This work was supported by NIH grants CA133402, CA152313 and Department of Energy Office of Science DE-SC0001271. We thank the University of California Davis Flow Cytometry Shared Resource Laboratory with funding from the NCI P30 CA0933730, and NIH NCRR C06-RR12088, S10 RR12964 and S10 RR 026825 grants and with technical assistance from Ms. Bridget McLaughlin and Mr. Jonathan Van Dyke for their help with the flow cytometry experiments.

<ol>
	<li>Weinert, T., Hartwell, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+G2+delay+by+the+rad9+gene+of+Saccharomyces+cerevisiae.">Control of G2 delay by the rad9 gene of Saccharomyces cerevisiae.</a> J Cell Sci Suppl. 12, 145-148 (1989).</li><li>Takizawa, C. G., Morgan, D. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+mitosis+by+changes+in+the+subcellular+location+of+cyclin-B1-Cdk1+and+Cdc25C.">Control of mitosis by changes in the subcellular location of cyclin-B1-Cdk1 and Cdc25C.</a> Curr Opin Cell Biol. 12 (6), 658-665 (2000).</li><li>Allan, L. A., Clarke, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphorylation+of+caspase-9+by+CDK1/cyclin+B1+protects+mitotic+cells+against+apoptosis.">Phosphorylation of caspase-9 by CDK1/cyclin B1 protects mitotic cells against apoptosis.</a> Mol Cell. 26 (2), 301-310 (2007).</li><li>Cerveny, K. L., Tamura, Y., Zhang, Z., Jensen, R. E., Sesaki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+mitochondrial+fusion+and+division.">Regulation of mitochondrial fusion and division.</a> Trends Cell Biol. 17 (11), 563-569 (2007).</li><li>Brandt, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Energy+converting+NADH:quinone+oxidoreductase+(complex+I).">Energy converting NADH:quinone oxidoreductase (complex I).</a> Annu Rev Biochem. 75, 69-92 (2006).</li><li>Hofhaus, G., Weiss, H., Leonard, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+microscopic+analysis+of+the+peripheral+and+membrane+parts+of+mitochondrial+NADH+dehydrogenase+(complex+I).">Electron microscopic analysis of the peripheral and membrane parts of mitochondrial NADH dehydrogenase (complex I).</a> J Mol Biol. 221 (3), 1027-1043 (1991).</li><li>Weiss, H., Friedrich, T., Hofhaus, G., Preis, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+respiratory-chain+NADH+dehydrogenase+(complex+I)+of+mitochondria.">The respiratory-chain NADH dehydrogenase (complex I) of mitochondria.</a> Eur J Biochem. 197 (3), 563-576 (1991).</li><li>Janssen, R. J., Nijtmans, L. G., van den Heuvel, L. P., Smeitink, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+complex+I:+structure,+function+and+pathology.">Mitochondrial complex I: structure, function and pathology.</a> J Inherit Metab Dis. 29 (4), 499-515 (2006).</li><li>Roessler, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+assignment+of+EPR+spectra+to+structurally+defined+iron-sulfur+clusters+in+complex+I+by+double+electron-electron+resonance.">Direct assignment of EPR spectra to structurally defined iron-sulfur clusters in complex I by double electron-electron resonance.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (5), 1930-1935 (2010).</li><li>Owusu-Ansah, E., Yavari, A., Mandal, S., Banerjee, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+mitochondrial+retrograde+signals+control+the+G1-S+cell+cycle+checkpoint.">Distinct mitochondrial retrograde signals control the G1-S cell cycle checkpoint.</a> Nat Genet. 40 (3), 356-361 (2008).</li><li>Wang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyclin+B1/Cdk1+coordinates+mitochondrial+respiration+for+cell-cycle+G2/M+progression.">Cyclin B1/Cdk1 coordinates mitochondrial respiration for cell-cycle G2/M progression.</a> Dev Cell. 29 (2), 217-232 (2014).</li><li>Omura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria-targeting+sequence,+a+multi-role+sorting+sequence+recognized+at+all+steps+of+protein+import+into+mitochondria.">Mitochondria-targeting sequence, a multi-role sorting sequence recognized at all steps of protein import into mitochondria.</a> J Biochem. 123 (6), 1010-1016 (1998).</li><li>Konishi, T., Takeyasu, A., Natsume, T., Furusawa, Y., Hieda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+heavy+ion+tracks+by+labeling+3'-OH+termini+of+induced+DNA+strand+breaks.">Visualization of heavy ion tracks by labeling 3'-OH termini of induced DNA strand breaks.</a> J Radiat Res. 52 (4), 433-440 (2011).</li><li>Leif, R. C., Stein, J. H., Zucker, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+short+history+of+the+initial+application+of+anti-5-BrdU+to+the+detection+and+measurement+of+S+phase.">A short history of the initial application of anti-5-BrdU to the detection and measurement of S phase.</a> Cytometry A. 58 (1), 45-52 (2004).</li><li>Li, K., Lee, L. A., Lu, X., Wang, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorogenic+'click'+reaction+for+labeling+and+detection+of+DNA+in+proliferating+cells.">Fluorogenic 'click' reaction for labeling and detection of DNA in proliferating cells.</a> Biotechniques. 49 (1), 525-527 (2010).</li><li>Kondo, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+sensitive+fluorescent+dyes+in+linkage+of+laser+microdissection+and+two-dimensional+gel+electrophoresis+as+a+cancer+proteomic+study+tool.">Application of sensitive fluorescent dyes in linkage of laser microdissection and two-dimensional gel electrophoresis as a cancer proteomic study tool.</a> Proteomics. 3 (9), 1758-1766 (2003).</li><li>Gundry, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+10,+Preparation+of+proteins+and+peptides+for+mass+spectrometry+analysis+in+a+bottom-up+proteomics+workflow.">Chapter 10, Preparation of proteins and peptides for mass spectrometry analysis in a bottom-up proteomics workflow.</a> Curr Protoc Mol Biol. , Unit 10.25 (2009).</li><li>Davies, D., Macey, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+11,+Cell+Sorting+by+Flow+Cytometry.">Chapter 11, Cell Sorting by Flow Cytometry.</a> Flow Cytometry. , 257-276 (2007).</li><li>van den Heuvel, S., Harlow, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+roles+for+cyclin-dependent+kinases+in+cell+cycle+control.">Distinct roles for cyclin-dependent kinases in cell cycle control.</a> Science. 262 (5142), 2050-2054 (1993).</li><li>Terry, N. H. A., White, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry+after+bromodeoxyuridine+labeling+to+measure+S+and+G2+M+phase+durations+plus+doubling+times+in+vitro+and+in+vivo.">Flow cytometry after bromodeoxyuridine labeling to measure S and G2+M phase durations plus doubling times in vitro and in vivo.</a> Nat. Protcols. 1 (2), 859-869 (2006).</li><li>Becker, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preprotein+translocase+of+the+outer+mitochondrial+membrane:+reconstituted+Tom40+forms+a+characteristic+TOM+pore.">Preprotein translocase of the outer mitochondrial membrane: reconstituted Tom40 forms a characteristic TOM pore.</a> J Mol Biol. 353 (5), 1011-1020 (2005).</li><li>Karniely, S., Pines, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+translation--dual+destination:+mechanisms+of+dual+protein+targeting+in+eukaryotes.">Single translation--dual destination: mechanisms of dual protein targeting in eukaryotes.</a> EMBO Rep. 6 (5), 420-425 (2005).</li><li>Candas, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CyclinB1/Cdk1+phosphorylates+mitochondrial+antioxidant+MnSOD+in+cell+adaptive+response+to+radiation+stress.">CyclinB1/Cdk1 phosphorylates mitochondrial antioxidant MnSOD in cell adaptive response to radiation stress.</a> J Mol Cell Biol. 5 (3), 166-175 (2013).</li><li>Nantajit, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyclin+B1/Cdk1+phosphorylation+of+mitochondrial+p53+induces+anti-apoptotic+response.">Cyclin B1/Cdk1 phosphorylation of mitochondrial p53 induces anti-apoptotic response.</a> PLoS One. 5 (8), e12341 (2010).</li><li>Cappella, P., Gasparri, F., Pulici, M., Moll, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+method+based+on+click+chemistry,+which+overcomes+limitations+of+cell+cycle+analysis+by+classical+determination+of+BrdU+incorporation,+allowing+multiplex+antibody+staining.">A novel method based on click chemistry, which overcomes limitations of cell cycle analysis by classical determination of BrdU incorporation, allowing multiplex antibody staining.</a> Cytometry A. 73 (7), 626-636 (2008).</li><li>Niwa, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+nature+of+the+light+emitter+of+the+Aequorea+green+fluorescent+protein.">Chemical nature of the light emitter of the Aequorea green fluorescent protein.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (24), 13617-13622 (1996).</li><li>Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+green+fluorescent+protein.">The green fluorescent protein.</a> Annu Rev Biochem. 67, 509-544 (1998).</li><li>Marouga, R., David, S., Hawkins, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+of+the+DIGE+system:+2D+fluorescence+difference+gel+analysis+technology.">The development of the DIGE system: 2D fluorescence difference gel analysis technology.</a> Anal Bioanal Chem. 382 (3), 669-678 (2005).</li><li>Timms, J. F., Cramer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Difference+gel+electrophoresis.">Difference gel electrophoresis.</a> Proteomics. 8 (23-24), 4886-4897 (2008).</li><li>Crane, J., Mittar, D., Soni, D., McIntyre, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+Cycle+Analysis+Using+the+BD+BrdU+FITC+Assay+on+the+BD+FACSVerse+System.">Cell Cycle Analysis Using the BD BrdU FITC Assay on the BD FACSVerse System.</a> BD Biosciences Appl Notes. , (2011).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

