著者は、撮影し、編集したビデオで彼の援助のエリック Fishback (デ モイン大学, デモイン、アイオワ州、米国) を感謝したいです。安定表現 NHE3 wt や NHE3 YRK PS120 線維芽細胞のような細胞は、博士マーク Donowitz (ジョンズ ・ ホプキンス大学医学、ボルティモア、MD、米国) によって提供された親切。

注: 2 つのアンプ、クランプ、全体セル構成と高 impendence アンプ (細胞を維持するためにパッチ クランプ アンプ パッチと組み合わせて自己参照伊勢で electroneutral 運送者の活動を記録するために必要です電位計)、伊勢経由で輸送活動を記録する (材料の表を参照してください)。パッチ クランプ アンプは、集録ボードの端子に直接接続されます。電位計を利用してフィルター処理し、信号を増幅する差動増幅器に接続されます。差動増幅器は、集録ボードの端子に接続されます。Capmeter、セル容量を監視するパッチ クランプ ソフトウェアは、以前の研究20で使用されています (材料の表を参照してください)。録音室と灌流ソリューションが 37 ° C で維持されます。
1. 天気予報のピペットの準備
<ol><li>ピペット ホウケイ酸塩のガラス管から 1.2 mm の外径を引く (材料の表を参照してください)2ピペットの引き手を使用して。</li>
	<li>使用して、マイクロフォージ ピペットを磨きます。ピペット先端の直径は、2-3 μ m にする必要があります。</li>
	<li>(材料の表を参照) を向いてピペット チップ ピペット用の瓶ホルダーで、ピペットを配置します。 注意: 換気の化学発煙のフード 1.4-1.6 の手順に従います。</li>
	<li>ビス (ジメチルアミノ) ジメチル シランと四塩化炭素の 10 滴 1 滴 (~ 150 μ L) で構成される製造混合物のミックス (材料の表を参照してください)。</li>
	<li>瓶にケイの混合物を注ぎ、ふたをしっかり締めて。</li>
	<li>混合物が完全に蒸発するまでは、24-48 時間室温での化学発煙のフード製造混合物と jar を孵化させなさい。</li>
	<li>バックフィル適切なイオン選択性樹脂を用いるピペット約 2-4 mm の列を作成します。 注: 水素イオノフォア私カクテル B は、NHE アクティビティの使用記録をすることができます (材料の表を参照してください)。</li>
	<li>先端部にイオン選択性樹脂を配布するピペットの先端をタップし、ダウン ピペット ピペット チップの瓶ホルダー内で縦方向に配置します。</li>
	<li>Checkunder 樹脂カクテルがヒントの最後に達したこと解剖顕微鏡。必要な場合は、最後に樹脂をプッシュする肯定的な圧力を適用します。</li>
	<li>適切なソリューションとバックフィル半分ピペット (~ 100 μ L)。イオノフォアを使用している場合ここでは、pH 7.0 で 100 mM KCl と 10 mM HEPES を使用私カクテル b.</li>
	<li>電位計に ISE を接続し、記録用風呂のソリューションに、伊勢の先端を配置します。電位計はゼロします。</li>
	<li>試験 H+-バス溶液の pH を変更することで選択的な伊勢の応答。平均 H+-伊勢の選択的な応答は 〜 58 単位 pH の mV。</li>
	<li>伊勢レスポンス校正を定期的に評価します。</li>
</ol>2. パッチク ランプの準備記録用ピペットします。
メモ: 単一チャネル記録21ドナルド ・ Hilgemann によって彼の記事で説明した方法をお勧めします。
<ol><li>ホウケイ酸ガラス管から巨大なパッチ用ピペットを引く (2.0 mmOD/1.5 mm ID) ピペット引き手2,22,23。</li>
	<li>広いピペット チップ (10-22 μ m)23をするために逆にされた顕微鏡のステージ上を使用して、マイクロフォージ マウント。ビーズを溶かす (〜 0.5 mL)、マイクロフォージの厚い白金線に軟質のガラス。 注: 比較的厚い白金細線が必要 (~0.5 mm) 巨大なパッチ ピペットを作製します。</li>
	<li>軟質ガラス ビーズに近いパッチ ピペットを置き、先端が後退を開始するまでの完全な熱を適用します。白金細線加熱配属されていますに向かって少し移動します。</li>
	<li>熱の電源を切り、軟化したガラス ビーズにピペット チップをプッシュします。冷却のワイヤー工具はリトラクトし、ピペット チップを破る。</li>
	<li>ピペット チップを滑らかに必要な径のピペット チップを作成し熱を再適用します。先端の直径が依存するセルのサイズ パッチ (本研究では 8-10 μ m)。</li>
</ol>3. 細胞の調製
<ol><li>ウォーム アップ リン酸バッファー生理食塩水 (PBS) Ca2 + Mg2 +、トリプシン EDTA 溶液、37 ° C で中長期成長なし</li>
	<li>洗浄のセル PBS で 2 回。35 mm 直径細胞培養プレートに 1 mL のバッファーを使用します。</li>
	<li>トリプシンの 0.5 mL を 35 mm 直径細胞培養プレートのセルに追加します。 注: セル起動するとラウンド アップ、セルをアタッチ解除するプレートを振るとき。</li>
	<li>10% 牛胎児血清を添加した完全な成長培地 5 mL (35 mm 径細胞培養プレートの量) を追加することによってトリプシンのアクションを停止します。 注: トリプシンの反応時間は、細胞型依存。</li>
	<li>塊の形成を防ぐためにロッキング シェーカーにセルを配置します。</li>
	<li>Trypsinization 後 2 h までのセルを使用します。 注: セルの行によって時間が異なります。</li>
</ol>4. ピペット内灌流システムの準備
<ol><li>石英管の適切なサイズをカット (150 μ m OD/75 μ m ID) 内ピペット灌流線を準備します。</li>
	<li>200 μ L ピペット チップ石英管の片側に挿入します。先端に石英管を接着し、鋭いかみそりの刃と先端の端をカットします。</li>
	<li>ピペット内灌流液の貯留層となるシリコン チューブの小片に灌流線 (石英チューブ先端に接着) を接続します。</li>
	<li>肯定的な圧力を作成する注射器にシリコン チューブを接続します。</li>
	<li>挿入側灌流のピペット ホルダーのポリエチレン管を通って石英チューブのポート (材料の表を参照)。</li>
	<li>ピペット ソリューションと灌流線を評価します。</li>
</ol>5. 溶液の調製
<ol><li>NHE (115 mM カリウム アスパラギン酸 (KAsp) 1 mM グリコールエーテルジアミン四酢酸、MgCl20.5 mM、10 mM Mg-ATP、HEPES が 12.5 mM、12.5 mM パイプ、12.5 mM モップ 12.5 mM MES の pH 6.0 アスパラギン酸で調整) を記録するため重くバッファー ピペット ソリューションを準備します。 注: は、ストック ピペット ソリューションとフィルターを準備します。録音の前に Mg ATP を追加します。</li>
	<li>(140 mM の NaCl、2 mM CaCl2、2 mM MgCl2、および 0.1 mM トリス塩酸 pH 8.2) するたびに新鮮なバス ソリューションを準備します。</li>
</ol>6. 輸送活動の記録
<ol><li>トランスポーターの活動は温度依存するので、録音室と 37 ° C ですべてのソリューションを維持します。</li>
	<li>記録室にセルを配置します。彼らはチャンバーの下部にドロップしますが、チャンバーに接続させていない場合まで待ちます。</li>
	<li>適切なセルを選択します。眼のマイクロメータとセルの直径を測定します。同じような直径を持つセルを選択します。 注: 一般的に、大細胞がありより細胞表面おそらくよりトランスポーター従ってより多くのトランスポーター活性を有するも、その膜に発現します。ただし、トランスポーターの活性によって異なります特定のトランスポーターと検討中細胞型、これは必ずしも正しくではないです。</li>
	<li>マイクロマニピュレーターにイオン選択性電極のピペットをマウント、バックフィル細胞内のソリューションでは、パッチ用ピペット ピペット2のヒントを解決策に到達を確認してください。 注: それはピペットの先端で気泡を除去するためにいくつかの穏やかなタップを必要があります。</li>
	<li>設定2,22,23電気生理学の頭の段階にパッチ用ピペットをマウントします。 これにより、強いシールの形成に適しているピペットの入口角度としてメモ: 水平軸に約 45 度の角度でヘッドのステージを保つために重要です。</li>
	<li>小さく肯定的な圧力を適用 (~ 5 cm H2O) パッチ ピペット先端をブロックする可能性を削減し、お風呂のソリューションに配置します。</li>
	<li>パッチ クランプ ピペットの先端がセルの近くに移動を停止します。</li>
	<li>ピペットに触れるセル間に肯定的な圧力を緩和し、わずかな否定的な圧力を適用 (~ 5 cm H2O) を取得する、> 1000 パッチで細胞膜上の MΩ (ギガ ω) シール ピペット23。</li>
	<li>伊勢市と同じ焦点面でセルとパッチ ピペットを置き、パッチ ピペット、伊勢への近さ内のセルを移動 (~ 5-10 μ m)2,5が回避する (図 1 a) 伊勢にお問い合わせください。</li>
	<li>潜在的な保有が 0 であることを保証する mV。</li>
	<li>シリーズでは全細胞構成を取得する短い吸引のシールを破裂します。</li>
	<li>伊勢 (またはパッチ クランプ ピペット) 移動ゆっくりと左右または上下トランスポーター (図 1 b) の活動を記録します。</li>
	<li>少なくとも 5-8 ピークを記録 (図 1、A から B に)。</li>
	<li>シールと細胞膜容量 (図 1) の品質を監視する記録中に方形波の摂動を適用します。</li>
	<li>H+フラックスの推定 (<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/56630/56630eq1.jpg">) 細胞表面とバルク ソリューション (ΔH+) 無料 H+の濃度の違いから <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/56630/56630eq2.jpg"> <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/56630/56630eq3v2.jpg"> 注:<img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/56630/56630eq4.jpg">と<img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/56630/56630eq5.jpg">H+は、それぞれ、拡散係数をバッファー BTがバッファーの合計濃度、 KDはバッファーの解離定数、 rはセル半径、および<img alt="Equation 6" src="/files/ftp_upload/56630/56630eq6.jpg">無料 H+の小さな変化のため連結 H+の濃度の定常状態の変化を決定します。H+は、ソリューションの無料プロトンを示します。先行研究と一致する H+フラックス、フラックスの現在の同等物を計算して電気生理学的磁束の単位に変換されます (<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/56630/56630eq1.jpg">/faraday) pA3,5]。</li>
	<li>携帯サイズから計算することができます細胞表面に膜容量陽子のフラックスを正規化します。</li>
</ol>

