J ・ チュア、n. a. フィッシャー、d. DeShazer、午前フリードランダー原稿で説明する手順を設計されています。J ・ チュア、n. a. フィッシャー、標準偏差 Falcinelli + DeShazer は、実験を実行しました。J ・ チュアは、原稿を書いていた。
著者は、ジョシュア ・ J ・ w ・粕毛、ノラ + ドイル、ニコラス ・ r ・ カーターとスティーブン A. Tobery の優秀なテクニカル サポートとデビッド p. Fetterer、スティーブン j. カーン統計分析のためにありがとうございます。
仕事によって、防衛脅威の減少代理店の提案 #CBCALL12-THRB1-1-0270 A.M.F と #CBS を受けました。D.D. に MEDBIO.02.10.RD.034
意見、解釈、結論及び提言、これらの者を必ずしも米国軍隊によって支持されません。
この文書の内容が必ずしも反映しないビューまたは国防省の政策も言及されている商号、商品、または組織は、米国政府によって裏書を意味します。

1. 歯擦音のゴキブリのコロニーを維持するための準備
<ol><li>住んでいるゴキブリをしっと叱るのケージを準備します。ケージから出して登山とエスケープからゴキブリをしっと叱るようにケージの上部にある内側の壁のまわりに石油ゼリー、幅で約 20 ~ 30 mm の薄い層を適用されます。 注: ゴキブリをしっと叱るは、様々 な大きな設置スペース、十分な高さのと蓋のある容器に保管できます。マウスのケージを使用して (~ 43 cm × 23 cm × 20 cm)。37 ° C に向けられたケージ、ワセリンは適用されません。</li>
	<li>自然内気な昆虫のための隠れ場所を提供するためにケージ内上下逆さまに配置段ボールの卵のカートンを含めます。発泡スチロールをプラスチックの摂取を防ぐために作ったものと段ボールの卵のカートンを代用しないでください。</li>
	<li>簡単にクリーンアップと孵化幼虫の可視性を高めるには、寝具を提供しません。</li>
	<li>〜 20% の粗蛋白質の組成を含む乾燥したドッグフードを取得します。粗く挽くフードプロセッサーやミキサーでドッグフードと 4 ° C で保存</li>
	<li>いくつかの浅い料理と水族館石や食料や水をスポンジを取得します。 注: ペトリ皿、recommeded。</li>
</ol>2. 歯擦音のゴキブリ繁殖と飼育
<ol><li>商業ブリーダーから (〜 5 cm) ゴキブリをしっと叱るザイモグラムのマダガスカルを取得します。このプロトコルで使用される種はGromphadorhina ホウライカガミです。受け取り後すぐに歯擦音のゴキブリを含む配送ボックスを展開します。</li>
	<li>動物の処理に個人用保護具の使用のための適切な制度的ガイドラインに従います。 注: は、歯擦音のゴキブリの瞼板の爪が鋭いようにゴキブリを処理するため厚い使い捨て手袋を使用します。</li>
	<li>最大 75 大きなゴキブリをしっと叱るを転送 (> 3 cm) 大きいケージごと。新しく孵化し、小さい幼虫を転送 (< 3 cm) 別々 のケージに。 注: は、大幅に上回る 75 を大きいのままに保つマウス ケージごとゴキブリ植民地の健康悪化につながることができるし、死につながる場合も音が聞こえます。</li>
	<li>軽く色、オフホワイトである新しく molted ゴキブリを処理し、それを圧迫を避けます。また、暗くして処理する前に強化外骨格を許可します。 注: ダニ、ブリーダーから受領ゴキブリをしっと叱ることが多いGromphadorholaelaps schaeferiを削除する必要はありません。有益なダニは歯擦音のゴキブリを清潔に保つ、人間には無害です。</li>
	<li>週に一度か二度地面浅い皿に乾燥したドッグフードとゴキブリをしっと叱るをフィードします。ゴキブリをしっと叱るが、次の授乳まで十分な食糧をあることを確認十分なドッグフードを提供します。ウェットとカビとなっている食品を破棄します。</li>
	<li>ドッグフードだけでなくカットされた果物や野菜、リンゴ、ジャガイモ、または浅い皿にレタスなどを提供します。カビや腐った食品を破棄します。</li>
	<li>浅い皿に水を飲んで一週間に一度か二度を提供するが、檻の中の流出を防ぐために皿を入れすぎないではないか。小型のニンフの着陸パッドを提供する料理に小さな水族館石やスポンジを配置します。利用可能な場合は、逆浸透膜水を使用します。</li>
	<li>21 ° C から 30 ° c. まで温度で暗闇の中でゴキブリをしっと叱るを維持大型のゴキブリをしっと叱る宛てで繁殖や妊娠を減らすため 〜 2 ヶ月間低温 (~ 21 ° C) で実験をしてください。対照的に、成長を早めるために高温 (28 ° C ~ 30 ° C) で幼虫を保ちます。 注: キャビネット部屋の温度 (21 ° C)、暗闇の中でケージを維持します。</li>
	<li>ゴキブリはインキュベーターになって音が聞こえる場合、水の別の鍋を含むによって湿度を提供します。</li>
	<li>ケージをきれいには、定期的に、または転送することによってヒスノイズきれいなケージにゴキブリすべて 2 〜 3 週間乾燥糞便をすくいします。ケージの下部を乾燥させておきます。余分な水分が蓄積し、ケージの下に排泄物とミックスする許可されている場合は、すぐにケージをきれい。</li>
</ol>3. ゴキブリ実験に備えて
<ol><li>37 ° C 加湿インキュベーター順化実験前に 1 〜 3 週間ケージでゴキブリをしっと叱るの適切な番号に転送します。インジェクションの制御グループが含まれます。この馴化期間は、実験中に温度ショックを避けるために重要です。</li>
	<li>宛てで 37 ° C 高い温度溶けるゼリーのでケージに石油ゼリーを適用されません。</li>
	<li>食料と水を交換し、ケージをきれいにゴキブリをしっと叱るすべての 1 〜 2 日間を確認します。</li>
	<li>実験中にゴキブリをしっと叱るをグループ化するための蓋付き透明な使い捨てのプラスチック食糧容器を取得します。換気、蓋や釘を使ってコンテナーの側面の穴をパンチ、ハンマーします。 注: スナップをスクリュー キャップの容器を使用キャップ バイオ セーフティ レベル 3 の設定内のコンテナーです。スナップ キャップ容器は、必要に応じてテープで補強することができます。</li>
	<li>注射の日、男女均等を確保するコンテナーごとにグループに 6 に 12 順応歯擦音のゴキブリを配布し、体重します。</li>
	<li>ゴキブリをしっと叱る個々 の性別を決定します。男性と女性の不足は、角の隆起によって性別を決定します。</li>
	<li>個々 の歯擦音のゴキブリの重量を量る。バランスの歯擦音のゴキブリの計量を容易にするには、tared された 2 つの重量を量るボートで囲みます。 注: 実験間の一貫性を保つのためには、4 に 8 g の重量を持つゴキブリをしっと叱るを使用します。しかし、感染後の生存率の差はありません小 (1.5 に 2 g) と大 (6 に 8 g) ゴキブリをしっと叱る。創薬研究、ゴキブリをしっと叱る ~ 5 g の重量とを取得する体当たりより一貫性のある薬物濃度質量。</li>
	<li>水皿の代わりに高水内容フルーツまたは野菜、リンゴやジャガイモのスライスなどがあります。腐った食べ物を破棄します。コンテナーを乾いた状態に保つ付加的な水を提供しません。</li>
	<li>注射までゴキブリをしっと叱るを 37 ° C に戻る。</li>
</ol>4. 細菌培養と準備
注: このプロトコルで使用される細菌種は、 B. thailandensis、B. pseudomallei B. 疽。クラス ii B. 疽とB. pseudomalleiのすべての操作を行う必要があります。 または 3 実験室バイオ セーフティ レベル (BSL) に位置するクラス III 生物学的安全キャビネット。操作b. thailandensisと同様の生物学的安全キャビネットある BSL2 または BSL3 研究室のいずれか。BSL3 仕事のため制度の標準運用手順に従います。細菌を処理するとき個人用保護具の使用のための制度のガイドラインに従ってください。