他の細胞内小器官宛のタンパク質と同様に、ミトコンドリアの標的タンパク質は、精巧なタンパク質のトランスロケーションと折り機21,22の支援を受けて細胞小器官にそれらを向ける彼らの一次または二次構造内ターゲティングシグナルを有しています。例えばCOX8としてのみミトコンドリア常駐タンパク質から得られた配列（MTS）を標的とするミトコンドリアは、ミトコンドリア11,23,24に特定のタンパク質を標的とする任意の遺伝子配列のN末端 ​​に付加することができます。ここでは、サイクリンおよびCdk1の遺伝子がベクターを含むCOX8のMTSへと発現の際にクローン化した、組換えサイクリンおよびCdk1のは、ミトコンドリアに局在していました。このアプローチの利点は、全体的な遺伝子発現を変化させることなく、この場合、ミトコンドリアに、特定の副細胞区画に遺伝子発現の改変を可能にすることです。この戦略では、ミトコンドリア特異的核キナーゼの機能は、Cdk1のがdeましたtermined。同様に、ドミナントネガティブCdk1のにMTSを添加することにより、ダウンCdk1のミトコンドリア特有の機能のノックミトコンドリアCDK1の比標的の同定を可能にし、Cdk1の機能のミトコンドリアの欠如の機能的結果の分析を可能にするものでした。ミトコンドリアおよび核の両方でCdk1のの発現増強でMTSタグ結果なしCdk1のの過剰発現は、そのためには、Cdk1ののミトコンドリア固有のアクションの結果のさらなる調査を複雑にしています。 私たちはMTSタグの添加によりミトコンドリアにいくつかのキナーゼを移転しようとする試みに失敗した数を経験しているようしかし、このアプローチは、すべての遺伝子産物に適していないかもしれません。いくつかの細胞株は、トランスフェクションに非常に耐性があり、最適なプロトコルを見つけることは時間がかかるかもしれません。細胞が健康であるとトランスフェクションは、蛍光標識されたタンパク質と協力し、成功した場合であってもいくつかの問題のSUCを示します集約、不正確なローカリゼーション、非機能の融合、および弱い信号として時間。 ミトコンドリアとミトプラストの分離の主な制限は、他の細胞またはサブミトコンドリアのコンパートメントからの低収量及び汚染の可能性があります。接着性細胞は、それが困難な培養接着細胞からミトコンドリアの高い量を得ることができるので、従来の化学的または機械的な方法によって効率的に破断されていないことが示唆されます。ここでは、MCF10A細胞の接着培養を利用しました。出発量を50μgのミトコンドリアタンパク質の3 - -約30を得るために、5×10 7細胞を使用しました。均質化工程は、ミトコンドリアの準備の最終収量のためのもう一つの重要なポイントです。使用される細胞株に依存して、ストロークおよび/または均質化の時間数が変化してもよいです。 MCF10A細胞のために、私たちはガラス/ガラスホモジナイザーにより均質化の10分は、マウス胚性fibroblaながら、必要とされることを観察しました均質化の5分 - STS（MEF）はわずか3を必要としました。過度の均質化は、ミトコンドリア膜に損傷を引き起こし、ミトコンドリアの成分の放出を誘発することができるので、各細胞株のための標準的な条件は、経験的に決定されるべきです。ガラス - ガラスホモジナイザーの使用は、ガラス/テフロンホモジナイザーに比べてミトコンドリア調製物の収量を増加させます。出発細胞の量だけでなく、細胞の凍結/解凍はオープン細胞を破壊するために必要なストローク数を変更することができます。最後に、タンパク質の変性や凝集が原因で均質化中の試料の局所的な加熱に発生する可能性があります。組織グラインダーを事前に冷やすと、この手順の実行中にサンプルを氷上で維持するために、したがって、必要不可欠です。 この記事で紹介したもう一つの方法は、リアルタイムで細胞周期を監視するEDUのラベリングを使用することです。 EDUは、蛍光明るく、光安定アレクサフルオロ色素で標識された修飾チミジン類似体です。 EDUはEFFIです効率良く新たに合成されたDNAに組み込まれました。この方法は、ヌクレオシドアナログ、ブロモデオキシウリジン（BrdUを）で細胞を増殖させる伝統的な標識の使用に優れた代替手段です。 BrdUの活性DNA合成中にDNAに組み込まれます。 BrdUで標識されたDNAの定量化は、このようなBrdU抗体結合のためのBrdU分子を露出させるために高熱や高酸度などの比較的過酷な方法により、DNAの変性を必要とします。 DNAの変性のための過酷な治療には、サンプルの質に影響を与え、時間がかかることができます。 EDUと、界面活性剤透過性は、DNAへのアクセスを得るためにEDU検出試薬に一般的に十分です。 DNAへのアクセスのために過酷な化学物質または熱を使用する必要なしに、EDUの方法は、より正確で一貫性のある使用が容易です。別にEDUが提供する利点から、増殖を研究するためにEDUの使用に関するいくつかの懸念がありました。 EDUはneglに減らすことができ、72時間以上のトリートメント、でわずかな抗増殖活性を示しましたEDUパルスが1時間25℃で維持したigibleレベル。 EDUのラベリングに使用されている1つの変更が定着時間及び方法です。キットには、設けられた固定液で15分間固定を示唆しました。しかし、70％エタノールで追加の固定は、この実験で使用しました。細胞は2時間毎に採取した、時点の実験を行ったところ、1）時間をかけて細胞周期の進行を追跡する：エタノールの使用のための2つの理由があります。実験時間点の全てが完了するまで細胞を4°Cの 70％エタノール中で保存しました。必要であれば実際に、細胞は、（カ月に数週間）より長い、70％エタノール中で維持することができます。 2）実験に使用した細胞は、安定にGFPタグ付きCDK1及び/またはRFPタグ付きサイクリントランスフェクトしました。 GFP / RFP蛍光のEDU及びPI信号を分離するために、エタノールの固定は、GFP及びRFPタンパク質を変性させ、ひいてはEDU行う前に蛍光を消光するために利用されましたD PI染色。変性GFP / RFPタンパク質は、本質的に完全に非蛍光性、発色団はもはや26,27を急冷から保護されているためと考えています。 Cdk1のミトコンドリアの標的を同定するために、多くの点で従来の2Dゲルよりも優れている2D-DIGE法は、使用されました。 例えば、2D-DIGE、異なる蛍光色素では、Cy 3、図5及び図2に示すように、ラベルのサンプルに使用され、標準的な2Dゲルのように複製を実行することなくばらつきを低減し、1つのゲルで3サンプルまで実行可能にします。 2D-DIGEに使用される蛍光色素は、0.2 ngの非常に高い感度を持っている/高いスポット分解能2D-DIGEゲル上で実行したタンパク質の少量を必要とする、このようにして、100 ngの/スポットでのトリフェニルメタン染料に比べてスポットと出版品質のゲルをスキャンします。自動化されたソフトウェアは、示差的に発現するタンパク質を検出、定量化および定義するために使用されます。高いスポット分解能のため、サンプルCAにおけるタンパク質発現を差動nはソフトウェア支援スポット定量化を使用して正確に比較すること; 10％という低い差が容易に翻訳後修飾の可視化を可能にする、2D-DIGEを介して検出することができます。ソフトウェア支援ゲル内分析の使用は、データのより速い取得を可能にします。例えば、蛍光スキャナーなどの機器が、画像取得のために必要とされるので、この方法の使用は、追加費用を伴います。 2D-DIGEの他の制限は、貧しい疎水性タンパク質の表現だけでなく、極端な等電点と大きな分子量を28,29を有するタンパク質が含まれます。このような免疫細胞化学またはウェスタンブロットのような代替技術を使用して、2D-DIGEを用いて得られた結果のさらなる検証は、新規の知見を確認するために必要とされます。

