テクニカル サポート、アリナ ・ ハリーリとマルチナ Hajduskova に感謝します。コメントの Tursun グループのメンバーは、原稿に感謝いたします。この仕事は ERC StG-2014 637530 し ERC CIG PCIG12-ジョージア州-2012-333922 が主催した、ヘルムホルツ協会における分子医学のマックス Delbrueck センターとしています。

動物のケアに関してここで説明したすべてのメソッドは、LaGeSo ベルリン、ドイツによって承認されています。
1. ソリューションの準備
<ol>
	<li>NGM 寒天 (1 L)
	<ol>
		<li>塩化ナトリウム 3 g、ペプトン メディア (例えば、バクト-ペプトン)、2.5 g、寒天 20 g を追加します。コレステロール (95% エタノール入荷 5 mg/mL) の 1 mL を 1 mL の 1 追加、オートクレーブから出した後 M MgSO41 M CaCl2 の 1 mL、1 M K2PO4、25 mL、1 mL アムホテリシン B (2.5 mg/mL 在庫) の。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>NGM 寒天 RNAi プレート (1 L)
	<ol>
		<li>塩化ナトリウム 3 g、ペプトン メディアの 2.5 g、寒天 20 g を追加します。オートクレーブ後追加、コレステロール (95% エタノール入荷 5 mg/mL) の 1 mL 1 M MgSO4の 1 mL、1 mL 1 M CaCl2 の 1 M K2PO4の 25 mL、1 mL アムホテリシン B (2.5 mg/mL 在庫) の 1 M IPTG の 1 mL、と 1 mL carbenicillin (50 mg/mL)。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>LB 寒天培地 (1 L)
	<ol>
		<li>ペプトン メディアの 10 g を加えて、5 グラム酵母エキス、, 塩化ナトリウム 5 g 寒天、1 M トリス pH 8.0 の 10 mL の 20 g。1 l H2O を追加します。オートクレーブ後、50 mg/mL carbenicillin 1 mL と 5 mg/mL テトラサイクリンの 2.5 mL を追加します。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>LB 培地 (1 L)
	<ol>
		<li>ペプトン メディアの 10 g を加えて、5 グラム酵母エキス、, 塩化ナトリウム 5 g 及び 10 mL 1 M トリス pH 8.0 の。1 l H2O を追加します。オートクレーブ後、50 mg/mL carbenicillin の 1 つの mL を追加します。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>M9-バッファー (1 L)
	<ol>
		<li>ゼラチンの 50 mg, 塩化ナトリウム 5 g、KH2PO4の 3 g の Na2HPO46.0 g を追加します。使用する前に 1 M MgSO4の 1 mL を追加します。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>漂白液 (10 mL)
	<ol>
		<li>1 mL NaClO と 5 N NaOH の 2 mL を追加します。10 ml の H2O を追加します。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. RNAi プレートの準備
注: c. の elegans線虫成長培地寒天培地 (NGM 寒天)10,11の 7.5 mL を含む 6 cm ペトリ プレートに研究室で培養通常。このプロトコルはワーム 15 ° C で保管に最適です。NGM のプレートを準備、真菌や細菌の汚染を防ぐために標準的な滅菌技術を使用します。以下は、RNAi の試薬を添加した NGM プレートを準備するためのプロトコルです。
<ol>
	<li>1 mM イソプロピル β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) および 50 μ G/ml carbenicillin を含む 6 cm NGM 寒天 RNAi プレートを準備します。暗い12に室温で 24-48 時間乾燥させます。
	<ol>
		<li>暗闇の中で 4 ° C で RNAi プレートを保ちます。14 日を過ぎた場合は使用しないでください。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>LB 寒天培地プレート 50 μ g/mL を含む利用可能な RNAi ライブラリ13から冷凍のグリセロール ストックから林 53遺伝子の dna 塩基配列と L4440 プラスミッドを含んでいる RNAi 細菌 (大腸菌 HT115) クローンを選択します。carbenicillin と三相光線パターンを使用して 12.5 μ g/mL テトラサイクリン。37 ° C 夜間12時細菌を育てます。このクローンは、IPTG による産生細菌の林 53 dsRNA をことができます。
	<ol>
		<li>さらに、空のベクター コントロール14として任意の遺伝子順序なし L4440 プラスミドを含む RNAi 細菌を育てます。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>次の日林 53から単一コロニーを選択化やチップ 200 μ L ピペットを使用して空のベクター LB 寒天培地プレート 50 μ G/ml carbenicillin を補充する液体 LB 中14の 2 mL を含む別の文化管にそれらのそれぞれを接種します。600 で光学濃度 (OD) に達するまでに 37 ° C で一晩文化を成長 nm の 0.6-0.8。分光光度計15を使用して外径を測定します。 注意: 液体の LB 媒体は、減少の RNAi 効率12リードを給餌中にテトラサイクリンの包含以来グリセロール ストックから細菌をストリー キング用 LB 寒天培地プレートと対照をなしてテトラサイクリンを含めないでください。</li>
	<li>6 cm RNAi NGM 寒天プレートに、multipipette を使用して各培養 (林 53または空のベクター) 500 μ L を追加します。一晩常温乾燥する暗闇の中で閉じた蓋付きプレートを孵化させなさい。この時間の間に NGM プレートに IPTG は細菌の dsRNA の生産を誘発します。
	<ol>
		<li>細菌培養実験あたりにつき少なくとも 3 プレートを使用します。これは、各実験の 3 技術をレプリケートが提供されます。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>暗闇の中 2 週間乾燥 NGM 寒天 RNAi 板 4 ° C で細菌を格納します。</li>
</ol>
3.線虫株 BAT28 の作製
<ol>
	<li>ワームひずみ BAT288遺伝子otIs305を含むを維持 [hsp-16.2prom::che-1、rol-6(su1006)] とntIs1 [gcy 5prom::gfp] OP50 細菌 15 ° C で標準 NGM 寒天を使用 注: 線虫文化に詳しいプロトコルは、10を参照してください。Rol-6(su1006)は支配的な対立遺伝子を一般的に使用される典型的なローリング運動を引き起こす表現型インジェクション マーカー16 。OtIs305遺伝子の追跡に使用されますhsp-16.2prom::che-1。<ol>
		<li>維持される活性化を防ぐためにすべての回で 15 ° C で BAT28 株、 hsp-16.2prom::che-1遺伝子。可能な限り多くのひずみを処理しながら 15 ° C 以上の高温への露出を減らします。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>ワームを年齢同期するには、漂白法17を使用します。
	<ol>
		<li>大人と 900 μ L M9 バッファーを使用して BAT28 の卵を含む 6 cm NGM 寒天プレートを洗浄します。1 分の 900 × g で遠心分離によってペレットのワームは、上澄みを除去します。</li>
		<li>0.5-1 mL のソリューションを漂白を追加、大人のワームが開いてバーストを開始するまで約 1 分の管を振る。標準的な顕微鏡を使用して監視します。</li>
		<li>1 分の 900 × g で遠心分離によってペレットのワームは、上澄みを除去します。</li>
		<li>M9 バッファーの 800 μ L を追加し、900 × g で遠心分離によってワーム餌 3 回を洗浄します。</li>
		<li>新鮮な NGM プレート OP50 細菌とシードに掃除の卵を配置します。15 ° C で OP50 細菌に漂白された人口は、L4 段階 (約 4 日) に達するまでに成長します。L4 の幼虫は、標準的な顕微鏡を使用してワーム18の腹側の約半分の位置の白いパッチが認識できます。 注:林 53の枯渇時にニューロンの変換の表現型の胚細胞を成し遂げるためには、それは親の世代 (P0) に枯渇する必要です。</li></ol></li></ol>次世代 (F1 雑種世代) をうけて変換表現型の得点します。P0 で既に破壊林 53を成し遂げるためには、L4 動物は RNAi にさらされます。
	
