この手順の全体的な目標は、ショウジョウバエのニューロンの発達中に樹状樹状の樹状樹状ニューロンの複雑さに対するSOX5遺伝子の影響を観察することです。この方法は、神経変性疾患遺伝子をよりよく理解するために、神経デンドライトの形態形成、および神経系の発達における遺伝子機能を研究するのに役立ちます。最終的にこの技術は、多くの異なるタイプの神経デンドライトで使用することができるデンドライトの複雑さの定量分析を提供する。
この技術の意味は、突然変異が遺伝子機能を理解する鍵を握るため、神経変性疾患の遺伝的メカニズムにまで及ぶ。UAS-Sox102F-RNAi株ハエまたはW118コントロールを備えたUAS-GFP;ppk-GAL4のセットアップクロス。25°Cの標準的な条件でハエを培養します。
約5〜6日で、鉗子を使用して3番目のインスター幼虫を慎重に採取して解剖を行います。シリコンエラストマーベースで作られた解剖皿に幼虫を入れ、組織培養ペトリ皿。その後、解剖顕微鏡の下に皿を置きます。
次に、幼虫の尾をピン留めして、正中線を露出します。その後、幼虫の口のフックをピン留めして、幼虫の後側が上がるようにします。今すぐ溶液に幼虫を浸すために皿にPBSの200マイクロリットルを追加します。
次に幼虫の尻尾と口を小さな切開で切ります。その後、幼虫を後頭線に沿って開き、2つの気管の間に切り取り、尾道から鼻孔に向かいます。その後、体が平らに横たわっているように、体の4つのコーナーのそれぞれにピンを置きます。
今度は幼虫の体壁を室温で25分間PFAの4%に固定します。その後、PBSで幼虫を1回5分間3回洗います。この後、ピンを取り外し、ガラススライドに組織を移します。
次に、アンチフェード実装媒体に組織を浸し、カバースリップで装着します。取り付けられたティッシュが指の爪の磨きでカバースリップに密封する前に1時間空気乾燥することを許す。これらのスライドは、摂氏4度の暗闇の中に保管してください。
20Xの目的を使用して、共焦点顕微鏡でZシリーズ画像をキャプチャします。まず、幼虫の体壁に全てのDAニューロンを含むようにzステップの範囲を設定し、ステップサイズを半マイクロメートルに設定します。次に、イメージを TIF または ND2 ファイルとして保存して処理します。
次に、DAニューロン上の樹状突起の数と形態を評価する。まず、長さを評価します。まず、フィジーImageJでは、必要に応じて画像を別々のチャンネルに分割します。
評価が必要なのは GFP チャネルのみです。次に、Z 投影を作成します。新しいウィンドウで、投影タイプの最大強度を選択し、開始スライスと終了スライスを選択します。
次に[OK]をクリックして、透明な樹状突起を持つ Z 投影イメージを作成します。プラグインツールを使用して、Neurite をトレースします。まず、興味のあるニューロンの相馬に行き、細胞体から1つの樹状突起が出てくる場所をクリックします。
次に、このデンドライトの先端をクリックします。2 つの点を結ぶ青い線が、ニューライトの長さを実行している場合は、Y を押して yes を押します。次に、この線がニューライトの完全パスに適合する場合は、[完全パス]をクリックします。
線がパスに適合しない場合は、このニューライトに沿ってさらにポイントをクリックして、パスを複数の線分セグメントに曲げ、ニューライトの長さに合わせます。次に、[完全なパス] をクリックし、次のニューライトのパスをマークします。すべてのトレース パスを完了したら、[解析]、[パスの計測] オプションを選択して、パスを CSV ファイルにエクスポートします。
このデータを使用して、解析用のパス長の値を計算し、平均します。次に、ニューロンの表面積を計算します。まず、フィジーの ImageJ ウィンドウからフリーハンド描画ツールを選択します。
次に、対象となるニューロンの終点を接続します。次に、[分析] ウィンドウから [測定] オプションを選択します。結果が、選択した領域の値を持つ新しいボックスに表示されます。
この値をデータ分析ソフトウェアにコピーします。最後に、スケルトン化されたパスの分析プラグインを使用して、ブランチの合計数を計算します。DAニューロンの樹状突起は、GFP蛍光イメージング分析のために、その相腫と樹状突起アーバーのGFPを過剰発現させることによって標識された。
デンドライトの形態を反転共焦点顕微鏡を用いて画像化した。DAニューロンの樹状突起は、記載されているように追跡された。このファイルは、デンドライトの長さを推定するために使用されました。
第3インスター幼虫のDAニューロンにおけるSox102Fのサイレンシングは、枝の長さの約半分とより単純な構造で樹状突起の総数を大幅に減少させ、枝の数の半分しか示していない。論理的には、これはアーバー表面積の減少につながった。このプロトコルは、DA感覚ニューロンの発達を評価するための迅速な方法を提供する。
この手順を試みている間、良好なカバレッジを得るためにDAニューロンの各グループの画像の十分な数を取るようにしてください。この手順に従って、デンドライトの開発に関する追加の質問に答えるために、樹状突起分析のような他の方法を実行することができます。開発以来、この技術は、神経科学の分野の研究者がモデルシステムを使用してアルツハイマー病などの神経変性疾患に推論するのを助けました。