哺乳類では、細胞周期の進行は、サイクリンおよびサイクリン依存性キナーゼ（CDK）1によって制御される、高度に秩序イベントに依存しています。その細胞質、核、および中心体の局在化を通じ、サイクリン/ Cdk1のは、核エンベロープの破壊や中心体の分離2などの有糸分裂におけるさまざまなイベントを同期することができます。サイクリン/ Cdk1のは、アポトーシス3に対して有糸分裂細胞を保護し、ミトコンドリアの分裂、新たに形成された娘細胞4にミトコンドリアの平等な分配のための重要なステップを促進します。 哺乳動物細胞の増殖には、ミトコンドリアのATP、5マルチサブユニット複合体で構成されている酸化的リン酸化（OXPHOS）機械（電子伝達系）を介して生成されます。複合体I - 複雑なV（CI-CV）。ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（NADH）：ユビキノン酸化還元酵素または複合体I（CI）は、5つの複合体5の理解最大と最小です。複雑なC45サブユニットの14のonsistsは、触媒コアを形成します。一旦組み立てられる、複合体は、1マトリックス内に突出するアームと内膜6,7に埋め込 ​​まれ、他方のアームとL字型構造を前提としています。 CIサブユニットの変異は、ミトコンドリア病8の様々な原因です。 OXPHOSで機能的、効率的なCIが、全体的なミトコンドリア呼吸9のためだけでなく、成功した細胞周期進行10のためだけでなく、必要とされます。健康と病気で、この膜結合酵素複合体の機能のメカニズムをUnravellingする新規な診断手順と高度な治療戦略の開発を可能にすることができます。最近の研究では、サイクリン/ Cdk1の複合体が細胞中の細胞の増加したエネルギー需要を相殺する（ギャップ2）G2 /（有糸分裂）M期におけるミトコンドリアに移行し、潜在的に、ミトコンドリアのエネルギー産生を高めるために、CIサブユニットをリン酸化することを見出しましたサイクル11。ここでは、SHO実験手順および他の方法で核/細胞質キナーゼのミトコンドリア転移を研究するために使用することができます戦略、そのミトコンドリアの基質と同様の例として、サイ​​クリン/ Cdk1のを使用して、ミトコンドリア局在の機能的結果をwcase。 必要なときにサイクリン/ Cdk1の複合体はミトコンドリアに移行していることを発見は、この複合体のミトコンドリア固有の過剰発現およびノックダウンの研究を促しました。蛋白質のミトコンドリア特異的発現を達成するためには、目的のタンパク質のN末端にミトコンドリアターゲティング配列（MTS）を追加することができます。配列を標的とするミトコンドリアは、彼らは通常、12を常駐ミトコンドリアへミトコンドリアタンパク質の選別を可能にします。我々は、サイクリンまたは赤色蛍光をタグ付きヒトシトクロムcオキシダーゼサブユニット8A（COX8）の前駆体から誘導された87塩基ミトコンドリアターゲティング配列を使用し、緑色蛍光タンパク質（GFP）にそれをクローン化してきましたタンパク質（RFP）がCdk1のがフレーム内にプラスミドを含むタグ付き。この方法は、具体的には、それらの核のプールに影響を与えることなく、これらのタンパク質のミトコンドリアの表現を変え、私たちはミトコンドリアにサイクリンとCdk1のをターゲットにすることができました。蛍光これらのタンパク質をタグ付けすることによって、我々はリアルタイムでそれらの局在をモニターすることができました。同様に、私たちは私たちは、特にCdk1のミトコンドリアの発現と機能をノックダウンすることができRFPタグ付きドミナントネガティブCdk1のを含むプラスミドにMTSを導入しています。 Cdk1のような二重のローカライズ版を持っているキナーゼのミトコンドリアと核の機能を区別することが不可欠です。これらの二重機能性キナーゼのN末端へのエンジニアリングMTSを採用することが容易かつ効果的である偉大な戦略を提供しています。 Cdk1のは、細胞周期キナーゼであるので、Cdk1のは、ミトコンドリアに局在している場合、細胞周期の進行を決定するために基本的です。これを達成するために、我々は、新しいメトを利用していますdは細胞におけるDNA含有量を監視します。従来の方法は、チミジンを置換するために、細胞周期のS期の間に新たに合成されたDNAに組み込まれたBrdU（ブロモデオキシウリジン）、合成チミジン類似体を用いることを含みます。そして積極的にそれらのDNAを複製している細胞を、抗BrdU抗体を用いて検出することができます。この方法の一つの欠点は、結果13,14の間で矛盾を生じ得る酸または熱処理などの過酷な方法によってBrdU抗体のためのアクセスを提供するために、DNAの変性を必要とすることです。代わりに、我々は異なるチミジンアナログ、EDUで活発に分裂する細胞を監視するために、同様のアプローチを利用しました。中性洗剤処理は新たに合成されたDNAにEDUにアクセスするための検出試薬を可能としてEDU検出は、過酷なDNA変性を必要としません。 EDUの方法は、より信頼性の高い一貫性および高スループット分析15のための潜在的であることが証明されています。 最後に、トンO Cdk1のミトコンドリアの基質を決定、我々は古典的な2次元ゲル電気泳動の高度なバージョンである2D-DIGEと呼ばれるプロテオミクスツールを使用していました。二次元電気泳動は、第二の最初の次元と分子量のそれらの等電点に応じてタンパク質を分離します。例えば、リン酸化などの翻訳後修飾は、タンパク質の等電点および分子量に影響を与えるので、2Dゲルは、異なる試料内のタンパク質のリン酸化状態の違いを検出することができます。タンパク質スポットの大きさ（面積および強度）は、複数のサンプル間の定量的な比較を可能にするタンパク質の発現レベルの変化します。この方法を使用して、我々は、変異ミトコンドリア標的Cdk1の発現細胞に対する野生型ではリン酸化タンパク質を区別することができました。野生型で示したが、ミトコンドリアを標的とした突然変異体Cdk1の準備に欠落していた特定のタンパク質スポットを単離し、質量分析により同定。 従来の2Dゲル中で、トリフェニルメタン染料、ゲル上のタンパク質を可視化するために使用されます。 2D-DIGEは、タンパク質電気泳動移動度への影響を最小限に抑えながら蛍光タンパク質のラベルを使用しています。異なるタンパク質サンプルは、単一のゲル16上の複数のサンプルの同時電気泳動を可能にする、一緒に混合し、同じゲルにより分離し、異なる蛍光色素で標識することができます。これは、ゲルベースの​​プロテオミクス研究における重要な問題であるゲルからゲルへの変化を、最小限に抑えることができます。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="765">
	<tbody>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:273px;">32P ATP&#160;</td>
			<td style="width:207px;">PerkinElmer</td>
			<td style="width:119px;">BLU002001MC&#160;</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti-mouse secondary antibody</td>
			<td>Invitrogen&#160;</td>
			<td>A-11003</td>
			<td>Alexa-546 conjugated</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti-rabbit secondary antibody</td>
			<td>Invitrogen&#160;</td>
			<td>A11029</td>
			<td>Alexa-488 conjugated</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ATP</td>
			<td>Research Organics</td>
			<td>1166A</td>
			<td>For in vitro kinase assay</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cdk1 antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>9112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cdk1 kinase buffer</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>P6020S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Click-iT EdU Alexa Fluor 488 Imaging Kit</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>C10337</td>
			<td>For cell cycle analysis with EdU labeling</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">COX IV antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>4844S</td>
			<td>For mitochondrial immunostaining</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cyclin B1 antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotech</td>
			<td>sc-752</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">CyclinB1/Cdk1 enzyme complex</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>P6020S</td>
			<td>Avoid freeze/thaw</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">CyDye DIGE Fluor Labeling Kit</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>25-8009-83</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DIGE Gel and DIGE Buffer Kit</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>28-9480-26 AA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dimethylformamide&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>319937</td>
			<td>DMF</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dithiothreitol</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0611</td>
			<td>DTT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">dNTP</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>71004</td>
			<td>For site-directed mutagenesis</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dpn I enzyme</td>
			<td>Stratagene</td>
			<td>200519-53</td>
			<td>For site-directed mutagenesis</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Dry Strip cover fluid</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>17-1335-01</td>
			<td>Used as mineral oil</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">EDTA</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td>4040-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">EGTA</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>409910250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Eppendorf Vacufuge Concentrator</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07-748-13</td>
			<td>Used as vacuum centrifuge concentrator</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fluoromount G</td>
			<td>Southern Biotech</td>
			<td>0100-01</td>
			<td>Anti-fade mounting solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fortessa Flow Cytometer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>649908</td>
