この作業は、研究資源 (2G12RR03060 26A1); 国立センターからの補助金によって支えられました。少数の健康および健康格差 (8G12MD007603-27) 国立衛生研究所から国立研究所プロフェッショナル スタッフ議会市立大学ニューヨーク (PSC ニューヨーク市立大学);教員の研究グラント (ドイツ連邦共和国 II) アメリカ大学シャルジャ.Vidyasagar Sriramoju は、これらのメソッドにご紹介を感謝いたします。

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	<li>Nakashima, A., Dyck, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zinc+and+cortical+plasticity.">Zinc and cortical plasticity.</a> Brain Res. Rev. 59, 347-373 (2009).</li><li>Frederickson, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurobiology+of+zinc+and+zinc-containing+neurons.">Neurobiology of zinc and zinc-containing neurons.</a> Int Rev Neurobiol. 31, 145-238 (1989).</li><li>Beaulieu, C., Dyck, R., Cynader, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enrichment+of+glutamate+in+zinc-containing+terminals+of+the+cat+visual+cortex.">Enrichment of glutamate in zinc-containing terminals of the cat visual cortex.</a> NeuroReport. 3 (10), 861-864 (1992).</li><li>Martinez-Guijarro, F. 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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Areal+organization+of+the+posterior+parietal+cortex+of+the+ferret+(Mustela+putorius).">Areal organization of the posterior parietal cortex of the ferret (Mustela putorius).</a> Cereb Cortex. 12, 1280-1297 (2002).</li><li>Wong, P., Kaas, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Architectonic+subdivisions+of+neocortex+in+the+gray+squirrel+(Sciurus+carolinensis.).">Architectonic subdivisions of neocortex in the gray squirrel (Sciurus carolinensis.).</a> The anatomical record. 291, 1301-1333 (2008).</li><li>Land, P. W., Shamalla-Hannah, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experience-dependent+plasticity+of+zinc-containing+cortical+circuits+during+a+critical+period+of+postnatal+development.">Experience-dependent plasticity of zinc-containing cortical circuits during a critical period of postnatal development.</a> J Comp Neurol. 447 (1), 43-56 (2002).</li><li>Czupryn, A., Skangiel-Kramska, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distribution+of+synaptic+zinc+in+the+developing+mouse+somatosensory+barrel+cortex.">Distribution of synaptic zinc in the developing mouse somatosensory barrel cortex.</a> J Comp Neurol. 386, 652-660 (1997).</li><li>Timm, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zur+Histochemie+der+Schwermetalle.+Das+Sulfid-Silber-Verfahren.">Zur Histochemie der Schwermetalle. Das Sulfid-Silber-Verfahren.</a> Dtsch Z ges gerichtl Med. 46, 706-711 (1958).</li></ol>

