この研究は国立研究所の一般的な医療科学 (日の出) (5605100122001)、ネブラスカ大学カーニー (UNK) 夏学生研究プログラム (SSRP) と UNK と同様、国民衛生の健康 (NIH)、コンポーネントによって資金を供給学部研究員 (ウルフ)。

1. 染料、バッファー、Agarose のゲルの準備
<ol><li>
DNA や染色の DNA の消化力の汚損のための次のソリューションを準備します。
	<ol>
<li>1 x テ (酸トリス-HCl とエチレンジアミン; を準備します。10 mM メスシリンダーやメスフラスコでトリス-HCl と 1 mM EDTA を使用して EDTA) バッファー。常温 (18-25 ° C) で保存します。</li>
		<li>各色素の因数を作る: TOTO 1、ヨーヨー 1、ポポ 1、ボボ 1、トト 3、ヨーヨー 3、ポ-3、ボーボボ 3 (表 1)。濃い黄色に 1 mM 染料の 4 μ L をピペットまたは 1.5 mL チューブを黒し 1 x テの 36 μ L を追加、ピペット; を使用してミックスこの濃度 100 μ M 染料液 (40 μ L 合計) になります。この手順では、各色素のため。4 ° C でのストア 注: は、色素退色や色素の劣化を防ぐために光の露出を避けます。</li>
		<li>10 mM ビス トリス プロパン塩酸、10 mM MgCl2、および 100 μ g/mL ウシ血清アルブミン (BSA) を使用して 1 のバッファーを準備します。2 50 mM NaCl を使用してバッファーを準備 10 mM トリス塩酸、10 mM MgCl2、および 100 μ g/mL BSA。3 50 mM 酢酸カリウム、20 mM トリス酢酸、酢酸マグネシウム 10 mM と 100 μ g/mL BSA を使用してバッファーを準備します。各酵素には、機能するこれらの特定のバッファーが必要です。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
次の解決策をゲル電気泳動に備えます。
	<ol>
<li>確認荷重 x 6 0.25% ブロモフェノールを組み合わせることによって染料の青、0.25% キシレンシアノール 15% dH2O. ストア常温で Ficoll。</li>
		<li>0.7% の agarose のゲル、三角フラスコに高いゲル化 (先ず) か温度の agarose の 0.07 g を量り 100 mL の 1 x TAE バッファーを追加し、フラスコの上に倒立ビーカーを配置します。<ol>
<li>ホット プレート上にあるソリューションを熱泡はフラスコ、上にフロートの下部に形成し始めるまで。</li>
			<li>ホット プレートからソリューションを削除、フラスコは、素手で触れることでき、井戸を作成するゲル櫛で 24.5 cm x 21.8 cm ゲル鋳型にゲルを注ぎなさいまでソリューションを冷ます。</li>
			<li>ピペット チップでそれらを飛び出るで櫛の近くまたはゲルの表面の泡を削除し、ゲルを許可する、少なくとも 15 分間を固めます。これは、汚染やジェルの乾燥を防ぐために 1 週間のためのプラスチック製のラップに包んで冷蔵庫 (4 ° C) に格納できます。ゲルを実行する方法の詳細については李らを参照してください。33. 注: は、30 個々 の井戸のゲル櫛を使用します。4.5 mm 幅 2 mm の深さでよくする必要があります。井戸の高さは、ボックスに注がれるゲルの量に依存します。</li>
		</ol>
</li>
		<li>40 mM トリス-HCl、20 mM 酢酸と 1 mM EDTA を使用して 1 x TAE (トリス酢酸 EDTA) バッファーを準備します。常温 (18-25 ° C) で保存します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. ステンド グラス DNA の準備
<ol><li>
ラムダ DNA (300-800 ng) 染料の異なる因数を使用して染色します。各染料 (表 1) でお越しの際にもテスト、制限酵素あたり 48 反応の合計六つの異なる濃度。次のプロセスは、1 反応 (図 1) をセットをについて説明します。
	<ol>
<li>100 に 1 x TE を使用してラムダ DNA を希釈 ng/μ L 4 ° c で保存。300 μ L の容量を持つソリューションを確認します。</li>
		<li>非メチル化ラムダ DNA を染色します。ダイジェストから期待される各バンドの 75-100 ng/バンドを推定します。1.9 μ M、3.8 μ M、μ 19.4 M、32.2 μ M、48.3 μ M、63.5 μ M の濃度を生成する色素の適切な量を追加/100 ng の DNA の。</li>
		<li>一晩インキュベート (15 18 h) 4 ° C で</li>
		<li>1 つの反作用制御25として無染色のままします。 注: は、消化反応の非メチル化 DNA を使用します。メチル化敏感な酵素は DNA のメチル化領域を切り取ることはできません、不完全な消化の外観を与えます。</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 制限酵素試金の準備
<ol><li>
ダイジェストは、その酵素が prestained DNA (図 1) を消化できるかどうかを決定するための制限の酵素と DNA を染色します。
	<ol>
<li>次の日は制限酵素、(表 2)、適切なバッファーの 3 μ L の 20 U を追加し、30 μ L の合計のために蒸留水オートクレーブおよびフィルター処理。それぞれの酵素反応では、製造元の web サイトで見つけることができます最高の切削効率とバッファーを選択します。</li>
		<li>反応が、Maschmannらに使用される 6 酵素の表 2 に記載されている最適の酵素活性の温水浴。、2-4 h (表 2)25。</li>
		<li>0.5 M EDTA pH 8.0 の 2 μ L の追加によって反作用を停止します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Electroeluting Agarose のゲルの DNA を染色
<ol><li>24.5 cm x 21.8 cm ゲル型 (ステップ 1.2.2) から側面を削除し、ジェルをゲル電気泳動のボックスにします。ボックスに 1 x TAE バッファーの 2.5 L を注ぐ。井戸がアクセス可能な33を慎重に、ゲルからゲル櫛を取り外します。</li>
	<li>プラスチック フィルム上に制限酵素反応のピペットし、ローディングの染料 × 6 とそれぞれ反応を組み合わせます。各反応液 1 μ L の DNA 溶液 (1 x) の 5-6 μ L ごとに染料を読み込んで x 6 を追加します。その後、ピペットの反応 (読み込み色素を含む < 18 μ L) 井戸に。</li>
	<li>1 kb のはしごの 1 μ L、1 x テ, 9 μ L とローディングの染料 × 6 の 2 μ L を混ぜます。井戸フランクの他のソリューションをソリューションに読み込みます。</li>
	<li>濃い青や黒い紙や布でジェル ボックスをカバーします。ジェル ボックス電源 30 V、電源をセットして一晩実行 (15-20 h) に接続します。ラベル付けされた DNA の電子スピンダイナミクスを防ぐために、ゲルの実行中、ライトをオフにします。</li>
	<li>次の朝は、電源をオフに。トレイを使用してゲルを取るし、45 臭化エチジウム μ L と 1 L 1 x TAE バッファーのコンテナーにそれを転送します。光への露出を防ぐために箔で暗闇の中で部屋の温度やカバーのコンテナーを格納します。部屋の温度の少なくとも 45 分の汚れをジェルができます。 注意: 臭化エチジウムを使用し手袋と安全メガネを着用します。エチジウム ブロマイド溶液とゲルを捨てて容器をきれいにするとき使用エチジウム ブロマイド; に対処する方法を決定する状態破棄のガイドラインを参照してください。また、その他の汚れは、エチジウム ブロマイド代わりに利用されるかもしれない。</li>
</ol>5. Agarose のゲルのイメージング
<ol><li>400-500 nm の間最大光出力を発する青い光の transilluminator の上にジェルを配置します。駅に接続されているカメラで写真を撮る。 注意: 照明器具のカバーを使用し、光源の電源を入れる前に保護眼鏡をかけることを確認してください。 注: この手順も完了するかもしれない紫外光源または標準的なゲルのスキャナーを使用しています。</li>
	<li>ImageJ ImageJ のステータスバーにファイルをドラッグすると、写真を表示、画像がポップアップ表示。</li>
	<li>予想されるインシリコゲル パターンにゲルのバンドを比較することによって実験の消化率を決定します。消化率を確認するのに実験的なバンドの数は DNA バンド24,25の数で分けられます。実験的消化の DNA のバンド パターンが予想されるパターンは、消化率は 1 です。消化率が 1 より大きいパターンに予想よりもさらにフラグメントがあるか。パターンに予想よりも少ないのフラグメントがある場合、消化率が 1 より小さいです。</li>
</ol>