			<td>For cell cycle analysis with EdU labeling</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Histone H1</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>382150</td>
			<td>For in vitro kinase assay</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">QIAquick Gel Extraction Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28704</td>
			<td>For purifying DNA fragments from agarose gels</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Immobiline DryStrip Gels</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>18-1016-61</td>
			<td>IEF (isoelectric focusing) strips</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Immobilized Glutathione</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>15160</td>
			<td>Glutathione-agarose beads</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Iodoacetamide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>I1149</td>
			<td>IAA</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">IPGphor 3 Isoelectric Focusing Unit</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>11-0033-64</td>
			<td>IPGphor strip holders</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Isopropyl-b-D-thio-galactopyranoside&#160;</td>
			<td>RPI Corp</td>
			<td>156000-5.0</td>
			<td>IPTG</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Leupeptin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>L9783</td>
			<td>For cell lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Lipofectamine 2000</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11668027</td>
			<td>Transfection reagent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lysine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>L5501</td>
			<td>For CyDye labeling</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lysozyme</td>
			<td>EMD Chemicals</td>
			<td>5960</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mitoctracker Red/Green</td>
			<td>Invitrogen&#160;</td>
			<td>M7512/M7514</td>
			<td>Mitochondrial fluorescent dyes</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MOPS</td>
			<td>EMD Chemicals</td>
			<td>6310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">pEGFP-N1</td>
			<td>Clonetech</td>
			<td>6085-1</td>
			<td>GFP-expressing vector</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pfu</td>
			<td>Stratagene</td>
			<td>600-255-52</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pGEX-5X-1&#160;</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>28-9545-53</td>
			<td>GST-expressing vector</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phenylmethylsulfonyl fluoride</td>
			<td>Shelton Scientific</td>
			<td>IB01090</td>
			<td>PMSF</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phosphate buffered saline</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>14040</td>
			<td>PBS</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Spectra/Por 4 dialysis tubing</td>
			<td>Spectrum Labs</td>
			<td>132700</td>
			<td>as porous membrane tubing for dialysis</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Pro-Q Diamond Phosphoprotein Gel Stain</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>P-33300</td>
			<td>For staining phosphoproteins on 2D gels</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Proteinase inhibitor cocktail</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>539134</td>
			<td>For cell lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">QuikChange site-directed mutagenesis kit</td>
			<td>Stratagene</td>
			<td>200519-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">QIAprep Spin Miniprep Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>27104</td>
			<td>MiniPrep Plasmid Isolation Kit</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">RO-3306</td>
			<td>Alexis Biochemicals</td>
			<td>270-463-M001</td>
			<td>Cdk1 inhibitor</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rotenone</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>150154</td>
			<td>Complex I inhibitor</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium carbonate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S93359</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sodium chloride</td>
			<td>EMD Chemicals</td>
			<td>SX0420-5</td>
			<td>For cell lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium orthovanadate</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>159664</td>
			<td>For cell lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium pyrophosphate decahydrate</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>33385</td>
			<td>For cell lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium &#946;-glycerophosphate</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>L03425</td>
			<td>For cell lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SpectraMax M2e&#160;</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>M2E</td>
			<td>Microplate reader</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sucrose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>57-50-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tissue Grinder pestle</td>
			<td>Kimble Chase</td>
			<td>885301-0007</td>
			<td>For mitochondria isolation</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tissue Grinder tube</td>
			<td>Kimble Chase</td>
			<td>885303-0007</td>
			<td>For mitochondria isolation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trichloroacetic acid solution</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T0699</td>
			<td>TCA</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tris</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>103133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Triton-x-100</td>
			<td>Teknova</td>
			<td>T1105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trypsin</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>650211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">Typhoon Imager</td>
			<td style="width:207px;">GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td style="width:119px;">28-9558-09</td>
			<td>Laser gel scanner fro 2D-DIGE</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ubiquinone</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C7956</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