<ol><li>感染する前に、少なくとも 3 日細菌病菌のマスター プレートを準備します。ルリア-ベルターニカミラ (レノックス) (LB) を使用して、 B. pseudomalleiまたはB. thailandensisの寒天とB. 疽の 4% のグリセロールを添加使用 LB 寒天培。-80 ° C で保存されている 25% グリセロール ストックから連勝細菌 注: は常に冷凍のグリセロール ストック; から直接マスター プレートを連勝します。細菌の継を避けるためプレートにプレートからこれは減らされた毒性を引き起こす可能性があります。</li>
	<li>マスター プレートからB. pseudomalleiまたはB. thailandensisの何人かのコロニーを 10 〜 20 mL LB スープを接種します。B. 疽の 4% のグリセロールを添加した流体培養基 LB を同様に接種します。</li>
	<li>37 ° C 〜 18 時間で 175 に 250 rpm でスープ文化を振る。</li>
	<li>10 分間 5,000 × g で文化の 3 に 2 mL を遠心します。</li>
	<li>上澄みを廃棄し、滅菌リン酸緩衝生理食塩水 (PBS、137 mM NaCl、2.7 mM KCl、10 mM Na2PO4、1.8 mM KH2PO4、pH 7.4) の細菌のペレットを再懸濁します。</li>
	<li>0.5, 600 で吸光度で測定の光学濃度 (OD) を達成するために PBS で細菌を希釈 nm の分光光度計です。</li>
	<li>直列細菌開始外径 0.5 から 10 倍の PBS で希釈します。感染症のこれらの懸濁液を使用します。</li>
	<li>シリアル希釈による接種の単位 (CFU) を形成し、寒天培地上に 100 μ L の因数のめっきの植民地を決定します。24 〜 48 時間の 37 ° C でプレートを孵化させなさい。</li>
</ol>5. 医薬品製剤
<ol><li>体ごとに与えられる薬の適切な量を決定するマス。歯擦音のゴキブリに CLQ 投与は 50 mg/kg である哺乳類、標準投与量に基づいていた日。</li>
	<li>再懸濁します。 または車両に関心の薬を薄めます。たとえば、12 mg/mL の濃度で PBS における CLQ を希釈します。この濃度は 25 μ L でゴキブリがボリュームを注入音が聞こえる 〜 6 g に薬物の 300 μ g を提供します。</li>
	<li>必要に応じて、薬液滅菌 0.22 μ m シリンジ フィルターを通過します。</li>
	<li>使用するまで 4 ° C で薬液を格納します。少なくとも 21 ° C (常温) 注射前に薬液を温めます。</li>
</ol>6. インジェクターのアセンブリ
<ol><li>反復的なピペットの調整ネジを回して音量 (25 μ L) へのポインターを設定します。</li>
	<li>反復的なピペットのリリース棒を内側にプッシュし、プッシャーを引き出します。繰り返しのピペットは、ロードされた注射器を収容する準備が整いました。 注: は、バランスで放出された水の量を測定することによって反復的なピペットによって放出されるボリュームを調整します。</li>
	<li>細菌や薬物を含む懸濁液 1 mL 注射器を入力します。</li>
	<li>注射器を付ける滅菌 26 または 27 G x 1/2 インチ (または短い) 針。</li>
	<li>トップに気泡をフロートし、10% の漂白剤を入れた容器に泡といくつかの懸濁液を排出する注射器をタップします。</li>
	<li>上向き針ベベルと反復的なピペットのシリンジ クリップにシリンジをスナップします。</li>
	<li>リリース棒を外側に引っ張って、ディスペンサー ボタンでしっかりとシリンジのプランジャーがプッシャーに対してまで 10% の漂白剤を入れた容器に空の注射を実行するを押します。</li>
	<li>1 または 2 追加空白の注射液は注射器から排出されることを確認するを実行します。反復的なピペットは注射の準備ができて。</li>
</ol>7. ゴキブリ注射
<ol><li>クラス II、クラス III 生物学的安全キャビネット、BSL2 のすべてのゴキブリの注射を行ったり、BSL3 設定使用制度個人用保護具をお勧め。</li>
	<li>ゴキブリをしっと叱ると接触するキャビネットの安全でクリーンな作業面。70% エタノールに続いて 10% の漂白剤を使用すると、残留漂白剤を削除できます。ように、表面の空気が乾燥。</li>
	<li>片方の手でその側で歯擦音のゴキブリをグリップします。注入中に反跳することがその歯擦音のゴキブリを固定します。腹部の terga 間皮膚膜を露出するよう歯擦音のゴキブリを若干曲げます。</li>
	<li>もう片方の手には、針が 0 ° 30 ° の角度に歯擦音のゴキブリの背腹側正中線から繰り返しのピペットなどを保持します。後端から 3rd、4thや 5th tergum に隣接する皮膚膜を穿刺します。 注: 示された角度で歯擦音のゴキブリに針のエントリにより針はなく通過し、歯擦音のゴキブリを終了します。注射部位は、放出された物質が体液でいっぱい腹部キャビティの内で含まれていることを確認します。歯擦音のゴキブリを押しながら事業生きたバクテリア、あるいは薬物を注射する前に水を注入することを練習します。</li>
	<li>しっかりとボリュームを注入する調剤ボタンを押します。優しくエントリの使用と同じ角度で針を撤回します。</li>
	<li>まだ注入されていない歯擦音のゴキブリから区別するために別の容器に注入された歯擦音のゴキブリを配置します。注射部位から滲んでいるが可能性がありますすべての体液をふき取りなさい。</li>
	<li>同じ注射器と針を使用してグループ内で他のゴキブリをしっと叱るを注入することを続行します。注射シリンジのプランジャーは最後の注射では不完全な投与を防ぐためにバレルの底に到達する前に停止します。</li>
	<li>単一歯擦音のゴキブリ、これらの細菌と薬などで複数の注射の歯擦音のゴキブリの背側に tergum の別の側面に挿入します。また、異なる terga (3rd 5th) に注入することで複数の注射を行います。</li>
	<li>容器の蓋をしっかりと閉じを確認します。必要に応じて、テープで蓋を強化します。</li>
	<li>加湿の 37 ° C の定温器でゴキブリをしっと叱る孵化させなさい。</li>
</ol>8. ヒスノイズ ゴキブリの罹患率や死亡率の記録
<ol><li>個人用保護具を推奨クラス II、クラス III 生物学的安全キャビネット制度ですべての歯擦音ゴキブリ検査を実行します。70% エタノールに続いて 10% 漂白剤できれいな安全キャビネットの表面。乾燥空気を作業領域として使用できます。</li>
	<li>罹患率の表 (表 1) の得点を使用して 1-2 週間の期間にわたって毎日歯擦音のゴキブリを一度か二度のスコアします。</li>
	<li>死んでいる歯擦音のゴキブリをコンテナーから削除し、生存者の数を記録します。</li>
	<li>残りのライブ コンテナーの下部に余分な水分が蓄積してきた場合は、清潔な容器にゴキブリをしっと叱るを転送します。また、使い捨てのペーパー タオルを使用して余分な水分をふき取る。</li>
	<li>腐った食べ物は毎日、加湿の 37 ° C の定温器にゴキブリをしっと叱る戻り値を交換してください。</li>
	<li>研究の終わりに、バイオハザード バッグの残りの生存者を置き、安楽死-80 ° C で凍結します。</li>
	<li>データ14 LD50を決定するための統計的な分析、生存のためのカプラン ・ マイヤーとログ ランク分析。同様にすべての昆虫実験対照群のいくつかの死亡があります。これらの死の昆虫15の自然死亡率に起因しています。対照群の死亡口座についての詳細について、参照15を参照してください。</li>
</ol>