	
	<li>あたり NGM プレートに白金線を使用して任意の細菌を含むしないと転送 OP50 細菌からワームを聞かせてする 50 の L4 段階ワームを手動で転送します。ワームの約 5 分のプレートの移動ができます。NGM 寒天 RNAi プレートから使用細菌は以前それぞれの RNAi プレートに転送する林 53 RNAi 細菌 (または空のベクトル制御) でシード。
	<ol>
		<li>実際の RNAi プレートに OP50 細菌を転送しないようにします。15 ° C 以上の高温ひずみの露光時間を最小限に抑えるために高速動作します。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>15 ° C で RNAi NGM 寒天プレート上でワームは、ワームの F1 子孫 L3-L4 段階に到達するまで約 7 日間インキュベートします。彼ら明確に分離できる P0 動物から彼らは大きく、F1 子孫よりも厚いので。
	<ol>
		<li>視覚的に標準的な顕微鏡の下で図 1に示すように F1 子孫ワームが突出の外陰部 (pvul) の表現型を示すかどうかを確認します。林 53に対する RNAi が有する多面的効果あり林 53に対する RNAi が成功しているかどうかを評価するために使用できるpvulの表現型を引き起こします。 注:林 53に対する RNAi の F1 胎児の致死率もあります。板が 15 ° C よりも高度にさらされている動物 L3-L4 段階に達した前にこの効果が増大します。死胚は、阻止された開発と孵化の欠如によって認識できます。</li>
		<li>IPTG は光に敏感なので、暗闇の版を孵化させなさい。</li>
	</ol>
	</li>

4. 生殖細胞リプログラミングの誘導
<ol>
	<li>林 53を含んでいる検討の RNAi 版を孵化させなさいチェ 1 をアクティブに暗闇の中で 37 ° C で 30 分間ベクトル RNAi 扱われた F1 子孫を空にします。効率的な熱衝撃を与えるのために出されたインキュベーターを使用します。</li>
	<li>暗闇の中で部屋の温度で 30 分間回復し、暗闇の中で一晩 25 ° C でプレートをインキュベーションして熱ショックによる動物を許可します。</li>
	<li>Gcy 5prom::gfpの GFP フィルターの下の動物を調べる蛍光光源に結合された標準的な顕微鏡を使用して-ワームの中間の本体領域の信号を図 2に示すように、派生します。GFP 信号セット顕微鏡: 励起 488 で最大放出 509 で nm nm。</li>
	<li>寒天パッド含む顕微鏡スライド19の中間体領域に GFP 信号取り付け動物によって生殖細胞ニューロンへの変換からの程度を評価します。
	<ol>
		<li>表現型浸透度を評価するために暗い動物対ニューロン変換する胚細胞を示す動物の数をカウントします。通常、約動物の 30% 離散 GFP 信号で表示林 53枯渇時に生殖動物の 5% 以上空のベクター RNAi に生殖細胞のびまん性 GFP シグナルを表示するのに対し。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol>
	<li>Davis, R. L., Weintraub, H., Lassar, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+a+single+transfected+cDNA+converts+fibroblasts+to+myoblasts.">Expression of a single transfected cDNA converts fibroblasts to myoblasts.</a> Cell. 51 (6), (1987).</li><li>Ebrahimi, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reprogramming+barriers+and+enhancers:+strategies+to+enhance+the+efficiency+and+kinetics+of+induced+pluripotency.">Reprogramming barriers and enhancers: strategies to enhance the efficiency and kinetics of induced pluripotency.</a> Cell Regen. , 1-12 (2015).</li><li>Becker, J. S., Nicetto, D., Zaret, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=H3K9me3-Dependent+Heterochromatin:+Barrier+to+Cell+Fate+Changes.">H3K9me3-Dependent Heterochromatin: Barrier to Cell Fate Changes.</a> Trends Gent. 32 (1), 29-41 (2016).</li><li>Tursun, B., Patel, T., Kratsios, P., Hobert, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+Conversion+of+C.+elegans+Germ+Cells+into+Specific+Neuron+Types.">Direct Conversion of C. elegans Germ Cells into Specific Neuron Types.</a> Science. 331 (6015), 304-308 (2011).</li><li>Patel, T., Tursun, B., Rahe, D. 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(47), e2293 (2011).</li><li>Ahringer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reverse+genetics.">Reverse genetics.</a> WormBook. , (2006).</li><li>Kamath, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+functional+analysis+of+the+Caenorhabditis+elegans+genome+using+RNAi.">Systematic functional analysis of the Caenorhabditis elegans genome using RNAi.</a> Nature. 421 (6920), 231-237 (2003).</li><li>Kamath, R. S., Martinez-Campos, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effectiveness+of+specific+RNA-mediated+interference+through+ingested+double-stranded+RNA+in+Caenorhabditis+elegans.">Effectiveness of specific RNA-mediated interference through ingested double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans.</a> Genome Biol. 18 (1), 419357 (2000).</li><li>Ciosk, R., DePalma, M., Priess, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translational+regulators+maintain+totipotency+in+the+Caenorhabditis+elegans+germline.">Translational regulators maintain totipotency in the Caenorhabditis elegans germline.</a> Science. 311 (5762), 851-853 (2006).</li><li>Jin, Y., Hoskins, R., Horvitz, H. 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著者は、競合する利益がないことを宣言しています。

