Name: subcellular fractionation for erk activation upon mitochondrial-derived peptide treatment
Uploaded: 2017-09-25T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 55 s
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この作品は、SJK、高齢化研究プログラムでエリソン/遠く員によって支えられた、グレン財団賞と NIH の PC への許可 (1P01AG034906、1R01GM 1R01ES 090311 020812)。映画の中にすべての著者が表示されます。

1 セルにペプチド治療 <ol><li>プレート 200 万 SH SY5Y または HEK293 細胞 (2 x 10 6) 10 cm に皿、2 日間のそれらを育てる</li> <li>(省略可能) 次の日、無血清ダルベッコとセルを洗浄して &#39; s 更新。イーグル培地 (DMEM) メディアの一度と無料 DMEM 治療血清無料メディアで実行する必要がある場合は一晩血清 incubate</li>。
	<li>3 日目、0.2 μ m フィルター、蒸留水、1 mM 原液としてそれらを再構成 S14G humanin ペプチドを溶解します 。
	注: ペプチドは、ペプチド (例えば、全体の電荷) のシーケンスの特性によって決定されることができます、場合は市販されているペプチドに製造元が提供可能性があります適切な溶媒で溶解する必要があります。たとえば、S14G humanin、SHLP2、および SHLP6、および MOTS c は水に溶かします。因数の凍結を避けるために、解凍サイクル適切なボリューム (例えば、50 μ L) 中のペプチド。解凍後、それらを使用しないでもう一度</li>。
	<li>に予め温めておいた血清含有の約数または血清の自由な媒体 50 mL コニカル管、室温 1 mM 原液使用濃度 (例えば、1 μ M、10 μ M) に参加することを追加します</li>。
	<li>1.4 のステップから 6 mL ペプチド ソリューションとメディアを交換しますセル間インキュベート時間の適切な量と。 。
	注: ERK をアクティブにあなたの条件に応じてインキュベーション時間を選択します</li>。
</ol> 2。細胞質と核の細胞レベル下の分別 <ol><li>10 mL の氷冷 PBS で 2 回細胞を洗浄、5 ml の氷冷 PBS のプレートから細胞をこすり、細胞懸濁液を 15 mL の円錐管に転送します</li>。
	<li>4時 5 分 500 x g で細胞を遠心分離機 ° C</li>
	<li>PBS を吸引し、氷、分別バッファーの 200 μ L でペレットを再停止 (10 mM HEPES pH 7.6, 3 mM MgCl 2、10 mM KCl, 5% (v/v) グリセロール 1% 非イオン性界面活性剤 (C 13 H 22 O (C 2 H 4 O) =n) プロテアーゼ/ホスファターゼの抑制剤). 
	注: のリン酸化状態で蛋白質を維持するには、ホスファターゼ阻害剤同様のプロテアーゼ阻害剤をたてに追加するか、サンプルがまったくの氷で保たれるべきである回します。凍結と融解を繰り返しサンプルのサイクルは避けるべきであります。-80 でそれらを固定する前に少量 (例えば 50 μ g) に割り切れるサンプル ° C</li>
	<li>15 分間氷の上再懸濁のペレットをインキュベートし、4時 5 分 250 × g で遠心分離 ° C</li>
	<li>細胞質画分として清を収集し、核分画用ペレット</li>。
	<li>は、細胞残渣および 4 ° C で 10 分間、18,000 × g で他の汚染物質を削除し、新しい微量遠心チューブに上清を転送上清を遠心分離機します。これは細胞質分画.</li>
	<li>200 μ L 冷たい洗浄バッファーでペレットを再懸濁します (10 mM HEPES pH = 7.6, 1.5 mM MgCl 2, 420 mM の NaCl、25% (v/v) グリセロール、0.2 ミリメートルの EDTA、プロテアーゼ/ホスファターゼの抑制剤) と 250 x g で 4 ° C で 5 分間遠心</li>
	<li>上澄みを除去し、100 μ L 冷たい、核抽出バッファーでペレットを再懸濁します (20 mM HEPES pH = 7.6, 1.5 mM MgCl 2, 420 mM の NaCl、25% (v/v) グリセロール、0.2 ミリメートルの EDTA、プロテアーゼ/ホスファターゼの抑制剤) と超音波照射 10 回 (5 s、10 sオフ、30% アンプです。)氷の</li>
	<li>4 ° C で 10 分間 18,000 × g で遠心します。</li>
	<li>は、新しい微量遠心チューブに上清を転送します。これは核分画.</li>
	<li>BCA アッセイを用いたタンパク質の量を定量化するため</li></ol>
 3. 粗ミトコンドリア分画 <ol><li>各 10 cm 皿 10 mL の氷冷 PBS のセルを洗浄、5 mL の氷冷 PBS を追加および細胞スクレーパーを使用してセルをデタッチします 。
	メモ: 西部のしみが付くことのミトコンドリアの良好な収率を取得するセルの 3 つの 10 cm 皿を使用しています</li>。
	<li>細胞懸濁液を 15 mL の円錐管に転送し、1 つ 15 ml の円錐管に 3品 10 cm からすべて結合します</li>。
	<li>4時 10 分 600 x g で細胞を遠心分離機 ° C</li>
	<li>、PBS を吸引し、冷たいミトコンドリア分離バッファーの 1 mL にペレットを再中断 (10 mM トリス-モップ 1 mM グリコールエーテルジアミン四酢酸/トリス、200 mM ショ糖、ph 調整 = 7.4).</li>
	<li>氷の四フッ化エチレン樹脂コーティング杵と 2 mL ホモジナイザーの 25 のストロークを持つ細胞をホモジナイズしてください 
	注: この手順は、ミトコンドリアの整合性を維持し、ミトコンドリア画分の収量を最大化するために重要です。セル タイプごとにストローク数を最適化する必要があります。手順を開始する前に、ホモジナイザーを precool.</li>
	<li>微量遠心チューブにホモジュネートを転送し、核と切れ目のない細胞を削除する 4 ° C で 10 分間 600 × g で遠心分離機します</li>。
	<li>、上澄みを集め、新しい遠心管にそれを転送、4時 10 分 7,000 x g で遠心分離機のそれ ° C 
	注: ペレットが緩んで、注意して上澄みを集め、ペレットを邪魔しないようにします</li>。
	<li>は、上澄みを除去、再ペレットを冷たいミトコンドリア分離バッファー 200 μ l を中断し、ソリューションを新しい微量遠心チューブに転送します。4時 10 分 7,000 x g でチューブを遠心分離機 ° C</li>
	<li>ペレットを洗浄する 3.8 手順を繰り返します。この手順では、新しい微量遠心チューブに上清を転送する必要はありません</li>。
	<li>洗浄のペレットから上澄みを除去し、50 μ L RIPA バッファーのミトコンドリアを含む餌を再停止します</li>。
	<li>加温 10 分間氷の上の懸濁液</li>
	<li>4時 15 分 16,000 x グラムの懸濁液を遠心分離機 ° C</li>
	<li>は、新しい微量遠心チューブに上清を転送します。これはミトコンドリアの一部です</li>。
	<li>BCA アッセイを用いた蛋白質量を定量化します</li>。
</ol> 4。リン酸化型特異タンパク質ウエスタンブロット <ol><li>SDS ポリアクリルアミド ゲル電気泳動 (あらかじめ作られた 8-16% ゲル) を行い、PVDF 膜 4 に蛋白質を転送します</li>。
	<li>インキュベート TBST で 5 %bsa を用いた膜 (0.1% ポリソルベート 20) 背景非特異的結合部位をブロックする室温で 30 分間 。
	注: リン酸化タンパク質検出用 BSA ないミルクの膜をブロックします。ミルクにはカゼイン、豊富なリン蛋白質、高い非特異的シグナルの結果が含まれています</li>。
	<li>4 ° C で一次抗体 (抗-リン-ERK1/2) と膜を一晩インキュベートします</li>。
	<li>次の日洗って tbst 膜 (0.1% ポリソルベート 20) 室温で 5 分間を 3 回します</li>。
	<li>膜二次抗体 (抗家兎 HRP) 室温で 1 時間インキュベートします</li>。
	<li>Tbst 膜を洗って部屋の温度で 5 分間を 3 回 (0.1% ポリソルベート 20).</li>
	<li>ECL ソリューションと膜をインキュベートし、画像解析装置の膜をイメージします</li>。
	<li>室温で 5 分間 3 回 tbst 膜の洗浄 15 分の除去バッファーと膜のストリップ</li>
	<li>4.7 4.2 反合計 ERK1/2 抗体を使用して手順を繰り返します</li>。
	<li>、各分画の純度を確認する SDS ページを実行し、各コンパートメントを (例えば、核、細胞質の GAPDH とミトコンドリアの TOM20 ラミン B1) のマーカーを認識する抗体を用いた immunoblots を実行します</li>。
</ol>