<ol>
	<li>Sifri, C. D., Ausubel, F. M., Boquet, P., Cossart, P., Normark, S., Rappuoli, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Cellular Microbiology. , 543-563 (2004).</li><li>Silcock, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Is+your+experiment+really+necessary?.">Is your experiment really necessary?.</a> New Sci. 134 (1817), 32-34 (1992).</li><li>Muller, U., Vogel, P., Alber, G., Schaub, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+innate+immune+system+of+mammals+and+insects.">The innate immune system of mammals and insects.</a> Contrib Microbiol. 15, 21-44 (2008).</li><li>Lavine, M. D., Strand, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insect+hemocytes+and+their+role+in+immunity.">Insect hemocytes and their role in immunity.</a> Insect Biochem Mol Biol. 32 (10), 1295-1309 (2002).</li><li>Bergin, D., Reeves, E. P., Renwick, J., Wientjes, F. B., Kavanagh, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Superoxide+production+in+Galleria+mellonella+hemocytes:+identification+of+proteins+homologous+to+the+NADPH+oxidase+complex+of+human+neutrophils.">Superoxide production in Galleria mellonella hemocytes: identification of proteins homologous to the NADPH oxidase complex of human neutrophils.</a> Infect Immun. 73 (7), 4161-4170 (2005).</li><li>Browne, N., Heelan, M., Kavanagh, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+analysis+of+the+structural+and+functional+similarities+of+insect+hemocytes+and+mammalian+phagocytes.">An analysis of the structural and functional similarities of insect hemocytes and mammalian phagocytes.</a> Virulence. 4 (7), 597-603 (2013).</li><li>Lemaitre, B., Hoffmann, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+host+defense+of+Drosophila+melanogaster.">The host defense of Drosophila melanogaster.</a> Annu Rev Immunol. 25, 697-743 (2007).</li><li>Mulder, P. G., Shufran, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Madagascar+hissing+cockroaches,+information+and+care.">Madagascar hissing cockroaches, information and care.</a> Oklahoma Cooperative Extension Service Leaflet L-278. , 4 (2016).</li><li>Nelson, M. C., Fraser, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sound+production+in+the+cockroach,+Gromphadorhina+portentosa:+Evidence+for+communication+by+hissing.">Sound production in the cockroach, Gromphadorhina portentosa: Evidence for communication by hissing.</a> Behav Ecol Sociobiol. 6 (4), 305-314 (1980).</li><li>Chua, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=pH+Alkalinization+by+Chloroquine+Suppresses+Pathogenic+Burkholderia+Type+6+Secretion+System+1+and+Multinucleated+Giant+Cells.">pH Alkalinization by Chloroquine Suppresses Pathogenic Burkholderia Type 6 Secretion System 1 and Multinucleated Giant Cells.</a> Infect Immun. 85 (1), e0058616 (2017).</li><li>Fisher, N. A., Ribot, W. J., Applefeld, W., DeShazer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Madagascar+hissing+cockroach+as+a+novel+surrogate+host+for+Burkholderia+pseudomallei,+B.+mallei+and+B.+thailandensis.">The Madagascar hissing cockroach as a novel surrogate host for Burkholderia pseudomallei, B. mallei and B. thailandensis.</a> BMC Microbiol. 12, 117 (2012).</li><li>Haraga, A., West, T. E., Brittnacher, M. J., Skerrett, S. J., Miller, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Burkholderia+thailandensis+as+a+model+system+for+the+study+of+the+virulence-associated+type+III+secretion+system+of+Burkholderia+pseudomallei.">Burkholderia thailandensis as a model system for the study of the virulence-associated type III secretion system of Burkholderia pseudomallei.</a> Infect Immun. 76 (11), 5402-5411 (2008).</li><li>West, T. E., Frevert, C. W., Liggitt, H. D., Skerrett, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhalation+of+Burkholderia+thailandensis+results+in+lethal+necrotizing+pneumonia+in+mice:+a+surrogate+model+for+pneumonic+melioidosis.">Inhalation of Burkholderia thailandensis results in lethal necrotizing pneumonia in mice: a surrogate model for pneumonic melioidosis.</a> Trans R Soc Trop Med Hyg. 102 Suppl 1, S119-S126 (2008).</li><li>Finney, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Probit Analysis. , (1971).</li><li>Abbott, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+of+computing+the+effectiveness+of+an+insecticide.">A method of computing the effectiveness of an insecticide.</a> J Am Mosq Control Assoc. 3 (2), 302-303 (1987).</li><li>Schell, M. A., Lipscomb, L., DeShazer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+genomics+and+an+insect+model+rapidly+identify+novel+virulence+genes+of+Burkholderia+mallei.">Comparative genomics and an insect model rapidly identify novel virulence genes of Burkholderia mallei.</a> J Bacteriol. 190 (7), 2306-2313 (2008).</li><li>Wand, M. E., Muller, C. M., Titball, R. W., Michell, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+and+Galleria+mellonella+infection+models+reflect+the+virulence+of+naturally+occurring+isolates+of+B.+pseudomallei,+B.+thailandensis+and+B.+oklahomensis.">Macrophage and Galleria mellonella infection models reflect the virulence of naturally occurring isolates of B. pseudomallei, B. thailandensis and B. oklahomensis.</a> BMC Microbiol. 11 (1), 11 (2011).</li><li>Pilatova, M., Dionne, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Burkholderia+thailandensis+is+virulent+in+Drosophila+melanogaster.">Burkholderia thailandensis is virulent in Drosophila melanogaster.</a> PLoS One. 7 (11), e49745 (2012).</li><li>Ramarao, N., Nielsen-Leroux, C., Lereclus, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+insect+Galleria+mellonella+as+a+powerful+infection+model+to+investigate+bacterial+pathogenesis.">The insect Galleria mellonella as a powerful infection model to investigate bacterial pathogenesis.</a> J Vis Exp. (70), e4392 (2012).</li><li>Eklund, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+orange+spotted+cockroach+(Blaptica+dubia,+Serville+1839)+is+a+permissive+experimental+host+for+Francisella+tularensis.">The orange spotted cockroach (Blaptica dubia, Serville 1839) is a permissive experimental host for Francisella tularensis.</a> PeerJ Preprints. 4, e1524v1522 (2016).</li></ol>