<ol>
	<li>Rives, M. L., Javitch, J. A., Wickenden, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potentiating+SLC+transporter+activity:+Emerging+drug+discovery+opportunities.">Potentiating SLC transporter activity: Emerging drug discovery opportunities.</a> Biochem Pharmacol. , (2017).</li><li>Kang, T. M., Markin, V. S., Hilgemann, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ion+fluxes+in+giant+excised+cardiac+membrane+patches+detected+and+quantified+with+ion-selective+microelectrodes.">Ion fluxes in giant excised cardiac membrane patches detected and quantified with ion-selective microelectrodes.</a> J Gen Physiol. 121 (4), 325-347 (2003).</li><li>Babich, V., Vadnagara, K., Di Sole, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biophysical+and+molecular+basis+of+intracellular+pH+sensing+by+Na+/H++exchanger-3.">The biophysical and molecular basis of intracellular pH sensing by Na+/H+ exchanger-3.</a> FASEB J. 27 (11), 4646-4658 (2013).</li><li>Fuster, D., Moe, O. W., Hilgemann, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Steady-state+function+of+the+ubiquitous+mammalian+Na/H+exchanger+(NHE1)+in+relation+to+dimer+coupling+models+with+2Na/2H+stoichiometry.">Steady-state function of the ubiquitous mammalian Na/H exchanger (NHE1) in relation to dimer coupling models with 2Na/2H stoichiometry.</a> J Gen Physiol. 132 (4), 465-480 (2008).</li><li>Fuster, D., Moe, O. W., Hilgemann, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid-+and+mechanosensitivities+of+sodium/hydrogen+exchangers+analyzed+by+electrical+methods.">Lipid- and mechanosensitivities of sodium/hydrogen exchangers analyzed by electrical methods.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (28), 10482-10487 (2004).</li><li>Forster, I. C., Virkki, L., Bossi, E., Murer, H., Biber, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrogenic+kinetics+of+a+mammalian+intestinal+type+IIb+Na(+)/P(i)+cotransporter.">Electrogenic kinetics of a mammalian intestinal type IIb Na(+)/P(i) cotransporter.</a> J Membr Biol. 212 (3), 177-190 (2006).</li><li>Smith, P. J., Trimarchi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+measurement+of+hydrogen+and+potassium+ion+flux+from+single+cells+and+epithelial+structures.">Noninvasive measurement of hydrogen and potassium ion flux from single cells and epithelial structures.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 280 (1), C1-C11 (2001).</li><li>Parker, M. D., Musa-Aziz, R., Boron, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+extracellular,+ion-selective+microelectrodes+to+study+the+function+of+heterologously+expressed+transporters+in+Xenopus+oocytes.">The use of extracellular, ion-selective microelectrodes to study the function of heterologously expressed transporters in Xenopus oocytes.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 296 (5), C1243 (2009).</li><li>Smith, P. J. S., Sanger, R. H., Messerli, M. A., Michael, A. C., Borland, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Electrochemical Methods for Neuroscience. , 373-406 (2007).</li><li>Orlowski, J., Grinstein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversity+of+the+mammalian+sodium/proton+exchanger+SLC9+gene+family.">Diversity of the mammalian sodium/proton exchanger SLC9 gene family.</a> Pflugers Arch. 447 (5), 549-565 (2004).</li><li>Brett, C. L., Donowitz, M., Rao, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolutionary+origins+of+eukaryotic+sodium/proton+exchangers.">Evolutionary origins of eukaryotic sodium/proton exchangers.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 288 (2), C223-C239 (2005).</li><li>Bobulescu, I. A., Di Sole, F., Moe, O. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Na+/H++exchangers:+physiology+and+link+to+hypertension+and+organ+ischemia.">Na+/H+ exchangers: physiology and link to hypertension and organ ischemia.</a> Curr Opin Nephrol Hypertens. 14 (5), 485-494 (2005).</li><li>Donowitz, M., Ming Tse, C., Fuster, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SLC9/NHE+gene+family,+a+plasma+membrane+and+organellar+family+of+Na(+)/H(+)+exchangers.">SLC9/NHE gene family, a plasma membrane and organellar family of Na(+)/H(+) exchangers.</a> Mol Aspects Med. 34 (2-3), 236-251 (2013).</li><li>Zachos, N. C., Tse, M., Donowitz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+physiology+of+intestinal+Na+/H++exchange.">Molecular physiology of intestinal Na+/H+ exchange.</a> Annu Rev Physiol. 67, 411-443 (2005).</li><li>Girardi, A. C., Di Sole, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deciphering+the+mechanisms+of+the+Na+/H++exchanger-3+regulation+in+organ+dysfunction.">Deciphering the mechanisms of the Na+/H+ exchanger-3 regulation in organ dysfunction.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 302 (11), C1569-C1587 (2012).</li><li>Bobulescu, I. A., Moe, O. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Na+/H++exchangers+in+renal+regulation+of+acid-base+balance.">Na+/H+ exchangers in renal regulation of acid-base balance.</a> Semin Nephrol. 26 (5), 334-344 (2006).</li><li>Hilgemann, D. W., Feng, S., Nasuhoglu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+complex+and+intriguing+lives+of+PIP2+with+ion+channels+and+transporters.">The complex and intriguing lives of PIP2 with ion channels and transporters.</a> Sci STKE. (111), re19 (2001).</li><li>Mohan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NHE3+activity+is+dependent+on+direct+phosphoinositide+binding+at+the+N+terminus+of+its+intracellular+cytosolic+region.">NHE3 activity is dependent on direct phosphoinositide binding at the N terminus of its intracellular cytosolic region.</a> J Biol Chem. 285 (45), 34566-34578 (2010).</li><li>Alexander, R. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+surface+charge+dictates+the+structure+and+function+of+the+epithelial+Na+/H++exchanger.">Membrane surface charge dictates the structure and function of the epithelial Na+/H+ exchanger.</a> EMBO J. 30 (4), 679-691 (2011).</li><li>Wang, T. M., Hilgemann, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ca-dependent+nonsecretory+vesicle+fusion+in+a+secretory+cell.">Ca-dependent nonsecretory vesicle fusion in a secretory cell.</a> J Gen Physiol. 132 (1), 51-65 (2008).</li><li>Hilgemann, D. W., Sakmann, B., Neher, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Single-Channel Recording. , 307-328 (1995).</li><li>Hilgemann, D. W., Lu, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Giant+membrane+patches:+improvements+and+applications.">Giant membrane patches: improvements and applications.</a> Methods Enzymol. 293, 267-280 (1998).</li><li>Matsuoka, S., Takeuchi, A., Okada, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Patch Clamp Techniques. , 207-218 (2012).</li><li>Pouyssegur, J., Sardet, C., Franchi, A., L'Allemain, G., Paris, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+specific+mutation+abolishing+Na+/H++antiport+activity+in+hamster+fibroblasts+precludes+growth+at+neutral+and+acidic+pH.">A specific mutation abolishing Na+/H+ antiport activity in hamster fibroblasts precludes growth at neutral and acidic pH.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 81 (15), 4833-4837 (1984).</li><li>Voipio, J., Pasternack, M., MacLeod, K., Ogden, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Microelectrode Techniques - The Plymouth Workshop Handbook. , 275-316 (1994).</li></ol>