<ol>
	<li>Yen, K., Lee, C., Mehta, H., Cohen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+emerging+role+of+the+mitochondrial-derived+peptide+humanin+in+stress+resistance.">The emerging role of the mitochondrial-derived peptide humanin in stress resistance.</a> J. Mol. Endocrinol. 50 (1), 11-19 (2013).</li><li>Muzumdar, R. H., Huffman, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Humanin:+a+novel+central+regulator+of+peripheral+insulin+action.">Humanin: a novel central regulator of peripheral insulin action.</a> PloS one. 4 (7), 6334 (2009).</li><li>Lee, C., Yen, K., Cohen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Humanin:+a+harbinger+of+mitochondrial-derived+peptides.">Humanin: a harbinger of mitochondrial-derived peptides.</a> Trends Endocrinol. Metab. 24 (5), 222-228 (2013).</li><li>Kim, S. J., Guerrero, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mitochondrial-derived+peptide+humanin+activates+the+ERK1/2,+AKT,+and+STAT3+signaling+pathways+and+has+age-dependent+signaling+differences+in+the+hippocampus.">The mitochondrial-derived peptide humanin activates the ERK1/2, AKT, and STAT3 signaling pathways and has age-dependent signaling differences in the hippocampus.</a> Oncotarget. 7 (30), 46899-46912 (2016).</li><li>Ying, G., Iribarren, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Humanin,+a+newly+identified+neuroprotective+factor,+uses+the+G+protein-coupled+formylpeptide+receptor-like-1+as+a+functional+receptor.">Humanin, a newly identified neuroprotective factor, uses the G protein-coupled formylpeptide receptor-like-1 as a functional receptor.</a> J. Immunol. 172 (11), 7078-7085 (2004).</li><li>Zhang, W., Liu, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MAPK+signal+pathways+in+the+regulation+of+cell+proliferation+in+mammalian+cells.">MAPK signal pathways in the regulation of cell proliferation in mammalian cells.</a> Cell Res. 12 (1), 9-18 (2002).</li><li>Huang, C., Jacobson, K., Schaller, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MAP+kinases+and+cell+migration.">MAP kinases and cell migration.</a> J. Cell Sci. 117, 4619-4628 (2004).</li><li>Cagnol, S., Chambard, J. -. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ERK+and+cell+death:+mechanisms+of+ERK-induced+cell+death--apoptosis,+autophagy+and+senescence.">ERK and cell death: mechanisms of ERK-induced cell death--apoptosis, autophagy and senescence.</a> FEBS J. 277 (1), 2-21 (2010).</li><li>Raman, M., Chen, W., Cobb, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+regulation+and+properties+of+MAPKs.">Differential regulation and properties of MAPKs.</a> Oncogene. 26 (22), 3100-3112 (2007).</li><li>Morrison, D. K., Davis, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+MAP+kinase+signaling+modules+by+scaffold+proteins+in+mammals.">Regulation of MAP kinase signaling modules by scaffold proteins in mammals.</a> Annu. Rev. Cell Dev. 19 (1), 91-118 (2003).</li><li>Wainstein, E., Seger, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dynamic+subcellular+localization+of+ERK:+mechanisms+of+translocation+and+role+in+various+organelles.">The dynamic subcellular localization of ERK: mechanisms of translocation and role in various organelles.</a> Curr. Opin. Cell Biol. 39, 15-20 (2016).</li><li>Zehorai, E., Yao, Z., Plotnikov, A., Seger, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+subcellular+localization+of+MEK+and+ERK--a+novel+nuclear+translocation+signal+(NTS)+paves+a+way+to+the+nucleus.">The subcellular localization of MEK and ERK--a novel nuclear translocation signal (NTS) paves a way to the nucleus.</a> Mol. Cell. Endocrinol. 314 (2), 213-220 (2010).</li><li>Kolch, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordinating+ERK/MAPK+signalling+through+scaffolds+and+inhibitors.">Coordinating ERK/MAPK signalling through scaffolds and inhibitors.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 6 (11), 827-837 (2005).</li><li>Horbinski, C., Chu, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinase+signaling+cascades+in+the+mitochondrion:+a+matter+of+life+or+death.">Kinase signaling cascades in the mitochondrion: a matter of life or death.</a> Free Radic. Biol. Med. 38 (1), 2-11 (2005).</li><li>Aebersold, D. M., Shaul, Y. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+signal-regulated+kinase+1c+(ERK1c),+a+novel+42-kilodalton+ERK,+demonstrates+unique+modes+of+regulation,+localization.">Extracellular signal-regulated kinase 1c (ERK1c), a novel 42-kilodalton ERK, demonstrates unique modes of regulation, localization.</a> Mol Cell Biol. 24 (22), 10000-10015 (2004).</li><li>Zhu, J. -. H., Guo, F., Shelburne, J., Watkins, S., Chu, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+phosphorylated+ERK/MAP+kinases+to+mitochondria+and+autophagosomes+in+Lewy+body+diseases.">Localization of phosphorylated ERK/MAP kinases to mitochondria and autophagosomes in Lewy body diseases.</a> Brain Pathol. 13 (4), 473-481 (2003).</li><li>Cobb, L. J., Lee, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Naturally+occurring+mitochondrial-derived+peptides+are+age-dependent+regulators+of+apoptosis,+insulin+sensitivity,+and+inflammatory+markers.">Naturally occurring mitochondrial-derived peptides are age-dependent regulators of apoptosis, insulin sensitivity, and inflammatory markers.</a> Aging. 8 (4), 796-809 (2016).</li><li>Ihle, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Stat+family+in+cytokine+signaling.">The Stat family in cytokine signaling.</a> Curr. Opin. Cell Biol. 13 (2), 211-217 (2001).</li><li>Xu, Y. S., Liang, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=STAT3+Undergoes+Acetylation-dependent+Mitochondrial+Translocation+to+Regulate+Pyruvate+Metabolism.">STAT3 Undergoes Acetylation-dependent Mitochondrial Translocation to Regulate Pyruvate Metabolism.</a> Sci. Rep. 6 (1), 39517 (2016).</li><li>You, L., Wang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+STAT3+in+autophagy.">The role of STAT3 in autophagy.</a> Autophagy. 11 (5), 729-739 (2015).</li><li>Hashimoto, Y., Niikura, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detailed+characterization+of+neuroprotection+by+a+rescue+factor+humanin+against+various+Alzheimer's+disease-relevant+insults.">Detailed characterization of neuroprotection by a rescue factor humanin against various Alzheimer's disease-relevant insults.</a> The J Neurosci. 21 (23), 9235-9245 (2001).</li><li>Ying, G., Iribarren, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Humanin,+a+newly+identified+neuroprotective+factor,+uses+the+G+protein-coupled+formylpeptide+receptor-like-1+as+a+functional+receptor.">Humanin, a newly identified neuroprotective factor, uses the G protein-coupled formylpeptide receptor-like-1 as a functional receptor.</a> J. Immunol. 172 (11), 7078-7085 (2004).</li><li>Hashimoto, Y., Kurita, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Humanin+inhibits+apoptosis+in+pituitary+tumor+cells+through+several+signaling+pathways+including+NF-&#954;B+activation.">Humanin inhibits apoptosis in pituitary tumor cells through several signaling pathways including NF-&#954;B activation.</a> Mol. Biol. Cell. 20 (12), 2864-2873 (2009).</li></ol>

