私たちはKaz NagaosaとShiratsuchi Akikoに助言をしてくれたことに感謝します。

1.準備<ol><li> 新鮮なブドウジュース寒天プレートの調製 <ol><li>寒天4.4gに水100mLを加え、電子レンジで混合物を加熱して寒天を溶解する。 </li><li> 80mLの新鮮なブドウ果汁、5mLの酢酸、および5mLのエタノールを寒天溶液に加える。 </li><li>約1.5 mLの溶液をピペットで各スライドガラスに注ぎ、凝固させます。 </li></ol></li><li> 6cm皿アガロースプレートの調製 <ol><li>アガロース0.5gに水50mLを加え、電子レンジで混合物を加熱してアガロースを溶解する。 </li><li>約2.5 mLのアガロース溶液を6 cmディッシュにピペットで注ぎます。 </li></ol></li></ol>ステージ16胚コレクション<ol><li>大人のハエを収集し、200匹の雌と200匹の雄を50 mLコニカルチューブに加える。 </li><li>酵母に新鮮なブドウ果汁寒天のプレートを50 mLのチューブに入れ、スポンジcaで閉じますp。 </li><li> 2〜3日間、16℃で軽くインキュベートします。プレートを1日1回交換してください。 </li><li>ハエを25℃で1時間動かします。 </li><li>古いプレートを酵母のない新しいプレートに交換してください。飛行機に2時間卵を産むことを許可する。 </li><li>プレートを集め、16℃で26時間インキュベートする。 </li><li> 0.2％（v / v）トリトンX - 100を含むPBS 1mLにペイントブラシでプレートから胚を収集します。 </li><li> 0.2％（v / v）のトリトンX-100を含有する1mLのPBSで胚を2回洗浄する。 </li><li>絨毛膜を除去するために、1.2mLの次亜塩素酸ナトリウム溶液（2.2〜3.4％Cl）を3分間胚に加える。 </li><li> 0.2％（v / v）Triton X-100を含む1mLのPBSで胚を4回洗浄する。 </li><li> 6cmのディッシュのアガロースプレートに胚を置きます。 Roberts 20によって記載されているように、顕微鏡下で第16段階胚を採取する。マイクロピペットを備えた1.5mLのTreffマイクロ試験管に約50個の胚を収集する。 </li></ol> 3.準備胚細胞の分化<ol><li> 150μLのPBSで胚を2回洗浄する。 </li><li> PBS中の200μLのコラゲナーゼ（0.25％（w / v））の存在下で、1.5mLマイクロ試験管およびペレットミキサー中で胚を30回均質化する。 </li><li>ピペットで10回胚細胞を分散させ、細胞懸濁液を1.5mLチューブに移す。 37℃で1分間水浴中で細胞をインキュベートする。この手順を2回繰り返します。 </li><li>細胞懸濁液にPBS800μLを添加し、1400× gで4℃で5分間遠心分離する。 </li><li>上清を除去し、PBSに200μLのトリプシン（0.25％（w / v））を細胞に加える。 50回ピペッティングすることにより胚細胞を分散させる。 </li><li>細胞懸濁液を70μm細胞ストレーナーでろ過する。 </li><li>トリプシン活性を停止させるために、濾過した細胞懸濁液に熱不活性化ウシ胎仔血清40μLを添加する。 800μLのPBSを添加し、4℃で1400× gで5分間遠心分離する。 </li><li>スーパーナタを削除する沈殿した細胞を200μLのPBSに懸濁し、1400× gで4℃で5分間遠心分離する。 </li><li>上清を除去し、沈殿した細胞を30μLのPBSに懸濁する。 </li><li>調製した細胞懸濁液をアミノプロピルトリエトキシシランでコーティングしたガラススライドにマウントし、細胞がスライドガラスに付着するまで10〜15分間待つ。 </li><li>ガラススライド上の残りの溶液をピペットで除去する。固定のために10〜15分間細胞に4％（w / v）PFA（パラホルムアルデヒド）を含む60〜70μLのPBSをマウントする。 </li><li>固定溶液を除去し、ガラススライドをPBSに1分以上置きます。 </li></ol> 4.血球の染色<ol><li> 抗クロキモト抗体による免疫染色 <ol><li> 0.2％（v / v）Triton X-100を含むPBS中で10分間メタノールを連続的に浸漬し、10分間PBSでスライドさせる。 </li><li> 5％（v / v）の全ブタ血清をPBS中に20μL詰めるブロッキングのために0.2％（v / v）Triton X-100を細胞に添加する。スライドを室温で20分間インキュベートする。 </li><li>ガラススライドから液を除去し、PBS、0.2％を含有する抗Croquemort抗血清19、21（0.1％（V / V））の20μLマウント（v / v）のトリトンX-100細胞上。スライドを4℃で一晩インキュベートする。 </li><li>ガラススライドを0.2％（v / v）Triton X-100を含むPBSに10分間5回浸漬する。 </li><li>ガラススライドをPBSに10分間浸します。 </li><li> 0.2％（v / v）Triton X-100および5％（v / v）ブタ血清を含むPBS中の20μLのアルカリホスファターゼ標識抗ラットIgG（0.5％（v / v） 1時間撹拌した。 </li><li>ガラススライドを0.2％（v / v）Triton X-100を含むPBSに10分間5回浸漬する。 </li><li> 100 mM Tris-HCl、pH 9.5,100 mM NaCl、50 mM MgCl 2を含むバッファーに10分間スライドガラスを浸します。 </li><li> 0.23mg / mLの5-ブロモ-4を含有するホスファターゼ基質基質溶液（BCIP）、0.35mg / mLのニトロブルーテトラゾリウム（NBT）、100mM Tris-HCl、pH9.5,100mM NaCl、および50mM MgCl 2を細胞に添加した。 </li><li>適切な染色のために顕微鏡下で細胞を観察する。血球の顆粒中に強い紫色のシグナルが現れた場合、基質溶液を除去し、ガラススライドを10mM Tris-HCl、pH 8.5および1mM EDTAからなる緩衝液に浸す。約5〜10分間の染色が推奨される。 </li></ol></li><li> 抗GFP抗体による免疫染色（血球の染色のための別の選択肢） <ol><li>ガラススライドをメタノール中で10分間、0.2％（v / v）Triton X-100を含むPBSを10分間、PBSを10分間浸漬する。 </li><li>ブロッキングのために0.2％（v / v）のTriton X-100を含有するPBSに5％（v / v）ブタ血清20μLをマウントする。スライドを室温で20分間インキュベートする。 </li><li>ガラススライド上の溶液を除去し、20μLのマウス抗GFP抗体（1％（v / v））/ PBS cをマウントする。細胞上の0.2％（v / v）Triton X-100を含む。スライドを室温で一晩インキュベートする。 </li><li>ガラススライドを0.2％（v / v）Triton X-100を含むPBSに10分間5回浸漬する。 </li><li>ガラススライドをPBSに10分間浸します。 </li><li> 0.2％（v / v）トリトンX-100および5％（v / v）全ブタ血清を含有するPBS中の20μLのアルカリホスファターゼ標識抗マウスIgG（0.5％（v / v） 1時間撹拌した。 </li><li>ガラススライドを0.2％（v / v）Triton X-100を含むPBSに10分間5回浸漬する。 </li><li> 100mM Tris-HCl、pH9.5,100mM NaCl、および50mM MgCl 2からなる緩衝液中に10分間ガラススライドを浸漬する。 </li><li>細胞に0.23mg / mL BCIP、0.35mg / mL NBT、100mM Tris-HCl、pH9.5,100mM NaCl、および50mM MgCl 2を含むホスファターゼ基質溶液をマウントする。 </li><li>適切な染色のために顕微鏡下で細胞を観察する。紫色のシグナルが全血球に現れると、基質溶液を除去し、10mMのトリス-HCl、pH8.5および1mMのEDTAを含む。約10〜15分間の染色が推奨される。 </li></ol></li></ol> 5.TUNELによるアポトーシス細胞の染色<ol><li>ガラススライドをPBSに5分間浸します。 </li><li>新しいPBSで繰り返します。 </li><li> 10分間、細胞上の平衡緩衝液（材料表を参照）をマウントする。 </li><li>ガラススライドから溶液を取り出し、37℃で1時間、細胞に5μLの末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼおよび15μLのReaction Bufferを含む20μLのTdT溶液をマウントする。 </li><li>ガラススライドから溶液を除去し、スライドを0.5 mLのSTOP / Washバッファーと17 mLの水で構成されたバッファーに浸します。 </li><li>スライドを5分間3回PBSに浸す。 </li><li>抗ジゴキシゲニン - ペルオキシダーゼ20μLを室温で30分間細胞に添加する。 </li><li>ガラススライドをPBSに5分間4回浸漬する。 </li><li> 50mM Tris-HCl、pH7.5を含む30mLのペルオキシダーゼ基質溶液にガラススライドを浸します3,3&#39;-ジアミノベンジジンテトラハイドロクロライド（DAB）、0.002％（v / v）H 2 O 2の30秒間の完全マイクロスパチュラである。 </li><li>アポトーシス細胞が褐色に染色されるまで、ステップ5.9を繰り返す。ガラスを水に浸してペルオキシダーゼ反応を停止させる。 </li><li>観察のために細胞を水で囲む。 </li></ol> 6.アポトーシス細胞の食作用のレベルを測定する。 <ol><li>ファゴサイトーシスのレベルを評価するために、サンプルを光学顕微鏡下で観察する。クロークポート陽性細胞または血球としてのGFP陽性細胞、アポトーシス細胞としてのTUNEL陽性細胞、および貪食血球としての二重陽性細胞を計数する。 </li><li>貪食指数は、Croquemort陽性細胞またはGFP陽性細胞の総数に対する二重陽性細胞の数として定義される。 300以上の血球が観察されることが推奨される。 </li></ol>