experimental approaches to study mitochondrial localization and function of a nuclear cell cycle kinase, cdk1

Although mitochondria possess their own transcriptional machinery, merely 1% of mitochondrial proteins are synthesized inside the organelle. The nuclear-encoded proteins are transported into mitochondria guided by their mitochondria targeting sequences (MTS); however, a majority of mitochondrial localized proteins lack an identifiable MTS. Nevertheless, the fact that MTS can instruct proteins to go into the mitochondria provides a valuable tool for studying mitochondrial functions of normally nuclear and/or cytoplasmic proteins. We have recently identified the cell cycle kinase CyclinB1/Cdk1 complex in the mitochondria. To specifically study the mitochondrial functions of this complex, mitochondrial overexpression and knock-down of this complex without interfering with its nuclear or cytoplasmic functions were essential. By tagging CyclinB1/Cdk1 with MTS, we were able to achieve mitochondrial overexpression of this complex to study its mitochondrial targets as well as functions. Via tagging dominant-negative Cdk1 with MTS, inhibition of Cdk1 activity was accomplished particularly in the mitochondria. Potential mitochondrial targets of CyclinB1/Cdk1 complex were identified using a gel-based proteomics approach. Unlike traditional 2D gel analysis, we employed 2-dimensional difference gel electrophoresis (2D-DIGE) technology followed by phosphoprotein staining to fluorescently label differentially phosphorylated proteins in mitochondrial Cdk1 expressing cells. Identification of phosphoprotein spots that were altered in wild type versus dominant negative Cdk1 bearing mitochondria revealed the identity of mitochondrial targets of Cdk1. Finally, to determine the effect of CyclinB1/Cdk1 mitochondrial localization in cell cycle progression, a cell proliferation assay using a synthetic thymidine analogue EdU (5-ethynyl-2&#8242;-deoxyuridine) was used to monitor the cells as they go through the cell cycle and replicate their DNA. Altogether, we demonstrated a variety of approaches available to study mitochondrial localization and activity of a cell cycle kinase. These are advanced, yet easy to follow methods that will be beneficial to many cell biology researchers.

サイクリンおよびCdk1ののサブミトコンドリア局在 炭酸ナトリウム抽出は、タンパク質がミトコンドリア内部又は外部表面、すなわち、外膜上に位置しているかどうかを決定するために使用されます。タンパク質は、ミトコンドリア内部で局在することが示されたら、サブミトコンドリア局在のさらなる決意は、プロテアーゼ消化と組み合わせmitoplastingを介して行うことができます。サイクリンまたはCdk1ののサブミトコンドリア局在を指定するには、ミトプラストは25 mmまでの200mMから浸透圧のスクロースの濃度を減少させて低張緩衝液中のミトコンドリアを希釈することによって単離しました。内膜は、ショ糖の25 mMの（ 図1A）での最終濃度まで無傷のまま外膜は、ショ糖の150 mMので破裂し始めます。 mitoplastingと組み合わせて、プロテアーゼ保護アッセイはtrypsを用いて行うことができます外破水次の露出したタンパク質を消化します。これは膜間腔タンパク質の消化になります。関心対象のタンパク質をトリプシン消化から保護されている場合、これは、タンパク質のミトコンドリアマトリックス局在化を示しています。この代表的な図では、ミトコンドリアマトリックスタンパク質のHsp60および膜間空間タンパク質Timm13サブミトコンドリア局在マーカーとして使用しました。 Hsp60を有するがTimm13、サイクリンおよびCdk1のとは異なり、同様のは、そのミトコンドリアマトリックス局在化（ 図1B）を示し、トリプシン消化から保護されていました。 MTS-およびGFPタグサイクリンおよびCdk1のタンパク質のミトコンドリア発現 MTSは、そのC末端にGFPまたはRFPタグを有するサイクリンまたはCdk1の遺伝子のN末端にフレーム内にクローニングします。得られた組換えタンパク質は、ミトコンドリアを標的とGFP-またはRFPタグ付きのCyでありますclinB1またはCdk1の。生成され、この研究で使用した構築物のリストは、図に示されています。これらの構築物を用いて、ミトコンドリアにおけるサイクリンおよび/ ​​またはCdk1のの過剰発現は、単離されたミトコンドリア画分（ 図2）のウェスタンブロッティングによってここに示され、達成されました。 2D-DIGEにより決定サイクリン/ Cdk1のの潜在的なミトコンドリア標的 CDK1はSまたはT残基を配向（P）のプロリンするATPからのリン酸の転移を触媒するセリン/トレオニン（S / T）キナーゼファミリーに属します。 Cdk1の（D146N）の位置146のアスパラギン（N）とアスパラギン酸（D）残基を置き換える点突然変異は、ドミナントネガティブ（DN）Cdk1の突然変異体19を生成します 。ミトコンドリアCdk1の機能を研究するために、ミトコンドリアを標的とCdk1の-dnのタンパク質は、29アミノ酸経度を含む（pERFP-N1-MTS-Cdk1の-DN）プラスミドを構築することによって生成されましたRFPタグ付きDN-Cdk1のに連結されたヒトチトクロームCオキシダーゼのサブユニットVIII由来グラムのミトコンドリアターゲティング配列（MTS）。 pERFP-N1-MTS生産ミトコンドリア標的ERFPタンパク質は、空のベクター対照として使用しました。両方の構築物でトランスフェクトされたG2 / M細胞内のミトコンドリアのリンタンパク質は、pH 4-10ゲルストリップとの2Dゲル分析によってプロファイルしました。空のベクタートランスフェクタント（ 図3、上パネル）と比較して、ミトコンドリアのリンタンパク質のグループが明らかに存在しなかったか、Cdk1の-dnのトランスフェクタント（ 図3、下のパネル）に減少しました。検出されたスポットの質量分析は、ミトコンドリアにCdk1のによりリン酸化タンパク質の同一性を決定しました。 EDUパルスチェイスアッセイとの相長さの細胞周期の進行と決意 細胞周期WHEの進行を調べるためnはミトコンドリアのサイクリンは/ Cdk1のレベルが増加する、チミジン類似体を使用して、パルスチェイス標識実験は、エチニルウリジン（EDU）は、DNA合成の20を受ける細胞の集団を標識するために行きました。この方法は、細胞がSおよびG2 / M期を経て進行し、G1期に蓄積するときにEDU-陽性集団を追跡することによって22時間のウィンドウの上に捕捉された細胞周期の可視化を可能にします。結果は、ベクトル制御または突然変異サイクリン/でトランスフェクトした細胞に6時間と比較して、ラベルされたS期細胞は、G2 / M期を通じて進行し、野生型ミトコンドリアサイクリン/ Cdk1のを発現する細胞に4時間ほど速くG1期に登場したことを示していますCDK1（ 図4A）は 、ミトコンドリアのサイクリンの増強を示す/ CDK1は、細胞周期の進行を加速させます。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/53417/53417fig1.jpg" /> 図1. ミトコンドリアサイクリン1 / Cdk1のは、マトリックスにローカライズします。保護アッセイをmitoplastingおよびプロテアーゼによって検出されたサイクリンとCdk1のの（AB）サブミトコンドリア局在、図は、Wang らから変更されている。2014年11。合計（T）、ペレット（P）および上清（S）画分を示した抗体を用いたウエスタンブロット分析に供しました。 TIMM13（インタースペースタンパク質）、およびHSP60（マトリックスタンパク質）が。 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53417/53417fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/53417/53417fig2.jpg" /> ミトコンドリアCdk1の構築物の 図2 発現。ミトコンドリアを標的としたサイクリンおよび/ ​​または野生型またはドミナントネガティブ変異体Cdk1のでトランスフェクトされた細胞から単離したミトコンドリア画分のウェスタンブロッティング（プラスミドが示されています<html>底部11に。 pEGFP-N1-MTSとpERFP-N1-MTSベクトル）は、それぞれMTS-サイクリンとMTS-Cdk1のために空のベクター対照であった。 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53417/53417fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/53417/53417fig3.jpg" /> 図3. Cdk1のの潜在的なミトコンドリア基質。ミトコンドリアを標的とした空ベクター（pERFP-N1-MTS、上パネル）または変異Cdk1の（pERFP-N1-MTS-Cdk1の-dnにトランスフェクトしたG2 / M-ピークに達した細胞から抽出したミトコンドリアタンパク質、下のパネル）は2-Dゲルで分離し、リン酸化タンパク質をリン酸化色素（赤色）で染色した、のCy5（緑色）で標識しました。この図は、Wangら 2014年11から変更されています。&quot;&gt;この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/53417/53417fig4.jpg" /> 図4. ミトコンドリアCdk1の増強G2 / M移行と全体のサイクル進行。 EDUパルスチェイスラベル付けされた細胞周期分析。 EDU標識細胞の散布図ヒストグラムはDNA含有量（X軸）とEDU（Y軸）のために採取しました。各パネルの下の数字は、EDUの平均蛍光強度は、核標識示します。時点は、EDUパルス11後の時間で示されました。 G0 / G1、S、およびG2 / M：全ての時点については、以下の集団を表示するゲートが描かれました。 6,8、および10時間の時点については、EdU-は*、S / G2 G1を標識し、G2は/ M *集団が示されています。この図は、王らから変更されている。2014年11。 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53417/53417fig4large.jpg" target="_blank">をクリックしてください</a>ここで、この図の拡大版を表示します。 <table fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr><td colspan="6">ショ糖濃度</td></tr><tr height="43"><td>いいえトリプシンありません</td><td> 25 mMの</td><td> 50 mMの</td><td> 100 mMの</td><td> 150mMの</td><td> 200 mMの</td></tr><tr height="43"><td> +トリプシン</td><td> 25 mMの</td><td> 50 mMの</td><td> 100 mMの</td><td> 150mMの</td><td> 200 mMの</td></tr></tbody></table> ステップ4.2のために使用される表1.低張スクロースバッファ <table fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr><td>ステップ1 </td><td> 30 V </td><td> 12時間</td><td>ステップとホールド</td></tr><tr><td>ステップ2 </td><td> 300 V </td><td> 0.5時間</td><td>ステップとホールド</td></tr><tr><td height="21" style="height:21px;">ステップ3 </td><td>千V </td><td> 0.5時間</td><td>勾配</td></tr><tr><td heigHT = &quot;21&quot;スタイル= &quot;高さ：21px;&quot;&gt;ステップ4 </td><td> 5000 V </td><td> 1.33時間</td><td>勾配</td></tr><tr><td height="21" style="height:21px;">ステップ5 </td><td> 5000 V </td><td> 2万Vの時間</td><td>ステップとホールド</td></tr></tbody></table> ステップ6.4.5のために使用される表2等電点電気泳動プロトコル