ピンカス ・ コーエンは株主とコンサルタント、円は CohBar 株式会社のコンサルタントとして役立った CohBar、株式会社ケルビン

ここでは、我々 は実証 humanin ペプチドを介した ERK1/2 活性化は、2 つの異なる細胞型と活性 ERK1/2 の細胞内局は条件 (例えばペプチド、時点、およびセルの線量によって異なることがあります。型)。それはその humanin を示されている 2 つの異なる受容器22,23, humanin の異なる用量の要件と同様に、2 つの細胞間シグナル伝達に違いを説明するかもしれない信号。これの生理学的意味が完全に研究されていないが、それは HN に依存して応答する組織の 1 つの可能なメカニズムを示唆している可能性があります。
ERK1/2 のリン酸化は、ERK1/2 のシグナル伝達に重要な役割を果たしている、ERK1/2 のリン酸化状態はダイナミックな変化を示しています。ERK1/2 で特定の条件/刺激下でリン酸化されるときを検索する条件を最適化することが重要です。このため、異なる刺激条件 (例えば、線量および媒体) をみてリン酸化の最高レベルを達成したときに見つけることの時間コースを実施します。研究の大多数の合計セル lysates の ERK1/2 リン酸化のみを対象します。ただし、ERK1/2 と異なるターゲットと対話したり、特定の細胞内コンパートメントに異なるダウン ストリーム カスケードを調節すると、結果は限られた機能の情報を得られます。したがって、ERK1/2 活性化の役割の理解を与えるリン酸 ERK1/2 の細胞内分布を調べるします。
ERK1/2 活性化後の細胞レベル下の分別は、ERK1/2 の下流標的の細胞レベル下の分別豊かにできるので新たな下流標的を識別するためにさらなる研究 (例えば、co 免疫沈降) のソースとして使用できます。このメソッドは、条件の最適化後刺激時に別の細胞内コンパートメントに転流されて他のシグナリング分子に適用できます。
過去数十年でミトコンドリアを分離するさまざまな方法が提案されている他の細胞内コンパートメントから部分的な汚染があります。粗ミトコンドリア分離手法をここで提案には、限られた細胞質の汚染物質も含まれています。汚染の量が小さく、活性化時にミトコンドリアに ERK1/2 の局在を検出するための有効な方法だと考えています。ペプチドはソリューションでは必ずしも安定ではないと時々 実験間の一貫性を維持することは困難です。必ずペプチド液凍結融解の影響を避けるために、ペプチドの活性の一貫性を保つための小さい因数。