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著者らは、競合する金銭的利益がないと宣言している。

<html>本明細書では、 ショウジョウバエ胚を用いた食作用アッセイについて記載した。胚細胞を分散させて貪食量を定量的に測定することにより、血球マーカーであるCroquemortまたはsrpHemo-駆動GFPについて、血球、 ショウジョウバエプロフェッショナル貪食細胞を免疫染色し、アポトーシス細胞をこのプロトコールでTUNELによって検出する。食作用のレベルは、血球の総数および食作用する血球の数を数えることによって、食作用指数として表される。分散された胚細胞の使用は、我々が全胚の中の全ての食細胞およびアポトーシス細胞を観察し、食作用のレベルを正確に定量化することを可能にする。さらに、本発明者らの方法は、蛍光顕微鏡ではなく、光学顕微鏡下で観察可能な色素で血球およびアポトーシス細胞を検出する。これは、血球およびアポトーシス細胞を、フィルターを変更することなく同時に観察することが可能であるため、食作用レベルの評価を容易にする。 胚細胞の固定工程では、2週間以内に調製された新鮮なPFAを使用する必要があります。クロークモルトの免疫染色では、抗Croquemortと細胞のインキュベーションを行う必要がありますTUNEL染色では、DABとのインキュベーションは、過剰染色を避けるために顕微鏡下で注意深く調べる必要があります.TUNELは、アポトーシス細胞に富んだ3&#39;-OHを検出することによって断片化DNAを可視化しますが、正常細胞もDNAの3 &#39;末端に3&#39;-OHを有するが、アポトーシス細胞よりも低いレベルであるので、DABとの細胞のインキュベーションは、アポトーシス細胞だけでなく正常細胞これを防ぐために、DAB染色中に15または30秒ごとに細胞を観察することが推奨される。 このプロトコルでは、食作用のレベルの定量化は迅速かつ正確であるが、いくつかの情報su血球の塞栓または分布部位が失われる。本発明者らは、このアッセイおよび全胚を用いたインサイツ貪食アッセイが、食作用指数21の点で類似の結果を生じたことを以前に示した。したがって、場合によっては得られた結果を正確に解釈するために、現場での食作用アッセイを並行して行うことを推奨します。 ショウジョウバエは、中枢神経系において別の専門的な食細胞であるグリア細胞を有する。このプロトコールでは、胚のグリア細胞によるアポトーシスニューロンの食作用を評価する方法は記載されていないが、同じプロトコールが、Kuraishi et al。 、 EMBO.J 21 。同様に、このアッセイは、 ショウジョウバエの胚におけるTUNEL陽性細胞が非専門の食細胞によって貪食される可能性があることを示唆している。それらの未同定のphによる食作用（ 図1D ）、胚細胞におけるアポトーシス細胞の総数が食作用遺伝子突然変異体において増加しないように思われるかもしれない。 結論として、このプロトコールは、プロフェッショナル食細胞によるアポトーシス細胞の食作用に必要とされる遺伝子の発見に成功した。 24、25、28。ファゴサイトーシス7の根底にある分子機構の進化的保存に基づいて、複雑なファゴサイトーシス反応を伴うショウジョウバエ胚の遺伝子機能を明らかにすることは、哺乳動物29の炎症性障害および自己免疫疾患に関連する死細胞の食作用クリアランスに意味のある洞察を提供する。