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現在の研究では、Danscher (1982) 法10、シナプス亜鉛の局在が検出され、脳で可視化するという修正版に基づく組織化学的手法を採用しています。このメソッドは本質的に亜鉛キレート剤ナトリウム亜セレン酸 (Na2SeO3) 動物 (15 mg/kg) を注入することによって動作します。注入後、亜セレン酸は脳に移動し、亜鉛亜鉛含有ニューロンのシナプス小胞にローカライズされたバインドします。亜鉛イオンはシナプス小胞の沈殿物内の分子にバインドされ、その後物理的な開発2,11的に視覚化できます。元のティムの硫化銀染色法は、検出し、生体組織22Au、Ag、Pt、Fe、Cd、Cu、Ni、Zn など重金属の数を視覚化する意図されていた。このメソッドに使用されるキレート剤は、硫化ナトリウムです。したがって、ティムの硫化物法を用いた主要な問題は、金属硫化物に変換することができます任意の金属に銀の物理的な開発によって増幅されるかもしれない確かに特異性の欠如です。ただし、現在の研究で使用されている Danscher メソッドの修正版は、亜鉛とは他の重金属に固有です。Danscher の 1982年法と本法の本研究で述べるいくつかの違いがあります。Danscher のメソッドは、我々 は凍結するティッシュを使用して固定されていない新鮮な脳組織を使用します。Danscher はまた、血流のパラホルムアルデヒドを使用する免疫組織化学的、我々 は定期的に私たちの研究室での染色他組織学的マーカーとの互換性これが、グルタルアルデヒドを使用します。Danscher はまた、トルイジン ブルー (1%)、我々 は本手法では実行しないなどの poststaining のプロシージャを使用します。
本手法の 1 つの制限は、ナトリウム亜セレン酸耐性を持つ動物に関連付けられている予測です。我々 は、亜セレン酸ナトリウム投与、時々 動物残らない 30 分以上を見つけます。亜セレン酸、脳への旅行には十分な時間ができないし、脳のセクションのそれに続く開発は通常不均一な組織染色につながるこのような状況が問題します。もう一つの潜在的な制限は、亜セレン酸ナトリウムの腹腔内投与の適切な管理に関連付けられます。1 つはより低い腹部キャビティの上の皮膚にプルする必要があります、腹壁だけを貫通 15-20 度の角度でを針ベベル側を挿入します。針必要がありますに引き戻され少し腹部臓器が浸透していない材料が吸引されていないことを確認します。針を破棄し、これが発生した場合は交換する必要があります。
高品質な染色結果と再現性を確保するため、次の警告措置をお勧めします。動物の動物、および最大生存期間に亜セレン酸ナトリウムを適切に管理 (90 60 分が最適)、安楽死させる前に脳への旅行にセレンに十分な時間を確保するために欠かせない。我々 はその短い生存期間を発見した (30 分以内) 通常不均一な組織染色に 。同様に、重要なステップは、ブロックを切断した直後に卵白话スライド セクションを装着します。日数の間、PBS の凍結切片を新鮮なカットを残してはに対して強く助言としてソリューションに亜鉛イオンが溶出します。開発者向けソリューションの準備中、クエン酸バッファーが正しい pH (4.0) この反応は pH の小さい変化に非常に敏感なことを確認する重要です。同様に、ヒドロキノン溶液を加熱は、それは 60 の ° C の下の温度を維持するために不可欠であるが、さらに加熱としてソリューションを酸化し、汚れを抑制します。同様に、ゼラチンのスライド マウントのセクションを簡単に水没が非固有セクションの表面に銀の沈着を防ぐため重要です。ただし、セクションはない 10 以上のゼラチン溶液に残っているべきこれとして s の原因に縮まる不均一な組織染色につながるようになります。開発者ソリューション中のセクションの定期的な目視検査を残して以来のセクション長すぎる overstaining につながることができます勧めします。この汚れはかなりセクションは周囲の温度が暖かいともっとゆっくり温度が涼しいときより迅速に開発する傾向があるので温度に敏感であります。最後に、ゼラチンやスライドから残留銀預金の除去を容易にするために暖かい水ですすぎ段階スライド ラックにスライドを軽く振るする場合があります。しかし、スリップするセクションを引き起こすことができますぬるま湯でスライドを洗浄中のセクションの余分で、不注意な攪拌はスライドをオフ、避けるべきであります。また、定量的な比較を行うため濃度測定のため使用は適切なコントロールが重要です。1 つは潜在的内部統制として軽く、染色または非汚染地域を使用可能性があります。当社の素材開発全体を通して異なる視覚皮質野の光学密度値を正規化するのにとコントロールとして、白質を使用します。我々 は、白質の値が匹敵するさまざまな年齢層の間で、大人17である見つけます。したがって、ことを考えると白質値は年齢の関数として変化しません、白質はデンシトメトリー分析の有効なコントロールとして機能します。
この方法の主な利点は、分布が使えるので、他の組織化学的マーカーのような脳の領域を区別するために、シンプルで信頼性の高い組織化学的染色であることです。しかし、この組織化学的方法の使用は (それらが亜鉛に欠けている) 特定の細胞集団を研究適さない場合がありますまたはシナプス亜鉛として非常に若い動物レベルがマウス体性感覚とネコ視覚野5 の開発に示すように、出生時低 ,20。このプロトコルの別の利点は、神経解剖学的トレーサー注入実験と組み合わせて使えます。私たちの研究室で通常視覚野における複数の領域間の接続パターンの発達的変化を研究する少年のフェレットの一次視覚野に双方向神経トレーサーを注入します。したがって、別の実験研究動物が悪用される場合動物がもっぱら亜鉛化学の使用されない必要があります。この方法の主な利点は、他の種や他の頭脳領域での使用に適応することができます。フェレットの脳組織を使用してこのメソッドを示しましたが、齧歯動物、猫、サルの脳組織を勉強するときに手順のいくつかの微妙な違いが可能性があります。他は正常に染色成人サル視覚野8、開発および大人猫視覚野5ラット体性感覚野9の開発の違いを説明するためにこの亜鉛の組織化学的手法を使用しました。,20、成体マウス体性感覚野6,21, および成人パルマ ワラビー視覚野7。
ここで、我々 は高品質亜鉛染色を一貫して達成するために制御する必要がありますプロトコルおよびアンダー スコアの重要なパラメーターの基本的な手順を概説します。1 つは他の感覚や運動野のシナプスの亜鉛レベルまたは他のモデル動物における皮質下構造の変化を評価する必要があります。その濃度の定量的な情報を解析は、このメソッドは (17以前示されている)、次の時間と異なる脳領域間のシナプスの亜鉛レベルのおそらく明らか別の発達プロファイルの皮質の開発のために有利にすることができます。重要な考慮事項は、発達の質問と勉強する動物の対応する年齢です。シナプス亜鉛化学はフェレットで明確に識別できる視覚皮質を明らかにし、皮質の組織と機能のさらなる研究に有用なガイドとして役立つかもしれない。