新興の研究は、ミトコンドリア由来ペプチド (MDPs) がより, および代謝の1,2,3で重要な役割を果たすことを示しています。MDPs の存在下での信号伝達経路を理解する MDPs は様々 な機能を調節するメカニズムへの洞察力をくれます。最初の識別された民主党、humanin、細胞外シグナル調節キナーゼ 1/2 (ERK1/2) を増加する示されているバインド4,5その受容体をリン酸化します。しかし、ERK1/2 活性化の下流の効果はまだエコイノベーションです。
ERK1/2 カスケードは、さまざまな増殖、細胞遊走、細胞代謝、生存、およびアポトーシス6,7,8を含む細胞プロセスで重要な仲介者として機能します。すべてを調整するには、これらの明瞭な細胞プロセス、アクティビティ、ERK1/2 の細胞内局しっかりとホスファターゼと足場蛋白質9,10によって規制されました。翻訳後修飾に加えて ERK1/2 の動的往復もそのシグナル伝達関数、アクティビティ、および特異性11,12を調節します。ERK1/2 は主に細胞質13でローカライズされます。一連のアンカーと足場蛋白質の細胞小器官の表面や細胞質13で拡散の骨格要素の ERK1/2 を維持するため。刺激、ERK1/2 リン酸化、ERK1/2 核、ミトコンドリア、ゴルジ体、リソソーム14,を含む他の細胞内コンパートメントへの転流をできるようにそのアンカリングのタンパク質から解離になります。15,16。
Humanin ERK1/2 シグナル伝達経路をアクティブに知られているが、合計のセル lysates においてのみ ERK1/2 の活性化です。リン酸化 ERK1/2 は包括的な理解を提供するために必要な ERK1/2 内局その波及効果, 両方の細胞内局在の解析とのレベルの合計の重大な役割を果たしているので前述のようhumanin ERK1/2 活性化の下流ターゲットのアクティブ化。
アクティブ ERK1/2 ターゲット細胞内小器官を理解するには、リン酸化 ERK1/2 ウェスタンブロッティング続いて細胞レベル下の分別を行った。このメソッドは、これは標準的な実験装置および試薬を活用して簡単に実装することができます。孤立した細胞内コンパートメントは、高純度、結果を素直に解釈することができます。ERK1 染色/2 似たような結果が生じる。ただし、特定の細胞内コンパートメントは視覚化する、特別な固定・透過方法を必要とする比較的難しいです。ERK1/2 レベル細胞レベル下コンパートメントによって異なり、全体のセル lysates を見ている時、この変化が原因で、偽陽性と偽否定的な信号。したがって、ERK1/2 ローカリゼーションの理解も、イムノブロット分離細胞レベル下コンパートメントを使用してくれます。
メソッドの汎用性により、他 MDPs STAT3 など他のシグナリング分子の転流を含む他の興奮剤の効果を調査するためのプロトコルの変更です。最近発見された小さな humanin のようなペプチド (SHLPs) は 16S rRNA 地域どこ humanin がエンコードされていると HN17と比較して似ていますが、異なるプロパティがあるからエンコードされます。たとえば、SHLP2 と SHLP3 は 8 h humanin 内局在 ERK1/2 の異なるペプチドへの応答で審査 5 分以内 ERK1/2 がアクティブになりますを与える私たちこれらのペプチドの生物学のよりよい理解後、ERK1/2 をアクティブにします。出現の証拠は、シグナル分子の細胞内の局在が彼らの下流の効果の重要な役割を果たしていることを示した。例えば、STAT3 が伝統的静止期細胞の細胞質でローカライズされる主に知られているが、それがサイトカイン18への応答における遺伝子発現をアクティブにする核に移行します。STAT3 はまたミトコンドリアに移行し、TCA サイクル、ATP 生産19を調節します。オートファジー規制に関する STAT3 の異なる細胞内局は、さまざまな方法20でオートファジーを変調します。たとえば、核 STAT3 は転写オートファジー関連遺伝子の発現制御し、オートファジーの変調器として機能します。細胞質の STAT3 恒常オートファジー シグナル分子との相互作用によってオートファジーを抑制します。ミトコンドリア STAT3 阻害し、酸化ストレス誘導されるオートファジーを抑制することによって mitophagy を防ぐことができます。したがって、この細胞レベル下コンパートメントの分離方法は他シグナリング分子、ERK1/2 の役割を理解するために重要です。

<table><tbody><tr><td>p44/42 MAPK (ERK1/2)</td><td>Cell signaling</td><td>9102</td><td>Dilution 1:1,000</td></tr><tr><td>phospho-p44/42 MAPK (ERK1/2)(Thr202/Tyr204)</td><td>Cell signaling</td><td>4370</td><td>Dilution 1:1,000</td></tr><tr><td>Lamin B1</td><td>Cell signaling</td><td>12586</td><td>Nuclear Marker, Dilution 1:1,000</td></tr><tr><td>GAPDH</td><td>Cell signaling</td><td>5174</td><td>Cytoplasmic marker, Dilution 1:2,000</td></tr><tr><td>Tom20</td><td>Santa cruz</td><td>SC-17764</td><td>Mitochondria marker, Dilution 1:2,000</td></tr><tr><td>anti-Rabbit-HRP conjugated</td><td>Cell signaling</td><td>7074</td><td>Dilution 1:30,000</td></tr><tr><td>RIPA Lysis and Extraction Buffer</td><td>ThermoFisher SCIENTIFIC</td><td>89900</td><td></td></tr><tr><td>100 mm Culture Dish</td><td>ThermoFisher SCIENTIFIC</td><td>12556002</td><td></td></tr><tr><td>HNG peptide</td><td>Genescript</td><td></td><td></td></tr><tr><td>25mm sylinge filter</td><td>ThermoFisher SCIENTIFIC</td><td>09-719A</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P9333</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sigma</td><td>G9012</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>ThermoFisher SCIENTIFIC</td><td>BP151-100</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>3609</td><td></td></tr><tr><td>MOPS</td><td>Sigma</td><td>M1254</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma</td><td>E3889</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma</td><td>S7903</td><td></td></tr><tr><td>Tris-base</td><td>ThermoFisher SCIENTIFIC</td><td>BP152-1</td><td></td></tr><tr><td>HCL</td><td>Sigma</td><td>H1758</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Lonza</td><td>17-512F</td><td></td></tr><tr><td>Cell Scraper</td><td>FALCON</td><td>353085</td><td></td></tr><tr><td>Halt&amp;trade; Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail (100X)</td><td>ThermoFisher SCIENTIFIC</td><td>78440</td><td></td></tr><tr><td>Thomas Pestle Tissue Grinder Assemblies with Smooth Pestles</td><td>Thomas Scientific</td><td>3432S90</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>ThermoFisher SCIENTIFIC</td><td>BP337-500</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>ThermoFisher SCIENTIFIC</td><td>BP1600-100</td><td></td></tr><tr><td>8-16% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels</td><td>BIO RAD</td><td>4561104</td><td></td></tr><tr><td>Mini Trans-Blot Module</td><td>BIO RAD</td><td>1658030</td><td></td></tr><tr><td>Trans-Blot Turbo Transfer System</td><td>BIO RAD</td><td>1704150</td><td></td></tr><tr><td>Trans-Blot Turbo RTA Mini PVDF Transfer Kit</td><td>BIO RAD</td><td>1704272</td><td></td></tr><tr><td>Clarity Western ECL Blotting Substrates</td><td>BIO RAD</td><td>1705060</td><td></td></tr><tr><td>Restore Western blot stripping buffer</td><td>ThermoFisher SCIENTIFIC</td><td>21059</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&#039;s Modified Eagle Medium</td><td>ThermoFisher SCIENTIFIC</td><td>11965-092</td><td></td></tr><tr><td>Sonicator, Medel: FB120</td><td>ThermoFisher SCIENTIFIC</td><td>695320-07-12</td><td></td></tr></tbody></table>

subcellular fractionation for erk activation upon mitochondrial-derived peptide treatment