後生動物では、 例えば 、線虫線虫（Caenorhabditis elegans）、果実はキイロショウジョウバエ 、マウスやヒトを飛ぶ、細胞の大多数は、自分の体を形作るために開発中のアポトーシスを受けるし、成人期に恒常性1、2を維持します。アポトーシス細胞は、完全に除去されなければ免疫原性細胞内物質を放出することによって周囲の組織に炎症を誘発するため、迅速に除去する必要がある3 。食細胞の貪食受容体によって認識され、貪食3、4、5、6によって除去される迅速な除去を容易にするために、本アポトーシス細胞いわゆる食べる-MEを信号。このように、食作用は宿主恒常性の維持に重要な役割を果たし、従って、分子の解明<html>アポトーシス細胞の食作用の根底にある機構が重要である。 アポトーシス細胞の食作用に関与する機構は、線虫、ハエ、およびマウスの種間で進化的に保存されているようである7 。いくつかの食作用アッセイが、現在、これらのモデル動物におけるアポトーシス細胞の貪食を評価するために利用可能である。 線虫では 、131体細胞は発達中にプログラム細胞死を起こし、細胞死体は非専門食細胞である隣接細胞によって貪食される8 。したがって、 C.エレガンスの残りの細胞死体の数を数えることは、インビボでの食作用のレベルを示す。死細胞数の増加を示し、線虫の変異体を探索することにより、食作用のために必要ないくつかの遺伝子が同定されており、遺伝的に10、9特徴付け、S = &quot;外部参照&quot;&gt; 11、12。 初代培養食細胞、一般にマクロファージを用いたエクスビボ食作用アッセイは、しばしばマウスにおいて利用される。アポトーシス細胞は、Jurkat細胞のような細胞系を用いて調製され、一次貪食細胞と混合される。数時間のインキュベーションの後、ファゴサイトーシスのレベルを評価するために、ファゴサイトおよび貪食ファゴサイトの総数を数える。この方法の洗練された改変として、Nagataのグループは、アポトーシス細胞がアポトーシスDNA断片化を起こさないカスパーゼ耐性ICAD（カスパーゼ活性化DNアーゼ阻害剤）を発現する細胞を用いたex vivo食作用アッセイを開発したが、細胞は貪食される。これらの細胞を食作用アッセイにおいてアポトーシス標的として使用する場合、貪食されたアポトーシス細胞のDNAのみが断片化され、TdT媒介dUTPニック末端標識（TUNEL）によって染色される。したがって、アポトーシス細胞の貪食は、食細胞とアポトーシス細胞の混合物中のTUNELシグナルを計数することによって測定される13 。 キイロショウジョウバエでは、血球、 ショウジョウバエマクロファージ、名前のプロの食細胞がアポトーシスを起こした細胞14、15の食作用を担当しています。培養細胞系を用いたin vitro食作用アッセイに加えて、 ショウジョウバエの全胚を用いたin vivo食作用アッセイが利用可能である。 ショウジョウバエの胚は、多くの細胞がアポトーシスを受けるし、胚発生14、15、16の間に血球によって貪食されているので、アポトーシス細胞の貪食のレベルを調べるための強力なツールです。 インビボ貪食アッセイの一例は、フランのグループによって開発された方法である。彼らの方法では、血球は、ペルオキシダの免疫染色、血球マーカーによってtected、アポトーシス細胞を核染料を用いて染色し、7-アミノアクチノマイシンD全体ショウジョウバエ胚において、二重陽性細胞の数は、貪食17の信号としてカウントされます。胚に対する食作用アッセイの別の例は、上記の永田の方法の概念に基づいている。しかしながら、 インビボで食作用は、（ ショウジョウバエカスパーゼ活性化デオキシリボヌクレアーゼ）突然変異体は18、19ハエDCADの胚を用いて評価されます。これらのインビボ食作用アッセイは、インサイチューで食作用を直接観察するのに有用である。しかしながら、貪食細胞の計数段階において可能な偏りを除外することには困難が伴う。なぜなら、その厚さのために全胚細胞中の全ての食細胞およびアポトーシス細胞を観察することが困難であるからである。 この制限を克服するために、我々はショウジョウバエの胚における新しい食作用アッセイを編集した。我々の方法では、貪食細胞を容易に計数するために、全胚を均質化して分散胚細胞を調製する。貪食細胞は食細胞マーカーの免疫染色により検出され、アポトーシス細胞はこれらの分散した胚細胞を有するTUNELによって検出される。分散された胚細胞の使用は、私たちが食作用のレベルを正確に定量するインビトロ貪食アッセイを行ったかのようにインビボ貪食レベルを測定することを可能にする。食作用によるアポトーシス細胞クリアランスが最も豊富な発生段階である、胚20の段階16に発展する場合、このアッセイでは、全ての遺伝子型のハエを用いることができる。この方法は、食作用のレベルを定量的に評価する利点を有し、したがって、 インビボでのアポトーシス細胞の食作用に関与する新しい分子の同定に寄与し得る 。