著者が明らかに何もありません。

最適な実験条件は最小限の一貫性のある時間のコミットメントが必要です健康の歯擦音のゴキブリ コロニーで始まります。比較的長い間行くことができるゴキブリをしっと叱る (~ 週間) 食料と水、なし毎週または隔週のケージのメンテナンスを提供する必要があります。これは、食料と水の供給をチェックし、ケージの乾燥を確実に含まれます。順化と; 高温孵化の間に特に重要です乾燥の生きている条件を維持します。我々 はより歯擦音のゴキブリが死ぬことを見つけるとコンテナーが毎日掃除しないとき高温に速い速度で。
一貫性のある投薬や歯擦音のゴキブリの接種にキーしっかりと反復的なピペットのディスペンサー ボタンを押すことです。このテクニックの練習、反復的なピペットにシリンジの読み込みおよび空白注射を実行することをお勧めします。技術に新しい演算子プロシージャの最も時間のかかるステップが保持または射出時歯擦音のゴキブリを固定します。したがって、保持とより野心的なプロジェクトに取り組む前に複数の歯擦音のゴキブリを注入のテクニックを練習しても強くお勧めします。これは、注射に専ら使用される歯擦音のゴキブリの小さいグループを維持することによって実現できます。ゴキブリをしっと叱る持株 (例えば滑らかな曲面上の歯擦音のゴキブリを固定; ヒスノイズ止まったその側、他手法の歯擦音のゴキブリを保持しているときに、注射を迅速行うことことがわかったが中指人差し指と親指固定中にゴキブリ) は好まれるかもしれないし、異なる事業者が検討する必要があります。
歯擦音のゴキブリ モデルを使用と動物モデルとして使用されている、その他昆虫モデル (例えばワックス ワーム幼虫ハチミツガとミバエショウジョウバエ) 上のいくつかの利点を提供します。病菌感染16,17,18。たとえば、歯擦音のゴキブリの実験的ウィンドウから範囲ヶ月年研究者、柔軟性ワックス ワーム幼虫はわずか 5 日間19,20に対し。ワックス ワーム幼虫 5 日間も繭の箱詰めと一致します。繭の除去は、幼虫20物理的な外傷を引き起こす可能性のある労働集約的なプロセスです。もっと重要なは、両方で減衰B. thailandensis T6SS 1 変異シリアのハムスターと歯擦音のゴキブリの11はガレリアガレリアの調査のためのよいモデルではないことを示唆しているでB. thailandensis (データは示されていない) で T6SS などのいくつかの変異。
歯擦音のゴキブリの使用は、フルーツ フライ上のいくつかの利点を示します。歯擦音のゴキブリは大きいと注射時に簡単に処理することができますタフな外骨格を持つ実質的な体重です。対照的に、フルーツ フライは小さく、接種のため特殊な装置が必要です。また、歯擦音のゴキブリは自然に類似している温度で生活や人間の体温を超える、フルーツ フライの最適温度は 22 に 28 ° c勉強 (多核巨細胞形成細菌病菌 10) など人間の体温に依存しているプロセスのコンテキストの限定的な使用のフルーツ フライになります。
ゴキブリをしっと叱るの使用にいくつかの欠点が存在します。同様、歯擦音のゴキブリの遺伝学はショウジョウバエかもガレリアのものとして研究いません。歯擦音のゴキブリには、実質的な「嫌なもの」または総要素もあります。ただし、歯擦音のゴキブリは、種に固有の研究での使用に明確な利点を提供することにより細菌病菌の魅力的で現実的な代理ホストを残ります。私たちイラストがマダガスカル ゴキブリは病菌の扱いやすい代理ホストのヒスノイズ、それは非常に可能性が高いが他の細菌の病原体のための代理ホストとしても使えます、我々 は現在そのような研究で it を活用しました。

昆虫病原細菌と自然免疫生体防御研究するため代替の非哺乳類動物モデルとしての使用は、近年勢いを得ています。ロジスティック、これは、比較的安価なコストと取得、処理、および哺乳類に比べて昆虫の世話のしやすさのためです。規制政策研究に昆虫の使用を支配するがもないです。範囲対象ではありませんまたは任意の動物によって定められた制限使用委員会や政府機関。サロゲートの動物モデルとして昆虫、特に病原因子、ホスト病原体の相互作用、および抗微生物薬の効果の評価のための包括的なスクリーニングの調査に。その使用はそれにより動物実験1,2の行為に内在する倫理的なジレンマのいくつかを克服する研究に使用される哺乳類の数を減らすことができます。
昆虫は、昆虫と哺乳類の1、3の生来の免疫システム間の共通性の高度があるため代理ホストとして役立つかもしれない。Plasmatocytes 昆虫と哺乳類のマクロファージは貪食微生物4です。好中球に昆虫相手は血球5,6です。昆虫および哺乳類細胞における細胞内オキシダティブ バースト経路が似ています。両方の活性酸素種は、オーソログ p47phoxと p67phox蛋白質5によって生成されます。フリー ダイヤル昆虫や Toll 様受容体受容体と哺乳類におけるインターロイキン-1 の下流シグナル伝達カスケードも非常に似ています。7ディフェンシンなどの抗菌ペプチドの生産の両方の結果します。このように、昆虫は後生動物によって共有される一般の生得的な免疫機構を研究対象に利用できます。
属Gromphadorhinaからゴキブリをヒス マダガスカルと呼ばれる昆虫は、存在する場合、通常満期 5 ~ 8 cm に達する最大のゴキブリの種のひとつです。マダガスカル島にのみネイティブ、歯擦音のゴキブリは8気門と呼ばれる呼吸器系の開口部から空気を追放するとき生じる音それが作る - シューという音によって特徴付けられます。独特のヒスノイズは求愛と侵略の9のゴキブリをしっと叱る間社会的なコミュニケーションの形として機能し、男性はその生息地で妨げられたときに聞くことができます。マダガスカルの音を立てるゴキブリは、アメリカのゴキブリと他都市害虫種に比べてゆっくり動くが。及び繁殖; 簡単です。妊娠中の歯擦音のゴキブリは、一度に 20 に 30 子孫を生成できます。5 ヶ月で性的に成熟に達する、ニンフと呼ばれるゴキブリ ヒス赤ちゃん後に 6 回の脱皮を受けているし、5 歳生きることができます野生と飼育下8の両方。
マダガスカル活用して病菌疽、B. pseudomallei、細胞内の病原体に感染し、 B. thailandensis 10、11.の代理ホストとしてゴキブリをヒスゴキブリをしっと叱るでこれらの病原体の病原性細菌病菌、シリアのハムスターのベンチマーク モデル動物に病原性を示したに比べていた。B. pseudomalleiとB. 疽の 50% 致死量 (LD50) 両方モデル11に類似していたことがわかった。興味深いことに、 B. thailandensis齧歯動物モデルにおける非病原性は歯擦音のゴキブリ11致命的です。B. thailandensis感染に関してこの違い歯擦音のゴキブリ モデルの有用性を強調します。B. thailandensis変異体の減衰は、齧歯動物モデルでより歯擦音のゴキブリでより容易に解決できます。さらに、 B. thailandensisとして使用され多くの場合B. pseudomallei B. 疽 10,12,13, それの減衰の突然変異を識別するためのモデル生物でした。その劇毒性の親戚に同じような目標に します。
B. 疽に減衰するB. thailandensisシリアのハムスターと歯擦音のゴキブリでの病原性の違い、6 型分泌システム-1 (T6SS-1) などの重要な病原因子の変異にもかかわらず、B. pseudomalleiが B. thailandensis 11同様に減衰します。さらに、歯擦音のゴキブリ モデルを検証すると、個別 T6SS 突然変異体 (T6SS-2 T6SS 6) B. pseudomallei、シリアンハム スターにおける病原性のベアリングを持たない、残る歯擦音のゴキブリ11病原性という点で。したがって、歯擦音のゴキブリは 3細菌病菌の種の実行可能な代理の動物モデルであります。我々 は最近、病菌感染10とその毒性に対する抗マラリア薬クロロキン (CLQ) の有効性を検証するサロゲートの動物モデルとして歯擦音のゴキブリを利用しました。
ここでは、マダガスカルのケアと育児について述べるゴキブリをヒスと病菌の 3 種でこの昆虫に感染する方法について詳細に説明します。さらに、我々 は歯擦音のゴキブリは病原性細菌病菌の感染症で薬の有効性と、それ可能性が高いとしても同様の研究で他の細菌の病原体の代理ホストを勉強するサロゲート実行可能なモデルを示しています。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Madagascar hissing cockroach 
			&#160;&#160; 
			&#160; 
			&#160; 
			&#160;</td>
			<td>Carolina Biological Supply Co, Burlington, NC&#160;</td>
			<td>143668</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kibbles n Bits, any flavor</td>
			<td>Big Heart Pet Brands, San Francisco, CA</td>
			<td>UPC #079100519378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Snap on disposable plastic containers or equivalent</td>
			<td>Rubbermaid, Huntersville, NC</td>
			<td>UPC #FG7F71RETCHIL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screw on disposable plastic containers or equivalent</td>
			<td>Rubbermaid, Huntersville, NC</td>
			<td>UPC #FG7J0000TCHIL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tridak STEPPER series repetitive pipette</td>
			<td>Dymax Corporation 
			www.dymax.com</td>
			<td>T15469</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe (1 mL)&#160;</td>
			<td>Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ</td>
			<td>309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle (26 or 27G x 1/2)</td>
			<td>Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ</td>
			<td>305109, 305111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroquine diphosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td>C6628</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline</td>
			<td>Gibco/ Thermo Fisher Scientific, Gaithersburg, MD</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Difco Luria- Bertani (Lennox)</td>
			<td>Becton Dickinson, Sparks, MD</td>
			<td>240230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td>A1296</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td>G6279</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the madagascar hissing cockroach as an alternative non-mammalian animal model to investigate virulence, pathogenesis, and drug efficacy