<ol>
	<li>Teague, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+human+genome+structure+by+single-molecule+analysis.">High-resolution human genome structure by single-molecule analysis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (24), 10848-10853 (2010).</li><li>Ananiev, G. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+mapping+discerns+genome+wide+DNA+methylation+profiles.">Optical mapping discerns genome wide DNA methylation profiles.</a> BMC Mol Biol. 9, 68 (2008).</li><li>Zhou, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+rice+genome+sequence+by+optical+mapping.">Validation of rice genome sequence by optical mapping.</a> BMC Genomics. 8, 278 (2007).</li><li>Reslewic, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-genome+shotgun+optical+mapping+of+Rhodospirillum+rubrum.">Whole-genome shotgun optical mapping of Rhodospirillum rubrum.</a> Appl Environ Microbiol. 71 (9), 5511-5522 (2005).</li><li>Zhou, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-genome+shotgun+optical+mapping+of+Rhodobacter+sphaeroides+strain+2.4.1+and+its+use+for+whole-genome+shotgun+sequence+assembly.">Whole-genome shotgun optical mapping of Rhodobacter sphaeroides strain 2.4.1 and its use for whole-genome shotgun sequence assembly.</a> Genome Res. 13 (9), 2142-2151 (2003).</li><li>Gupta, A., Kounovsky-Shafer, K. L., Ravindran, P., Schwartz, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+mapping+and+nanocoding+approaches+to+whole-genome+analysis.">Optical mapping and nanocoding approaches to whole-genome analysis.</a> Microfluidics and Nanofluidics. 20 (44), 1-14 (2016).</li><li>Kounovsky-Shafer, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presentation+of+large+DNA+molecules+for+analysis+as+nanoconfined+dumbbells.">Presentation of large DNA molecules for analysis as nanoconfined dumbbells.</a> Macromolecules. 46 (20), 8356-8368 (2013).</li><li>Kim, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanochannel+confinement:+DNA+stretch+approaching+full+contour+length.">Nanochannel confinement: DNA stretch approaching full contour length.</a> Lab Chip. 11 (10), 1721-1729 (2011).</li><li>Yu, H., Jo, K., Kounovsky, K. L., de Pablo, J. J., Schwartz, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+propulsion:+chemical+sensing+and+chemotaxis+of+DNA+driven+by+RNA+polymerase.">Molecular propulsion: chemical sensing and chemotaxis of DNA driven by RNA polymerase.</a> J Am Chem Soc. 131 (16), 5722-5723 (2009).</li><li>Lam, E. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+mapping+on+nanochannel+arrays+for+structural+variation+analysis+and+sequence+assembly.">Genome mapping on nanochannel arrays for structural variation analysis and sequence assembly.</a> Nat Biotechnol. 30 (8), 771-776 (2012).</li><li>Cao, H., Tegenfeldt, J. O., Austin, R. H., Chou, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gradient+nanostructures+for+interfacing+microfluidics+and+nanofluidics.">Gradient nanostructures for interfacing microfluidics and nanofluidics.</a> Applied Physics Letters. 81 (16), 3058-3060 (2002).</li><li>Gupta, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+analysis+reveals+widespread+structural+variation+in+multiple+myeloma.">Single-molecule analysis reveals widespread structural variation in multiple myeloma.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (25), 7689-7694 (2015).</li><li>Wu, C. W., Schramm, T. M., Zhou, S., Schwartz, D. C., Talaat, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+mapping+of+the+Mycobacterium+avium+subspecies+paratuberculosis+genome.">Optical mapping of the Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis genome.</a> BMC Genomics. 10, 25 (2009).</li><li>Jo, K., Schramm, T. M., Schwartz, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single-molecule+barcoding+system+using+nanoslits+for+DNA+analysis+:+nanocoding.">A single-molecule barcoding system using nanoslits for DNA analysis : nanocoding.</a> Methods Mol Biol. 544, 29-42 (2009).</li><li>Jo, K., Chen, Y. L., de Pablo, J. J., Schwartz, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elongation+and+migration+of+single+DNA+molecules+in+microchannels+using+oscillatory+shear+flows.">Elongation and migration of single DNA molecules in microchannels using oscillatory shear flows.</a> Lab Chip. 9 (16), 2348-2355 (2009).</li><li>Jo, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single-molecule+barcoding+system+using+nanoslits+for+DNA+analysis.">A single-molecule barcoding system using nanoslits for DNA analysis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (8), 2673-2678 (2007).</li><li>Reccius, C. H., Mannion, J. T., Cross, J. D., Craighead, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compression+and+free+expansion+of+single+DNA+molecules+in+nanochannels.">Compression and free expansion of single DNA molecules in nanochannels.</a> Phys Rev Lett. 95 (26), 268101 (2005).</li><li>Staerk, D., Hamed, A. A., Pedersen, E. B., Jacobsen, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bisintercalation+of+homodimeric+thiazole+orange+dyes+in+DNA:+effect+of+modifying+the+linker.">Bisintercalation of homodimeric thiazole orange dyes in DNA: effect of modifying the linker.</a> Bioconjug Chem. 8 (6), 869-877 (1997).</li><li>Spielmann, H. P., Wemmer, D. E., Jacobsen, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solution+structure+of+a+DNA+complex+with+the+fluorescent+bis-intercalator+TOTO+determined+by+NMR+spectroscopy.">Solution structure of a DNA complex with the fluorescent bis-intercalator TOTO determined by NMR spectroscopy.</a> Biochemistry. 34, 8542-8553 (1995).</li><li>Carlsson, C., Jonsson, M., Akerman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Double+bands+in+DNA+gel+electrophoresis+caused+by+bis-intercalating+dyes.">Double bands in DNA gel electrophoresis caused by bis-intercalating dyes.</a> Nucleic Acids Res. 23 (13), 2413-2420 (1995).</li><li>Kundukad, B., Yan, J., Doyle, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+YOYO-1+on+the+mechanical+properties+of+DNA.">Effect of YOYO-1 on the mechanical properties of DNA.</a> Soft Matter. 10 (48), 9721-9728 (2014).</li><li>Technologies, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Molecular Probes Handbook: A guide to Fluorescent Probes and Labeling Technologies. , (2010).</li><li>Riehn, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Restriction+mapping+in+nanofluidic+devices.">Restriction mapping in nanofluidic devices.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (29), 10012-10016 (2005).</li><li>Meng, X., Cai, W., Schwartz, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+restriction+endonuclease+activity+by+DNA+binding+fluorochromes.">Inhibition of restriction endonuclease activity by DNA binding fluorochromes.</a> J Biomol Struct Dyn. 13 (6), 945-951 (1996).</li><li>Maschmann, A., Kounovsky-Shafer, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+restriction+enzyme+activity+when+cutting+DNA+labeled+with+the+TOTO+Dye+family.">Determination of restriction enzyme activity when cutting DNA labeled with the TOTO Dye family.</a> Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids. , 1-12 (2017).</li><li>Biebricker, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+DNA+intercalators+on+DNA+and+DNA-processing+enzymes+elucidated+through+force-dependent+binding+kinetics.">The impact of DNA intercalators on DNA and DNA-processing enzymes elucidated through force-dependent binding kinetics.</a> Nature Communications. 6, 7304 (2015).</li><li>Gunther, K., Mertig, M., Seidel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+and+structural+properties+of+YOYO-1+complexed+DNA.">Mechanical and structural properties of YOYO-1 complexed DNA.</a> Nucleic Acids Res. 38 (19), 6526-6532 (2010).</li><li>Zhou, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+clone-free,+single+molecule+map+of+the+domestic+cow+(Bos+taurus)+genome.">A clone-free, single molecule map of the domestic cow (Bos taurus) genome.</a> BMC Genomics. 16, 644 (2015).</li><li>Ray, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+structural+alterations+in+solid+tumor+oligodendroglioma+by+single+molecule+analysis.">Discovery of structural alterations in solid tumor oligodendroglioma by single molecule analysis.</a> BMC Genomics. 14, 505 (2013).</li><li>Chen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+sequence+of+the+model+medicinal+mushroom+Ganoderma+lucidum.">Genome sequence of the model medicinal mushroom Ganoderma lucidum.</a> Nat Commun. 3, 913 (2012).</li><li>Zhou, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single+molecule+scaffold+for+the+maize+genome.">A single molecule scaffold for the maize genome.</a> PLoS Genet. 5 (11), e1000711 (2009).</li><li>Sischka, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+and+kinetics+between+DNA+and+DNA+binding+ligands.">Molecular mechanisms and kinetics between DNA and DNA binding ligands.</a> Biophys J. 88 (1), 404-411 (2005).</li><li>Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agarose+gel+electrophoresis+for+the+separation+of+DNA+fragments.">Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments.</a> J Vis Exp. (62), (2012).</li><li>Zipper, H., Brunner, H., Bernhagen, J., Vitzthum, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigations+on+DNA+intercalation+and+surface+binding+by+SYBR+Green+I,+its+structure+determination+and+methodological+implications.">Investigations on DNA intercalation and surface binding by SYBR Green I, its structure determination and methodological implications.</a> Nucleic Acids Res. 32 (12), e103 (2004).</li></ol>