遺伝子組換え線虫を使用して記述されているプロトコル中 BAT28 をひずみし、林 53に対する RNAi は簡単です、一連の手順が順序で重要な神経細胞のリプログラミングに生殖細胞の期待される結果を確保するため。BAT28 ひずみが実験の前にすべての回で 15 ° C で保管されていることが重要です。ひずみの中の処理および保守、15 の ° C の上の温度で時間を可能な限り最小化する必要。適切な熱ショック条件は ASE ニューロン変換する生殖細胞でされませんチェ 1過剰発現の誘導を不十分なので重要であります。これは、プロトコルで説明されているように表現型浸透度を測定することによって検出できます。動物の致死性に広範な熱衝撃を与える可能性があります。例えば、プレートに配置されている内部の壁の近くまたは静的空気インキュベーターの下の地面によく経験豊富な熱処理です。したがって、出された熱インキュベーターを使用することをお勧めします。L3 は、外陰部 (図 3) などの異なる部位のgcy 5prom::gfp異所性誘導につながることができますし、また、熱ショック誘導のタイミングは幼虫段階で以前チェ 1の過剰発現以来重要です9します。 さらに、広範な熱衝撃が 5%、その他の組織、すなわち腸の高められた自己蛍光を拡張する空のベクター RNAi 動物で表現型浸透によって検出できます。
散発的に、RNAi 細菌はターゲット遺伝子の dsRNA を効率的に生成する彼らの活動を失うことができます。残念ながら、これは RNAi 実験する前に検出することはできません。このような場合プロトコルのセクション 2 の説明に従ってグリセロールから新鮮なストリークを栽培する必要があります。まだない RNAi による多面形質pvul表現型は、林 53プラスミド、に対して成功した RNAi によるそれぞれの細菌からの DNA の隔離のように表示する必要があります実行してする必要があります新鮮な HT115 細菌がある場合林 53シーケンスを含む L4400 プラスミドで形質転換。
重要なは、BAT28 株を持って、動物の遺伝子の間に使用されたインジェクション マーカー pRF4 によるローラーの表現型、 hsp-16.2prom::che-1 DNA の構造物。時折、動物を失うを黙らせることができる圧延の表現型、 hsp-16.2prom::che-1遺伝子。BAT28 歪みを正しく維持するため新鮮なプレートに 10 のローラーの動物をピックアップし、動物を圧延のための選択を伝達します。
プロトコルのアプリケーションは、両親 (P0 世代) が林 53 RNAi にさらされていない動物では、ニューロン変換を伴う母体レスキュー4生殖細胞を表示されませんを意味する F1 RNAi プロシージャに限定されます。生殖細胞を神経細胞に変換する代替手順は、 gld 1および転写因子の過剰発現なしmex 3の RNAi ノックダウンを使用して Ciosk および同僚の15によって記述されています。得られたニューロンは、ニューロンの特定の型に属していないし、生殖細胞はまた、 gld 1 mex 3の15の RNAi による枯渇時に筋様細胞に変換します。以前は、それが実証されている林 53に対する RNAi が gaba 作動性ニューロンのような Pitx 型 homoedomain 転写因子チェ 14の代わりに UNC 3016の過剰発現細胞を胚細胞に変換を許可.将来の方向性の林 53枯渇生殖細胞かどうか要因をテストことができます異なる運命を誘発する転写は特定のニューロンより他の細胞型に変換できます。このコンテキストでは、哺乳類 MyoD17の相同、HLH 1 筋 bHLH 転写因子の過剰発現は生殖細胞のリン 53 RNAi5 時に筋肉への変換を誘導します。林 53 RNAi の時に特定の体細胞のタイプと適切な運命を誘導する転写因子の過剰発現に生殖細胞のリプログラミング設立は、さまざまな遺伝的画面の番号を使用できます。このような抑制やエンハンサーの画面は、解離細胞運命変換中に役割を果たす規制経路を助けることができます。