自然免疫の多くの側面は、哺乳類と昆虫の間保存されます。昆虫、 Gromphadorhina、属からゴキブリをヒス マダガスカルは、病原性、宿主-病原体相互作用、生得の免疫反応および薬の有効性の研究のための代替動物モデルとして利用できます。子育てに関する詳細は、歯擦音のゴキブリの繁殖と飼育が提供されます。またどのようにそれは細胞内病原体B. thailandensis、B. pseudomallei 病菌疽などの細菌に感染することを示す.歯擦音のゴキブリの使用は高価ではない、研究における哺乳類の使用規制問題を克服します。さらに、歯擦音のゴキブリ モデルを使用して検索結果、再現性と哺乳類モデルを用いて得られたもののようです。したがって、マダガスカルの歯擦音のゴキブリは、動物実験を行う際に検討する必要があります魅力的なサロゲート ホストを表します。

このセクションは、マダガスカル ゴキブリをしっと叱るB. 疽、B. pseudomallei B. thailandensis; に感染していた場合に得られた結果を示しています。結果は細菌感染に対する薬物の効果、薬物の毒性病原性の勉強にこの昆虫が病菌の種の扱いやすい動物モデルであります。ゴキブリをしっと叱るよりは野生型B. pseudomallei K96243 親B. 疽に感染していたグループより弱毒変異株 (Δhcp1) に感染していたグループで生き残った SR1 またはB. thailandensis DW503 (図 1)。逆に、感染病原性変異体 (Δhcp2または Δhcp3) またはB. pseudomallei (図 1) と同様に、歯擦音のゴキブリが死亡しました。哺乳類の非病原性細菌病菌種、 B. thailandensis E264 そのアミノ配糖体の敏感な導関数 DW503 と感染を示す歯擦音のゴキブリ モデルは特にの突然変異の解明に適しています。B. thailandensis減衰 (図 2) に 。したがって、齧歯動物モデルよりもb. thailandensisの研究よりフィッティング動物モデルです。歯擦音のゴキブリを殺していない濃度または CLQ の複数の注射を増やすこれは薬物の毒性は歯擦音のゴキブリ モデル(図 3)でもテストすることができます示しています。さらに、図 4に CLQ のB. thailandensis感染に対する有効性を示します。ヒスノイズ ゴキブリ ケアや感染症の重要な側面は、図 5のとおりです。表 1は、実験中にゴキブリをしっと叱るの罹患率をスコアに使用できます。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56491/56491fig1.jpg"> 図 1:強毒株と弱毒注入後ゴキブリの生存をヒス細菌病菌. グループごと 8 歯擦音のゴキブリは細菌懸濁液の 25 μ L を注入しました。ゴキブリをしっと叱るは 5 日間、一日一回の生存のためにチェックされました。(A) Hissing ゴキブリが親B. 疽を注入した SR1 (空白の正方形) または (閉鎖正方形) Δhcp1変異 100 CFUs で。(B) Hissing ゴキブリが野生型B. pseudomallei K96243 を注入した (開いている四角形)、Δhcp1 (閉鎖正方形)、Δhcp2 (開いた三角形)、または Δhcp3 (白丸) 変異 10 CFUs。(C) Hissing ゴキブリが親B. thailandensisを注入した DW503 (空白の正方形) または 100 CFUs の Δhcp1変異体 (正方形は休業)。図参照11に掲載されたもの。<a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56491/56491fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56491/56491fig2.jpg"> 図 2: 濃度の増加の注射後のゴキブリの生存をヒスB. thailandensis LD 用50 定量.グループごと 8 歯擦音のゴキブリは野生型B. thailandensis E264 を注入した (A) またはアミノ配糖体の敏感な派生物 DW503 (B) と生存は 7 日間の得点だった。LD50が 3 CFUs E264 のと DW503 の 6 CFUs です。<a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56491/56491fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56491/56491fig3.jpg"> 図 3: クロロキンの注射後のゴキブリの生存をヒスします。グループごと 5 歯擦音のゴキブリを一度投与 (A) や 2 回 2 日連続で (B) 250 (ダイヤモンド)、500 (正方形) または 1,000 μ g (三角形) CLQ または PBS (円) と生存は 7 日間。<a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56491/56491fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56491/56491fig4.jpg"> 図 4:感染後のゴキブリの生存をヒスB. thailandensis ・とクロロキン。 治療10 に 12 グループごとゴキブリをしっと叱るB. thailandensis DW503 に感染していたとない扱われ (正方形)、 b. thailandensis DW503 に感染して、扱われて CLQ (三角形) CLQ だけ (ダイヤモンド) で治療された感染や放置 (円)。7 日間の生存率を記録しました。生存曲線、4 の別の実験の複合は、生存者の日に各治療の歯擦音のゴキブリの合計数で割った値の合計数に等しい割合表される示されます。CFU 接種を与え 20 LD5010 からであった。図参照10に掲載されたもの。<a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56491/56491fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56491/56491fig5.jpg"> 図 5:歯擦音のゴキブリ モデルに関連する画像。(A) A 女性の頭にゴキブリが欠けている突起をヒスします。(B) A 男性歯擦音のゴキブリは、角の存在によって識別できます。(C) A の歯擦音のゴキブリは、成長するその外骨格から脱皮する必要があります。新興の昆虫は色が白いが徐々 に暗くなり、新しい外骨格が硬化します。(D) 実験中に通気穴付きスナップ キャップ プラスチック製コンテナーに収容されるゴキブリをしっと叱る。(E) の下で BSL3 ゴキブリをしっと叱る条件に入ってネジ キャップ プラスチック容器です。(F) A マウスの大きなケージは、歯擦音のゴキブリのコロニーの家に使用されます。それは、食料、水、隠れの段ボールの卵のカートンを含める必要があります。(G) Hissing ゴキブリが繰り返しのピペットに添付 1 mL 注射器で注入されます。(H) A 歯擦音のゴキブリが腹部 terga 間皮膚の膜を通して注射による接種します。<a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56491/56491fig5large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>1</td>
			<td>ライブ、通常</td>
			<td>-積極的にモバイル -をつかみ、歯擦音のゴキブリを拾ったときに指を保持することができます。</td>
		</tr>
<tr>
<td>2</td>
			<td>ライブ、無気力</td>
			<td>-クロールを当てるときは不動</td>
		</tr>
<tr>
<td>3</td>
			<td>ライブ、瀕死</td>
			<td>-足に隠れて動かない -当てるときに移動しません。 -アンテナおよび/または足を当てるときに移動</td>
		</tr>
<tr>
<td>4</td>
			<td>死者</td>
			<td>-足に隠れて動かない -採用を働きかけ、アンテナは移動しません -採用を働きかけ、足は移動しません</td>
		</tr>
</tbody></table>表 1: ゴキブリ罹患率をスコアリング システムをヒスします。ゴキブリをしっと叱るのグループの全体的なスコアは、グループで最高のスコアで歯擦音のゴキブリに基づいています。