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蛍光に分類された DNA (図 1)を消化するために一連の手順が必要です。最初に、DNA は染色、螢光色素の一夜。DNA は、時間の短い期間のためシアニン ダイマーで培養できます。しかし、カールソンらは DNA が不完全な染色20による DNA サイズごとに二重のバンドを作成することを発見しました。この問題を解決するため、DNA は二重バンドが発生するを防ぐために一晩汚すことができます。これは、プロトコルの重要なステップです。染料が十分に長い時間の培養されていない色素 DNA は平衡でできないし、ダブル バンディング パターンを与えます。これが発生した場合は、時間の長い期間の平衡に DNA 染料混合物を許可します。
次に、制限酵素は DNA 色素混合物に追加し、各酵素の特定の温度で 2-4 時間消化します。DNA がメチル化敏感な酵素のメチル化である必要があります。そうでない場合、メチル化された DNA は切断 DNA メチル化領域から制限酵素を抑制します。さらに、反応は、正しいバッファーと酵素の温度で培養する必要があります。各酵素では、各バッファーのバッファーと酵素活性のリストがあります。可能であれば 100% の酵素活性を持つバッファーを選択します。温度、それが適切な温度で抱卵を確認します。ない場合は、酵素活性を失うことまたは変性温度が高すぎる場合があります。EDTA を利用して反応を停止します。酵素を購入した会社でお越しの際にも最適な温度とその酵素のバッファー状態のグラフ。コントロールは右の分子量、酵素が期限切れかどうか参照してくださいにチェックでバンドの正しい数を与えない場合インキュベーション時間を増やすかチェックを確認する温度が正しくその酵素のため。
反応が完了すると、サンプルはゲルにロードできます。まず、ゲルはゲル コンテナーに読み込まれ、1 x TAE バッファーに浸漬します。次に、消化の DNA はローディングの染料と混合し、ゲルの井戸にソリューションを読み込みます。上ふたをスライド、ワイヤは、ジェル ボックスにアタッチされます。一緒に録音されたが、その濃い紙は、両側の上に羽織るし、蓋をカバーする蓋の上に配置されます。もう一つの重要なステップは、サンプルが保護されている光からすべての回でゲルを実行中に特にです。電源をオンにする必要があり、部屋にライトがオフになっています。DNA の電子スピンダイナミクスを防止するため、サンプルでは、全体の時間を光から保護されます。濃い紙がない場合暗い生地にも使用できます。DNA が移動しない場合は、ボックスにワイヤが接続され、実行ボタンが押されたを確認します。
朝は、ジェル ボックスのゲルを取るし、ゲルをエチジウム ブロマイドを含むコンテナーに読み込みます。臭化エチジウム青い光 transilluminator (図 2) の下で DNA バンドを見ることができます。他の染料は、エチジウム ブロマイドの代わりに使用できます。ゲルの写真をキャプチャする青い光 transilluminator 上カメラをマウントできます。設定によって画像ステーションも利用できます。
このメソッドは、主体または TOTO シリーズだけではなく、DNA を汚れ色素の利用できます。Maschmannら。孟らが開発した技術を変更しました。DNA を蛍光染色どう制限酵素24,25消化することができます。これを利用してステンド グラス前 DNA の制限の酵素に影響を与えるかどうかを決定する唯一の手法です。このメソッドは、科学者は、市販されていない他の制限の酵素へのアクセスを持っていない限り、市販の制限の酵素に限定されます。DNA によって選ばれた酵素は、識別可能な DNA バンド パターンと十分なバンドを持つ必要があります (> 3) DNA の分子が完全な長さを判断します。また、メチル化敏感な酵素を使用している場合、DNA がメチル化しないにする必要があります。DNA がメチル化された場合は、メチル化敏感な酵素を使用しないでください。
このメソッドは、制限の酵素は認識部位を特定のカット サイト34のプライマーを設計することがなくデュアルインターカレーション染料で染色で DNA 分子を切ることができるかどうかを決定する使いやすい方法です。このメソッドの将来のアプリケーションは、どう実験からの分子を蛍光標識した全長制限酵素を用いたダイジェストまたは DNA メチル化プロファイルを決定する DNA バンドのサイズを決定するだろう分子。今後の実験計画は、刻み目をつける人の酵素シアニン色素や他の蛍光染料によって影響を受けるかどうかも判断でした。