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Experimental Approaches to Study Mitochondrial Localization and Function of a Nuclear Cell Cycle Kinase, Cdk1

Here, we outline how to study mitochondrial localization of a (cell cycle) kinase, and how to determine its sub-mitochondrial location as well as potential mitochondrial substrates/targets. Forced expression of proteins into the mitochondria provides a useful tool for studying the functional consequences of mitochondrial localization of a protein of interest.

ミトコンドリア局在と原子力細胞周期キナーゼ、Cdk1のの機能を研究するための実験的アプローチ

Although mitochondria possess their own transcriptional machinery, merely 1% of mitochondrial proteins are synthesized inside the organelle. The ...

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ビデオ: Experimental Approaches to Study Mitochondrial Localization and Function of a Nuclear Cell Cycle Kinase, Cdk1

Experimental Approaches to Tissue Engineering

組織工学への実験的アプローチ

生物学

Visualizing RNA Localization in Xenopus Oocytes

RNA localization is a conserved mechanism of establishing cell polarity. Vg1 mRNA localizes to the vegetal pole of Xenopus laevis oocytes and acts to spatially restrict gene expression of Vg1 protein. Tight control of Vg1 distribution in this manner is required for proper germ layer specification in the developing embryo. RNA sequence elements in the 3' UTR of the mRNA, the Vg1 localization element (VLE) are required and sufficient to direct transport. To study the recognition and transport of Vg1 mRNA in vivo, we have developed an imaging technique that allows extensive analysis of trans-factor directed transport mechanisms via a simple visual readout. 
To visualize RNA localization, we synthesize fluorescently labeled VLE RNA and microinject this transcript into individual oocytes. After oocyte culture to allow transport of the injected RNA, oocytes are fixed and dehydrated prior to imaging by confocal microscopy. Visualization of mRNA localization patterns provides a readout for monitoring the complete pathway of RNA transport and for identifying roles in directing RNA transport for cis-acting elements within the transcript and trans-acting factors that bind to the VLE (Lewis et al., 2008, Messitt et al., 2008). We have extended this technique through co-localization with additional RNAs and proteins (Gagnon and Mowry, 2009, Messitt et al., 2008), and in combination with disruption of motor proteins and the cytoskeleton (Messitt et al., 2008) to probe mechanisms underlying mRNA localization.

Visualizing RNA Localization in Xenopus Oocytes

Visualization of in vivo RNA transport is accomplished by microinjection of fluorescently labeled RNA transcripts into Xenopus oocytes, followed by confocal microscopy.

可視化RNAの局在にアフリカツメガエル卵母細胞

RNA localization is a conserved mechanism of establishing cell polarity.  Vg1 mRNA localizes to the vegetal pole of Xenopus laevis oocytes and acts to ...

Using the optokinetic response to study visual function of zebrafish

Optokinetic response (OKR) is a behavior that an animal vibrates its eyes to follow a rotating grating around it. It has been widely used to assess the visual functions of larval zebrafish1-5. Nevertheless, the standard protocol for larval fish is not yet readily applicable in adult zabrafish. Here, we introduce how to measure the OKR of adult zebrafish with our simple custom-built apparatus using a new protocol which is established in our lab. Both our apparatus and step-by-step procedure of OKR in adult zebrafish are illustrated in this video. In addition, the measurements of the larval OKR, as well as the optomotor response (OMR) test of adult zebrafish, are also demonstrated in this video. This OKR assay of adult zebrafish in our experiment may last for up to 4 hours. Such OKR test applied in adult fish will benefit to visual function investigation more efficiently when the adult fish vision system is manipulated.
Su-Qi Zou and Wu Yin contributed equally to this paper.

Optokinetic response has been widely used to assess the visual functions of larval zebrafish. Nevertheless, the standard protocol for larval fish is not yet readily applicable in adults1-5. Here, we introduce how to measure the OKR of adult zebrafish using a new protocol which is established in our lab.