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The Madagascar Hissing Cockroach as an Alternative Non-mammalian Animal Model to Investigate Virulence, Pathogenesis, and Drug Efficacy

細菌の病原性、病態、薬物毒性、薬効、生得の免疫反応の研究を実施する、代替の非哺乳類動物モデルとしてゴキブリをヒス マダガスカルを利用するプロトコルを提案します。

病原性、病態、および薬の有効性を調査するため、代替の非哺乳類動物モデルとしてゴキブリをヒス マダガスカル

Many aspects of innate immunity are conserved between mammals and insects. An insect, the Madagascar hissing cockroach from the genus Gromphadorhina, can ...

the-madagascar-hissing-cockroach-as-an-alternative-non-mammalian

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

10.9K ビュー.  United States Army Medical Research Institute of Infectious Diseases. 細菌の病原性、病態、薬物毒性、薬効、生得の免疫反応の研究を実施する、代替の非哺乳類動物モデルとしてゴキブリをヒス マダガスカルを利用するプロトコルを提案します。

ビデオ: The Madagascar Hissing Cockroach as an Alternative Non-mammalian Animal Model to Investigate Virulence, Pathogenesis, and Drug Efficacy

In vitro Biofilm Formation in an 8-well Chamber Slide

The chronic nature of many diseases is attributed to the formation of bacterial biofilms which are recalcitrant to traditional antibiotic therapy. Biofilms are community-associated bacteria attached to a surface and encased in a matrix. The role of the extracellular matrix is multifaceted, including facilitating nutrient acquisition, and offers significant protection against environmental stresses (e.g. host immune responses). In an effort to acquire a better understanding as to how the bacteria within a biofilm respond to environmental stresses we have used a protocol wherein we visualize bacterial biofilms which have formed in an 8-well chamber slide. The biofilms were stained with the BacLight Live/Dead stain and examined using a confocal microscope to characterize the relative biofilm size, and structure under varying incubation conditions. Z-stack images were collected via confocal microscopy and analyzed by COMSTAT. This protocol can be used to help elucidate the mechanism and kinetics by which biofilms form, as well as identify components that are important to biofilm structure and stability.

In vitro Biofilm Formation in an 8-well Chamber Slide

This article describes the procedure for the formation and visualization of a bacterial biofilm grown within an 8-well chamber slide

8ウェルチャンバースライドを用いたin vitro のバイオフィルム形成における

The chronic nature of many diseases is attributed to the formation of bacterial biofilms which are recalcitrant to traditional antibiotic therapy. ...

免疫・感染学

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the initial and determining step of the pathogenesis. Although experimentally adhesion is mostly studied in static conditions adhesion actually takes place in the presence of flowing liquid. First encounters between bacteria and their host often occur at the mucosal level, mouth, lung, gut, eye, etc. where mucus flows along the surface of epithelial cells. Later in infection, pathogens occasionally access the blood circulation causing life-threatening illnesses such as septicemia, sepsis and meningitis. A defining feature of these infections is the ability of these pathogens to interact with endothelial cells in presence of circulating blood. The presence of flowing liquid, mucus or blood for instance, determines adhesion because it generates a mechanical force on the pathogen. To characterize the effect of flowing liquid one usually refers to the notion of shear stress, which is the tangential force exerted per unit area by a fluid moving near a stationary wall, expressed in dynes/cm2. Intensities of shear stress vary widely according to the different vessels type, size, organ, location etc. (0-100 dynes/cm2). Circulation in capillaries can reach very low shear stress values and even temporarily stop during periods ranging between a few seconds to several minutes 1. On the other end of the spectrum shear stress in arterioles can reach 100 dynes/cm2 2. The impact of shear stress on different biological processes has been clearly demonstrated as for instance during the interaction of leukocytes with the endothelium 3. To take into account this mechanical parameter in the process of bacterial adhesion we took advantage of an experimental procedure based on the use of a disposable flow chamber 4. Host cells are grown in the flow chamber and fluorescent bacteria are introduced in the flow controlled by a syringe pump. We initially focused our investigations on the bacterial pathogen Neisseria meningitidis, a Gram-negative bacterium responsible for septicemia and meningitis. The procedure described here allowed us to study the impact of shear stress on the ability of the bacteria to: adhere to cells 1, to proliferate on the cell surface 5and to detach to colonize new sites 6 (Figure 1). Complementary technical information can be found in reference 7. Shear stress values presented here were chosen based on our previous experience1 and to represent values found in the literature. The protocol should be applicable to a wide range of pathogens with specific adjustments depending on the objectives of the study.

During the infection process, a key step is the adhesion of pathogens with host cells. In most instances this adhesion step occurs in the presence of mechanical stress generated by flowing liquid. We describe a technique that introduces shear stress as an important parameter in the study of bacterial adhesion.

細菌付着の研究ではせん断応力を導入する

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

The Insect Galleria mellonella as a Powerful Infection Model to Investigate Bacterial Pathogenesis

The study of bacterial virulence often requires a suitable animal model. Mammalian models of infection are costly and may raise ethical issues. The use of insects as infection models provides a valuable alternative. Compared to other non-vertebrate model hosts such as nematodes, insects have a relatively advanced system of antimicrobial defenses and are thus more likely to produce information relevant to the mammalian infection process. Like mammals, insects possess a complex innate immune system1. Cells in the hemolymph are capable of phagocytosing or encapsulating microbial invaders, and humoral responses include the inducible production of lysozyme and small antibacterial peptides2,3. In addition, analogies are found between the epithelial cells of insect larval midguts and intestinal cells of mammalian digestive systems. Finally, several basic components essential for the bacterial infection process such as cell adhesion, resistance to antimicrobial peptides, tissue degradation and adaptation to oxidative stress are likely to be important in both insects and mammals1. Thus, insects are polyvalent tools for the identification and characterization of microbial virulence factors involved in mammalian infections.
Larvae of the greater wax moth Galleria mellonella have been shown to provide a useful insight into the pathogenesis of a wide range of microbial infections including mammalian fungal (Fusarium oxysporum, Aspergillus fumigatus, Candida albicans) and bacterial pathogens, such as Staphylococcus aureus, Proteus vulgaris, Serratia marcescens Pseudomonas aeruginosa, Listeria monocytogenes or Enterococcus faecalis4-7. Regardless of the bacterial species, results obtained with Galleria larvae infected by direct injection through the cuticle consistently correlate with those of similar mammalian studies: bacterial strains that are attenuated in mammalian models demonstrate lower virulence in Galleria, and strains causing severe human infections are also highly virulent in the Galleria model8-11. Oral infection of Galleria is much less used and additional compounds, like specific toxins, are needed to reach mortality.
G. mellonella larvae present several technical advantages: they are relatively large (last instar larvae before pupation are about 2 cm long and weight 250 mg), thus enabling the injection of defined doses of bacteria; they can be reared at various temperatures (20 &deg;C to 30 &deg;C) and infection studies can be conducted between 15 &deg;C to above 37 &deg;C12,13, allowing experiments that mimic a mammalian environment. In addition, insect rearing is easy and relatively cheap. Infection of the larvae allows monitoring bacterial virulence by several means, including calculation of LD5014, measurement of bacterial survival15,16 and examination of the infection process17. Here, we describe the rearing of the insects, covering all life stages of G. mellonella. We provide a detailed protocol of infection by two routes of inoculation: oral and intra haemocoelic. The bacterial model used in this protocol is Bacillus cereus, a Gram positive pathogen implicated in gastrointestinal as well as in other severe local or systemic opportunistic infections18,19.