トト シリーズ (TOTO 1 ヨーヨー 1 ポポ 1、ボボ 1、トト 3、ヨーヨー 3、ポ-3、ボボ-3;表 1)さまざまな DNA の可視化が必要な1,2,3,4,5,6,7、の実験に利用されています。8,9,10,11,12,13,14,15,16,17. シアニン ダイマー家族はその量子収率、感度、および DNA 分子18,19,20の親和性が高いため広く使用されています。シアニン ダイマー色素蛍光21の 100 〜 1000 倍の増加を持っている偉大な選択インターカ レートしたとき、二本鎖 DNA があります。ピリジニウム染料 (ヨーヨー 1、TOTO 1、ヨーヨー-3、およびトト 3)、quinolium (ボボ 1、ポポ 1、ボボ-3、およびポポ 3) (表 1) のカウンター パート22よりも短い波長があります。また、DNA にインターカ レートしたシアニン ダイマー量子収率は高い (0.2 - 0.6)22。ただし、既に蛍光染料で染色、DNA の分子の23を拡大または DNA 分子2のメチル化プロファイルを決定する酵素を使用すると、どのような酵素はステンド グラスの DNA を消化を判断する方法が必要です。DNA に主体の染料の任意の型、または DNA 基板の識別可能なパターンを提供する酵素は、このメソッドを使用できます。
孟らはまず、さまざまな異なる染料24を使用してゲルの電気泳動による prestained DNA の消化率を決定します。Maschmannらに掘り下げたを染料のトト家族見て深い。両方には、DNA の特定の色素で染色でした25の制限の酵素と消化されるかどうかを参照してくださいに汚された DNA の消化率が決定されます。他の方法は、光ピンセット26または27NMR を用いた DNA にインターカ レートした色素の結合効果を検討します。どちらの方法でも特殊な装置が必要です。このメソッドを使用する場合は染料を判断しなければならないほとんどの分子生物学実験室機器に対し、制限酵素消化を妨げます。
また、任意の分子の長さを測定する他の方法で光マッピングは表面に無染色の dna を伸長、ストレッチとフラグメントのサイズを決定する DNA を消化します。輪郭の長さが異なる21染料のインターカレーションは DNA 分子の蛍光染色の使用染料によって輪郭の長さを増加する示されています。このメソッドは様々 なゲノム1,3,4,6,13,28,29,30,に利用されています。31します。 ただし、分子の色素と酵素によって、あらかじめ染色なら、酵素できないことがあります特定の色素に染まった DNA を切断します。したがって、このメソッドは、特定の色素に染まった DNA 酵素と消化できないかどうかを決定します。さらに、染料と染料の利用、DNA の移動度の濃度に応じてゲルのバンド移行されます32 の塩基対の間に挿入するための染料のための部屋を作る DNA のバックボーンの部分的なアンワインドのためネイティブ DNA よりもゆっくりと.
しかし、時々 これらの染料を部分的または完全にある特定の制限の酵素7,24の作用を抑制します。これは蛍光染料、酵素を特定の順序を認識できない場合がありますの添付ファイルによって引き起こされる DNA の構造変化が原因であると考えられます。これらの染料が制限の酵素にどのような影響を与えるかを理解することは、実験でメチル化プロファイルまたは汚された DNA のストレッチが必要です助けることができます。
手法では, DNA は興味の螢光色素で染色され制限の酵素と消化されます。DNA がゲル、イメージの electrophoresed だったし、制限の酵素の消化率を測定しました。制限酵素は、ゲルの切断面パターンに基づいて選ばれました。バンドが多すぎる原因 DNA バンドの重なりとあまりにもいくつかのバンドは DNA の分子の完全な画像を与えていません。消化の DNA 分子のプロファイルを決定することができるにスイート スポットがあります。したがって、それは使用される DNA や酵素に依存されます。この方法の利点はその単純さです。それだけ制限消化とゲルの電気泳動で使用する機器が必要です。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="605">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:173px;">Unmethylated lambda DNA</td>
			<td style="width:111px;">NEB</td>
			<td style="width:155px;">N3013S</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:173px;">YOYO-1</td>
			<td style="width:111px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Y3601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:173px;">TOTO-1</td>
			<td style="width:111px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td>T3600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:173px;">POPO-1</td>
			<td style="width:111px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td>P3580</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:173px;">BOBO-1</td>
			<td style="width:111px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td>B3582</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:173px;">YOYO-3</td>
			<td style="width:111px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Y3606</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:173px;">TOTO-3</td>
			<td style="width:111px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td>T3604</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:173px;">POPO-3</td>
			<td style="width:111px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td>P3584</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:173px;">BamHI</td>
			<td style="width:111px;">NEB</td>
			<td>R0136S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:173px;">PmlI</td>
			<td style="width:111px;">NEB</td>
			<td>R0532S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:173px;">ScaI</td>
			<td style="width:111px;">NEB</td>
			<td>R3122S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:173px;">EcoRI&#160;</td>
			<td style="width:111px;">NEB</td>
			<td>R0101S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:173px;">HindIII</td>
			<td style="width:111px;">NEB</td>
			<td>R0104S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:173px;">SmaI</td>
			<td style="width:111px;">NEB</td>
			<td>R0141S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:173px;">Tris</td>
			<td style="width:111px;">Fisher</td>
			<td>BP152-1</td>
			<td>Irritant</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:173px;">EDTA</td>
			<td style="width:111px;">Fisher</td>
			<td style="width:155px;">S316-212</td>
			<td>Toxic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:173px;">HCl</td>
			<td style="width:111px;">Fisher</td>
			<td>S25358</td>
			<td>Corrosive and irritant</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:173px;">Buffer 1</td>
			<td style="width:111px;">NEB</td>
			<td>B7201S</td>
			<td>NEB 1.1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:173px;">Buffer 2</td>
			<td style="width:111px;">NEB</td>
			<td>B7202S</td>
			<td>NEB 2.1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:173px;">Buffer 3</td>
			<td style="width:111px;">NEB</td>
			<td>B7204S</td>
			<td>NEB Cutsmart</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:173px;">High gelling temperature agarose gel</td>
			<td style="width:111px;">Lonza</td>
			<td>50041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:173px;">Acetic Acid</td>
			<td style="width:111px;">Fisher</td>
			<td>S25118</td>
			<td>Hazardous</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:173px;">Blue light transilluminator</td>
			<td style="width:111px;">Dark Reader</td>
			<td>DR196</td>
			<td>Wear correct eyewear&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:173px;">Ethidium bromide</td>
			<td style="width:111px;">Fisher</td>
			<td>15585011</td>
			<td style="width:167px;">Carcinogen; other alternatives are Nancy 520, Gel red, etc.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:173px;">Cannon EOS Rebel T3I camera</td>
			<td style="width:111px;">Cannon</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Apogee Model H4</td>
			<td style="width:111px;">Biorad</td>
			<td>1704510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:173px;">Power Pac Basic Power Supply</td>
			<td style="width:111px;">Biorad</td>
			<td>1645050&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:173px;">Ficoll</td>
			<td style="width:111px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:155px;">BP525-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:173px;">Bromophenol blue</td>
			<td style="width:111px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:155px;">B-392</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:173px;">Xylene Cyanol</td>
			<td style="width:111px;">Eastmen</td>
			<td style="width:155px;">T1579</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

determining if dna stained with a cyanine dye can be digested with restriction enzymes