組織学的汚れは伝統的建築の機能の違いを明らかにして様々 な種の皮質領野の同定の支援するために使用されています。ニッスル物質、チトクロム酸化酵素 (CO) 反応性ミエリンを組織化学的手法の併用は、成人の脳と同様の面積境界を明らかにする証明実り。しかし、これらの組織化学的汚れは皮質と未熟な脳の層の間の明確な境界を常に十分に明らかに行います。
中枢神経系における亜鉛の多数規制機能に参加してシナプス小胞の存在を通して神経調節物質として作用する酵素の補足因子としての DNA 構造の安定化を含むいくつかの重要な機能1。 それが視覚化できること組織学的手法を用いた蛋白結合亜鉛は可視化2をすることはできません一方、シナプス亜鉛はユニークな。この機能は、異なる皮質のシナプス亜鉛パターンを明らかにするために悪用されているし、組織化学シナプスの亜鉛は、多くの研究で使用されています。大脳皮質のグルタミン酸作動性ニューロンのサブセットには、その軸索ターミナル3,4内シナプス小胞中の亜鉛が含まれています。組織化学的研究は、大脳皮質の5,6,7でのシナプスの亜鉛の不均質分布を明らかにしました。異なる皮質領域 (例えば、体性感覚野と視覚的)、または層中の亜鉛の組織化学的反応性の異なる面積と層流分布をするようです (例えば亜鉛量は、顆粒と一次視覚野のではレイヤーが視床入力層 IV シナプス亜鉛の比較的低レベルでより大幅に高い)5,8,9。シナプスの亜鉛は、大脳皮質にみられる染色の不均一性は、面積と層流の識別を容易に特に有利であります。
Danscher の 1982年法10の修正版は、シナプスの亜鉛の化学プロシージャの詳細な説明をご紹介します。このメソッドは、キレート剤として、動物に亜セレン酸注入腹腔内 (IP) を利用しています。亜セレン酸は、脳内でグルタミン酸作動性シナプスのサブセットの小胞は、亜鉛のプールと反応する脳へ移動します。この反応は銀の開発2,,1011後高めることができる沈殿物を生成します。
この手順は、シナプス亜鉛の汚損; の層流および面積のパターンを明らかにします。デンシトメトリー分析は、感覚や環境、薬理学的、遺伝的操作など、他の介入の効果を研究する大人と未熟な脳で定性的・定量的にこれらのパターンを評価するために使用可能性があります。また、1 つはまた他のモデル系シナプス亜鉛その他の皮質や皮質下構造の分布の潜在的な発達的変化を評価しすることも。デンシトメトリーの分析を提供するこの方法で定量的な情報を時間をかけて次の脳の発達のために有利にすることができます。このプロトコルは、層流と地域の境界を明らかにする他の免疫・組織化学的マーカーにコンパニオンを提供します。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Euthasol (Euthanasia solution)</td>
			<td>Henry Schein</td>
			<td>710101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium selenite</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>214485</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine (Ketaved)</td>
			<td>Henry Schein</td>
			<td>48858</td>
			<td>100 mg/ml injectables</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine (Anased)</td>
			<td>Henry Schein</td>
			<td>33198</td>
			<td>100 mg/ml injectables</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F8775</td>
			<td>Dilute to 4%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gum arabic</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G9752-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citric acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C1909</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium citrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>W302600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydroquinone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H9003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silver lactate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>85210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fish gelatine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7765</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytochrome c</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C2506</td>
			<td>(Type III, from equine heart)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Catalse</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Domino</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>X5P-1GAL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Permount</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SP15-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% Ethanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A406-20</td>
			<td>Used for dehydration prior to slide mounting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td>Brain Research Laboratories</td>
			<td>#3660-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Frosted unsubbed slides</td>
			<td>Brain Research Laboratories</td>
			<td>#3875-FR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome</td>
			<td>American Optical Company</td>
			<td>860</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>BX-60</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adope Photoshop</td>
			<td>Adobe Systems, San Jose, CA</td>
			<td></td>
			<td>To assemble images</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>Free software can be downloaded at http://rsb.info.nih.gov/ij/</td>
			<td></td>
			<td>For densometric measurements</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic tray</td>
			<td>Any standard plastic tray may be used</td>
			<td></td>
			<td>to immerse slides in developer solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hot plate</td>
			<td>Any standard hotplate may be used</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

use of synaptic zinc histochemistry to reveal different regions and laminae in the developing and adult brain

解剖学的および機能的な脳組織および開発の評価には、異なる神経回路と未熟な大人の脳の領域の正確な同定が必要です。ここで別のレイヤーと脳の間で染色パターンの違いを明らかにする亜鉛の組織化学的染色手順をについて説明します。他の人は亜鉛含有ニューロンと脳の回路の分布を明らかにするだけでなく、正常にいくつかの種の開発と大人の脳の面積と層流境界の線引きにもこのプロシージャを利用しています。ここで我々 は説明これ開発から画像とプロシージャを汚すと大人のフェレット脳。我々 はエリアのレイヤー、解剖学的マーカーとして機能する亜鉛染色パターンを明らかにして開発および成人の視覚野における視覚皮質を区別するために安心して使用できます。このプロトコルの主な目的は、レイヤーと他の方法がように失敗する発展途上と大人の脳の領域の正確な同定を可能にする組織化学的方法を提示することです。第二に、デンシトメトリーの画像解析と併せて、この方法により開発中の潜在的な変化を明らかにするためのシナプスの亜鉛の分布を評価するために 1 つです。このプロトコルは、試薬、ツール、および順次冷凍脳のセクションを染色に必要な手順の詳細について説明します。フェレット脳組織を使用してこのプロトコルを解説していますが、それは簡単に、齧歯動物、猫、または他の頭脳領域のように同様にサルでの使用に適応できます。