<table><tbody><tr><td>whole swine serum</td><td>MP Biomedicals</td><td>55993</td><td>For bloking</td></tr><tr><td>Treff micro test tube(easy fit)&amp;nbsp; Dnase, Rnase free tube, 1.5 mL</td><td>TreffLab</td><td>96. 4625. 9. 01</td><td>For&amp;nbsp; homogenization</td></tr><tr><td>pellet mixer&amp;nbsp; 1.5 mL</td><td>TreffLab</td><td>96. 7339. 9. 03</td><td>For&amp;nbsp; homogenization</td></tr><tr><td>Collagenase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C-0130</td><td>For preparation of embryonic cells</td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Thermo Fisher SCIENTIFIC</td><td>27250-018</td><td>For preparation of embryonic cells</td></tr><tr><td>Kpl Anti-Rat IgG (H+L) Ab MSA, AP</td><td>KPL</td><td>475-1612</td><td>secondary antibody for&lt;br/&gt; stainig hemocytes with an anti-Croquemort antibody</td></tr><tr><td>5-bromo-4-chloro-&lt;br/&gt; 3-indolyl-phosphate</td><td>Roche</td><td>11383221001</td><td>BCIP, For staining of hemocytes</td></tr><tr><td>nitro blue tetrazolium</td><td>Roche</td><td>11383213001</td><td>NBT, For staining of hemocytes</td></tr><tr><td>Anti-Croquemort antibody</td><td></td><td></td><td>described previously in Manaka &lt;em&gt;et al.&lt;/em&gt;, J. Biol. Chem., 279, 48466-48476</td></tr><tr><td>&amp;nbsp;Anti-GFP&lt;br/&gt; from mouse IgG1&amp;kappa; (clones 7.1 and 13.1)&amp;nbsp;</td><td>Roche</td><td>11814460001</td><td>For staining of hemocytes</td></tr><tr><td>Goat Anti-Mouse IgG-AP Conjugate</td><td>Bio-Rad</td><td>170-6520</td><td>secondary antibody for stainig hemocytes with an anti-Croquemort antibody</td></tr><tr><td>Apop Tag Peroxidase In Situ Apoptosis Detection Kit</td><td>Millipore</td><td>S7100</td><td>For staining of apoptoitc cells. This kit includes Equilibration buffer, Reaction buffer, STOP/Wash buffer, TdT enzyme, and Anti-Digoxigenin-Peroxidase.</td></tr><tr><td>3,3&#039;-diaminobenzidine&lt;br/&gt; tetrahydrichloride</td><td>nacalai tesque</td><td>11009-41</td><td>DAB, For staining of apoptoitc cells</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Table of Fly Strains&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Stock center&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Stock ID&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>w&lt;sup&gt;1118&lt;/sup&gt;</td><td></td><td></td><td>Control flies, described in Freeman &lt;em&gt;et al.&lt;/em&gt;, Neuron, 38, 567-580</td></tr><tr><td>drpr&lt;sup&gt;&amp;Delta;5&lt;/sup&gt;</td><td></td><td></td><td>drpr mutant, described in Freeman &lt;em&gt;et al.&lt;/em&gt;, Neuron, 38, 567-580</td></tr><tr><td>Itgbn&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt;</td><td></td><td></td><td>Itgbn mutant, described in Devenport &lt;em&gt;et al.&lt;/em&gt;, Development, 131, 5405-5415</td></tr><tr><td>srpHemoGAL4 UAS-EGFP</td><td></td><td></td><td>described in Br&amp;uuml;ckner &lt;em&gt;et al.&lt;/em&gt;, Dev. Cell., 7, 73-84</td></tr><tr><td>UAS-drpr-IR</td><td>VDRC</td><td>4833</td><td>-</td></tr><tr><td>UAS-Itgbn-IR</td><td>NIG-fly</td><td>1762R-1</td><td>-</td></tr></tbody></table>