蛍光顕微鏡用 DNA の可視化は、さまざまなシアニン色素などの色素を利用しています。これらの染料は、DNA の彼らの親和性が高いと感度のため利用されます。DNA 分子実験の完了の後の完全な長さをかを決定するためには、ステンド グラスの分子が DNA の制限の酵素と消化によって完全な長さをあるかどうかをメソッドが必要です。しかし、ステンド グラスの DNA は酵素が阻害する可能性があるため、螢光色素の 1 つ使用できるどのような酵素は、DNA を染色する方法が必要です。このメソッドでは、DNA は染料と平衡に DNA を許可する一晩シアニン系感光色素と汚れます。次に、ステンド グラスの DNA は制限の酵素と消化され、ゲルに読み込まれ、electrophoresed。実験的 DNA ダイジェスト バンドは、制限酵素活性を決定するインシリコダイジェストと比較されます。期待どおりに、バンドの同じ数がある、反作用は完了です。部分消化を示す予想よりもより多くのバンドおよびより少ないバンド不完全な消化力を示します。この方法の利点は、そのシンプルさと科学者が制限の酵素の必要な機器を使用して試金およびゲルの電気泳動。このメソッドの制限はほとんどの科学者に利用可能な酵素が市販の酵素;ただし、任意の制限酵素を使用可能性があります。

正しい順序で手順を実行する必要がありますデュアルインターカレーションの色素は DNA を消化制限の酵素に影響を与える場合を決定するために (図 1) に続いた。DNA を染色し、特定の酵素と消化され、一度は、フラグメントとサイズ (図 2) の数を決定するゲルの画像を取得できます。ために酵素の効率、予想される目に見えるバンド目に見えるバンドの数で割った値の合計数を決定します。バンドの数が予想される場合、団結に匹敵する酵素の効率と見た試合。次に予想されるゲルの他のバンドがある場合、値が 1 より大きいと部分的に消化反応を示します。予想以下のバンドが存在する場合、値が 1 より小さい、不完全な消化力を示すです。図 2 a3 と 4 の車線ショー バンドの可動性が減少している、井戸へのシフトがバンドの原因。1 と 2 の車線、バンド コントロールに一致するので色素の量は、モビリティを著しく、影響としません。図 2 a5 と 6 レーンはので、部分消化コントロールよりも多くのバンドを示します。つまり、染料はその酵素の認識部位で DNA の開裂を影響を受けます。図 2 b、期待されるすべてのバンドは、染料は DNA の消化力に干渉しないようにすべての染料濃度に見られています。図 2 cトラック移動色アスタリスクでシフトします。
染料濃度-1、移動性を持つ染料の減少を増加します。バンドのおおよそのサイズを判断するためにコントロールのネイティブの DNA 分子を必要とする場所を知っている (図 2 a) のステンド グラスの DNA と比較して必要です。-3 で染料の移動性は減少しなかった-1 染料でした、という程度に (図 2 b) フラグメント サイズを決定する簡単だったので。モビリティ違いは Maschmannらに見られるように、染料のタイプのため、します。25。これらの染料の分散は染料の構造にみられます。染料-3 の芳香環の間のリンカーは-1 よりも長かった。染料がなぜ移動性シフトは-3 染料のために以下を説明するかもしれないリンカーのサイズの違いにより若干異なるインターカ レートします。
DNA がないまたは DNA バンドがゲルで非常にかすかな、DNA の濃度を増やすことが必要です。ただし、DNA 濃度が増加した場合、必要な染料の量も増えます DNA 比正しい染料濃度を維持します。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57141/57141fig1.jpg"> 図 1:DNA 分子をラベル付けされる螢光色素を消化に必要な手順の概略をします。DNA やヨーヨー-1 TOTO シリーズから別の染料は黒いチューブに追加され、培養一晩 (O ・ N; 15-20 h)。制限酵素は、管に追加されます。2-4 h (表 2) の最寄り温のインキュベーターで置かれます。1 x TAE バッファーを使った浸漬の 0.7% の agarose のゲルにサンプルをロードします。ジェル ボックスとライトがオフ、ゲルは、濃い色の紙カバーを色素の電子スピンダイナミクスを防ぐために夜通し走った。<a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57141/57141fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57141/57141fig2.jpg"> 図 2:シアニン ダイマー色素をインターカ レートした DNA の制限の消化力。(、) ラムダ DNA は染色ヨーヨー 1 の異なる濃度の一夜 (レーン c: 消化色素 (コントロール)、レーン 1: 1.9 ng、レーン 2: 3.8 ng、車線 3: 19.4 ng、レーン 4: 32.2 ng、レーン 5: 48.3 ng、100 ごとに染料のレーン 6: 63.5 ng ラムダ DNA DNA の ng) と、dige2-4 h の 37 ° C に EcoRI で stedすべての反応を electrophoresed (E = 0.85 V/cm) 0.7% 高のゲル化温度 (先ず) agarose のゲルを使った 1 x TAE バッファー (1 x TAE; 40 mM 20 mM 酢酸トリス塩酸 1 mM EDTA)。ゲルは、エチジウム ブロマイドで染色し、撮像カメラと結合した青い光 transilluminator。レーン L は 1 kb のはしご (サイズ、kb)レーン λ はラムダ DNA をフルの長さ;レーン E は期待されるバンド パターン (サイズ、kb) です。ヨーヨー 3 (b) ラムダ DNA を染色 (1: 1.9 ng のレーン、レーン 2: 3.8 ng、レーン 3: 19.4 ng、レーン 4: 32.2 ng、レーン 5: 48.3 ng、100 ごとに染料のレーン 6: 63.5 ng DNA の ng) と 37 ° C で HindIII 消化(c) ヨーヨー 1 濃度として移動がどのようにシフトしては増えましたが、各ヨーヨー 1 濃度の各バンドの横に色付きのアスタリスクがあります。たとえば、3.5 kb のバンドは、各ヨーヨー 1 濃度の各バンドの横に赤色のアスタリスクを持ちます。5 と 6 の車線の予期しないバンドはバンドの横にアスタリスクを持っていません。Maschmannらからの図が変更されました。25. 著作権 (2017) ヌクレオシド、ヌクレオチド、核酸。<a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57141/57141fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>化学名</td>
			<td>省略名</td>
			<td>Ex/Em (nm)</td>
		</tr>
<tr>
<td>[(1-1 '-[1, 3-propanediylbis [(dimethyliminio) - 3, 1 - propanediyl] ビス [4-[(3-メチル-2(3H)-benzothiazolylidene) メチル]-、四ヨウ化</td>
			<td>トト-1</td>
			<td>514/533</td>
		</tr>
<tr>
<td>1, 1 ' - (4,4,8,8-テトラメチル-4, 8-diazaundecamethylene) ビス [4-[(3-methylbenzo-1,3-oxazol-2-yl) methylidene]-l、4 dihydroquinolinium] ヨウ化}</td>
			<td>ヨーヨー 1</td>
			<td>491/509</td>
		</tr>
<tr>
<td>2, 2 '-[1, 3-支柱-anediylbis [(dimethyliminio) - 3, 1 - propanediyl-1 (4 H) - pyridinyl - 4-ylidenemethylid - イン] ビス [3-メチル]-、四ヨウ化</td>
			<td>ポ 1</td>
			<td>434/456</td>
		</tr>
<tr>
<td>2, 2 '-[1, 3-propanediylbis [(dimethylimi-nio)-3, 1-propanediyl-1(4H) - pyridinyl - 4-1、1 ′-[4,8-bis(dimethyliminio)undecane-1,11-diyl]bis{4-[3-(3-methyl-1,3-benzothiazol-2(3H)-ylidene)prop-1-en-1-yl]qui-nolinium}</td>
			<td>ボボ 1</td>
			<td>462/481</td>
		</tr>
<tr>
<td>2, 2 '-{[4, 8-ビス (dimethyliminio) ウンデカン-1, 11-diyl] ビス [キノリン-1-イル-4-ylideneprop-1-en-1-yl-3-ylidene]}bis(3-methyl-1,3-benzothiazol-3-ium) tetraio-dide</td>
			<td>トト 3</td>
			<td>642/660</td>
		</tr>
<tr>
<td>1, 1 '-[1, 3-propanediylbis [(dimethyliminio) - 3, 1 - propanediyl] ビス [4 - [3-(3-methyl-2(3H)-benzoxazolylidene)-1-propenyl]]-、ヨウ化</td>
			<td>ヨーヨー 3</td>
			<td>612/631</td>
		</tr>
<tr>
<td>2, 2 '-[1, 3-propanediylbis [(dimethyliminio) - 3, 1 - propanediyl-1 (4 H) - pyridinyl - 4 - ylidene-1-pr-open-1-yl-3-ylidene]]bis[3-methyl]-、四ヨウ化</td>
			<td>ポポ 3</td>
			<td>534/570</td>
		</tr>
<tr>
<td>ヨウ化 2,2'-{propane-1,3-diylbis[(dimethylazaniumdiyl)propane-3,1-diylpyridin-1-yl-4-ylideneprop-1-en-1-yl-3-ylidene]}bis(3-methyl-1,3-benzothiazol-3-ium)</td>
			<td>ボーボボ 3</td>
			<td>570/602</td>
		</tr>
</tbody></table>表 1:染料のトト家族の名前と放出 (Em) と (Ex) maximima22励起 IUPAC 名を省略します。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>酵素</td>
			<td>メチル化敏感な</td>
			<td>バッファー</td>
			<td>お風呂の水の温度</td>
		</tr>
<tr>
<td>病原</td>
			<td>違います</td>
			<td>2</td>
			<td>37 ° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>EcoRI</td>
			<td>うん</td>
			<td>2</td>
			<td>37 ° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>HindIII</td>
			<td>違います</td>
			<td>2</td>
			<td>37 ° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>PmlI</td>
			<td>うん</td>
			<td>1</td>
			<td>37 ° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>ScaI</td>
			<td>違います</td>
			<td>2</td>
			<td>37 ° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>SmaI</td>
			<td>うん</td>
			<td>3</td>
			<td>25 ° C</td>
		</tr>
</tbody></table>表 2:の表にはこれらの実験で使用することが可能な酵素のサブセット。3 つの酵素、メチル化敏感な 3 はメチル化敏感ではありません。各酵素酵素と培養温度に使用されるバッファーが表示されます。