著者はある利益相反を開示します。

トランスポーターの重要な機能、にもかかわらず彼らの活動を研究するメソッドがないと不十分です。1 つの制限は、使用可能なメソッドが実験4細胞内イオン組成の変動を考慮することがなくトランスポーター活性化イオンの動きを測定することです。提案手法により、細胞内外のイオン組成を正確に制御し、細胞内イオン、タンパク質と脂質組成3,4,5を変更するための強力なツールを提供しています。
このプロトコルでは最も重要なステップは、25の長周期の安定している伊勢の準備です。我々 の経験で不安定な伊勢、ないよくシリル (例えば、伊勢ピペット両側イオン選択性樹脂は再配布)、伊勢の信号で定数と手に負えないドリフトによる検知が可能します。さらに、実験中に ISE で樹脂分布を綿密に監視する必要があります。お風呂のソリューションは、樹脂25までバス ソリューションの列を作成する ISE ピペット内部のイオン選択性樹脂をプッシュ可能性があります。この場合、ISE はこのコラムからイオン濃度を記録、実験中にイオン勾配の変化に応答していないになります。ISE のジオメトリを調整する 100 ms9の範囲で伊勢応答を取得し、伊勢の時間応答の遅延の可能性を克服するための鍵は、イオン勾配の変化と比較します。
提案手法の主な制限は、パッチク上皮細胞におけるトランスポーター活性の測定から継承されます。サポートからデタッチすると懸濁液の維持、偏光の上皮細胞は頂または基底膜トランスポーターの偏光のローカリゼーションを失うかもしれない。
クランプ測定修正パッチを使用して、チャネル, 偏光上皮におけるトランスポーターを勉強してください。提供される数式によってフラックスに H+のグラデーションに変換する際、球は重要ななくシリンダー内にセルが表す概数を検討しています。数式を変更する必要がありますこの場合は、 <img alt="Equation 7" src="/files/ftp_upload/56630/56630eq7.jpg"> r は半径、λ は、シリンダーの長さは、ad x はグラデーションが測定5されるシリンダーの中間点からの放射距離。Electroneutral トランスポーターを研究のためこの強力な技術の将来の発展、単分子膜の成長記録セルの最適化方法を変更することに焦点を当てる必要があります。