phagocytosis assay for apoptotic cells in drosophila embryos

アポトーシス細胞の食作用の根底にある分子メカニズムは、免疫および炎症性難治性疾患におけるその役割のために、より詳細に解明される必要がある。本発明者らは、本明細書において 、エンザイムリアクションを制御する遺伝子ネットワークが哺乳動物から進化的に保存されているショウジョウバエを用いて、貪食を定量的に調べる実験的方法を開発した。全動物を用いて貪食細胞および貪食細胞を正確に検出および計数するために、 ショウジョウバエ胚をホモジナイズして、貪食細胞およびアポトーシス細胞を含む分散細胞を得た。分散胚細胞の使用は、我々は全体の胚では、すべての食細胞およびアポトーシス細胞を観察し、正確に食作用のレベルを定量化することも可能であるインビトロ食作用アッセイを行ったかのようにin vivoでの食作用のレベルを測定することが可能になります。この方法が以前の研究のものを再現することを確認したアポトーシス細胞の貪食に必要な遺伝子を同定した。この方法は、死細胞の貪食を分析することができ、 ショウジョウバエの強力な遺伝学と組み合わせると、貪食細胞によるアポトーシス細胞の遊走、認識、貪食、分解からなる複合貪食反応を明らかにする。

アポトーシス細胞の食作用を調べるために、発育段階16のショウジョウバエ胚を回収し、分散細胞として調製した。血球、 ショウジョウバエマクロファージは、特異的抗体19、21を用いて、血球マーカー「Croquemort」17、22のために免疫細胞化学により染色し、そしてアポトーシス細胞は、分散胚細胞（ 図1A）にTUNELにより染色しました。 ショウジョウバエの CD36関連受容体であるCroquemortは、すべての胚性血球22に特異的に発現され、 ショウジョウバエの胚17におけるアポトーシス細胞のクリアランスに遺伝子的に関与していることが示されている17 。クロレモート陽性細胞は、その細胞の小さな顆粒に紫色のシグナルを有する。 TUNEL陽性細胞は、ab全体のコーパス内の荒れた信号。 TUNEL陽性細胞は他の細胞よりも小さく、一部はCroquemort陽性細胞の中にあり、貪食細胞死細胞であると考えられている。 2〜10％のクロクエルト陽性細胞および1〜5％のTUNEL陽性細胞が、通常、すべての胚細胞において観察される。 ショウジョウバエでは、アポトーシス細胞の貪食のための2つのシグナル伝達経路が存在する。対応する経路のための二つのファゴサイトーシス受容体、ドレーパー及びインテグリンαPS3βνは、独立して、25、24、23、21、死細胞19を認識する。ドレイパーは、細胞外領域に非定型表皮成長因子（EGF）様配列を有し、i細胞内に2つのリン酸化可能なモチーフNPxYおよびYxxLを有する膜貫通タンパク質である細胞内部分26 。インテグリンαPS3βνはまた、α及びβサブユニット25のヘテロ二量体からなる膜貫通受容体です。 図1Bは、野生型またはdrprまたはItgbn単一突然変異胚における全血球に対する食作用する血球の割合を示す。 Croquemort陽性細胞（総血球）およびCroquemortおよびTUNEL二重陽性細胞（貪食細胞）を計数することにより、貪食指数を、貪食細胞の数として血球の総数に換算した。貪食指数は、血球およびアポトーシス細胞の数は類似していたが、 drprまたはItgbn突然変異体で野生型よりも低かった （ 図1C- D ）。これは、以前のrと同様に、これら2つの遺伝子がアポトーシス細胞の貪食に必要であることを示している報告された。 抗Croquemort抗体が利用できない場合、または変化したCroquemort発現を有する突然変異株が検査される場合、我々は血球を検出するための別の選択肢を選択する必要がある。血球特異的プロモーター（ srpHemo-GAL4 ）によって制御されるGAL4ドライバおよびGAL4結合部位（ UAS-EGFP ）を含む上流活性化配列（UAS）によって制御されるGFP遺伝子を有する胚は、GFP標識血球27 、抗GFPを用いて血球を検出することができます。 図2Aは、抗GFP抗体およびsrpHemo-GAL4UAS-EGFPを有する胚細胞中のTUNELを用いて、免疫染色で血球およびアポトーシス細胞を検出した後に得られた画像を示す。抗Croquemort抗体は細胞内で小さな顆粒を染色するが、抗GFP抗体は全血球を染色する。 図1Aと同様に、2〜6％のGFP陽性細胞および1〜5％のTUNEL陽性細胞<html>細胞はすべての胚細胞で観察される。