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Determining if DNA Stained with a Cyanine Dye Can Be Digested with Restriction Enzymes

蛍光顕微鏡用 dna を染色科学者実験中にそれらを表示することができます。今回紹介した方法で DNA 分子は事前に蛍光染料で染色された、メチル化および非メチル化敏感な制限の酵素と消化されます。

DNA 染色、シアニン色素が消化される制限の酵素とかどうかを決定します。

Visualization of DNA for fluorescence microscopy utilizes a variety of dyes such as cyanine dyes. These dyes are utilized due to their high affinity and ...

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Nanyang Technological University

Research

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Biochemistry

8.7K ビュー.  University of Nebraska - Kearney. 蛍光顕微鏡用 dna を染色科学者実験中にそれらを表示することができます。今回紹介した方法で DNA 分子は事前に蛍光染料で染色された、メチル化および非メチル化敏感な制限の酵素と消化されます。

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Highly Sensitive and Rapid Fluorescence Detection with a Portable FRET Analyzer

Recent improvements in F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) sensors have enabled their use to detect various small molecules including ions and amino acids. However, the innate weak signal intensity of FRET sensors is a major challenge that prevents their application in various fields and makes the use of expensive, high-end fluorometers necessary. Previously, we built a cost-effective, high-performance FRET analyzer that can specifically measure the ratio of two emission wavelength bands (530 and 480 nm) to achieve high detection sensitivity. More recently, it was discovered that FRET sensors with bacterial periplasmic binding proteins detect ligands with maximum sensitivity in the critical temperature range of 50 - 55 &#176;C. This report describes a protocol for assessing sugar content in commercially-available beverage samples using our portable FRET analyzer with a temperature-specific FRET sensor. Our results showed that the additional preheating process of the FRET sensor significantly increases the FRET ratio signal, to enable more accurate measurement of sugar content. The custom-made FRET analyzer and sensor were successfully applied to quantify the sugar content in three types of commercial beverages. We anticipate that further size reduction and performance enhancement of the equipment will facilitate the use of hand-held analyzers in environments where high-end equipment is not available.

This protocol describes the rapid and highly sensitive quantification of F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) sensor data using a custom-made portable FRET analyzer. The device was used to detect maltose within a critical temperature range that maximizes detection sensitivity, enabling practical and efficient assessment of sugar content.

ポータブルFRETアナライザを使用して高感度かつ迅速な蛍光検出

Recent improvements in F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) sensors have enabled their use to detect various small molecules including ions and ...

生化学

Sheathless Capillary Electrophoresis&#8211;Mass Spectrometry for Metabolic Profiling of Biological Samples

In metabolomics, a wide range of analytical techniques is used for the global profiling of (endogenous) metabolites in complex samples. In this paper, a protocol is presented for the analysis of anionic and cationic metabolites in biological samples by capillary electrophoresis&#8211;mass spectrometry (CE-MS). CE is well-suited for the analysis of highly polar and charged metabolites as compounds are separated on the basis of their charge-to-size ratio. A recently developed sheathless interfacing design, i.e., a porous tip interface, is used for coupling CE to electrospray ionization (ESI) MS. This interfacing approach allows the effective use of the intrinsically low-flow property of CE in combination with MS, resulting in nanomolar detection limits for a broad range of polar metabolite classes. The protocol presented here is based on employing a bare fused-silica capillary with a porous tip emitter at low-pH separation conditions for the analysis of a broad array of metabolite classes in biological samples. It is demonstrated that the same sheathless CE-MS method can be used for the profiling of cationic metabolites, including amino acids, nucleosides and small peptides, or anionic metabolites, including sugar phosphates, nucleotides and organic acids, by only switching the MS detection and separation voltage polarity. Highly information-rich metabolic profiles in various biological samples, such as urine, cerebrospinal fluid and extracts of the glioblastoma cell line, can be obtained by this protocol in less than 1 hr of CE-MS analysis.