運命は筋の TF MyoD など異所性 TF 式によるリプログラミング細胞筋様細胞の1に直接変換線維芽細胞が何十年も研究フォーカスをされているときに、過剰に発現します。ただし、分化した細胞が細胞の身元を保護メカニズムのため、このプロセスに難治性多い。生殖細胞は保護の類似度を示し、しばしば胚細胞運命誘導 TF の過剰発現時に他の細胞の型変換を防ぐために障壁として機能する基本的なメカニズムがあります。通常は、ヒストンやクロマチン構造などのエピジェネティック制御細胞運命2,3の変換の障害を課しています。以前線虫ノック ダウン RNAi を用いた逆遺伝学を応用して携帯電話の id を保護し、それによってニューロン4に生殖細胞のプログラムし直す対抗する要因を特定します。具体的には、ポリコーム抑圧的な複雑な 2 (PRC2) と非常に節約されたヒストンシャペロン林 53 (CAF-1/RBBP/4/7 人間で) 生殖細胞の線虫におけるグルタミン酸の味神経などの特定の体細胞への直接変換を防ぐ4,5します。 これらの生殖細胞をリプログラミング バリアの要因を識別するために、熱ショック誘導亜鉛指 TF チェ-1 を運ぶトランスジェニック動物を使いました。チェ 1 通常、線虫味覚のグルタミン酸作動性ニューロンの運命と呼ぶ ASE6指定しますの 2 つのヘッド ニューロンで表されます。ASE ニューロンの運命は、ASE 固有蛍光レポーター gcy 5prom::gfpの式で視覚化できます。GCY 5 は化学受容器の ASE 右ニューロン7でしか表現です。RNAi による林 53枯渇と熱ショックによるチェ 1 の広い異所性発現の誘導、生殖細胞は4,5生体内でのニューロンに変換できます。重要なは、RNAi 治療のタイミングは、林 53 RNAi にさらされる唯一の大人のワーム (P0 世代) はニューロン4にプログラムし直すために寛容な生殖細胞を持つ F1 子孫動物に上昇を与えるという非常に重要です。
線虫のニューロン変換プロシージャに上述した生殖細胞はさまざまな細胞運命リプログラミングにおける情報伝達システムの含意など生物学的質問を勉強する使用できます。例えば、林 53に対する RNAi に ASE ニューロンにノッチ シグナル伝達過程で生殖細胞リプログラミング8経路の意義を検討するためにプログラムし直すチェ 1 誘発胚細胞を使用しました。共同林 53とヒストン脱メチル化酵素エンコーディングを破壊する二重の RNAi を実行することによって我々 はノッチ信号 PRC2 を介した遺伝子における生殖細胞系8 UTX 1 の発現を活性化によるサイレンシング経路を打ち消すことを示した遺伝子utx 1.この発見は、このプロトコルで記述されているニューロンに生殖細胞変換を使用してそのまま生物の発達と環境別のコンテキストでの細胞リプログラミングなど複雑な生物学的過程を研究できるを示します条件。さらに、それは過剰発現細胞の可塑性9の制限内での役割を研究したり、生殖細胞へのリプログラミングを誘導するための可能性を評価するために別の運命を誘発する TFs によって生殖細胞に挑戦する視点を提供します他のセルタイプをin vivo。
哺乳類の組織培養こと、細胞運命の再プログラミングのさまざまな側面を学ぶことが、文化で育つ細胞にそのまま生物と比較してシグナル伝達経路の状態を模倣する能力が限られています。したがって、 c. の elegansは、Notch シグナル生体内リプログラミング中など様々 な生物学的プロセスの役割の検査のための汎用的なモデルです。さらに、比較的簡単に維持するために、低コストの変更遺伝子は、遺伝子スクリーニングの強力なモデルです。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Chemicals&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar-Agar, Kobe I</td>
			<td>Roth</td>
			<td>5210.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bactopeptone&#160;</td>
			<td>A. Hartenstein GmbH</td>
			<td>211 677</td>
			<td>Peptone Media&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract&#160;</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A1552,0100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin B</td>
			<td>USBiological</td>
			<td>A2220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Merck Biosciences</td>
			<td>208290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesterol</td>
			<td>Roth</td>
			<td>8866.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatine</td>
			<td>Roth</td>
			<td>4275.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>15502-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2PO4</td>
			<td>Roth</td>
			<td>T875.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Roth&#160;</td>
			<td>3904.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25,163,364</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>Roth</td>
			<td>P030.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Roth</td>
			<td>9265.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaClO</td>
			<td>Roth</td>
			<td>9062.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH (5 N)</td>
			<td>Roth&#160;</td>
			<td>KK71.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Roth</td>
			<td>AE15.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbenicillin</td>
			<td>Roth</td>
			<td>634412</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetracycline</td>
			<td>Roth</td>
			<td>2371.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubators</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator&#160;</td>
			<td>New Brunswick Scientific C24</td>
			<td>M1247-0052</td>
			<td>for heat-shock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator&#160;</td>
			<td>Sanyo MIR-5</td>
			<td>5534210</td>
			<td>for maintenance of worm strains at 15 &#176;C or 25 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscopes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microscope</td>
			<td>M205 FA</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope (Imaging) + camera</td>
			<td>Axio Imager 2</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope (Imaging) + camera</td>
			<td>Sensicam</td>
			<td>PCO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>SMZ745</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacterial strains</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Escherichia coli HT115</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>F-, mcrA, mcrB, IN(rrnD-rrnE)1, rnc14::Tn10(DE3 lysogen: lavUV5 
			promoter -T7 polymerase) (IPTG-inducible T7 polymerase) (RNAse 
			III minus).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Escherichia coli OP50&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Uracil auxotroph E. coli strain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Worm strains</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BAT28: otIs305 (hsp16.2prom::che-1:: 
			3xHA) ntIs1 (gcy-5prom::gfp) V.</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>derived from OH9846 by 4x times more back crossing with N2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAi Clones</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lin-53</td>
			<td>SourceBioscience</td>
			<td>ID I-4D14</td>
			<td>Ahringer library 16B07 ChromI, K07A1.12</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>empty vetor: L4440</td>
			<td>Addgene&#160;</td>
			<td>#1654</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Misc.</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Worm pick&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>self-made using a pasteur pipette and a platinum wire</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

application of rnai and heat-shock-induced transcription factor expression to reprogram germ cells to neurons in c. elegans