ミトコンドリア由来ペプチド (MDPs) は、ミトコンドリアのゲノムの他の知られている遺伝子の中で小型の開いたリーディング ・ フレームによってエンコードされているペプチドの新しいクラスです。MDPs は、アポトーシスからニューロンを保護する、代謝マーカーの改善、化学療法から細胞を保護するなどの生物学的効果のさまざまながあります。Humanin 発見される最初の民主党、民主党の家族の間で最も研究のペプチド。膜受容体と humanin の下流のシグナル伝達経路を慎重に特徴づけられています。MOTS c など SHLP1 6 追加 MDPs を最近発見されているし、シグナリング メカニズムは解明することいません。ここでこれらのペプチドの機能を決定する細胞文化ベース手法について述べる。特に、西部のしみとの組み合わせでのセル分別の技術の活性化の定量及び重要なシグナル伝達分子の転流を可能にします。セル分別の他の方法がありますが、ここで説明は簡単でわかりやすい方法です。さらにこれらのペプチドとその他の治療薬の作用メカニズムを解明するため、これらのメソッドを使用できます。

ここに示す手順を使用して、我々 は 1 μ M、100 μ M と SH SY5Y HEK293 細胞を扱わ S14G humanin、強力な humanin のアナログ21、それぞれに完成でメディア (図 1A 図 1 の指定された期間B). 木202/Tyr204総蛋白抽出物から、ERK1/2 の全体とリン酸形を検討します。S14G humanin の治療は、その規制木202/Tyr204サイトで ERK1/2 のリン酸化の増加を示した。ERK1/2 の細胞レベル下のローカリゼーションは、その特異性を得ることに特にそのシグナル伝達関数で重要な役割を果たしています。S14G humanin 媒介 ERK1/2 活性化の対象を理解するには、合計の細胞内分布を分析し、, ERK1/2 S14G humanin 治療をリン酸化.HEK293 細胞におけるリン酸化 ERK の両方増加細胞質と核、ミトコンドリア (図 2A) ではないです。興味深いことに、ERK のリン酸化は細胞質、核、および SH SY5Y (図 2B) 細胞内のミトコンドリアで減少しました。その S14G humanin 媒介 ERK のリン酸化は、異なる種類の細胞と異なる条件で異なる役割を果たすことが示唆されました。したがって、それ以上の調査がリン酸化 ERK1/2 核、ミトコンドリア、エンドソーム/リソソームに移行 ERK1/2 他の細胞内コンパートメント S14G humanin 介したリン酸化の局在を解析する必要と各種膜。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56496/56496fig1.jpg"> 
図 1:S14G humanin 増加 ERK1/2 HEK293 および SH SY5Y 細胞におけるリン酸化します。HEK293 (A) と (B) SH SY5Y 細胞における ERK の活性化の定量化と代表の西部のしみ。セル lysates の合計以下の (A) 1 μ M または (B) 100 μ M S14G humanin 治療 10 %dmem で示されたため FBS 期間られた抗リン-、合計 ERK 1/2 (Thr202/Tyr204) を使用しています。この図は、キムらから変更されています。4 <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56496/56496fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56496/56496fig2.jpg"> 
図 2:ERK1/2 のリン酸化は細胞質、核、および SH SY5Y と HEK293 細胞に S14G humanin 治療時に他の細胞内コンパートメントにローカライズされています。ERK1/2 細胞内局在を示す代表的な西部のしみ (n = 3)。(A) HEK293 細胞は 1 μ M を施した S14G humanin。ゾル性細胞質 (15 μ g)、原子力 (15 μ g ・ 50 μ g)、リンと合計 ERK 抗体を用いたミトコンドリア (15 μ g) lysates られたと。(B) SH-SY5Y 100 μ M で細胞が治療された S14G humanin。ミトコンドリア画分 S14G humanin 治療後 30 分が得られました。ゾル性細胞質、核、ミトコンドリア (15 μ g) lysates られたリンと合計 ERK 抗体を用いたします。アンチ GAPDH、アンチ ラミン B 反 Tom20 抗体はそれぞれ細胞質、核、ミトコンドリア分画マーカーとして使用されました。この図は、キムらから変更されています。4.<a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56496/56496fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Table 1" src="/files/ftp_upload/56496/56496table1v2.jpg"> 
表 1:細胞質、核、バッファーとミトコンドリア分画.

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Subcellular Fractionation for ERK Activation Upon Mitochondrial-derived Peptide Treatment

このプロトコルでは、ミトコンドリア由来ペプチドと細胞を刺激し、シグナル伝達カスケードとリン蛋白質の局在化を評価する方法について説明します。

ミトコンドリア由来ペプチド治療時に ERK の活性化のための細胞レベル下の分別

Mitochondrial-derived peptides (MDPs) are a new class of peptides that are encoded by small open reading frames within other known genes of the ...

subcellular-fractionation-for-erk-activation-upon-mitochondrial

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

7.8K ビュー.  University of Southern California. このプロトコルでは、ミトコンドリア由来ペプチドと細胞を刺激し、シグナル伝達カスケードとリン蛋白質の局在化を評価する方法について説明します。

ビデオ: Subcellular Fractionation for ERK Activation Upon Mitochondrial-derived Peptide Treatment

Assaying Protein Kinase Activity with Radiolabeled ATP

Protein kinases are able to govern large-scale cellular changes in response to complex arrays of stimuli, and much effort has been directed at uncovering allosteric details of their regulation. Kinases comprise signaling networks whose defects are often hallmarks of multiple forms of cancer and related diseases, making an assay platform amenable to manipulation of upstream regulatory factors and validation of reaction requirements critical in the search for improved therapeutics. Here, we describe a basic kinase assay that can be easily adapted to suit specific experimental questions including but not limited to testing the effects of biochemical and pharmacological agents, genetic manipulations such as mutation and deletion, as well as cell culture conditions and treatments to probe cell signaling mechanisms. This assay utilizes radiolabeled [&#947;-32P] ATP, which allows for quantitative comparisons and clear visualization of results, and can be modified for use with immunoprecipitated or recombinant kinase, specific or typified substrates, all over a wide range of reaction conditions.