図 1のフローチャートのシナプス亜鉛の脳のセクションを染色するこのプロトコルに関連する主要な手順が掲載されています。プロトコルは 3 つのフェーズに分けることができます: 1) 血流や組織の採取、2) ティッシュの準備と染色と 3) 亜鉛化学。簡潔に、プロトコルの最初のフェーズは、動物は麻酔をかけられ、亜セレン酸ナトリウムの適切な投与量と IP を注入します。十分な時間の経過の (理想的には 60-90 分) 後、は、動物がその後安楽死させた後 4% パラホルムアルデヒド溶液に 0.9 %nacl 水溶液の灌流が。頭は首し、脳が頭蓋骨からすぐに削除されます。脳は、4% パラホルムアルデヒド プラス保護剤の検討として 30% ショ糖液でシンクできます。プロトコルの 2 番目のフェーズで凍結切片をリン酸緩衝生理食塩水 (PBS) に切断 40 μ m での滑走式ミクロトームで、番号のシリーズに分けます。最適な結果を得るのための一晩乾燥してセクションを残して断面、直後後卵白话スライド セクションをマウントすることが重要です。ゼラチン话 subbing のソリューションで通常使用される硫酸カリウム クロム cross-reacts 銀の乳酸と最適染色につながるよう、スライドは推奨されません。セクションを無水アルコールと室温で完全に乾燥を左で 15 分間インキュベーションします。この手順は、早めに、準備 1% ゼラチン液でマウントされたセクションの簡単な水没に続いては、最適な結果を得るのために一晩乾燥させています。プロトコル (亜鉛化学) の最後の段階で開発者溶液を調製して、メソッドのセクションで説明する手順に従って、スライドは、ソリューションに沈んでプラスチックまたはガラスのトレイに配置されます。汚れの開発は通常 2-3 日間かかりますが、近い外観検査はセクションを overstaining を避ける必要があります。適切な強度を達成したとき、スライドの削除、スライド ラックに配置および外側の銀の預金を削除する 5-10 分のために暖かい水で洗浄する必要があります。常温、クリア、coverslipped セクションを乾燥し、ことができます。プロトコルの亜鉛化学フェーズを完了するために必要な具体的な手順の概略を図 2に示します。
このプロトコルは、フェレット脳の視覚皮質の間で染色レベルの面積と層流の変動を明らかにするのに組織化学シナプスの亜鉛を使用します。このプロトコルは、他の頭脳領域のように同様に他の種で使用するために合わせることができます。たとえば、フェレットや他のモデル システムの体性感覚、聴覚、または前頭皮質など他の感覚野を調査している研究は、この組織化学的染色を使用してから大きく恩恵。この手法の主な利点は、齧歯動物、フェレット、猫、猿などの動物の子供で皮質を確実に区別し同様、大人の地域識別を容易にするために区域間の明確な転移を提供することです。
図 3 aは、プロセスでステンド グラスのセクションも長い、従って、我々 は誤って用に開発された overstained 亜鉛の例を示します。Overstained 組織は、非常に濃い茶色色、層流の変化の欠如によって特徴づけられるし、白質を強く染色です。ただし、図 3 bに示すように亜鉛ステンドの脳のセクションは understained 時。Understained セクションは、脳への旅からすべての挿入されたセレンを排除する時間 (60 分以上) の十分な量の動物が生存しなかった場合を生じる場合があります。亜セレン酸は正しく投与しない、したがって脳へ旅行していなかった組織の understaining があります。
大人のフェレットの複数の視覚皮質野における染色シナプスの亜鉛の不均質分布を図 4 aの代表的な半接線のセクションに示します。矢印は、面の境界をポイントします。17 と 18 の分野でシナプス亜鉛の染色強度は一般的に高層の I、II、III、および V、低層 IV (thalamorecipient 層)、および層 VI で中程度の。エリア 17 と 18 間の明確に識別できる転移の存在は、図 4 aで明らかです。地区 18 層 IV 染色強度が若干増加して変数の強度は V 層減少します。図 4 bは、チトクロム酸化酵素 (CO) 我々 は亜鉛染色で観察された地域の境界のような場所を示すため隣接するセクションです。CO 染色の低レベルを持っている 17 と亜鉛の高レベルを一般に持っている 18 の領域の領域が表示されます。
エリア 19 と 21 のシナプスの亜鉛の分布は、両方の領域 17 と 18 の分野でより少ない層流のバリエーションがあるつーことです。エリア 19 と 21 の 4 層は、それが適度にステンド グラス エリア 17 と 18 の 4 層とは明らかに違います。エリア 19 の顆粒とでは層似たような強さの V 層のわずかにより暗い汚れ。エリア 21 は、エリア 19 に匹敵するシナプス亜鉛分布。ただし、エリア 21 の VI 層は地域 19 の 4 層よりも大きいのシナプスの亜鉛レベルによって特徴付けられます。レイヤー VI と Suprasylvian IV (Ssy) 染色する適度に見えるし、匹敵する強度ですが、V 層はシナプスの亜鉛のより高いレベルによって特徴付けられる顆粒層は、シナプスの亜鉛レベルの変動パターンによって示されます。
だから必要な場合、異なる脳の領域は、さまざまな治療法や、さまざまな年齢層でシナプスの亜鉛の分布の定量的評価を実現できます。例えば、シナプス亜鉛大人でまたは第一次視覚野、聴覚、開発全体の分布の変化と任意の系における体性感覚野を評価することも 1 つ。デンシトメトリー分析を使用して、我々 は以前に、シナプスの亜鉛の分布複数の視覚野で (17、18、19、21、および Suprasylvian) フェレット脳の発達の年齢17の 6 週に 5 から大幅減少します。ここで我々 はプロセスを説明するために大人のフェレットから採取した代表的なサンプルのシナプスの亜鉛の分布の違いを評価するために必要な手順を説明します。これらの手順は、種や脳の他の地域と同様に少年フェレット視覚野を同様のシナプスの亜鉛の分布の変化を追跡することができます。大人の脳のセクション、相補的な正規化された光学密度プロット プロファイルと一緒に亜鉛化学処理から代表的な柱状の顕微鏡写真を図 5に示します。光学濃度値の正規化されたプロットは、皮質の深さに応じた変更を反映するように生成されました。したがって、各プロットのプロファイル値は、連続した皮質水深平均グレースケール値を反映します。例えば、エリア 17 と 18 は、亜鉛層 IV (トラフによって表される)、彼らのプロットのプロファイルから明らかになっている染色で顕著な減少によって特徴付けられます。エリア 17 と 18 の最小の光学密度値はいっぱい黒い楕円形で示されますを意味します。染色, 低亜鉛 19、21、および Ssy のエリアの亜鉛で微妙なディップ層 IV のみとエリア 17 と 18 は対照的のレベルします。総称して、エリア、レイヤー全体の亜鉛レベルは、17 と 18 の地域よりもより均一な 19、21、および Ssy が 17、18 のエリアよりも質的に異なる。また、顆粒層とエリア 17 と 18 の V 層通常染色しない層の VI よりももっと激しく。