特定の細胞型の id を変換する時に細胞の生物学的過程を勉強して保持し、携帯電話の id を保護機構に重要な洞察を提供します。生殖細胞の線虫の線虫(C. elegans) 特定のニューロンへの変換は、細胞のアイデンティティを保護する規制の経路を分析するために遺伝的画面を実行するための強力なツールです。ASE と呼ばれるニューロンの特定の種類に生殖細胞のリプログラミングできる亜鉛指のトランスクリプションの広範な過剰発現トランスジェニック動物因子 (TF) チェ 1 が必要です。内因性チェ 1 頭 2 つのニューロンのみで表され、 gcy 5prom::gfpレポーターによって可視化することができます簡単に ASE グルタミン酸作動性ニューロンの運命を指定する必要は。熱ショック プロモーターに駆動されるチェ 1遺伝子発現コンストラクトを含むトランス遺伝子は、熱ショック処理全体の動物のチェ 1 の広範な誤式をできます。クロマチン制御因子林 53 と熱衝撃によるチェ 1過剰発現に対する RNAi の組み合わせは、ASE ニューロンのような細胞に生殖細胞のリプログラミングにつながります。ここで RNAi の特定の手順と述べるトランスジェニック動物の熱ショック治療のための適切な条件正常に胚細胞ニューロンへの変換からを引き起こすために。

図 1のように、 pvulの表現型を示す F1 動物は林 53 RNAi の成功のアプリケーションを示しています。これらの動物は、図 2に示すように、生殖細胞のチェ 1過剰発現の熱ショック誘導 ASE 神経様細胞への変換を許可するようになりやすいです。空のコントロールで育ったワームとは対照的 RNAi林 53 RNAi 治療を行えば、中間体エリア説明以前の4,として一晩熱ショックおよび 25 ° C の孵化後の異所性 GFP 信号を表示する動物をベクター8です。 これらのワームを落射蛍光顕微鏡下で綿密に検討を明らかにする (図 2 b、白い矢印) 神経細胞の典型的なニューロンのような突起をも GFP シグナルを表示セルに表示します。林 53に対する RNAi が成功しなかった場合は熱ショック条件が適切な GFP 信号はコントロール RNAi 扱われた動物 (図 2) を似ています。動物半ば L3 段階に到達する前に熱誘導によるチェ 1の過剰発現を誘導する重要なことは、避けてください。図 313に示すように、チェ 1発現誘導の時に幼すぎて動物開発外陰部など体の他の地域で異所性 gcy 5prom::gfp式を表示できます。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56889/56889fig1.jpg"> 
図 1:林 53 に対する RNAi による Pvul 表現型。(Top)L4/ヤング アダルト ステージ F1 子孫ワームの DIC 画像はコントロールまたは林 53 RNAi 扱われる母親から派生します。スケール バー = 20 μ m. (下) 動物林 53 RNAi 表示突出外陰部 (pvul) 表現型 (黒矢印) で扱われます。Pvulの表現型は、林 53に対する RNAi が成功したことを確認します。スケール バー = 20 μ m.<a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56889/56889fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56889/56889fig2.jpg"> 
図 2:ワームを正常にプログラムし直された生殖細胞とニューロン。(A) 空のベクター上に成長した BAT28 ひずみ動物がチェ 1過剰発現の熱ショック誘導後生殖細胞に GFP シグナルを表示しません。白破線は、ワームをについて説明します。スケール バー = 20 μ m. (B)林 53上中間ボディ区域で RNAi 表示gcy 5prom::gfp信号に成長した RNAi 動物空のベクター コントロール上に成長した BAT28 ひずみ動物とは対照的。63 倍の倍率で撮影した GFP シグナルと中間の body セクションの写真では、GFP 陽性細胞 (白い矢印) 突起部を明らかにします。この形態的特徴は、生殖細胞が ASE 神経様細胞への変換を受けたことを示します。白い星印は腸由来の自家蛍光。すべての写真は、20 倍の拡大率と 63 X と落射蛍光顕微鏡を用いた買収されました。白破線は、ワームをについて説明します。スケール バー = 20 μ m.<a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56889/56889fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56889/56889fig3.jpg"> 
図 3:異所性 GFP と初期段階ワーム。BAT28 ひずみ動物熱ショック L2 など初期の幼虫段階でチェ 1発現誘導をした空のベクター RNAi 細菌の成長は、半ば本体領域 (白アスタリスク) の GFP 信号を表示します。これらの信号は、生殖細胞のリプログラミング原因ではないです。白破線は、ワームをについて説明します。スケール バー = 20 μ m.<a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56889/56889fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。

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Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

線虫のニューロンに生殖細胞を再プログラムする RNAi と熱衝撃による転写因子の発現のアプリケーション

このプロトコルでは、線虫の体内の細胞運命変換中に細胞プロセスを研究する方法について説明します。観察することができます熱ショック プロモーターに駆動されるニューロン運命誘導転写因子チェ 1 過剰発現と神経細胞のリプログラミング クロマチン制御因子林 53 生殖細胞の RNAi による枯渇のトランスジェニック動物を使用して生体内で。

Studying the cell biological processes during converting the identities of specific cell types provides important insights into mechanism that maintain ...