イオンとプラズマ膜における溶質の輸送は細胞のと、それゆえ、生物1の生存に不可欠です。溶質とイオンの選択的輸送は専門にされたチャネルおよび蛋白質の配列によって実現されます。さまざまな病態、薬物治療1のチャネルやトランスポーター蛋白質の潜在的なターゲットをレンダリングしばしばこれらの蛋白質の突然変異の結果します。残念ながら、チャネルやトランスポーターの機能と制御機構の解明は、しばしば制限のアクティビティ2,3、4を研究するのにアプローチで。
具体的には、トランスポーターがサブに分けることが彼らは溶質の輸送中における細胞膜電位を変更するかどうかに応じて 2 つの大規模なグループ: 無k イオン変更 [例えばナトリウム ・ リン酸輸送体共輸送体 2 a (NaPi2a)、ナトリウム カルシウム交換体 (NCX) など]。または非変更 electroneutral イオン運送者 [例えば、ナトリウム プロトン交換 (NHE)、塩化ナトリウム共輸送体、NaPi2c、等です。]。膜側の透過物の蛍光染料2やトランスポーターの両方のクラスの活動は広範囲の放射性同位体の取り込みを使用して検討されています。両方のアプローチは、特定の細胞質のイオンのバルク濃度の変化を測定することによってトランスポーターの活性を推定し、両者適度な感度と時間分解能と細胞内の管理不十分などの制限があります。環境。確かに、多くのトランスポーターの活性は細胞質 (例えばNHE3、NCX)、運ばれたイオン濃度に依存して、これらのイオン濃度の変化が輸送活動2の調節に重要な役割を果たすことが期待,3,5します。 これらの調節のメカニズムの正確な測定は古典的な方法を使用して制限されます。
これらの制限を克服するために、パッチ クランプ方法トランスポーター活性2,6が検討されます。具体的には、クランピング システム パッチ併用自己参照型イオン選択性電極 (ISEs)7,8は最近 electroneutral トランスポーター アクティビティ3,4の測定を許可しています。,5。 天気予報がトランスポーター活性細胞膜近くにイオン勾配を作成するという事実に基づいています。移動し、細胞膜の繰り返しから伊勢、振動のファッションは、電圧差 (μ V) を記録します。電圧の違いは、拡散2,9の Fick の最初の法律を適用する校正法を用いたイオン流束の値に変換できます。天気予報が使用されている間のうち移動イオンのフラックスを検出する細胞、両方の全細胞のパッチ クランプ法またはインサイド アウト構成膜電位および細胞内のイオン組成を制御するために使用します。また、巨大なパッチ ・ クランプの技術のアプリケーションには、イオンだけでなく、脂質とタンパク質の3、5の細胞内構成の変更ができます。
要約すると、パッチ クランプ法の汎用性は研究する他の方法の輸送活動が行ったことパッチはこれらの他のメソッドの一般的な制限事項を克服するために適切なクランプと比較されます。自己参照を示さなかったし、パッチク ランプ法の組み合わせが厳しく制御された実験環境における electroneutral トランスポーターの活性を測定して小説生物物理・分子を発見するユニークな可能性を提供しています細胞膜の性質は、3,4,5を転送します。このアプローチは、NHE の活動を研究する正常に使用されています。哺乳類 NHE タンパク質ファミリーは、内側の Na+グラデーションを利用した細胞内のプロトン (H+)10,11細胞外ナトリウム (Na+) の electroneutral ネット交換を触媒します。哺乳類で、NHE タンパク質ファミリーには、11 の関連蛋白質 (NHE1 9 および NHA1 2) と精子固有の NHE10,12,13が含まれています。
NHEs (SLC9a 族) 単純な原核生物から高等真核生物にほとんど生物で普遍的に発見され、さまざまな重要な細胞機能10,11で細胞の塩分防御を制御に関与しています。原核生物、酸基盤ホメオスタティス、細胞量を維持し、様々 な特殊な上皮10,12,14,15の塩と水の吸収を調節します。NHEs の重要な生物学的役割とその機能の重要性がいくつかの研究によって決定されています。ただし、いくつかの研究は、方法論の限界4のための哺乳類 NHEs 生物物理・分子特性を検討しました。最近では、自己細胞パッチク中に天気予報を参照するアプリケーションはイオン、タンパク質やリン脂質で3の細胞内濃度の変化によって規制されての NHE アイソ フォームの分子機構を明らかにしました。 4。
具体的には、この原稿の提供されるプロトコル概要方法や勉強活動と NHE アイソ フォーム 3 の規則 (NHE3) Na+、Cl-、HCO3- 、液の吸収の主要なプレーヤーのためのアプローチ、腎と小腸上皮14,16の刷子縁膜。細胞内イノシトールリン脂質 NHE3 活動の感度の違いに新しい洞察力 (phosphatidylinositide 4, 5-ビスリン酸 [PI (4, 5) P2] と phosphatidylinositide 3,4,5 三リン酸 [PI(3,4,5]P3]) が報告されます。チャンネルやトランスポーターなどの細胞輸送蛋白質はイノシトールリン脂質17、によって調整されるし、NHE3 は直接 PI (4, 5) P2 と P3 PI (3,4,5)18をバインドします。現在の文献に基づいて、いずれかのイノシトールリン脂質 NHE35,18,19の生理や病態生理学的規制に関連する可能性があります。我々 の調査結果は、PI (4, 5) P2 の PI (3,4,5) P3 NHE3 活性の調節の別のロールをサポートします。この区別は、全細胞パッチク ランプとの組み合わせで伊勢の技術の適用のため可能だった。この技法は、NHE3 活性の測定中に異なるイノシトールリン脂質の細胞内血流を介してホスホイノシチド携帯電話コンテンツのコントロールもできます。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="961">
	<tbody>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:367px;">Patch clamp Amplifier</td>
			<td style="width:219px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td style="width:276px;"></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;">Dual Channel Differential Electrometer (HiZ-223)</td>
			<td style="width:219px;">Warner Instruments</td>
			<td style="width:101px;">64-1650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;">Differential Amplifier (DP-301)</td>
			<td style="width:219px;">Warner Instruments</td>
			<td style="width:101px;">64-0044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;">Patch Clamp Software Based on MatLab</td>
			<td style="width:219px;">MatLab with acquisition toolbox</td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td>The capmeter software is recommended</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:367px;">ThermoClamp-1 Temperature Control System</td>
			<td>&#160;AutoMate Scientific</td>
			<td style="width:101px;">03-11-LL</td>
			<td>In-line heater</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:367px;">Single-Channel Temperature Controller (TC-324C)</td>
			<td style="width:219px;">Warner Instruments</td>
			<td style="width:101px;">64-2400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:367px;">Single-Barrel Standard Borosilicate Glass Tubing</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td style="width:101px;">1B120F-3&#160;&#160;</td>
			<td style="width:276px;">Used for ion selective electrodes</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:367px;">Micropipette Storage Jar</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>E212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:367px;">Bis(dimethylamino)dimethylsilane</td>
			<td style="width:219px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>14755-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:367px;">Carbon tetrachloride</td>
			<td style="width:219px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td colspan="2">319961-500ML</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:367px;">Hydrogen ionophore I - cocktail B</td>
			<td style="width:219px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">95293</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:367px;">Thin Wall Borosilicate Tubing</td>
			<td style="width:219px;">&#160;Sutter Instrument</td>
			<td style="width:101px;">B200-156-15</td>
			<td style="width:276px;">Used for patch clamp pipette&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:367px;">Soft glass (Corning 8161 Patch Glass)</td>
			<td style="width:219px;">Warner Instruments</td>
			<td style="width:101px;">64-0815</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;">Silica Capillary Tubing (150um OD/75um ID)</td>
			<td style="width:219px;">Molex (Polymicro Technologies)</td>
			<td>106815-0018</td>
			<td style="width:276px;">Used for intra-pipette perfusion system</td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;">Potassium chloride</td>
			<td style="width:219px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:367px;">Potassium aspartate&#160;</td>
			<td style="width:219px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>A6558</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:367px;">EGTA</td>
			<td style="width:219px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>E3889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:367px;">Magnesium chloride</td>
			<td style="width:219px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">M4880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:367px;">Mg-ATP</td>
			<td style="width:219px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">A9187</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:367px;">HEPES</td>
			<td style="width:219px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:367px;">PIPES</td>
			<td style="width:219px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6757</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:367px;">MOPS</td>
			<td style="width:219px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>M1254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:367px;">MES</td>
			<td style="width:219px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>M3671</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:367px;">Calcium chloride</td>
			<td style="width:219px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>C5670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:367px;">Tris</td>
			<td style="width:219px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">T1503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:367px;">Hydrochloric acid</td>
			<td style="width:219px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>H1758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:367px;">Apyrase</td>
			<td style="width:219px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>A6535</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;">Phosphatidylinositol(4,5) bisphosphate diC8</td>
			<td>Echelon Biosciences</td>
			<td>P-4508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;">Phosphatidylinositol 3,4,5-trisphosphate diC8</td>
			<td>Echelon Biosciences</td>
			<td>P-3908</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