いくつかのTUNEL陽性細胞は、貪食された死細胞であると考えられるGFP陽性細胞内で検出される。 RNAiを介したノックダウンは、 srpHemo-GAL4UAS-EGFPを用いて候補遺伝子のUAS-dsRNAとハエを交差させることにより、貪食に関与する遺伝子を評価するために容易に適用される。 drprまたはItgbnのRNAi媒介性のノックダウンは、貪食指数を減少させたが（ 図2B ）、胚細胞における血球およびアポトーシス細胞の数は匹敵した（ 図2C -2D ）、これらの貪食受容体は再び貪食に関与しているアポトーシス細胞。同様の食作用指数は、両方の血球検出法から得られ、両方が適合性であることを示唆している。 g &quot;/&gt; 図1 ： Anti-Croquemort抗体およびTUNELによる胚細胞の染色。抗Croquemort抗体およびTUNELによる免疫染色によってW 1118株から分散胚細胞の（A）明視野像。正または負に染色された代表的な細胞（上位4パネル）および低出力フィールド（下側パネル）の拡大図を示す。スケールバー、5μm（上）。 50μm（底部）。 （ B ） drprまたはItgbn突然変異体におけるCroquemort陽性血球とTUNELシグナルとの全Croquemort陽性血球の割合を 、分散した胚細胞で分析した。 （ C ）Croquemort陽性血球とdrprまたはItgbn変異体の全細胞との比を、分散した胚細胞で分析した。 （ D ）TUNEL陽性アポトーシス細胞の、 drprまたはItgbn突然変異体を、分散した胚細胞で分析した。遺伝子型; 1118ワット（野生型コントロール）、Δ5（drpr 変異体）、及びItgbn 2（インテグリンβν変異体）drpr。データは3つの独立した実験の代表であり、スチューデントのt検定によって分析された。およそ300のクロークエート陽性血球が各実験で観察され、値は3つの顕微鏡視野の平均± SDを表す。 *; p &lt;0.05、ns;差は有意ではない。 <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56352/56352fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。</a> <img alt="図2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56352/56352fig2.jpg" /> 図2： Antによる胚細胞の染色i-GFPおよびTUNEL。 （ A ） srpHemo-GAL4UAS-EGFP / +株からの抗GFP抗体およびTUNELによる免疫染色による分散した胚細胞の明視野像。正または負に染色された代表的な細胞（上位4パネル）および低出力フィールド（下側パネル）の拡大図を示す。スケールバー=5μm（上部）。 50μm（底部）。 （ B ） drprまたはItgbnの RNAi媒介性ノックダウンハエにおけるすべてのGFP陽性血球に対するTUNELシグナルを伴うGFP陽性血球の割合を、分散した胚細胞で分析した。 （ C ）RNAi媒介ノックダウンハエのdrprまたはItgbnの全細胞に対するGFP陽性血球の割合を、分散した胚細胞で分析した。 （ D ）RNAiを介したdrprまたはItgbnのノックダウンハエにおける全細胞に対するTUNEL陽性アポトーシス細胞の割合を、分散した胚細胞で分析した。遺伝子型; RNAi -： yw / w; srpHemo-GAL4 UAS-EGFP / + 、RNAi drpr：yw / w; srpHemo-GAL4 UAS-EGFP / +; UAS-drpr-IR / +、 RNAi Itgbn ： yw / w; srpHemo-GAL4 UAS-EGFP / +; UAS-Itgbn-IR / + 。データは3つの独立した実験の代表であり、スチューデントのt検定によって分析された。約300個のGFP陽性血球が各実験において観察され、値は3つの顕微鏡視野の平均± SDを表す。 *; p &lt;0.05、ns;差は有意ではない。 <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56352/56352fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。</a>