application-rnai-heat-shock-induced-transcription-factor-expression

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

7.6K ビュー.  Max Delbrück Center for Molecular Medicine in the Helmholtz Association. このプロトコルでは、線虫の体内の細胞運命変換中に細胞プロセスを研究する方法について説明します。観察することができます熱ショック プロモーターに駆動されるニューロン運命誘導転写因子チェ 1 過剰発現と神経細胞のリプログラミング クロマチン制御因子林 53 生殖細胞の RNAi による枯渇のトランスジェニック動物を使用して生体内で

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Application of Impermeable Barriers Combined with Candidate Factor Soaked Beads to Study Inductive Signals in the Chick

The chick embryo provides a superb vertebrate model that can be used to dissect developmental questions in a direct way. Its accessibility and robustness following surgical intervention are key experimental strengths. Mica plates were the first barriers used to prevent chick limb bud initiation1. Protocols that use aluminum foil as an impermeable barrier to wing bud or leg bud induction and or initiation are described. We combine this technique with bead placement lateral to the barrier to exogenously supply candidate endogenous factors that have been blocked by the barrier. The results are analyzed using in situ hybridization of subsequent gene expression. Our main focus is on the role of retinoic acid signaling in the induction and later initiation of the chick embryo fore and hindlimb. We use BMS 493 (an inverse agonist of retinoic acid receptors (RAR)) soaked beads implanted in the lateral plate mesoderm (LPM) to mimic the effect of a barrier placed between the somites (a source of retinoic acid (RA)) and the LPM from which limb buds grow. Modified versions of these protocols could also be used to address other questions on the origin and timing of inductive cues. Provided the region of the chick embryo is accessible at the relevant developmental stage, a barrier could be placed between the two tissues and consequent changes in development studied. Examples may be found in the developing brain, axis extension and in organ development, such as liver or kidney induction.

Protocols using impermeable barriers to block induction events between tissues of the main body axis and flank in the chick embryo required for limb formation are described. Beads soaked in candidate inductive signals are used to overcome the effect of barrier placement and analysis of gene expression confirms this.

チックに誘導シグナルを研究するために、候補因子浸しビーズと組み合わせることで不浸透性の障壁の応用

The chick embryo provides a superb vertebrate model that can be used to dissect developmental questions in a direct way. Its accessibility and robustness ...

発生生物学

Spatial and Temporal Analysis of Active ERK in the C. elegans Germline

The evolutionarily conserved&#160;extracellular signal transducing RTK-RAS-ERK pathway is an important kinase-signaling cascade that controls multiple cellular and developmental processes principally via activation of ERK, the terminal kinase of the pathway. Tight regulation of ERK activity is essential for normal development and homeostasis; overly active ERK results in excessive cellular proliferation, while underactive ERK causes cell death. C. elegans is a powerful model system that has helped characterize the function and regulation of RTK-RAS-ERK signaling pathway during development. In particular, the RTK-RAS-ERK pathway is essential for C. elegans germline development, which is the focus of this method. Using antibodies specific to the active, diphosphorylated form of ERK (dpERK), the stereotypical localization pattern can be visualized within the germline. Because this pattern is both spatially and temporally controlled, the ability to reproducibly assay dpERK is useful to identify regulators of the pathway that affect dpERK signal duration and amplitude and thus germline development. Here we demonstrate how to successfully dissect, stain, and image dpERK within the C. elegans gonad. This method can be adapted for spatial localization of any signaling or structural protein in the C. elegans gonad, provided an antibody compatible with immunofluorescence is available.

Spatial and Temporal Analysis of Active ERK in the C. elegans Germline

We present an immunofluorescence&#160;imaging-based method for spatial and temporal localization of active ERK in the dissected C. elegans gonad. The protocol described here can be adapted for visualization of any signaling or structural protein in the C. elegans gonad, provided a suitable antibody reagent is available.

で活躍ERKの時空間解析<em&gt; C。エレガンス</em&gt;生殖細胞系列

The evolutionarily conserved&#160;extracellular signal transducing RTK-RAS-ERK pathway is an important kinase-signaling cascade that controls multiple ...

Assessing Cardiomyocyte Subtypes Following Transcription Factor-mediated Reprogramming of Mouse Embryonic Fibroblasts

Direct reprogramming of one cell type into another has recently emerged as a powerful paradigm for regenerative medicine, disease modeling, and lineage specification. In particular, the conversion of fibroblasts into induced cardiomyocyte-like myocytes (iCLMs) by Gata4, Hand2, Mef2c, and Tbx5 (GHMT) represents an important avenue for generating de novo cardiac myocytes in vitro and in vivo. Recent evidence suggests that GHMT generates a greater diversity of cardiac subtypes than previously appreciated, thus underscoring the need for a systematic approach to conducting additional studies. Before direct reprogramming can be used as a therapeutic strategy, however, the mechanistic underpinnings of lineage conversion must be understood in detail to generate specific cardiac subtypes. Here we present a detailed protocol for generating iCLMs by GHMT-mediated reprogramming of mouse embryonic fibroblasts (MEFs). 
We outline methods for MEF isolation, retroviral production, and MEF infection to accomplish efficient reprogramming. To determine the subtype identity of reprogrammed cells, we detail a step-by-step approach for performing immunocytochemistry on iCLMs using a defined set of compatible antibodies. Methods for confocal microscopy, identification, and quantification of iCLMs and individual atrial (iAM), ventricular (iVM), and pacemaker (iPM) subtypes are also presented. Finally, we discuss representative results of prototypical direct reprogramming experiments and highlight important technical aspects of our protocol to ensure efficient lineage conversion. Taken together, our optimized protocol should provide a stepwise approach for investigators to conduct meaningful cardiac reprogramming experiments that require identification of individual CM subtypes.