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Use of Synaptic Zinc Histochemistry to Reveal Different Regions and Laminae in the Developing and Adult Brain

さまざまな地域と発展途上と大人の脳のラミナを明らかにするシナプス亜鉛化学の使用

パターンの異なる脳の領域を染色特性の層流および面積の亜鉛を明らかに組織化学的手順をについて説明します。レイヤーと領域を開発、大人の脳を確実に区別するためにその他の解剖学的マーカーと亜鉛染色パターンは組み合わせて使用可能性があります。

Characterization of anatomical and functional brain organization and development requires accurate identification of distinct neural circuits and regions ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

7.1K ビュー.  American University of Sharjah. パターンの異なる脳の領域を染色特性の層流および面積の亜鉛を明らかに組織化学的手順をについて説明します。レイヤーと領域を開発、大人の脳を確実に区別するためにその他の解剖学的マーカーと亜鉛染色パターンは組み合わせて使用可能性があります。

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Monitoring Changes in the Intracellular Calcium Concentration and Synaptic Efficacy in the Mollusc Aplysia

It has been suggested that changes in intracellular calcium mediate the induction of a number of important forms of synaptic plasticity (e.g., homosynaptic facilitation) 1. These hypotheses can be tested by simultaneously monitoring changes in intracellular calcium and alterations in synaptic efficacy. We demonstrate how this can be accomplished by combining calcium imaging with intracellular recording techniques. Our experiments are conducted in a buccal ganglion of the mollusc Aplysia californica. This preparation has a number of experimentally advantageous features: Ganglia can be easily removed from Aplysia and experiments use adult neurons that make normal synaptic connections and have a normal ion channel distribution. Due to the low metabolic rate of the animal and the relatively low temperatures (14-16 &deg;C) that are natural for Aplysia, preparations are stable for long periods of time. 
To detect changes in intracellular free calcium we will use the cell impermeant version of Calcium Orange 2 which is easily 'loaded' into a neuron via iontophoresis. When this long wavelength fluorescent dye binds to calcium, fluorescence intensity increases. Calcium Orange has fast kinetic properties 3 and, unlike ratiometric dyes (e.g., Fura 2), requires no filter wheel for imaging. It is fairly photo stable and less phototoxic than other dyes (e.g., fluo-3) 2,4. Like all non-ratiometric dyes, Calcium Orange indicates relative changes in calcium concentration. But, because it is not possible to account for changes in dye concentration due to loading and diffusion, it can not be calibrated to provide absolute calcium concentrations. 
An upright, fixed stage, compound microscope was used to image neurons with a CCD camera capable of recording around 30 frames per second. In Aplysia this temporal resolution is more than adequate to detect even a single spike induced alteration in the intracellular calcium concentration. Sharp electrodes are simultaneously used to induce and record synaptic transmission in identified pre- and postsynaptic neurons. At the conclusion of each trial, a custom script combines electrophysiology and imaging data. To ensure proper synchronization we use a light pulse from a LED mounted in the camera port of the microscope. Manipulation of presynaptic calcium levels (e.g. via intracellular EGTA injection) allows us to test specific hypotheses, concerning the role of intracellular calcium in mediating various forms of plasticity.

Monitoring Changes in the Intracellular Calcium Concentration and Synaptic Efficacy in the Mollusc Aplysia

We demonstrate how changes in the intracellular free calcium concentration and synaptic efficacy can be simultaneously monitored in a ganglion preparation of Aplysia. We image intracellular calcium using a fluorescent dye, Calcium Orange, and induce and monitor synaptic transmission with sharp (intracellular) electrodes.