Protein kinases are highly evolved signaling enzymes and scaffolds that are critical for inter- and intracellular signal transduction. We present a protocol for measuring kinase activity through the use of radiolabeled adenosine triphosphate ([&#947;-32P] ATP), a reliable method to aid in elucidation of cellular signaling regulation.

放射性標識ATPによるタンパク質キナーゼ活性のアッセイ

Protein kinases are able to govern large-scale cellular changes in response to complex arrays of stimuli, and much effort has been directed at uncovering ...

生化学

Probing for Mitochondrial Complex Activity in Human Embryonic Stem Cells

Mitochondria are cytoplasmic organelles that have a primary role in cellular metabolism and homeostasis, regulation of the cell signaling network, and programmed cell death. Mitochondria produce ATP, regulate the cytoplasmic redox state and Ca2+ balance, catabolize fatty acids, synthesize heme, nucleotides, steroid hormones, amino acids, and help assemble iron-sulfur clusters in proteins. Mitochondria also have an essential role in heat production. Mutations of the mitochondrial genome cause several types of human disorder. The accumulation of mtDNA mutations correlates with aging and is suspected to have an important role in the development of cancer. Due to their vitally important role in all cell types, the function of mitochondria must also be critical for stem cells. Key advances have been made in our understanding of stem cell viability, proliferation, and differentiation capacity. But the functional activity of stem cells, in particular their energy status, was not yet been studied in detail. Almost nothing is known about the mitochondrial properties of human embryonic stem cells (hESCs) and their differentiated precursor progeny. One way to understand and evaluate the role of mitochondria in hESC function and developmental potential is to directly measure the activity of mitochondrial respiratory complexes. Here, we describe high resolution clear native gel electrophoresis and subsequent in gel activity visualization as a method for analyzing the five respiratory chain complexes of hESCs.

In this video, we will show you how the mitochondrial respiratory chain complexes of human embryonic stem cells can be analyzed using in gel activity assays.

ヒト胚性幹細胞のミトコンドリア複合体活性の状態調査

Mitochondria are cytoplasmic organelles that have a primary role in cellular metabolism and homeostasis, regulation of the cell signaling network, and ...

生物学

Spatial and Temporal Analysis of Active ERK in the C. elegans Germline

The evolutionarily conserved&#160;extracellular signal transducing RTK-RAS-ERK pathway is an important kinase-signaling cascade that controls multiple cellular and developmental processes principally via activation of ERK, the terminal kinase of the pathway. Tight regulation of ERK activity is essential for normal development and homeostasis; overly active ERK results in excessive cellular proliferation, while underactive ERK causes cell death. C. elegans is a powerful model system that has helped characterize the function and regulation of RTK-RAS-ERK signaling pathway during development. In particular, the RTK-RAS-ERK pathway is essential for C. elegans germline development, which is the focus of this method. Using antibodies specific to the active, diphosphorylated form of ERK (dpERK), the stereotypical localization pattern can be visualized within the germline. Because this pattern is both spatially and temporally controlled, the ability to reproducibly assay dpERK is useful to identify regulators of the pathway that affect dpERK signal duration and amplitude and thus germline development. Here we demonstrate how to successfully dissect, stain, and image dpERK within the C. elegans gonad. This method can be adapted for spatial localization of any signaling or structural protein in the C. elegans gonad, provided an antibody compatible with immunofluorescence is available.

Spatial and Temporal Analysis of Active ERK in the C. elegans Germline

We present an immunofluorescence&#160;imaging-based method for spatial and temporal localization of active ERK in the dissected C. elegans gonad. The protocol described here can be adapted for visualization of any signaling or structural protein in the C. elegans gonad, provided a suitable antibody reagent is available.

で活躍ERKの時空間解析<em&gt; C。エレガンス</em&gt;生殖細胞系列

The evolutionarily conserved&#160;extracellular signal transducing RTK-RAS-ERK pathway is an important kinase-signaling cascade that controls multiple ...

発生生物学

Cell Fractionation of U937 Cells in the Absence of High-speed Centrifugation

In this protocol we detail a method to obtain subcellular fractions of U937 cells without the use of ultracentrifugation or indiscriminate detergents. This method utilizes hypotonic buffers, digitonin, mechanical lysis and differential centrifugation to isolate the cytoplasm, mitochondria and plasma membrane. The process can be scaled to accommodate the needs of researchers, is inexpensive and straightforward. This method will allow researchers to determine protein localization in cells without specialized centrifuges and without the use of commercial kits, both of which can be prohibitively expensive. We have successfully used this method to separate cytosolic, plasma membrane and mitochondrial proteins in the human monocyte cell line U937.

Here, we present a protocol to isolate the plasma membrane, cytoplasm and mitochondria of U937 cells without the use of high-speed centrifugation. This technique can be used to purify subcellular fractions for subsequent examination of protein localization via immunoblotting.

高速遠心分離のない状態で U937 細胞のセル分別

In this protocol we detail a method to obtain subcellular fractions of U937 cells without the use of ultracentrifugation or indiscriminate detergents. ...

Assessment of Submitochondrial Protein Localization in Budding Yeast Saccharomyces cerevisiae

Despite recent advances in the characterization of yeast mitochondrial proteome, the submitochondrial localization of a significant number of proteins remains elusive. Here, we describe a robust and effective method for determining the suborganellar localization of yeast mitochondrial proteins, which is considered a fundamental step during mitochondrial protein function elucidation. This method involves an initial step that consists of obtaining highly pure intact mitochondria. These mitochondrial preparations are then subjected to a subfractionation protocol consisting of hypotonic shock (swelling) and incubation with proteinase K (protease). During swelling, the outer mitochondrial membrane is selectively disrupted, allowing the proteinase K to digest proteins of the intermembrane space compartment. In parallel, to obtain information about the topology of membrane proteins, the mitochondrial preparations are initially sonicated, and then subjected to alkaline extraction with sodium carbonate. Finally, after centrifugation, the pellet and supernatant fractions from these different treatments are analyzed by SDS-PAGE and western blot. The submitochondrial localization as well as the membrane topology of the protein of interest is obtained by comparing its western blot profile with known standards.