This manuscript describes a step-by-step protocol for the generation and quantification of diverse reprogrammed cardiac subtypes using a retrovirus-mediated delivery of Gata4, Hand2, Mef2c, and Tbx5.

マウス胚線維芽細胞の転写因子媒介リプログラミングに続いて心筋細胞のサブタイプを評価します

Direct reprogramming of one cell type into another has recently emerged as a powerful paradigm for regenerative medicine, disease modeling, and lineage ...

A Standardized Approach for Multispecies Purification of Mammalian Male Germ Cells by Mechanical Tissue Dissociation and Flow Cytometry

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) has been one of the methods of choice to isolate enriched populations of mammalian testicular germ cells. Currently, it allows the discrimination of up to 9 murine germ cell populations with high yield and purity. This high-resolution in discrimination and purification is possible due to unique changes in chromatin structure and quantity throughout spermatogenesis. These patterns can be captured by flow cytometry of male germ cells stained with fluorescent DNA-binding dyes such as Hoechst-33342 (Hoechst). Herein is a detailed description of a recently developed protocol to isolate mammalian testicular germ cells. Briefly, single cell suspensions are generated from testicular tissue by mechanical dissociation, double stained with Hoechst and propidium iodide (PI) and processed by flow cytometry. A serial gating strategy, including the selection of live cells (PI negative) with different DNA content (Hoechst intensity), is used during FACS sorting to discriminate up to 5 germ cell types. These include, with corresponding average purities (determined by microscopy evaluation): spermatogonia (66%), primary (71%) and secondary (85%) spermatocytes, and spermatids (90%), further separated into round (93%) and elongating (87%) subpopulations. Execution of the entire workflow is straightforward, allows the isolation of 4 cell types simultaneously with the appropriate FACS machine, and can be performed in less than 2 h. As reduced processing time is crucial to preserve the physiology of ex vivo cells, this method is ideal for downstream high-throughput studies of male germ cell biology. Moreover, a standardized protocol for multispecies purification of mammalian germ cells eliminates methodological sources of variables and allows a single set of reagents to be used for different animal models.

This work describes the standardization of a method to obtain purified germ cell populations from testicular tissue of different mammalian species. It is a straightforward protocol that combines mechanical testis dissociation, staining with Hoechst-33342 and propidium iodide, and FACS sorting, with wide applications in comparative studies of male reproductive biology.

機械的組織解離およびフローサイトメトリーによる哺乳動物雄胚細胞のマルチシード精製のための標準的アプローチ

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) has been one of the methods of choice to isolate enriched populations of mammalian testicular germ cells. ...

Immobilization of Caenorhabditis elegans to Analyze Intracellular Transport in Neurons

Axonal transport and intraflagellar transport (IFT) are essential for axon and cilia morphogenesis and function. Kinesin superfamily proteins and dynein are molecular motors that regulate anterograde and retrograde transport, respectively. These motors use microtubule networks as rails. Caenorhabditis elegans (C. elegans) is a powerful model organism to study axonal transport and IFT in vivo. Here, I describe a protocol to observe axonal transport and IFT in living C. elegans. Transported cargo can be visualized by tagging cargo proteins using fluorescent proteins such as green fluorescent protein (GFP). C. elegans is transparent and GFP-tagged cargo proteins can be expressed in specific cells under cell-specific promoters. Living worms can be fixed by microbeads on 10% agarose gel without killing or anesthetizing the worms. Under these conditions, cargo movement can be directly observed in the axons and cilia of living C. elegans without dissection. This method can be applied to the observation of any cargo molecule in any cells by modifying the target proteins and/or the cells they are expressed in. Most basic proteins such as molecular motors and adaptor proteins that are involved in axonal transport and IFT are conserved in C. elegans. Compared to other model organisms, mutants can be obtained and maintained more easily in C. elegans. Combining this method with various C. elegans mutants can clarify the molecular mechanisms of axonal transport and IFT.

Immobilization of Caenorhabditis elegans to Analyze Intracellular Transport in Neurons

Caenorhabditis elegans (C. elegans) is a good model to study axonal and intracellular transport. Here, I describe a protocol for in vivo recording and analysis of axonal and intraflagellar transport in C. elegans.

線虫ニューロンの細胞内輸送を分析するための固定化

Axonal transport and intraflagellar transport (IFT) are essential for axon and cilia morphogenesis and function. Kinesin superfamily proteins and dynein ...

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and chromosome dynamics. While the germline is an excellent model, the analysis is often two dimensional due to the time and labor required for three-dimensional analysis. Major readouts in such studies are the number/position of nuclei and protein distribution within the germline. Here, we present a method to perform automated analysis of the germline using confocal microscopy and computational approaches to determine the number and position of nuclei in each region of the germline. Our method also analyzes germline protein distribution that enables the three-dimensional examination of protein expression in different genetic backgrounds. Further, our study shows variations in cytoskeletal architecture in distinct regions of the germline that may accommodate specific spatial developmental requirements. Finally, our method enables automated counting of the sperm in the spermatheca of each germline. Taken together, our method enables rapid and reproducible phenotypic analysis of the C. elegans germline.

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

We present an automated method for three-dimensional reconstruction of the Caenorhabditis elegans germline. Our method determines the number and position of each nucleus within the germline and analyses germline protein distribution and cytoskeletal structure.

核の分布、蛋白質および細胞骨格を研究する線虫生殖細胞の解析

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and ...