軟体​​動物細胞内カルシウム濃度とシナプス伝達効率での変更のモニタ<em&gt;アメフラシ</em

It has been suggested that changes in intracellular calcium mediate the induction of a number of important forms of synaptic plasticity (e.g., ...

神経科学

Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of the dendritic tree, which eventually leads to neuronal output of action potentials at the axon. The influence of diverse spatial and temporal parameters of specific synaptic input on neuronal output is currently under investigation, e.g. the distance-dependent attenuation of dendritic inputs, the location-dependent interaction of spatially segregated inputs, the influence of GABAergig inhibition on excitatory integration, linear and non-linear integration modes, and many more.
With fast micro-iontophoresis of glutamate and GABA it is possible to precisely investigate the spatial and temporal integration of glutamatergic excitation and GABAergic inhibition. Critical technical requirements are either a triggered fluorescent lamp, light-emitting diode (LED), or a two-photon scanning microscope to visualize dendritic branches without introducing significant photo-damage of the tissue. Furthermore, it is very important to have a micro-iontophoresis amplifier that allows for fast capacitance compensation of high resistance pipettes. Another crucial point is that no transmitter is involuntarily released by the pipette during the experiment.
Once established, this technique will give reliable and reproducible signals with a high neurotransmitter and location specificity. Compared to glutamate and GABA uncaging, fast iontophoresis allows using both transmitters at the same time but at very distant locations without limitation to the field of view. There are also advantages compared to focal electrical stimulation of axons: with micro-iontophoresis the location of the input site is definitely known and it is sure that only the neurotransmitter of interest is released. However it has to be considered that with micro-iontophoresis only the postsynapse is activated and presynaptic aspects of neurotransmitter release are not resolved. In this article we demonstrate how to set up micro-iontophoresis in brain slice experiments.

In this article we introduce fast micro-iontophoresis of neurotransmitters as a technique to investigate integration of postsynaptic signals with high spatial and temporal precision.

グルタミン酸とGABAの高速マイクロイオン導入：シナプス統合を調査するために便利なツール

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of ...

Growing Neural Stem Cells from Conventional and Nonconventional Regions of the Adult Rodent Brain

Recent work demonstrates that central nervous system (CNS) regeneration and tumorigenesis involves populations of stem cells (SCs) resident within the adult brain. However, the mechanisms these normally quiescent cells employ to ensure proper functioning of neural networks, as well as their role in recovery from injury and mitigation of neurodegenerative processes are little understood. These cells reside in regions referred to as &#34;niches&#34; that provide a sustaining environment involving modulatory signals from both the vascular and immune systems. The isolation, maintenance, and differentiation of CNS SCs under defined culture conditions which exclude unknown factors, makes them accessible to treatment by pharmacological or genetic means, thus providing insight into their in vivo behavior. Here we offer detailed information on the methods for generating cultures of CNS SCs from distinct regions of the adult brain and approaches to assess their differentiation potential into neurons, astrocytes, and oligodendrocytes in vitro. This technique yields a homogeneous cell population as a monolayer culture that can be visualized to study individual SCs and their progeny. Furthermore, it can be applied across different animal model systems and clinical samples, being used previously to predict regenerative responses in the damaged adult nervous system.

Neural stem cells harvested from the adult brain are increasing utilized in applications ranging from the basic research of nervous system development to exploring potential clinical applications in regenerative medicine. This makes rigorous control in the isolation and culturing conditions used to grow these cells critical to sound experimental outcomes.

大人の齧歯類の脳の従来の従来にない地域から神経幹細胞を増殖させる

Recent work demonstrates that central nervous system (CNS) regeneration and tumorigenesis involves populations of stem cells (SCs) resident within the ...

Live Imaging of Mitosis in the Developing Mouse Embryonic Cortex

Although of short duration, mitosis is a complex and dynamic multi-step process fundamental for development of organs including the brain. In the developing cerebral cortex, abnormal mitosis of neural progenitors can cause defects in brain size and function. Hence, there is a critical need for tools to understand the mechanisms of neural progenitor mitosis. Cortical development in rodents is an outstanding model for studying this process. Neural progenitor mitosis is commonly examined in fixed brain sections. This protocol will describe in detail an approach for live imaging of mitosis in ex vivo embryonic brain slices. We will describe the critical steps for this procedure, which include: brain extraction, brain embedding, vibratome sectioning of brain slices, staining and culturing of slices, and time-lapse imaging. We will then demonstrate and describe in detail how to perform post-acquisition analysis of mitosis. We include representative results from this assay using the vital dye Syto11, transgenic mice (histone H2B-EGFP and centrin-EGFP), and in utero electroporation (mCherry-&#945;-tubulin). We will discuss how this procedure can be best optimized and how it can be modified for study of genetic regulation of mitosis. Live imaging of mitosis in brain slices is a flexible approach to assess the impact of age, anatomy, and genetic perturbation in a controlled environment, and to generate a large amount of data with high temporal and spatial resolution. Hence this protocol will complement existing tools for analysis of neural progenitor mitosis.