application of electrophysiology measurement to study the activity of electro-neutral transporters

細胞膜中のイオン輸送は細胞の生存に不可欠な細胞内外のイオン濃度の微調整を保証します。これらの転送機構は、専門にされた蛋白質の活動によって仲介されます。具体的には、pH の動態は、原形質膜プロトン (H+) 押出シ ステ ム、ナ+などによって制御される細かく/H+交換 (NHE) 蛋白質家族。NHE の調節機構を研究するための広範な努力にもかかわらず NHE 族の生物物理・分子の性質の私達の現在の理解は、NHE 活動を効果的に測定する方法の限られた供給のためは十分ではないです。.本稿では、我々 は H+を使用-全体セル中に電極パッチ クランプ記録 NHE 誘起 H+フラックスを測定します。提案した通常のいくつかの制限を克服するためにこのアプローチは、放射性の取り込みなど蛍光膜定性、NHE の利用状況を測定するためのメソッドを使用します。記述法を用いた NHE 活性の測定により、細胞内の H+濃度のより効率的なコントロールと時間分解能高感度。H+-電極がトランスポーター活性細胞膜近くにイオン勾配を作成するという事実に基づいています。H+-への移行と繰り返し、振動方法で細胞膜から離れた電極記録電圧差 h+に依存しています。一方、H+-H+フラックス全体セル構成でパッチ クランプ メソッドを使用して、細胞内のイオン組成を制御する、セルの外に移動を検出する電極を使用します。また、巨大なパッチ ・ クランプの技術のアプリケーションには、イオンだけでなく、脂質の細胞内構成の変更ができます。NHE アイソ フォーム 3 (NHE3) の輸送活動はイノシトールリン脂質により NHE3 調節の分子基盤の研究にこの技術的なアプローチを使用して測定しました。