A protocol for metabolic profiling of biological samples by capillary electrophoresis&#8211;mass spectrometry using a sheathless porous tip interface design is presented.

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In metabolomics, a wide range of analytical techniques is used for the global profiling of (endogenous) metabolites in complex samples. In this paper, a ...

Imaging Amyloid Tissues Stained with Luminescent Conjugated Oligothiophenes by Hyperspectral Confocal Microscopy and Fluorescence Lifetime Imaging

Proteins that deposit as amyloid in tissues throughout the body can be the cause or consequence of a large number of diseases. Among these we find neurodegenerative diseases such as Alzheimer&#39;s and Parkinson&#39;s disease afflicting primarily the central nervous system, and systemic amyloidosis where serum amyloid A, transthyretin and IgG light chains deposit as amyloid in liver, carpal tunnel, spleen, kidney, heart, and other peripheral tissues. Amyloid has been known and studied for more than a century, often using amyloid specific dyes such as Congo red and Thioflavin T (ThT) or Thioflavin (ThS). In this paper, we present heptamer-formyl thiophene acetic acid (hFTAA) as an example of recently developed complements to these dyes called luminescent conjugated oligothiophenes (LCOs). hFTAA is easy to use and is compatible with co-staining in immunofluorescence or with other cellular markers. Extensive research has proven that hFTAA detects a wider range of disease associated protein aggregates than conventional amyloid dyes. In addition, hFTAA can also be applied for optical assignment of distinct aggregated morphotypes to allow studies of amyloid fibril polymorphism. While the imaging methodology applied is optional, we here demonstrate hyperspectral imaging (HIS), laser scanning confocal microscopy and fluorescence lifetime imaging (FLIM). These examples show some of the imaging techniques where LCOs can be used as tools to gain more detailed knowledge of the formation and structural properties of amyloids. An important limitation to the technique is, as for all conventional optical microscopy techniques, the requirement for microscopic size of aggregates to allow detection. Furthermore, the aggregate should comprise a repetitive &#946;-sheet structure to allow for hFTAA binding. Excessive fixation and/or epitope exposure that modify the aggregate structure or conformation can render poor hFTAA binding and hence pose limitations to accurate imaging.

Amyloid deposition is a hallmark of different diseases and afflicts many different organs. This paper describes the application of luminescent conjugated oligothiophene fluorescence staining in combination with fluorescence microscopy techniques. This staining method represents a powerful tool for detection and exploration of protein aggregates in both clinical and scientific setups.

アミロイド組織イメージング ステンド グラス ハイパー スペクトルで発光共役オリゴチオフェンと共焦点顕微鏡と蛍光寿命イメージング

Proteins that deposit as amyloid in tissues throughout the body can be the cause or consequence of a large number of diseases. Among these we find ...

Dual DNA Rulers to Study the Mechanism of Ribosome Translocation with Single-Nucleotide Resolution

The ribosome translocation refers to the ribosomal movement on the mRNA by exactly three nucleotides (nt), which is the central step in protein synthesis. To investigate its mechanism, there are two essential technical requirements. First is single-nt resolution that can resolve normal translocation from frameshifting, during which the ribosome moves by other than 3 nt. The second is the capability to probe both the entrance and exit sides of mRNA in order to elucidate the whole picture of translocation. We report the dual DNA ruler assay that is based on the critical dissociation forces of DNA-mRNA duplexes, obtained by force-induced remnant magnetization spectroscopy (FIRMS).&#160; With 2-4 pN force resolution, the dual ruler assay is sufficient to distinguish different translocation steps. By implementing a long linker on the probing DNAs, they can reach the mRNA on the opposite side of the ribosome, so that the mRNA position can be determined for both sides. Therefore, the dual ruler assay is uniquely suited to investigate the ribosome translocation, and nucleic acid motion in general. We show representative results which indicated a looped mRNA conformation and resolved normal translocation from frameshifting.

Dual DNA ruler assay is developed to determine the mRNA position during ribosome translocation, which relies on the dissociation forces of the formed DNA-mRNA duplexes. With single-nucleotide resolution and capability of reaching both ends of mRNA, it can provide mechanistic insights for ribosome translocation and probe other nucleic acid displacements.

単一ヌクレオチド分解能を持つリボソーム転移のメカニズムを研究するデュアルDNA定規

The ribosome translocation refers to the ribosomal movement on the mRNA by exactly three nucleotides (nt), which is the central step in protein synthesis. ...

Characterizing Cellular Proteins with In-cell Fast Photochemical Oxidation of Proteins

Fast photochemical oxidation of proteins (FPOP) is a hydroxyl radical protein footprinting method used to characterize protein structure and interactions. FPOP uses a 248 nm excimer laser to photolyze hydrogen peroxide producing hydroxyl radicals. These radicals oxidatively modify solvent exposed side chains of 19 of the 20 amino acids. Recently, this method has been used in live cells (IC-FPOP) to study protein interactions in their native environment. The study of proteins in cells accounts for intermolecular crowding and various protein interactions that are disrupted for in vitro studies. A custom single cell flow system was designed to reduce cell aggregation and clogging during IC-FPOP. This flow system focuses the cells past the excimer laser individually, thus ensuring consistent irradiation. By comparing the extent of oxidation produced from FPOP to the protein&#39;s solvent accessibility calculated from a crystal structure, IC-FPOP can accurately probe the solvent accessible side chains of proteins.

Here, we characterize protein structure and interaction sites in living cells using a protein footprinting technique termed in-cell fast photochemical oxidation of proteins (IC-FPOP).

細胞内高速光化学タンパク質による細胞タンパク質の特性分析

Fast photochemical oxidation of proteins (FPOP) is a hydroxyl radical protein footprinting method used to characterize protein structure and interactions. ...

Single-Molecule Dwell-Time Analysis of Restriction Endonuclease-Mediated DNA Cleavage

This novel total internal reflection fluorescence microscopy-based assay facilitates the simultaneous measurement of the length of the catalytic cycle for hundreds of individual restriction endonuclease (REase) molecules in one experiment. This assay does not require protein labeling and can be carried out with a single imaging channel. In addition, the results of multiple individual experiments can be pooled to generate well-populated dwell-time distributions. Analysis of the resulting dwell-time distributions can help elucidate the DNA cleavage mechanism by revealing the presence of kinetic steps that cannot be directly observed. Example data collected using this assay with the well-studied REase, EcoRV - a dimeric Type IIP restriction endonuclease that cleaves the palindromic sequence GAT&#8595;ATC (where &#8595; is the cut site) - are in agreement with prior studies. These results suggest that there are at least three steps in the pathway to DNA cleavage that is initiated by introducing magnesium after EcoRV binds DNA in its absence, with an average rate of 0.17 s-1 for each step.