Neural progenitor mitosis is a critical parameter of neurogenesis. Much of our understanding of neural progenitor mitosis is based on analysis of fixed tissue. Live imaging in embryonic brain slices is a versatile technique to assess mitosis with high temporal and spatial resolution in a controlled environment.

発生中のマウス胚性皮質における有糸分裂のライブイメージング

Although of short duration, mitosis is a complex and dynamic multi-step process fundamental for development of organs including the brain. In the ...

High Resolution Quantitative Synaptic Proteome Profiling of Mouse Brain Regions After Auditory Discrimination Learning

The molecular synaptic mechanisms underlying auditory learning and memory remain largely unknown. Here, the workflow of a proteomic study on auditory discrimination learning in mice is described. In this learning paradigm, mice are trained in a shuttle box Go/NoGo-task to discriminate between rising and falling frequency-modulated tones in order to avoid a mild electric foot-shock. The protocol involves the enrichment of synaptosomes from four brain areas, namely the auditory cortex, frontal cortex, hippocampus, and striatum, at different stages of training. Synaptic protein expression patterns obtained from trained mice are compared to na&#239;ve controls using a proteomic approach. To achieve sufficient analytical depth, samples are fractionated in three different ways prior to mass spectrometry, namely 1D SDS-PAGE/in-gel digestion, in-solution digestion and phospho-peptide enrichment. 
High-resolution proteomic analysis on a mass spectrometer and label-free quantification are used to examine synaptic protein profiles in phospho-peptide-depleted and phospho-peptide-enriched fractions of synaptosomal protein samples. A commercial software package is utilized to reveal proteins and phospho-peptides with significantly regulated relative synaptic abundance levels (trained/na&#239;ve controls). Common and differential regulation modes for the synaptic proteome in the investigated brain regions of mice after training were observed. Subsequently, meta-analyses utilizing several databases are employed to identify underlying cellular functions and biological pathways.

The identification of molecules and pathways controlling synaptic plasticity and memory is still a major challenge in neuroscience. Here, a workflow is described addressing the relative quantification of synaptic proteins supposedly involved in the molecular reorganization of synapses during learning and memory consolidation in an auditory learning paradigm.

聴覚弁別学習した後、マウス脳領域の高分解能定量的シナプスプロテオームプロファイリング

The molecular synaptic mechanisms underlying auditory learning and memory remain largely unknown. Here, the workflow of a proteomic study on auditory ...

Recording Synaptic Plasticity in Acute Hippocampal Slices Maintained in a Small-volume Recycling-, Perfusion-, and Submersion-type Chamber System

Even though experiments on brain slices have been in use since 1951, problems remain that reduce the probability of achieving a stable and successful analysis of synaptic transmission modulation when performing field potential or intracellular recordings. This manuscript describes methodological aspects that might be helpful in improving experimental conditions for the maintenance of acute brain slices and for recording field excitatory postsynaptic potentials in a commercially available submersion chamber with an outflow-carbogenation unit. The outflow-carbogenation helps to stabilize the oxygen level in experiments that rely on the recycling of a small buffer reservoir to enhance the cost-efficiency of drug experiments. In addition, the manuscript presents representative experiments that examine the effects of different carbogenation modes and stimulation paradigms on the activity-dependent synaptic plasticity of synaptic transmission.

This protocol describes the stabilization of the oxygen level in a small volume of recycled buffer and methodological aspects of recording activity-dependent synaptic plasticity in submerged acute hippocampal slices.

少量循環、血流 - と水没型チャンバー システムで管理急性海馬スライスにおけるシナプス可塑性を記録

Even though experiments on brain slices have been in use since 1951, problems remain that reduce the probability of achieving a stable and successful ...

Exploring Deep Space - Uncovering the Anatomy of Periventricular Structures to Reveal the Lateral Ventricles of the Human Brain

Anatomy students are typically provided with two-dimensional (2D) sections and images when studying cerebral ventricular anatomy and students find this challenging. Because the ventricles are negative spaces located deep within the brain, the only way to understand their anatomy is by appreciating their boundaries formed by related structures. Looking at a 2D representation of these spaces, in any of the cardinal planes, will not enable visualisation of all of the structures that form the boundaries of the ventricles. Thus, using 2D sections alone requires students to compute their own mental image of the 3D ventricular spaces. The aim of this study was to develop a reproducible method for dissecting the human brain to create an educational resource to enhance student understanding of the intricate relationships between the ventricles and periventricular structures. To achieve this, we created a video resource that features a step-by-step guide using a fiber dissection method to reveal the lateral and third ventricles together with the closely related limbic system and basal ganglia structures. One of the advantages of this method is that it enables delineation of the white matter tracts that are difficult to distinguish using other dissection techniques. This video is accompanied by a written protocol that provides a systematic description of the process to aid in the reproduction of the brain dissection. This package offers a valuable anatomy teaching resource for educators and students alike. By following these instructions educators can create teaching resources and students can be guided to produce their own brain dissection as a hands-on practical activity. We recommend that this video guide be incorporated into neuroanatomy teaching to enhance student understanding of the morphology and clinical relevance of the ventricles.

This paper demonstrates the effective use of a fiber dissection method to reveal the superficial white matter tracts and periventricular structures of the human brain, in three-dimensional space, to aid student comprehension of ventricular morphology.

