトレースを使用した複雑な細胞のコミュニティのソートされた亜集団で代謝を測定する方法

ターゲット安定同位体希釈液体クロマトグラフィー - 質量分析のための細胞の脂質の抽出

定量的質量分析のための脂肪滴の分離

ミトコンドリア代謝を研究するためのプラットフォームとしてのヒト血小板のLC-MS分析

スフィンゴ糖脂質抗原の質量分析

液体クロマトグラフィーとタンデム質量分析法を用いたサッカロミセス・セレビシエ細胞リピドームの定量的解析

質量分析のための最適な切削温度化合物に包埋されたヒト組織の調製

安定同位体標識 LC-TIMS-TOF MS/MS を用いた de novo 脂質の追跡

安定同位体標識 LC-TIMS-TOF MS/MS を用いた de novo 脂質の追跡

同位体 2 つの安定を用いる液体クロマトグラフィー質量によってスフィンゴミエリンの定量的および定性的な方法ラベルスフィンゴミエリン種