The Insect Galleria mellonella as a Powerful Infection Model to Investigate Bacterial Pathogenesis

Oral and intra haemocolic infection of larvae of the greater wax moth Galleria mellonella is described. This insect can be used to study virulence factors of entomopathogenic as well as mammalian opportunistic bacteria. Rearing of the insects, methods of infection and examples of in vivo analysis are described.

昆虫<em&gt;ハチノスツヅリガ</em&gt;細菌性病因を調査するための強力な感染モデルとして

The study of bacterial virulence often requires a suitable animal model. Mammalian models of infection are costly and may raise ethical issues. The use of ...

Following in Real Time the Impact of Pneumococcal Virulence Factors in an Acute Mouse Pneumonia Model Using Bioluminescent Bacteria

Pneumonia is one of the major health care problems in developing and industrialized countries and is associated with considerable morbidity and mortality. Despite advances in knowledge of this illness, the availability of intensive care units (ICU), and the use of potent antimicrobial agents and effective vaccines, the mortality rates remain high1. Streptococcus pneumoniae is the leading pathogen of community-acquired pneumonia (CAP) and one of the most common causes of bacteremia in humans. This pathogen is equipped with an armamentarium of surface-exposed adhesins and virulence factors contributing to pneumonia and invasive pneumococcal disease (IPD). The assessment of the in vivo role of bacterial fitness or virulence factors is of utmost importance to unravel S. pneumoniae pathogenicity mechanisms. Murine models of pneumonia, bacteremia, and meningitis are being used to determine the impact of pneumococcal factors at different stages of the infection. Here we describe a protocol to monitor in real-time pneumococcal dissemination in mice after intranasal or intraperitoneal infections with bioluminescent bacteria. The results show the multiplication and dissemination of pneumococci in the lower respiratory tract and blood, which can be visualized and evaluated using an imaging system and the accompanying analysis software.

Streptococcus pneumoniae is the leading pathogen causing severe community-acquired pneumonia and responsible for over 2&#160;million deaths worldwide. The impact of bacterial factors implicated in fitness or virulence can be monitored in real-time in an acute mouse pneumonia or bacteremia model using bioluminescent bacteria.

生物発光細菌を使用してリアルタイムに急性肺炎のマウスモデルにおける肺炎球菌の毒性因子の影響を以下の

Pneumonia is one of the major health care problems in developing and industrialized countries and is associated with considerable morbidity and mortality. ...

The Mesenteric Lymph Duct Cannulated Rat Model: Application to the Assessment of Intestinal Lymphatic Drug Transport

The intestinal lymphatic system plays key roles in fluid transport, lipid absorption and immune function. Lymph flows directly from the small intestine via a series of lymphatic vessels and nodes that converge at the superior mesenteric lymph duct. Cannulation of the mesenteric lymph duct thus enables the collection of mesenteric lymph flowing from the intestine. Mesenteric lymph consists of a cellular fraction of immune cells (99% lymphocytes), aqueous fraction (fluid, peptides and proteins such as cytokines and gut hormones) and lipoprotein fraction (lipids, lipophilic molecules and apo-proteins). The mesenteric lymph duct cannulation model can therefore be used to measure the concentration and rate of transport of a range of factors from the intestine via the lymphatic system. Changes to these factors in response to different challenges (e.g., diets, antigens, drugs) and in disease (e.g., inflammatory bowel disease, HIV, diabetes) can also be determined. An area of expanding interest is the role of lymphatic transport in the absorption of orally administered lipophilic drugs and prodrugs that associate with intestinal lipid absorption pathways. Here we describe, in detail, a mesenteric lymph duct cannulated rat model which enables evaluation of the rate and extent of lipid and drug transport via the lymphatic system for several hours following intestinal delivery. The method is easily adaptable to the measurement of other parameters in lymph. We provide detailed descriptions of the difficulties that may be encountered when establishing this complex surgical method, as well as representative data from failed and successful experiments to provide instruction on how to confirm experimental success and interpret the data obtained.

Here we describe a technique to cannulate the mesenteric lymph duct in rats which enables quantification of lipid and drug transport via the lymphatic system following intestinal delivery. The technique can be adapted to assess mesenteric lymph concentrations and/or transport of fluid, immune cells, peptides, proteins and lipophilic molecules.

腸間膜リンパダクトカニューレを挿入ラットモデル：腸のリンパ医薬品輸送の評価への応用

The intestinal lymphatic system plays key roles in fluid transport, lipid absorption and immune function. Lymph flows directly from the small intestine ...

Applying an Inducible Expression System to Study Interference of Bacterial Virulence Factors with Intracellular Signaling

The technique presented here allows one to analyze at which step a target protein, or alternatively a small molecule, interacts with the components of a signaling pathway. The method is based, on the one hand, on the inducible expression of a specific protein to initiate a signaling event at a defined and predetermined step in the selected signaling cascade. Concomitant expression, on the other hand, of the gene of interest then allows the investigator to evaluate if the activity of the expressed target protein is located upstream or downstream of the initiated signaling event, depending on the readout of the signaling pathway that is obtained. Here, the apoptotic cascade was selected as a defined signaling pathway to demonstrate protocol functionality. Pathogenic bacteria, such as Coxiella burnetii, translocate effector proteins that interfere with host cell death induction in the host cell to ensure bacterial survival in the cell and to promote their dissemination in the organism. The C. burnetii effector protein CaeB effectively inhibits host cell death after induction of apoptosis with UV-light or with staurosporine. To narrow down at which step CaeB interferes with the propagation of the apoptotic signal, selected proteins with well-characterized pro-apoptotic activity were expressed transiently in a doxycycline-inducible manner. If CaeB acts upstream of these proteins, apoptosis will proceed unhindered. If CaeB acts downstream, cell death will be inhibited. The test proteins selected were Bax, which acts at the level of the mitochondria, and caspase 3, which is the major executioner protease. CaeB interferes with cell death induced by Bax expression, but not by caspase 3 expression. CaeB, thus, interacts with the apoptotic cascade between these two proteins.

The method described here is used to induce the apoptotic signaling cascade at defined steps in order to dissect the activity of an anti-apoptotic bacterial effector protein. This method can also be used for inducible expression of pro-apoptotic or toxic proteins, or for dissecting interference with other signaling pathways.

誘導発現系を適用すると、細胞内シグナル伝達と細菌の病原性因子の干渉を研究するために、

The technique presented here allows one to analyze at which step a target protein, or alternatively a small molecule, interacts with the components of a ...

Zebrafish as a Model to Assess the Teratogenic Potential of Nitrite

High nitrate levels in the environment may&#160;result in congenital defects or miscarriages in humans. Presumably, this is due to the conversion of nitrate to nitrite by gut and salivary bacteria. However, in other mammalian studies, high nitrite levels do not cause birth defects, although they can lead to poor reproductive outcomes. Thus, the teratogenic potential of nitrite is not clear. It would be useful to have a vertebrate model system to easily assess teratogenic effects of nitrite or any other chemical of interest. Here, we demonstrate the utility of zebrafish (Danio rerio) to screen compounds for toxicity and embryonic defects. Zebrafish embryos are fertilized externally and have rapid development, making them a good model for teratogenic studies. We show that increasing the time of exposure to nitrite negatively affects survival. Increasing the concentration of nitrite also adversely affects survival, whereas nitrate does not. For embryos that survive nitrite exposure, various defects can occur, including pericardial and yolk sac&#160;edema, swim bladder noninflation, and craniofacial malformation. Our results indicate that the zebrafish is a convenient system for studying the teratogenic potential of nitrite. This approach can easily be adapted to test other chemicals for their effects on early vertebrate development.