人間の脳の側脳室を明らかにする脳室周囲構造の解剖学を暴く - 深宇宙の探索

Anatomy students are typically provided with two-dimensional (2D) sections and images when studying cerebral ventricular anatomy and students find this ...

Combining Optogenetics with Artificial microRNAs to Characterize the Effects of Gene Knockdown on Presynaptic Function within Intact Neuronal Circuits

The purpose of this protocol is to characterize the effect of gene knockdown on presynaptic function within intact neuronal circuits. We describe a workflow on how to combine artificial microRNA (miR)-mediated RNA interference with optogenetics to achieve selective stimulation of manipulated presynaptic boutons in acute brain slices. The experimental approach involves the use of a single viral construct and a single neuron-specific promoter to drive the expression of both an optogenetic probe and artificial miR(s) against presynaptic gene(s). When stereotactically injected in the brain region of interest, the expressed construct makes it possible to stimulate with light exclusively the neurons with reduced expression of the gene(s) under investigation. This strategy does not require the development and maintenance of genetically modified mouse lines and can in principle be applied to other organisms and to any neuronal gene of choice. We have recently applied it to investigate how the knockdown of alternative splice isoforms of presynaptic P/Q-type voltage-gated calcium channels (VGCCs) regulates short-term synaptic plasticity at CA3 to CA1 excitatory synapses in acute hippocampal slices. A similar approach could also be used to manipulate and probe the neuronal circuitry in vivo.

This protocol provides a workflow on how to combine artificial microRNA-mediated RNA interference with optogenetics to stimulate specifically presynaptic boutons with reduced expression of selective gene(s) within intact neuronal circuits.

オプトジェネティクスを組み合わせてそのまま神経回路内でのシナプス前機能に関する遺伝子ノックダウンの効果を特徴付ける人工マイクロ Rna

The purpose of this protocol is to characterize the effect of gene knockdown on presynaptic function within intact neuronal circuits. We describe a ...

Quantifying the Heterogeneous Distribution of a Synaptic Protein in the Mouse Brain Using Immunofluorescence

The presence, absence, or levels of specific synaptic proteins can severely influence synaptic transmission. In addition to elucidating the function of a protein, it is vital to also determine its distribution. Here, we describe a protocol employing immunofluorescence, confocal microscopy, and computer-based analysis to determine the distribution of the synaptic protein Mover (also called TPRGL or SVAP30). We compare the distribution of Mover to that of the synaptic vesicle protein synaptophysin, thereby determining the distribution of Mover in a quantitative manner relative to the abundance of synaptic vesicles. Notably, this method could potentially be implemented to allow for comparison of the distribution of proteins using different antibodies or microscopes or across different studies. Our method circumvents the inherent variability of immunofluorescent stainings by yielding a ratio rather than absolute fluorescence levels. Additionally, the method we describe enables the researcher to analyze the distribution of a protein on different levels: from whole brain slices to brain regions to different subregions in one brain area, such as the different layers of the hippocampus or sensory cortices. Mover is a vertebrate-specific protein that is associated with synaptic vesicles. With this method, we show that Mover is heterogeneously distributed across brain areas, with high levels in the ventral pallidum, the septal nuclei, and the amygdala, and also within single brain areas, such as the different layers of the hippocampus.

Here, we describe a quantitative approach to determining the distribution of a synaptic protein relative to a marker protein using immunofluorescence staining, confocal microscopy, and computer-based analysis.

蛍光抗体法を用いたマウス脳内シナプス蛋白質の不均質分布の定量化

The presence, absence, or levels of specific synaptic proteins can severely influence synaptic transmission. In addition to elucidating the function of a ...

Non-Invasive Modulation and Robotic Mapping of Motor Cortex in the Developing Brain

Mapping the motor cortex with transcranial magnetic stimulation (TMS) has potential to interrogate motor cortex physiology and plasticity but carries unique challenges in children. Similarly, transcranial direct current stimulation (tDCS) can improve motor learning in adults but has only recently been applied to children. The use of tDCS and emerging techniques like high&#8211;definition tDCS (HD-tDCS) require special methodological considerations in the developing brain. Robotic TMS motor mapping may confer unique advantages for mapping, particularly in the developing brain. Here, we aim to provide a practical, standardized approach for two integrated methods capable of simultaneously exploring motor cortex modulation and motor maps in children. First, we describe a protocol for robotic TMS motor mapping. Individualized, MRI-navigated 12x12 grids centered on the motor cortex guide a robot to administer single-pulse TMS. Mean motor evoked potential (MEP) amplitudes per grid point are used to generate 3D motor maps of individual hand muscles with outcomes including map area, volume, and center of gravity. Tools to measure safety and tolerability of both methods are also included. Second, we describe the application of both tDCS and HD-tDCS to modulate the motor cortex and motor learning. An experimental training paradigm and sample results are described. These methods will advance the application of non-invasive brain stimulation in children.

We demonstrate protocols for the modulation (tDCS, HD-tDCS) and mapping (robotic TMS) of the motor cortex in children.

発達中の脳における運動皮質の非侵襲的変調とロボットマッピング

Mapping the motor cortex with transcranial magnetic stimulation (TMS) has potential to interrogate motor cortex physiology and plasticity but carries ...