Assessment of Submitochondrial Protein Localization in Budding Yeast Saccharomyces cerevisiae

Despite recent advances, many yeast mitochondrial proteins still remain with their functions completely unknown. This protocol provides a simple and reliable method to determine the submitochondrial localization of proteins, which has been fundamental for the elucidation of their molecular functions.

出芽酵母サッカロミセスセレビシエにおけるサブソキアドタンパク質の局在化の評価

Despite recent advances in the characterization of yeast mitochondrial proteome, the submitochondrial localization of a significant number of proteins ...

An Efficient Protocol to Assess ERK Activity Modulation in Early Zebrafish Noonan Syndrome Models via Live FRET Microscopy and Immunofluorescence

RASopathies are genetic syndromes caused by ERK hyperactivation and resulting in multisystemic diseases that can also lead to cancer predisposition. Despite a broad genetic heterogeneity, germline gain-of-function mutations in key regulators of the RAS-MAPK pathway underlie the majority of the cases, and, thanks to advanced sequencing techniques, potentially pathogenic variants affecting the RAS-MAPK pathway continue to be identified. Functional validation of the pathogenicity of these variants, essential for accurate diagnosis, requires fast and reliable protocols, preferably in vivo. Given the scarcity of effective treatments in early childhood, such protocols, especially if scalable in cost-effective animal models, can be instrumental in offering a preclinical ground for drug repositioning/repurposing. 
Here we describe step-by-step the protocol for rapid generation of transient RASopathy models in zebrafish embryos and direct inspection of live disease-associated ERK activity changes occurring already during gastrulation through real-time multispectral F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) imaging. The protocol uses a transgenic ERK reporter recently established and integrated with the hardware of commercial microscopes. We provide an example application for Noonan syndrome (NS) zebrafish models obtained by expression of the Shp2D61G. We describe a straightforward method that enables registration of ERK signal change in the NS fish model before and after pharmacological signal modulation by available low-dose MEK inhibitors. We detail how to generate, retrieve, and assess ratiometric FRET signals from multispectral acquisitions before and after treatment and how to cross-validate the results via classical immunofluorescence on whole embryos at early stages. We then describe how, via examining standard morphometric parameters, to query late changes in embryo shape, indicative of a resulting impairment of gastrulation, in the same embryos whose ERK activity is assessed by live FRET at 6 h post fertilization.

RASopathies are multisystem genetic syndromes caused by RAS-MAPK pathway hyperactivation. Potentially pathogenic variants awaiting validation emerge continuously while poor preclinical evidence limits therapy. Here, we describe our in vivo protocol to test and cross-validate RASopathy-associated ERK activation levels and its pharmacological modulation during embryogenesis by live FRET imaging in Teen-reporter zebrafish.

RASopathies are genetic syndromes caused by ERK hyperactivation and resulting in multisystemic diseases that can also lead to cancer predisposition. ...

Assessment of Mitochondrial Functions and Cell Viability in Renal Cells Overexpressing Protein Kinase C Isozymes

The protein kinase C (PKC) family of isozymes is involved in numerous physiological and pathological processes. Our recent data demonstrate that PKC regulates mitochondrial function and cellular energy status. Numerous reports demonstrated that the activation of PKC-a and PKC-&epsilon; improves mitochondrial function in the ischemic heart and mediates cardioprotection. In contrast, we have demonstrated that PKC-&alpha; and PKC-&epsilon; are involved in nephrotoxicant-induced mitochondrial dysfunction and cell death in kidney cells. Therefore, the goal of this study was to develop an in vitro model of renal cells maintaining active mitochondrial functions in which PKC isozymes could be selectively activated or inhibited to determine their role in regulation of oxidative phosphorylation and cell survival. Primary cultures of renal proximal tubular cells (RPTC) were cultured in improved conditions resulting in mitochondrial respiration and activity of mitochondrial enzymes similar to those in RPTC in vivo. Because traditional transfection techniques (Lipofectamine, electroporation) are inefficient in primary cultures and have adverse effects on mitochondrial function, PKC-&epsilon; mutant cDNAs were delivered to RPTC through adenoviral vectors. This approach results in transfection of over 90% cultured RPTC.
Here, we present methods for assessing the role of PKC-&epsilon; in: 1. regulation of mitochondrial morphology and functions associated with ATP synthesis, and 2. survival of RPTC in primary culture. PKC-&epsilon; is activated by overexpressing the constitutively active PKC-&epsilon; mutant. PKC-&epsilon; is inhibited by overexpressing the inactive mutant of PKC-&epsilon;. Mitochondrial function is assessed by examining respiration, integrity of the respiratory chain, activities of respiratory complexes and F0F1-ATPase, ATP production rate, and ATP content. Respiration is assessed in digitonin-permeabilized RPTC as state 3 (maximum respiration in the presence of excess substrates and ADP) and uncoupled respirations. Integrity of the respiratory chain is assessed by measuring activities of all four complexes of the respiratory chain in isolated mitochondria. Capacity of oxidative phosphorylation is evaluated by measuring the mitochondrial membrane potential, ATP production rate, and activity of F0F1-ATPase. Energy status of RPTC is assessed by determining the intracellular ATP content. Mitochondrial morphology in live cells is visualized using MitoTracker Red 580, a fluorescent dye that specifically accumulates in mitochondria, and live monolayers are examined under a fluorescent microscope. RPTC viability is assessed using annexin V/propidium iodide staining followed by flow cytometry to determine apoptosis and oncosis.
These methods allow for a selective activation/inhibition of individual PKC isozymes to assess their role in cellular functions in a variety of physiological and pathological conditions that can be reproduced in in vitro.

The effects of activation of protein kinase C (PKC) isozymes on mitochondrial functions associated with respiration and oxidative phosphorylation and on cell viability are described. The approach adapts adenoviral technique to selectively overexpress PKC isozymes in primary cell culture and a variety of assays to determine mitochondrial functions and energy status of the cell.

腎細胞内のミトコンドリアの機能と細胞生存率の評価を過剰発現するプロテインキナーゼCアイソザイム

The protein kinase C (PKC) family of isozymes is involved in numerous physiological and pathological processes. Our recent data demonstrate that PKC ...