全細胞のパッチ ・ クランプ記録の中に自己参照の伊勢は、イノシトールリン脂質によって NHE3 活性の調節を研究に適用されました。PS120 線維芽細胞様細胞の24、内因性膜 NHEs の表現が不足しているが使用されました。NHE3 野生型 (NHE3 wt) または NHE3 変異しないバインド イノシトールリン脂質 [チロシン 501、503 アルギニンとリジン 505 はアラニン、Y501A/R503A/K505A (NHE3 YRK) で置換された] 安定 PS120 線維芽細胞様細胞18で表現されました。
トレースは、図 2に掲載されています。セルを全体セル構成、パッチク ランプ用ピペットで開催しましたし、ISE はセルの前に置かれました。この位置で、伊勢記録無料 H+の濃度に近い細胞膜 (図 1 a)。その後、伊勢 (またはパッチ クランプ ピペット) は手動で移動の横に 50 μ m、ソリューション (図 1 b) に無料 H+の濃度を記録しました。NHE3 活動 (図 1) のセルのセルの前にまたは、伊勢から遠いパッチ ピペットの 2 つの位置に対応する記録された電圧の違いはします。エンドウアピラーゼ (ATP-diphosphatase) のピペット内灌流後減少ホスホイノシチド コンテンツ5ATP の細胞内濃度が低下します。以前に報告された研究5,18,19, 合意エンドウアピラーゼ治療を介したイノシトールリン脂質低下コンテンツ削減 NHE3 活動 (50% 以下)、電圧の減少として計上しました振動振幅 (図 2)。NHE3 活動に及ぼす (5 単位/ml で与えられる) エンドウアピラーゼ完全に逆だった 2 μ M との組み合わせでエンドウアピラーゼのピペット内灌流による PI (3,4,5) P3 (図 2および 3 a)。これらの調査結果は、安定に発現する phosphatidylinositides18をバインドすることができませんでした NHE3 変異体 (NHE3 YRK) PS120 セルに記録 NHE3 活動によって支えられました。エンドウアピラーゼ単独または組み合わせて PIP3 の灌流は、NHE3 YRK 変異 (図 3 b) NHE3 の活動には影響しなかった.内因性 NHE3 の活動も、オポッサム腎臓 (OK) セル3のエンドウアピラーゼ処理により抑制された.PI (3,4,5) P3 のピペット内灌流逆 OK 細胞 (図 3) のエンドウアピラーゼによる NHE3 活性の阻害になります。NHE3 活動に及ぼす PI (3,4,5) P3 は細胞タイプに固有ではないことが示唆されました。
次に、NHE3 活動でエンドウアピラーゼを介した変更を規制する PIP3 の特異性をテストする目的とします。私たちはこの試金の PI (4, 5) P2 などの他のイノシトールリン脂質の灌流後 NHE3 活動エンドウアピラーゼ依存低減効果でした。PI (4, 5) P2 (10 μ M) では、エンドウアピラーゼ (図 4 a) を介した NHE3 活性の低下には影響しなかった。最後に、アンプ-PNP、非加水分解性 ATP アナログの灌流は NHE3 アクティビティ (図 4 b) theapyrase 依存的な抑制をブロックしていません。これらの調査結果は、PI (3,4,5) P3 がない PI (4, 5) P2 の ATP の枯渇後の NHE3 の調節の役割を提案します。PI (4, 5) P2 の規制は全細胞パッチク ランプ記録5併用伊勢測定中にイノシトールリン脂質の細胞灌流のためにだけ可能だった NHE3 の PI (3,4,5) P3 別のロールの id。PI (3,4,5) P3 よりもむしろ NHE3 活性の調節における PI (4, 5) P2 の特定のアクションは、異なる細胞内イノシトールリン脂質が異なる NHE3 の機能を調節するかどうかを決定するため貴重です。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56630/56630fig1.jpg"> 図 1.H+の模式図フラックス測定と NHE 活動と pH 電極によって記録された潜在的な違いの相関します。 記録設定の模式図。A.初期の実験的設定の図。セルは全体セル構成で保有するパッチ クランプ ピペットは、ISE の前に置かれました。この位置には、ISE は、細胞膜に近い無料 H+の濃度を記録します。B. 『 伊勢 (またはパッチ クランプ ピペット) 手動で移動横 ~ 50 μ m でありこの位置でソリューションの無料 H+の濃度を記録します。C.電圧差のグラフィック表現は、ISE を使用して記録されます。B (伊勢から遠いセル) に、伊勢の前に (セル) の位置から振動 NHE 活動の代表であります。使用ソフトウェアには、電圧の違い、伊勢で記録された細胞膜キャパシタンスとパッチ クランプ シールの品質を監視するための摂動 (20 mV, 0.2 kHz) 方形波を生成が登録されています。<a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56630/56630fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56630/56630fig2.jpg"> 図 2.記録の例はエンドウアピラーゼと PI (3,4,5) P3 潅流前後安定 NHE3 wt に発現する PS120 単細胞で NHE3 トランスポーター アクティビティの設定 (PIP3)。 初期録音後セルはエンドウアピラーゼ ピペット内灌流による ATP の枯渇だった。NHE3 活動は徐々 に減少し、PIP3 ピペット内灌流によって復元されました。エンドウアピラーゼ添加は赤色のバーで示される、PIP3 添加は緑色のバーで示されます。<a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56630/56630fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56630/56630fig3.jpg"> 図 3.ATP の枯渇と PIP3 PS120 と OK 細胞における NHE3 トランスポーター活性血流分布の効果。 PIP3 ピペット内灌流による NHE3 活動と NHE3 活性に及ぼすエンドウアピラーゼの予約に及ぼす ATP の枯渇のエンドウアピラーゼを介した: A. PS120 細胞発現 NHE3 wt またはBPS120 細胞発現 NHE3 YRK、NHE3 変異体イノシトールリン脂質をバインドできません。C. [ok] 細胞の内因性 NHE3 を表現します。実線の円は、個々 の実験 (同一の条件で実験 4) から平均データを表示します。誤差範囲は、平均 ± 標準誤差 (SE) を表します。* P < コントロール、分散分析対 0.05。$P < 0.5、エンドウアピラーゼ + PIP3, ANOVA 対$P < 0.01 エンドウアピラーゼ。<a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56630/56630fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56630/56630fig4.jpg"> 図 4.PI (4, 5) P2 の効果 (PIP2) と ATP の枯渇後の潅流 NHE3 活動に ANP PNP。 Aの効果PIP2 またはBANP PNP 内ピペット血流分布 NHE3 NHE3 重量実線の円は、個々 の実験 (同一の条件で実験 4) の平均データを表示を表現する PS120 細胞活性のエンドウアピラーゼ依存低減。誤差範囲を表す平均 ± SE。 * P < 0.05、* * P < コントロール、分散分析対 0.01。<a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56630/56630fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。

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Application of Electrophysiology Measurement to Study the Activity of Electro-Neutral Transporters

本稿では、プロトン電極やパッチク メソッドのプロトン輸送システムのアクティビティを計測への応用について説明します。これらのメソッドは、一般的に中等度の感度、時間分解能が不足して細胞内環境制御などのプロトン輸送活性を研究する使用される技術のいくつかの制限を克服します。

電気生理学測定の電気中立運送者の活動を研究への応用

The transport of ions through cell membranes ensures the fine control of ion content within and outside the cell that is indispensable for cell survival. ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

6.9K ビュー.  Des Moines University. 本稿では、プロトン電極やパッチク メソッドのプロトン輸送システムのアクティビティを計測への応用について説明します。これらのメソッドは、一般的に中等度の感度、時間分解能が不足して細胞内環境制御などのプロトン輸送活性を研究する使用される技術のいくつかの制限を克服します。

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Testing Visual Sensitivity to the Speed and Direction of Motion in Lizards

Testing visual sensitivity in any species provides basic information regarding behaviour, evolution, and ecology. However, testing specific features of the visual system provide more empirical evidence for functional applications. Investigation into the sensory system provides information about the sensory capacity, learning and memory ability, and establishes known baseline behaviour in which to gauge deviations (Burghardt, 1977). However, unlike mammalian or avian systems, testing for learning and memory in a reptile species is difficult. Furthermore, using an operant paradigm as a psychophysical measure of sensory ability is likewise as difficult. Historically, reptilian species have responded poorly to conditioning trials because of issues related to motivation, physiology, metabolism, and basic biological characteristics. Here, I demonstrate an operant paradigm used a novel model lizard species, the Jacky dragon (Amphibolurus muricatus) and describe how to test peripheral sensitivity to salient speed and motion characteristics. This method uses an innovative approach to assessing learning and sensory capacity in lizards. I employ the use of random-dot kinematograms (RDKs) to measure sensitivity to speed, and manipulate the level of signal strength by changing the proportion of dots moving in a coherent direction. RDKs do not represent a biologically meaningful stimulus, engages the visual system, and is a classic psychophysical tool used to measure sensitivity in humans and other animals. Here, RDKs are displayed to lizards using three video playback systems. Lizards are to select the direction (left or right) in which they perceive dots to be moving. Selection of the appropriate direction is reinforced by biologically important prey stimuli, simulated by computer-animated invertebrates.

Testing visual sensitivity in lizards using an operant conditioning paradigm that employs video playback of random-dot kinematograms and computer-generated invertebrates.