In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give rise to multiple cell types, including the myotome (MYO), sclerotome (SCL), dermatome (D), and syndetome (SYN), which in turn develop into skeletal muscle, axial skeleton, dorsal dermis, and axial tendon/ligament, respectively. Therefore, the generation of SMs and their derivatives from human induced pluripotent stem cells (iPSCs) is critical to obtain pluripotent stem cells (PSCs) for application in regenerative medicine and for disease research in the field of orthopedic surgery. Although the induction protocols for MYO and SCL from PSCs have been previously reported by several researchers, no study has yet demonstrated the induction of SYN and D from iPSCs. Therefore, efficient induction of fully competent SMs remains a major challenge. Here, we recapitulate human SM patterning with human iPSCs in vitro by mimicking the signaling environment during chick/mouse SM development, and report on methods of systematic induction of SM derivatives (MYO, SCL, D, and SYN) from human iPSCs under chemically defined conditions through the presomitic mesoderm (PSM) and SM states. Knowledge regarding chick/mouse&#160;SM development was successfully applied to the induction of SMs with human iPSCs. This method could be a novel tool for studying human somitogenesis and patterning without the use of embryos and for cell-based therapy and disease modeling.

We present here a protocol for the differentiation of human induced pluripotent stem cells into each somite derivative (myotome, sclerotome, dermatome, and syndetome) in chemically defined conditions, which has applications in future disease modeling and cell-based therapies in orthopedic surgery.

体節誘導体誘導される人間からの体外世代多能性幹細胞します。

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...

Hemogenic Endothelium Differentiation from Human Pluripotent Stem Cells in A Feeder- and Xeno-free Defined Condition

Deriving functional hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) from human pluripotent stem cells (PSCs) have been an elusive goal for autologous transplants to treat hematological and malignant disorders. Hemogenic endothelium (HE) is an amenable platform to produce functional HSPCs by transcription factors or to induce lymphocytes in a robust manner. However, current methods to derive HE are either costly or variable in yield. In this protocol, we established a cost-effective and precise method to derive HE within 4 days in a feeder- and xeno-free defined condition. The resultant HE underwent an endothelial-to-hematopoietic transition and produced CD34+CD45+ clonogenic hematopoietic progenitors. The potential capacity of our platform for generating functional HSPCs will have broad applications in disease modeling and screening for therapeutic compounds.

Here, we present a protocol to precisely form hemogenic endothelium from human pluripotent stem cells in a feeder- and xeno-free condition. This method will have broad applications in disease modeling and screening for therapeutic compounds.

フィーダーとゼノフリーの定義条件におけるヒト多能性幹細胞からの血原性内皮分化

Deriving functional hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) from human pluripotent stem cells (PSCs) have been an elusive goal for autologous ...

Assessment of Oxidative Damage in the Primary Mouse Ocular Surface Cells/Stem Cells in Response to Ultraviolet-C (UV-C) Damage

The ocular surface is subjected to regular wear and tear due to various environmental factors. Exposure to UV-C radiation constitutes an occupational health hazard. Here, we demonstrate the exposure of primary stem cells from the mouse ocular surface to UV-C radiation. Reactive oxygen species (ROS) formation is the readout of the extent of oxidative stress/damage. In an experimental in vitro setting, it is also essential to assess the percentage of dead cells generated due to oxidative stress. In this article, we will demonstrate the 2&#39;,7&#39;-Dichlorofluoresceindiacetate (DCFDA) staining of UV-C exposed mouse primary ocular surface stem cells and their quantification based on the fluorescent images of DCFDA staining. DCFDA staining directly corresponds to ROS generation. We also demonstrate the quantification of dead and live cells by simultaneous staining with propidium iodide (PI) and Hoechst 3332 respectively and the percentage of DCFDA (ROS positive) and PI positive cells.

Assessment of Oxidative Damage in the Primary Mouse Ocular Surface Cells/Stem Cells in Response to Ultraviolet-C UV-C Damage

This protocol demonstrates the simultaneous detection of reactive oxygen species (ROS), live cells, and dead cells in live primary cultures from mouse ocular surface cells. 2&#39;,7&#39;-Dichlorofluoresceindiacetate, propidium iodide, and Hoechst staining are used to assess the ROS, dead cells, and live cells, respectively, followed by imaging and analysis.

紫外C(UV-C)損傷に対する主なマウス眼表面細胞/幹細胞における酸化的損傷の評価

The ocular surface is subjected to regular wear and tear due to various environmental factors. Exposure to UV-C radiation constitutes an occupational ...

Hemogenic Reprogramming of Human Fibroblasts by Enforced Expression of Transcription Factors

The cellular and molecular mechanisms underlying specification of human hematopoietic stem cells (HSCs) remain elusive. Strategies to recapitulate human HSC emergence in vitro are required to overcome limitations in studying this complex developmental process. Here, we describe a protocol to generate hematopoietic stem and progenitor-like cells from human dermal fibroblasts employing a direct cell reprogramming approach. These cells transit through a hemogenic intermediate cell-type, resembling the endothelial-to-hematopoietic transition (EHT) characteristic of HSC specification. Fibroblasts were reprogrammed to hemogenic cells via transduction with GATA2, GFI1B and FOS transcription factors. This combination of three factors induced morphological changes, expression of hemogenic and hematopoietic markers and dynamic EHT transcriptional programs. Reprogrammed cells generate hematopoietic progeny and repopulate immunodeficient mice for three months. This protocol can be adapted towards the mechanistic dissection of the human EHT process as exemplified here by defining GATA2 targets during the early phases of reprogramming. Thus, human hemogenic reprogramming provides a simple and tractable approach to identify novel markers and regulators of human HSC emergence. In the future, faithful induction of hemogenic fate in fibroblasts may lead to the generation of patient-specific HSCs for transplantation.

This protocol demonstrates the induction of a hemogenic program in human dermal fibroblasts by enforced expression of the transcription factors GATA2, GFI1B and FOS to generate hematopoietic stem and progenitor cells.

転写因子の強制発現によるヒト線維芽細胞のヘモジェニックリプログラミング

The cellular and molecular mechanisms underlying specification of human hematopoietic stem cells (HSCs) remain elusive. Strategies to recapitulate human ...