A Functional Assay for Gap Junctional Examination; Electroporation of Adherent Cells on Indium-Tin Oxide

In this technique, cells are cultured on a glass slide that is partly coated with indium-tin oxide (ITO), a transparent, electrically conductive material. A variety of molecules, such as peptides or oligonucleotides can be introduced into essentially 100% of the cells in a non-traumatic manner.&#160; Here, we describe how it can be used to study intercellular, gap junctional communication. Lucifer yellow penetrates into the cells when an electric pulse, applied to the conductive surface on which they are growing, causes pores to form through the cell membrane. This is electroporation. Cells growing on the nonconductive&#160;glass surface immediately adjacent to the electroporated region do not take up Lucifer yellow by electroporation but do acquire the fluorescent dye as it is passed to them via gap junctions that link them to the electroporated cells. The results of the transfer of dye from cell to cell can be observed microscopically under fluorescence illumination. This technique allows for precise quantitation of gap junctional communication. In addition, it can be used for the introduction of peptides or other non-permeant molecules, and the transfer of small electroporated peptides via gap junctions to inhibit the signal in the adjacent, non-electroporated cells is a powerful demonstration of signal inhibition.

This presentation demonstrates a method whereby electroporation of adherent, cultured cells is used for the study of intercellular, junctional communication, while the cells grow on a slide coated with conductive and transparent indium-tin oxide.

ギャップ結合審査のための機能アッセイ;インジウム - スズ酸化物に対する接着した細胞のエレクトロポレーション

In this technique, cells are cultured on a glass slide that is partly coated with indium-tin oxide (ITO), a transparent, electrically conductive material. ...

Experimental Approaches to Study Mitochondrial Localization and Function of a Nuclear Cell Cycle Kinase, Cdk1

Although mitochondria possess their own transcriptional machinery, merely 1% of mitochondrial proteins are synthesized inside the organelle. The nuclear-encoded proteins are transported into mitochondria guided by their mitochondria targeting sequences (MTS); however, a majority of mitochondrial localized proteins lack an identifiable MTS. Nevertheless, the fact that MTS can instruct proteins to go into the mitochondria provides a valuable tool for studying mitochondrial functions of normally nuclear and/or cytoplasmic proteins. We have recently identified the cell cycle kinase CyclinB1/Cdk1 complex in the mitochondria. To specifically study the mitochondrial functions of this complex, mitochondrial overexpression and knock-down of this complex without interfering with its nuclear or cytoplasmic functions were essential. By tagging CyclinB1/Cdk1 with MTS, we were able to achieve mitochondrial overexpression of this complex to study its mitochondrial targets as well as functions. Via tagging dominant-negative Cdk1 with MTS, inhibition of Cdk1 activity was accomplished particularly in the mitochondria. Potential mitochondrial targets of CyclinB1/Cdk1 complex were identified using a gel-based proteomics approach. Unlike traditional 2D gel analysis, we employed 2-dimensional difference gel electrophoresis (2D-DIGE) technology followed by phosphoprotein staining to fluorescently label differentially phosphorylated proteins in mitochondrial Cdk1 expressing cells. Identification of phosphoprotein spots that were altered in wild type versus dominant negative Cdk1 bearing mitochondria revealed the identity of mitochondrial targets of Cdk1. Finally, to determine the effect of CyclinB1/Cdk1 mitochondrial localization in cell cycle progression, a cell proliferation assay using a synthetic thymidine analogue EdU (5-ethynyl-2&#8242;-deoxyuridine) was used to monitor the cells as they go through the cell cycle and replicate their DNA. Altogether, we demonstrated a variety of approaches available to study mitochondrial localization and activity of a cell cycle kinase. These are advanced, yet easy to follow methods that will be beneficial to many cell biology researchers.

Here, we outline how to study mitochondrial localization of a (cell cycle) kinase, and how to determine its sub-mitochondrial location as well as potential mitochondrial substrates/targets. Forced expression of proteins into the mitochondria provides a useful tool for studying the functional consequences of mitochondrial localization of a protein of interest.

ミトコンドリア局在と原子力細胞周期キナーゼ、Cdk1のの機能を研究するための実験的アプローチ

Although mitochondria possess their own transcriptional machinery, merely 1% of mitochondrial proteins are synthesized inside the organelle. The ...

神経科学におけるミトコンドリアネットワーク解析のためのMATLAB最適化

Optimized Automated Analysis of Live Neuronal Mitochondria Homeostasis Modulation by Isoform-Specific Retinoic Acid Receptors

The complex mitochondrial network makes it very challenging to segment, follow, and analyze live cells. MATLAB tools allow the analysis of mitochondria in timelapse files, considerably simplifying and speeding up the process of image processing. Nonetheless, existing tools produce a large output volume, requiring individual manual attention, and basic experimental setups have an output of thousands of files, each requiring extensive and time-consuming handling. 
To address these issues, a routine optimization was developed, in both MATLAB code and live-script forms, allowing for swift file analysis and significantly reducing document reading and data processing. With a speed of 100 files/min, the optimization allows an overall rapid analysis. The optimization achieves the results output by averaging frame-specific data for individual mitochondria throughout time frames, analyzing data in a defined manner, consistent with those output from existing tools. Live confocal imaging was performed using the dye tetramethylrhodamine methyl ester, and the routine optimization was validated by treating neuronal cells with retinoic acid receptor (RAR) agonists, whose effects on neuronal mitochondria are established in the literature. The results were consistent with the literature and allowed further characterization of mitochondrial network behavior in response to isoform-specific RAR modulation. 
This new methodology allowed rapid and validated characterization of whole-neuron mitochondria network, but it also allows for differentiation between axon and cell body mitochondria, an essential feature to apply in the neuroscience field. Moreover, this protocol can be applied to experiments using fast-acting treatments, allowing the imaging of the same cells before and after treatments, transcending the field of neuroscience.

著者スポットライト:ニューロンミトコンドリアにおけるレチノイン酸受容体を調査するための最適化された自動化法(英語)

The mitochondrial network is extremely complex, making it very challenging to analyze. A novel MATLAB tool analyzes live confocal imaged mitochondria in timelapse images but results in a large output volume requiring individual manual attention. To address this issue, a routine optimization was developed, allowing for speedy file analysis.

アイソフォーム特異的レチノイン酸受容体による生きた神経細胞ミトコンドリアの恒常性調節の最適化された自動解析(英語)

The complex mitochondrial network makes it very challenging to segment, follow, and analyze live cells. MATLAB tools allow the analysis of mitochondria in ...