トカゲの運動の速度と方向の視覚感度のテスト

Testing visual sensitivity in any species provides basic information regarding behaviour, evolution, and ecology. However, testing specific features of ...

生物学

Computer-Generated Animal Model Stimuli

Communication between animals is diverse and complex. Animals may communicate using auditory, seismic, chemosensory, electrical, or visual signals. In particular, understanding the constraints on visual signal design for communication has been of great interest. Traditional methods for investigating animal interactions have used basic observational techniques, staged encounters, or physical manipulation of morphology. Less intrusive methods have tried to simulate conspecifics using crude playback tools, such as mirrors, still images, or models. As technology has become more advanced, video playback has emerged as another tool in which to examine visual communication (Rosenthal, 2000). However, to move one step further, the application of computer-animation now allows researchers to specifically isolate critical components necessary to elicit social responses from conspecifics, and manipulate these features to control interactions. Here, I provide detail on how to create an animation using the Jacky dragon as a model, but this process may be adaptable for other species. In building the animation, I elected to use Lightwave  3D to alter object morphology, add texture, install bones, and provide comparable weight shading that prevents exaggerated movement. The animation is then matched to select motor patterns to replicate critical movement features. Finally, the sequence must rendered into an individual clip for presentation. Although there are other adaptable techniques, this particular method had been demonstrated to be effective in eliciting both conspicuous and social responses in staged interactions.

Computer-generated stimuli using the Jacky dragon as a model.

コンピュータによって生成された動物モデルの刺激

Communication between animals is diverse and complex. Animals may communicate using auditory, seismic, chemosensory, electrical, or visual signals. In ...

Applying Microfluidics to Electrophysiology

Microfluidics can be integrated with standard electrophysiology techniques to allow new experimental modalities.  Specifically, the motivation for the microfluidic brain slice device is discussed including how the device docks to standard perfusion chambers and the technique of passive pumping which is used to deliver boluses of neuromodulators to the brain slice.  By simplifying the device design, we are able to achieve a practical solution to the current unmet electrophysiology need of applying multiple neuromodulators across multiple regions of the brain slice.  This is achieved by substituting the standard coverglass substrate of the perfusion chamber with a thin microfluidic device bonded to the coverglass substrate.  This was then attached to the perfusion chamber and small holes connect the open-well of the perfusion chamber to the microfluidic channels buried within the microfluidic substrate.  These microfluidic channels are interfaced with ports drilled into the edge of the perfusion chamber to access and deliver stimulants.  This project represents how the field of microfluidics is transitioning away from proof-of concept device demonstrations and into practical solutions for unmet experimental and clinical needs.

電気生理学的にマイクロ流体の適用

Microfluidics can be integrated with standard electrophysiology techniques to allow new experimental modalities.  Specifically, the motivation for the ...

Semi-automated Optical Heartbeat Analysis of Small Hearts

We have developed a method for analyzing high speed optical recordings from Drosophila, zebrafish and embryonic mouse hearts (Fink, et. al., 2009). Our Semi-automatic Optical Heartbeat Analysis (SOHA) uses a novel movement detection algorithm that is able to detect cardiac movements associated with individual contractile and relaxation events. The program provides a host of physiologically relevant readouts including systolic and diastolic intervals, heart rate, as well as qualitative and quantitative measures of heartbeat arrhythmicity. The program also calculates heart diameter measurements during both diastole and systole from which fractional shortening and fractional area changes are calculated. Output is provided as a digital file compatible with most spreadsheet programs. Measurements are made for every heartbeat in a record increasing the statistical power of the output. We demonstrate each of the steps where user input is required and show the application of our methodology to the analysis of heart function in all three genetically tractable heart models.

We have developed a Semi-automated Optical Heartbeat Analysis method (SOHA) for analyzing high speed optical recordings from Drosophila, zebrafish and embryonic mouse hearts. We demonstrate the application of our methodology to the analysis of heart function in fruit fly and embryonic mouse hearts.

スモールハーツの半自動光ビート解析

We have developed a method for analyzing high speed optical recordings from Drosophila, zebrafish and embryonic mouse hearts (Fink, et. al., 2009). Our ...

Spinal Cord Electrophysiology

The neonatal mouse spinal cord is a model for studying the development of neural circuitries and locomotor movement. We demonstrate the spinal cord dissection and preparation of recording bath artificial cerebrospinal fluid used for locomotor studies. Once dissected, the spinal cord ventral nerve roots can be attached to a recording electrode to record the electrophysiologic signals of the central pattern generating circuitry within the lumbar cord.

A demonstration of the isolation of neonatal mouse spinal cord for electrophysiologic studies.

脊髄電気生理学

The neonatal mouse spinal cord is a model for studying the development of neural circuitries and locomotor movement. We demonstrate the spinal cord ...

Application of MassSQUIRM for Quantitative Measurements of Lysine Demethylase Activity

Recently, epigenetic regulators have been discovered as key players in many different diseases 1-3. As a result, these enzymes are prime targets for small molecule studies and drug development 4. Many epigenetic regulators have only recently been discovered and are still in the process of being classified. Among these enzymes are lysine demethylases which remove methyl groups from lysines on histones and other proteins. Due to the novel nature of this class of enzymes, few assays have been developed to study their activity. This has been a road block to both the classification and high throughput study of histone demethylases. Currently, very few demethylase assays exist. Those that do exist tend to be qualitative in nature and cannot simultaneously discern between the different lysine methylation states (un-, mono-, di- and tri-). Mass spectrometry is commonly used to determine demethylase activity but current mass spectrometric assays do not address whether differentially methylated peptides ionize differently. Differential ionization of methylated peptides makes comparing methylation states difficult and certainly not quantitative (Figure 1A). Thus available assays are not optimized for the comprehensive analysis of demethylase activity.
Here we describe a method called MassSQUIRM (mass spectrometric quantitation using isotopic reductive methylation) that is based on reductive methylation of amine groups with deuterated formaldehyde to force all lysines to be di-methylated, thus making them essentially the same chemical species and therefore ionize the same (Figure 1B). The only chemical difference following the reductive methylation is hydrogen and deuterium, which does not affect MALDI ionization efficiencies. The MassSQUIRM assay is specific for demethylase reaction products with un-, mono- or di-methylated lysines. The assay is also applicable to lysine methyltransferases giving the same reaction products. Here, we use a combination of reductive methylation chemistry and MALDI mass spectrometry to measure the activity of LSD1, a lysine demethylase capable of removing di- and mono-methyl groups, on a synthetic peptide substrate 5. This assay is simple and easily amenable to any lab with access to a MALDI mass spectrometer in lab or through a proteomics facility. The assay has ~8-fold dynamic range and is readily scalable to plate format 5.

We present a method for using MALDI mass spectrometry and reductive methylation chemistry to quantify changes in lysine methylation.