ゼブラフィッシュの視覚機能を研究するために視運動性応答を使用して

Optokinetic response (OKR) is a behavior that an animal vibrates its eyes to follow a rotating grating around it. It has been widely used to assess the ...

Monitoring Kinase and Phosphatase Activities Through the Cell Cycle by Ratiometric FRET

F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET)-based reporters1 allow the assessment of endogenous kinase and phosphatase activities in living cells. Such probes typically consist of variants of CFP and YFP, intervened by a phosphorylatable sequence and a phospho-binding domain. Upon phosphorylation, the probe changes conformation, which results in a change of the distance or orientation between CFP and YFP, leading to a change in FRET efficiency (Fig 1). Several probes have been published during the last decade, monitoring the activity balance of multiple kinases and phosphatases, including reporters of PKA2, PKB3, PKC4, PKD5, ERK6, JNK7, Cdk18, Aurora B9 and Plk19. Given the modular design, additional probes are likely to emerge in the near future10. 
Progression through the cell cycle is affected by stress signaling pathways 11. Notably, the cell cycle is regulated differently during unperturbed growth compared to when cells are recovering from stress12.Time-lapse imaging of cells through the cell cycle therefore requires particular caution. This becomes a problem particularly when employing ratiometric imaging, since two images with a high signal to noise ratio are required to correctly interpret the results. Ratiometric FRET imaging of cell cycle dependent changes in kinase and phosphatase activities has predominately been restricted to sub-sections of the cell cycle8,9,13,14.
Here, we discuss a method to monitor FRET-based probes using ratiometric imaging throughout the human cell cycle. The method relies on equipment that is available to many researchers in life sciences and does not require expert knowledge of microscopy or image processing.

FRET-based reporters are increasingly used to monitor kinase and phosphatase activities in live cells. Here we describe a method on how to use FRET-based reporters to assess cell cycle-dependent changes in target phosphorylation.

FRETはレシオメトリックで細胞周期のキナーゼおよびホスファターゼの活動を監視

F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET)-based reporters1 allow the assessment of endogenous kinase and phosphatase activities in living cells. Such ...

Analysis of Cell Cycle Position in Mammalian Cells

The regulation of cell proliferation is central to tissue morphogenesis during the development of multicellular organisms. Furthermore, loss of control of cell proliferation underlies the pathology of diseases like cancer. As such there is great need to be able to investigate cell proliferation and quantitate the proportion of cells in each phase of the cell cycle. It is also of vital importance to indistinguishably identify cells that are replicating their DNA within a larger population. Since a cell&prime;s decision to proliferate is made in the G1 phase immediately before initiating DNA synthesis and progressing through the rest of the cell cycle, detection of DNA synthesis at this stage allows for an unambiguous determination of the status of growth regulation in cell culture experiments.
DNA content in cells can be readily quantitated by flow cytometry of cells stained with propidium iodide, a fluorescent DNA intercalating dye. Similarly, active DNA synthesis can be quantitated by culturing cells in the presence of radioactive thymidine, harvesting the cells, and measuring the incorporation of radioactivity into an acid insoluble fraction. We have considerable expertise with cell cycle analysis and recommend a different approach. We Investigate cell proliferation using bromodeoxyuridine/fluorodeoxyuridine (abbreviated simply as BrdU) staining that detects the incorporation of these thymine analogs into recently synthesized DNA. Labeling and staining cells with BrdU, combined with total DNA staining by propidium iodide and analysis by flow cytometry1 offers the most accurate measure of cells in the various stages of the cell cycle. It is our preferred method because it combines the detection of active DNA synthesis, through antibody based staining of BrdU, with total DNA content from propidium iodide. This allows for the clear separation of cells in G1 from early S phase, or late S phase from G2/M. Furthermore, this approach can be utilized to investigate the effects of many different cell stimuli and pharmacologic agents on the regulation of progression through these different cell cycle phases.
In this report we describe methods for labeling and staining cultured cells, as well as their analysis by flow cytometry. We also include experimental examples of how this method can be used to measure the effects of growth inhibiting signals from cytokines such as TGF-&beta;1, and proliferative inhibitors such as the cyclin dependent kinase inhibitor, p27KIP1. We also include an alternate protocol that allows for the analysis of cell cycle position in a sub-population of cells within a larger culture5. In this case, we demonstrate how to detect a cell cycle arrest in cells transfected with the retinoblastoma gene even when greatly outnumbered by untransfected cells in the same culture. These examples illustrate the many ways that DNA staining and flow cytometry can be utilized and adapted to investigate fundamental questions of mammalian cell cycle control.

Determining the cell cycle position of a population of cells, or understanding how signals affect proliferation, can be readily measured by flow cytometry using this protocol. We report a simple experimental approach to staining cells and quantifying their position in the cell cycle.

哺乳動物細胞における細胞周期の位置の解析

The regulation of cell proliferation is central to tissue morphogenesis during the development of multicellular organisms. Furthermore, loss of control of ...

Assessment of Mitochondrial Functions and Cell Viability in Renal Cells Overexpressing Protein Kinase C Isozymes

The protein kinase C (PKC) family of isozymes is involved in numerous physiological and pathological processes. Our recent data demonstrate that PKC regulates mitochondrial function and cellular energy status. Numerous reports demonstrated that the activation of PKC-a and PKC-&epsilon; improves mitochondrial function in the ischemic heart and mediates cardioprotection. In contrast, we have demonstrated that PKC-&alpha; and PKC-&epsilon; are involved in nephrotoxicant-induced mitochondrial dysfunction and cell death in kidney cells. Therefore, the goal of this study was to develop an in vitro model of renal cells maintaining active mitochondrial functions in which PKC isozymes could be selectively activated or inhibited to determine their role in regulation of oxidative phosphorylation and cell survival. Primary cultures of renal proximal tubular cells (RPTC) were cultured in improved conditions resulting in mitochondrial respiration and activity of mitochondrial enzymes similar to those in RPTC in vivo. Because traditional transfection techniques (Lipofectamine, electroporation) are inefficient in primary cultures and have adverse effects on mitochondrial function, PKC-&epsilon; mutant cDNAs were delivered to RPTC through adenoviral vectors. This approach results in transfection of over 90% cultured RPTC.
Here, we present methods for assessing the role of PKC-&epsilon; in: 1. regulation of mitochondrial morphology and functions associated with ATP synthesis, and 2. survival of RPTC in primary culture. PKC-&epsilon; is activated by overexpressing the constitutively active PKC-&epsilon; mutant. PKC-&epsilon; is inhibited by overexpressing the inactive mutant of PKC-&epsilon;. Mitochondrial function is assessed by examining respiration, integrity of the respiratory chain, activities of respiratory complexes and F0F1-ATPase, ATP production rate, and ATP content. Respiration is assessed in digitonin-permeabilized RPTC as state 3 (maximum respiration in the presence of excess substrates and ADP) and uncoupled respirations. Integrity of the respiratory chain is assessed by measuring activities of all four complexes of the respiratory chain in isolated mitochondria. Capacity of oxidative phosphorylation is evaluated by measuring the mitochondrial membrane potential, ATP production rate, and activity of F0F1-ATPase. Energy status of RPTC is assessed by determining the intracellular ATP content. Mitochondrial morphology in live cells is visualized using MitoTracker Red 580, a fluorescent dye that specifically accumulates in mitochondria, and live monolayers are examined under a fluorescent microscope. RPTC viability is assessed using annexin V/propidium iodide staining followed by flow cytometry to determine apoptosis and oncosis.
These methods allow for a selective activation/inhibition of individual PKC isozymes to assess their role in cellular functions in a variety of physiological and pathological conditions that can be reproduced in in vitro.