Using quantum-dot-labeled DNA and total internal reflection fluorescence microscopy, we can investigate the reaction mechanism of restriction endonucleases while using unlabeled protein. This single-molecule technique allows for massively multiplexed observation of individual protein-DNA interactions, and data can be pooled to generate well-populated dwell-time distributions.

制限エンドヌクレアーゼ媒介性DNA切断の1分子滞留時間解析

This novel total internal reflection fluorescence microscopy-based assay facilitates the simultaneous measurement of the length of the catalytic cycle for ...

Cryo-EM and Single-Particle Analysis with Scipion

Cryo-electron microscopy has become one of the most important tools in biological research to reveal the structural information of macromolecules at near-atomic resolution. In single-particle analysis, the vitrified sample is imaged by an electron beam and the detectors at the end of the microscope column produce movies of that sample. These movies contain thousands of images of identical particles in random orientations. The data need to go through an image processing workflow with multiple steps to obtain the final 3D reconstructed volume. The goal of the image processing workflow is to identify the acquisition parameters to be able to reconstruct the specimen under study. Scipion provides all the tools to create this workflow using several image processing packages in an integrative framework, also allowing the traceability of the results. In this article the whole image processing workflow in Scipion is presented and discussed with data coming from a real test case, giving all the details necessary to go from the movies obtained by the microscope to a high resolution final 3D reconstruction. Also, the power of using consensus tools that allow combining methods, and confirming results along every step of the workflow, improving the accuracy of the obtained results, is discussed.

Single-particle analysis in cryo-electron microscopy is one of the main techniques used to determine the structure of biological ensembles at high resolution. Scipion provides the tools to create the whole pipeline to process the information acquired by the microscope and achieve a 3D reconstruction of the biological specimen.

クリオEMとシピオンによる単粒子分析

Cryo-electron microscopy has become one of the most important tools in biological research to reveal the structural information of macromolecules at ...

Continuous Fluorescence-Based Endonuclease-Coupled DNA Methylation Assay to Screen for DNA Methyltransferase Inhibitors

DNA methylation, a form of epigenetic gene regulation, is important for normal cellular function. In cells, proteins called DNA methyltransferases (DNMTs) establish and maintain the DNA methylation pattern. Changes to the normal DNA methylation pattern are linked to cancer development and progression, making DNMTs potential cancer drug targets. Thus, identifying and characterizing novel small molecule inhibitors of these enzymes is of great importance. This paper presents a protocol that can be used to screen for DNA methyltransferase inhibitors. The continuous coupled kinetics assay allows for initial velocities of DNA methylation to be determined in the presence and absence of potential small molecule inhibitors. The assay uses the methyl-sensitive endonuclease Gla I to couple methylation of a hemimethylated DNA substrate to fluorescence generation.
This continuous assay allows for enzyme activity to be monitored in real time. Conducting the assay in small volumes in microtiter plates reduces the cost of reagents. Using this assay, a small example screen was conducted for inhibitors of DNMT1, the most abundant DNMT isozyme in humans. The highly substituted anthraquinone natural product, laccaic acid A, is a potent, DNA-competitive inhibitor of DNMT1. Here, we examine three potential small molecule inhibitors &#8212; anthraquinones or anthraquinone-like molecules with one to three substituents &#8212; at two concentrations to describe the assay protocol. Initial velocities are used to calculate the percent activity observed in the presence of each molecule. One of three compounds examined exhibits concentration-dependent inhibition of DNMT1 activity, indicating that it is a potential inhibitor of DNMT1.

DNA methyltransferases are potential cancer drug targets. Here, a protocol is presented to assess small molecules for DNA methyltransferase inhibition. This assay utilizes an endonuclease to couple DNA methylation to fluorescence generation and allows for enzyme activity to be monitored in real time.&#160;

DNAメチルトランスフェラーゼ阻害剤をスクリーニングするための連続蛍光ベースのエンドヌクレアーゼ共役DNAメチル化アッセイ(英語)

DNA methylation, a form of epigenetic gene regulation, is important for normal cellular function. In cells, proteins called DNA methyltransferases (DNMTs) ...

Preparation of Nucleosome Core Particles Complexed with DNA Repair Factors for Cryo-Electron Microscopy Structural Determination

DNA repair in the context of chromatin is poorly understood. Biochemical studies using nucleosome core particles, the fundamental repeating unit of chromatin, show most DNA repair enzymes remove DNA damage at reduced rates as compared to free DNA. The molecular details on how base excision repair (BER) enzymes recognize and remove DNA damage in nucleosomes have not been elucidated. However, biochemical BER data of nucleosomal substrates suggest the nucleosome presents different structural barriers dependent on the location of the DNA lesion and the enzyme. This indicates the mechanisms employed by these enzymes to remove DNA damage in free DNA may be different than those employed in nucleosomes. Given that the majority of genomic DNA is assembled into nucleosomes, structural information of these complexes is needed. To date, the scientific community lacks detailed protocols to perform technically feasible structural studies of these complexes. Here, we provide two methods to prepare a complex of two genetically fused BER enzymes (Polymerase &#946; and AP Endonuclease1) bound to a single-nucleotide gap near the entry-exit of the nucleosome for cryo-electron microscopy (cryo-EM) structural determination. Both methods of sample preparation are compatible for vitrifying quality grids via plunge freezing. This protocol can be used as a starting point to prepare other nucleosomal complexes with different BER factors, pioneer transcription factors, and chromatin-modifying enzymes.

This protocol outlines in detail the preparation of nucleosomal complexes using two methods of sample preparation for freezing TEM grids.

クライオ電子顕微鏡による構造決定のためのDNA修復因子と複合体を形成したヌクレオソームコア粒子の作製

DNA repair in the context of chromatin is poorly understood. Biochemical studies using nucleosome core particles, the fundamental repeating unit of ...

Determining the Thermodynamic and Kinetic Association of a DNA Aptamer and Tetracycline Using Isothermal Titration Calorimetry

The determination of binding affinity and behavior between an aptamer and its target is the most crucial step in selecting and using an aptamer for application. Due to the drastic differences between the aptamer and small molecules, scientists need to put much effort into characterizing their binding properties. Isothermal Titration Calorimetry (ITC) is a powerful approach for this purpose. ITC goes beyond determining disassociation constants (Kd) and can provide the enthalpy changes and binding stoichiometry of the interaction between two molecules in the solution phase. This approach conducts continuous titration using label-free molecules and records released heat over time upon the binding events produced by each titration, so the process can sensitively measure the binding between macromolecules and their small targets. Herein, the article introduces a step-by-step procedure of the ITC measurement of a selected aptamer with a small target, tetracycline. This example proves the versatility of the technique and its potential for other applications.

The present protocol describes the use of Isothermal Titration Calorimetry (ITC) to analyze the association and dissociation kinetics of the binding between a DNA aptamer and tetracycline, including sample preparation, running standards and samples, and interpreting the resulting data.

等温滴定熱量測定を用いたDNAアプタマーとテトラサイクリンの熱力学的および速度論的会合の決定(英語)

The determination of binding affinity and behavior between an aptamer and its target is the most crucial step in selecting and using an aptamer for ...