リジン脱メチル化酵素活性の定量測定のためのMassSQUIRMのアプリケーション

Recently, epigenetic regulators have been discovered as key players in many different diseases 1-3. As a result, these enzymes are prime targets for small ...

Introduction to Solid Supported Membrane Based Electrophysiology

The electrophysiological method we present is based on a solid supported membrane (SSM) composed of an octadecanethiol layer chemisorbed on a gold coated sensor chip and a phosphatidylcholine monolayer on top. This assembly is mounted into a cuvette system containing the reference electrode, a chlorinated silver wire.
After adsorption of membrane fragments or proteoliposomes containing the membrane protein of interest, a fast solution exchange is used to induce the transport activity of the membrane protein. In the single solution exchange protocol two solutions, one non-activating and one activating solution, are needed. The flow is controlled by pressurized air and a valve and tubing system within a faraday cage.
The kinetics of the electrogenic transport activity is obtained via capacitive coupling between the SSM and the proteoliposomes or membrane fragments. The method, therefore, yields only transient currents. The peak current represents the stationary transport activity. The time dependent transporter currents can be reconstructed by circuit analysis.
This method is especially suited for prokaryotic transporters or eukaryotic transporters from intracellular membranes, which cannot be investigated by patch clamp or voltage clamp methods.

Here we present an electrophysiological method based on solid supported membranes with focus on its applications for the characterization of electrogenic membrane transporters.

電気生理学基づき固体支持された膜の概要

The electrophysiological method we present is based on a solid supported membrane (SSM) composed of an octadecanethiol layer chemisorbed on a gold coated ...

Reconstruction of 3-Dimensional Histology Volume and its Application to Study Mouse Mammary Glands

Histology volume reconstruction facilitates the study of 3D shape and volume change of an organ at the level of macrostructures made up of cells. It can also be used to investigate and validate novel techniques and algorithms in volumetric medical imaging and therapies. Creating 3D high-resolution atlases of different organs1,2,3 is another application of histology volume reconstruction. This provides a resource for investigating tissue structures and the spatial relationship between various cellular features. We present an image registration approach for histology volume reconstruction, which uses a set of optical blockface images. The reconstructed histology volume represents a reliable shape of the processed specimen with no propagated post-processing registration error. The Hematoxylin and Eosin (H&#38;E) stained sections of two mouse mammary glands were registered to their corresponding blockface images using boundary points extracted from the edges of the specimen in histology and blockface images. The accuracy of the registration was visually evaluated. The alignment of the macrostructures of the mammary glands was also visually assessed at high resolution.
This study delineates the different steps of this image registration pipeline, ranging from excision of the mammary gland through to 3D histology volume reconstruction. While 2D histology images reveal the structural differences between pairs of sections, 3D histology volume provides the ability to visualize the differences in shape and volume of the mammary glands.

We present an image registration approach for 3-dimensional (3D) histology volume reconstruction, which facilitates the study of the changes of an organ at the level of macrostructures made up of cells . Using this approach, we studied the 3D changes between wild-type and Igfbp7-null mammary glands.

3次元組織学ボリュームとマウス乳腺研究への応用再建

Histology volume reconstruction facilitates the study of 3D shape and volume change of an organ at the level of macrostructures made up of cells. It can ...

High-throughput Image Analysis of Tumor Spheroids: A User-friendly Software Application to Measure the Size of Spheroids Automatically and Accurately

The increasing number of applications of three-dimensional (3D) tumor spheroids as an in vitro model for drug discovery requires their adaptation to large-scale screening formats in every step of a drug screen, including large-scale image analysis. Currently there is no ready-to-use and free image analysis software to meet this large-scale format. Most existing methods involve manually drawing the length and width of the imaged 3D spheroids, which is a tedious and time-consuming process. This study presents a high-throughput image analysis software application &#8211; SpheroidSizer, which measures the major and minor axial length of the imaged 3D tumor spheroids automatically and accurately; calculates the volume of each individual 3D tumor spheroid; then outputs the results in two different forms in spreadsheets for easy manipulations in the subsequent data analysis. The main advantage of this software is its powerful image analysis application that is adapted for large numbers of images. It provides high-throughput computation and quality-control workflow. The estimated time to process 1,000 images is about 15 min&#160;on a minimally configured laptop, or around 1 min&#160;on a multi-core performance workstation. The graphical user interface (GUI) is also designed for easy quality control, and users can manually override the computer results. The key method used in this software is adapted from the active contour algorithm, also known as Snakes, which is especially suitable for images with uneven illumination and noisy background that often plagues automated imaging processing in high-throughput screens. The complimentary &#8220;Manual Initialize&#8221; and &#8220;Hand Draw&#8221; tools provide the flexibility to SpheroidSizer in dealing with various types of spheroids and diverse quality images. This high-throughput image analysis software remarkably reduces labor and speeds up the analysis process. Implementing this software is beneficial for 3D tumor spheroids to become a routine in vitro model for drug screens in industry and academia.

We present a high-throughput image analysis software application to measure the size of three-dimensional tumor spheroids imaged with bright-field microscopy. This application provides a fast and effective way to examine the effects of therapeutic drugs on spheroids, which is beneficial for researchers who wish to use spheroids in drug screens.

腫瘍球の高スループット画像解析：自動的かつ正確にスフェロイドのサイズを測定するための使いやすいソフトウェアアプリケーション

The increasing number of applications of three-dimensional (3D) tumor spheroids as an in vitro model for drug discovery requires their adaptation to ...

Measurement of Larval Activity in the Drosophila Activity Monitor

Drosophila larvae are used in many behavioral studies, yet a simple device for measuring basic parameters of larval activity has not been available. This protocol repurposes an instrument often used to measure adult activity, the TriKinetics Drosophila activity monitor (MB5 Multi-Beam Activity Monitor) to study larval activity. The instrument can monitor the movements of animals in 16 individual 8 cm glass assay tubes, using 17 infrared detection beams per tube. Logging software automatically saves data to a computer, recording parameters such as number of moves, times sensors were triggered, and animals&#8217; positions within the tubes. The data can then be analyzed to represent overall locomotion and/or position preference as well as other measurements. All data are easily accessible and compatible with basic graphing and data manipulation software. This protocol will discuss how to use the apparatus, how to operate the software and how to run a larval activity assay from start to finish.

Measurement of Larval Activity in the Drosophila Activity Monitor

This report describes a method for measuring Drosophila larval activity using the TriKinetics Drosophila Activity Monitor. The device employs infrared beams to detect movements of up to 16 individual animals. Data can be analyzed to represent motion parameters including rates and the positions of the animals within the assay chambers.

幼虫活性の測定<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;アクティビティモニタ

Drosophila larvae are used in many behavioral studies, yet a simple device for measuring basic parameters of larval activity has not been available. This ...