The effects of activation of protein kinase C (PKC) isozymes on mitochondrial functions associated with respiration and oxidative phosphorylation and on cell viability are described. The approach adapts adenoviral technique to selectively overexpress PKC isozymes in primary cell culture and a variety of assays to determine mitochondrial functions and energy status of the cell.

腎細胞内のミトコンドリアの機能と細胞生存率の評価を過剰発現するプロテインキナーゼCアイソザイム

The protein kinase C (PKC) family of isozymes is involved in numerous physiological and pathological processes. Our recent data demonstrate that PKC ...

Combined Immunofluorescence and DNA FISH on 3D-preserved Interphase Nuclei to Study Changes in 3D Nuclear Organization

Fluorescent in situ hybridization using DNA probes on 3-dimensionally preserved nuclei followed by 3D confocal microscopy (3D DNA FISH) represents the most direct way to visualize the location of gene loci, chromosomal sub-regions or entire territories in individual cells. This type of analysis provides insight into the global architecture of the nucleus as well as the behavior of specific genomic loci and regions within the nuclear space. Immunofluorescence, on the other hand, permits the detection of nuclear proteins (modified histones, histone variants and modifiers, transcription machinery and factors, nuclear sub-compartments, etc). The major challenge in combining immunofluorescence and 3D DNA FISH is, on the one hand to preserve the epitope detected by the antibody as well as the 3D architecture of the nucleus, and on the other hand, to allow the penetration of the DNA probe to detect gene loci or chromosome territories 1-5. Here we provide a protocol that combines visualization of chromatin modifications with genomic loci in 3D preserved nuclei.

Here we describe a protocol for simultaneous detection of histone modifications by immunofluorescence and DNA sequences by DNA FISH followed by 3D microscopy and analyses (3D immuno-DNA FISH).

3D原子力組織の変化を研究するために3D保存状態間期核に組み合わさ免疫やDNA FISH

Fluorescent in situ hybridization using DNA probes  on 3-dimensionally preserved nuclei followed by 3D confocal microscopy (3D DNA  FISH) represents the ...

A Method for Screening and Validation of Resistant Mutations Against Kinase Inhibitors

The discovery of BCR/ABL as a driver oncogene in chronic myeloid leukemia (CML) resulted in the development of Imatinib, which, in fact, demonstrated the potential of targeting the kinase in cancers by effectively treating the CML patients. This observation revolutionized drug development to target the oncogenic kinases implicated in various other malignancies, such as, EGFR, B-RAF, KIT and PDGFRs. However, one major drawback of anti-kinase therapies is the emergence of drug resistance mutations rendering the target to have reduced or lost affinity for the drug. Understanding the mechanisms employed by resistant variants not only helps in developing the next generation inhibitors but also gives impetus to clinical management using personalized medicine. We reported a retroviral vector based screening strategy to identify the spectrum of resistance conferring mutations in BCR/ABL, which has helped in developing the next generation BCR/ABL inhibitors. Using Ruxolitinib and JAK2 as a drug target pair, here we describe in vitro screening methods that utilizes the mouse BAF3 cells expressing the random mutation library of JAK2 kinase.

Emergence of genetic resistance against kinase inhibitor therapy poses significant challenge for effective cancer therapy. Identification and characterization of resistant mutations against a newly developed drug helps in better clinical management and next generation drug design. Here, we describe our protocol for in vitro screening and validation of resistant mutations.

キナーゼ阻害剤に対して耐性変異のスクリーニングおよび検証のための方法

The discovery of BCR/ABL as a driver oncogene in chronic myeloid leukemia (CML) resulted in the development of Imatinib, which, in fact, demonstrated the ...

A Cell Free Assay to Study Chromatin Decondensation at the End of Mitosis

During the vertebrate cell cycle chromatin undergoes extensive structural and functional changes. Upon mitotic entry, it massively condenses into rod shaped chromosomes which are moved individually by the mitotic spindle apparatus. Mitotic chromatin condensation yields chromosomes compacted fifty-fold denser as in interphase. During exit from mitosis, chromosomes have to re-establish their functional interphase state, which is enclosed by a nuclear envelope and is competent for replication and transcription. The decondensation process is morphologically well described, but in molecular terms poorly understood: We lack knowledge about the underlying molecular events and to a large extent the factors involved as well as their regulation. We describe here a cell-free system that faithfully recapitulates chromatin decondensation in vitro, based on mitotic chromatin clusters purified from synchronized HeLa cells and X. laevis egg extract. Our cell-free system provides an important tool for further molecular characterization of chromatin decondensation and its co-ordination with processes simultaneously occurring during mitotic exit such as nuclear envelope and pore complex re-assembly.

The molecular mechanisms of the decondensation of highly compacted mitotic chromatin are ill-defined. We present a cell-free assay based on mitotic chromatin clusters isolated from HeLa cells and Xenopus laevis egg extract that faithfully reconstitutes the decondensation process in vitro.

無細胞アッセイは、有糸分裂の終了時クロマチン脱凝縮を勉強します

During the vertebrate cell cycle chromatin undergoes extensive structural and functional changes. Upon mitotic entry, it massively condenses into rod ...

A Cell-Free Assay Using Xenopus laevis Embryo Extracts to Study Mechanisms of Nuclear Size Regulation

A fundamental question in cell biology is how cell and organelle sizes are regulated. It has long been recognized that the size of the nucleus generally scales with the size of the cell, notably during embryogenesis when dramatic reductions in both cell and nuclear sizes occur. Mechanisms of nuclear size regulation are largely unknown and may be relevant to cancer where altered nuclear size is a key diagnostic and prognostic parameter. In vivo approaches to identifying nuclear size regulators are complicated by the essential and complex nature of nuclear function. The in vitro approach described here to study nuclear size control takes advantage of the normal reductions in nuclear size that occur during Xenopus laevis development. First, nuclei are assembled in X. laevis egg extract. Then, these nuclei are isolated and resuspended in cytoplasm from late stage embryos. After a 30 - 90 min incubation period, nuclear surface area decreases by 20 - 60%, providing a useful assay to identify cytoplasmic components present in late stage embryos that contribute to developmental nuclear size scaling. A major advantage of this approach is the relative facility with which the egg and embryo extracts can be biochemically manipulated, allowing for the identification of novel proteins and activities that regulate nuclear size. As with any in vitro approach, validation of results in an in vivo system is important, and microinjection of X. laevis embryos is particularly appropriate for these studies.

A Cell-Free Assay Using Xenopus laevis Embryo Extracts to Study Mechanisms of Nuclear Size Regulation

Mechanisms of cellular and intra-cellular scaling remain elusive. The use of Xenopus embryo extracts has become increasingly common to elucidate mechanisms of organelle size regulation. This method describes embryo extract preparation and a novel nuclear scaling assay through which mechanisms of nuclear size regulation can be identified.

用いた無細胞アッセイ<em&gt;アフリカツメガエル</em&gt;胚は、核サイズの規制のメカニズムを研究するために抽出します

A fundamental question in cell biology is how cell and organelle sizes are regulated. It has long been recognized that the size of the nucleus generally ...