Exposure to teratogens may cause birth defects. Zebrafish are useful for determining the teratogenic potential of chemicals. We demonstrate the utility of zebrafish by exposing embryos to various levels of nitrite and also at different times of exposure. We show that nitrite can be toxic and cause severe developmental defects.

亜硝酸塩の催奇形性を評価するためのモデルとしてのゼブラフィッシュ

High nitrate levels in the environment may&#160;result in congenital defects or miscarriages in humans. Presumably, this is due to the conversion of ...

A High-throughput Compatible Assay to Evaluate Drug Efficacy against Macrophage Passaged Mycobacterium tuberculosis

The early drug development process for anti-tuberculosis drugs is hindered by the inefficient translation of compounds with in vitro activity to effectiveness in the clinical setting. This is likely due to a lack of consideration for the physiologically relevant cellular penetration barriers that exist in the infected host. We recently established an alternative infection model that generates large macrophage aggregate structures containing densely packed M. tuberculosis (Mtb) at its core, which was suitable for drug susceptibility testing. This infection model is inexpensive, rapid, and most importantly BSL-2 compatible. Here, we describe the experimental procedures to generate Mtb/macrophage aggregate structures that would produce macrophage-passaged Mtb for drug susceptibility testing. In particular, we demonstrate how this infection system could be directly adapted to the 96-well plate format showing throughput capability for the screening of compound libraries against Mtb. Overall, this assay is a valuable addition to the currently available Mtb drug discovery toolbox due to its simplicity, cost effectiveness, and scalability.

A High-throughput Compatible Assay to Evaluate Drug Efficacy against Macrophage Passaged Mycobacterium tuberculosis

New models and assays that would improve the early drug development process for next-generation anti-tuberculosis drugs are highly desirable. Here, we describe a quick, inexpensive, and BSL-2 compatible assay to evaluate drug efficacy against Mycobacterium tuberculosis that can be easily adapted for high-throughput screening.

マクロファージ継代に対する薬効を評価するために、ハイスループットアッセイの互換性<em&gt;結核菌</em

The early drug development process for anti-tuberculosis drugs is hindered by the inefficient translation of compounds with in vitro activity to ...

Using Phylogenetic Analysis to Investigate Eukaryotic Gene Origin

Phylogenetic analysis uses nucleotide or amino acid sequences or other parameters, such as domain sequences and three-dimensional structure, to construct a tree to show the evolutionary relationship among different taxa (classification units) at the molecular level. Phylogenetic analysis can also be used to investigate domain relationships within an individual taxon, particularly for organisms that have undergone substantial change in morphology and physiology, but for which researchers lack fossil evidence due to the organisms&#39; long evolutionary history or scarcity of fossilization.
In this text, a detailed protocol is described for using the phylogenetic method, including amino acid sequence alignment using Clustal Omega, and subsequent phylogenetic tree construction using both Maximum Likelihood (ML) of Molecular Evolutionary Genetics Analysis (MEGA) and Bayesian Inference via MrBayes. To investigate the origin of eukaryotic Sugars Will Eventually be Exported Transporters (SWEET) genes, 228 SWEETs including 35 SWEET proteins from unicellular eukaryotes and 57 SemiSWEET proteins from prokaryotes were analyzed. Interestingly, SemiSWEETs were found in prokaryotes, but SWEETs were found in eukaryotes. Two phylogenetic trees constructed using theoretically distinct methods have consistently&#160;suggested that the first eukaryotic SWEET gene might stem from the fusion of a bacterial SemiSWEET gene and an archaeal SemiSWEET gene.&#160;It is worth noting that one should be cautious to draw a conclusion based only on phylogenetic analysis, although it is useful to explain the underlying relationship between different taxa, which is difficult or even impossible to discern through experimental means.

A method of constructing a phylogenetic tree based on sequence homology of SWEETs from eukaryotes and SemiSWEETs from prokaryotes is described. Phylogenetic analysis is a useful tool for explaining the evolutionary relatedness between homologous proteins or genes from different organism groups.

系統解析を使用して真核生物遺伝子の起源を調査するには

Phylogenetic analysis uses nucleotide or amino acid sequences or other parameters, such as domain sequences and three-dimensional structure, to construct ...

An Ex Vivo Chicken Primary Bursal-cell Culture Model to Study Infectious Bursal Disease Virus Pathogenesis

Infectious bursal disease virus (IBDV) is a birnavirus of economic importance to the poultry industry. The virus infects B cells, causing morbidity, mortality, and immunosuppression in infected birds. In this study, we describe the isolation of chicken primary bursal cells from the bursa of Fabricius, the culture and infection of the cells with IBDV, and the quantification of viral replication. The addition of chicken CD40 ligand significantly increased cell proliferation fourfold over six days of culture and significantly enhanced cell viability. Two strains of IBDV, a cell-culture adapted strain, D78, and a very virulent strain, UK661, replicated well in the ex vivo cell cultures. This model will be of use in determining how cells respond to IBDV infection and will permit a reduction in the number of infected birds used in IBDV pathogenesis studies. The model can also be expanded to include other viruses and could be applied to different species of birds.

An Ex Vivo Chicken Primary Bursal-cell Culture Model to Study Infectious Bursal Disease Virus Pathogenesis

Here we describe the isolation of chicken primary bursal cells from the bursa of Fabricius, the culture and infection of the cells with infectious bursal disease virus, and the quantification of viral replication.

伝染性ファブリキウス嚢病ウイルスの病原性を研究するためのEx Vivo鶏ファブリキウス嚢細胞培養モデル

Infectious bursal disease virus (IBDV) is a birnavirus of economic importance to the poultry industry. The virus infects B cells, causing morbidity, ...

病原性、病態、および薬の有効性を調査するため、代替の非哺乳類動物モデルとしてゴキブリをヒスマダガスカル

要約

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この動画の章

8ウェルチャンバースライドを用いたin vitro のバイオフィルム形成における

細菌付着の研究ではせん断応力を導入する

昆虫

生物発光細菌を使用してリアルタイムに急性肺炎のマウスモデルにおける肺炎球菌の毒性因子の影響を以下の

腸間膜リンパダクトカニューレを挿入ラットモデル：腸のリンパ医薬品輸送の評価への応用

誘導発現系を適用すると、細胞内シグナル伝達と細菌の病原性因子の干渉を研究するために、

亜硝酸塩の催奇形性を評価するためのモデルとしてのゼブラフィッシュ

マクロファージ継代に対する薬効を評価するために、ハイスループットアッセイの互換性

系統解析を使用して真核生物遺伝子の起源を調査するには

伝染性ファブリキウス嚢病ウイルスの病原性を研究するためのEx Vivo鶏ファブリキウス嚢細胞培養モデル

病原性、病態、および薬の有効性を調査するため、代替の非哺乳類動物モデルとしてゴキブリをヒス マダガスカル

要約

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8ウェルチャンバースライドを用いたin vitro のバイオフィルム形成における

細菌付着の研究ではせん断応力を導入する

昆虫

生物発光細菌を使用してリアルタイムに急性肺炎のマウスモデルにおける肺炎球菌の毒性因子の影響を以下の

腸間膜リンパダクトカニューレを挿入ラットモデル：腸のリンパ医薬品輸送の評価への応用

誘導発現系を適用すると、細胞内シグナル伝達と細菌の病原性因子の干渉を研究するために、

亜硝酸塩の催奇形性を評価するためのモデルとしてのゼブラフィッシュ

マクロファージ継代に対する薬効を評価するために、ハイスループットアッセイの互換性

系統解析を使用して真核生物遺伝子の起源を調査するには

伝染性ファブリキウス嚢病ウイルスの病原性を研究するためのEx Vivo鶏ファブリキウス嚢細胞培養モデル

病原性、病態、および薬の有効性を調査するため、代替の非哺乳類動物モデルとしてゴキブリをヒスマダガスカル