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Phagocytosis Assay for Apoptotic Cells in Drosophila Embryos

本明細書では、 ショウジョウバエの分散胚細胞を用いた食作用アッセイを記載する。これにより、in vivoでの貪食レベルを簡単かつ正確に定量化し 、アポトーシス細胞の貪食に必要な新しい分子を同定することができます。

アポトーシス細胞の食作用アッセイ<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;胚

The molecular mechanisms underlying the phagocytosis of apoptotic cells need to be elucidated in more detail because of its role in immune and ...

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Nanyang Technological University

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Phagocytosis Assay for Apoptotic Cells in Drosophila Embryos

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9.8K ビュー.  Kanazawa University. 本明細書では、 ショウジョウバエの分散胚細胞を用いた食作用アッセイを記載する。これにより、in vivoでの貪食レベルを簡単かつ正確に定量化し 、アポトーシス細胞の貪食に必要な新しい分子を同定することができます。 

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RNAi Screening for Host Factors Involved in Vaccinia Virus Infection using Drosophila Cells

Viral pathogens represent a significant public health threat; not only can viruses cause natural epidemics of human disease, but their potential use in bioterrorism is also a concern. A better understanding of the cellular factors that impact infection would facilitate the development of much-needed therapeutics. Recent advances in RNA interference (RNAi) technology coupled with complete genome sequencing of several organisms has led to the optimization of genome-wide, cell-based loss-of-function screens. Drosophila cells are particularly amenable to genome-scale screens because of the ease and efficiency of RNAi in this system 1. Importantly, a wide variety of viruses can infect Drosophila cells, including a number of mammalian viruses of medical and agricultural importance 2,3,4. Previous RNAi screens in Drosophila have identified host factors that are required for various steps in virus infection including entry, translation and RNA replication 5. Moreover, many of the cellular factors required for viral replication in Drosophila cell culture are also limiting in human cells infected with these viruses 4,6,7,8, 9. Therefore, the identification of host factors co-opted during viral infection presents novel targets for antiviral therapeutics. Here we present a generalized protocol for a high-throughput RNAi screen to identify cellular factors involved in viral infection, using vaccinia virus as an example.

RNAi Screening for Host Factors Involved in Vaccinia Virus Infection using Drosophila Cells

Novel host factors involved in viral infection can be identified through cell-based genome-wide loss of function RNAi screening. A Drosophila cell culture model is particularly amenable to this approach due to the ease and efficiency of RNAi. Here we demonstrate this technique using vaccinia virus as an example.

に関与する宿主因子のためのRNAiスクリーニングワク</em使用して>ウイルス感染ショウジョウバエセル

Viral pathogens represent a significant public health threat; not only can viruses cause natural epidemics of human disease, but their potential use in ...

免疫・感染学

Colony Forming Cell (CFC) Assay for Human Hematopoietic Cells

Human hematopoietic stem/progenitor cells are usually obtained from bone marrow, cord blood, or peripheral blood and are used to study hematopoiesis and leukemogenesis. They have the capacity to differentiate into lymphoid and myeloid lineages. The colony forming cell (CFC) assay is used to study the proliferation and differentiation pattern of hematopoietic progenitors by their ability to form colonies in a semisolid medium. The number and the morphology of the colonies formed by a fixed number of input cells provide preliminary information about the ability of progenitors to differentiate and proliferate. Cells can be harvested from individual colonies or from the whole plate to further assess their numbers and differentiation states using flow cytometry and morphologic evaluation of Giemsa-stained slides. This assay is useful for assessing myeloid but not lymphoid differentiation. The term myeloid in this context is used in its wider sense to encompass granulocytic, monocytic, erythroid, and megakaryocytic lineages.

We have used this assay to assess the effects of oncogenes on the differentiation of primary human CD34+ cells derived from peripheral blood. For this purpose cells are transduced with either control retroviral construct or a construct expressing the oncogene of interest, in this case NUP98-HOXA9. We employ a commonly used retroviral vector, MSCV-IRES-GFP, that expresses a bicistronic mRNA that produces the gene of interest and a GFP marker. Cells are pre-activated by growing in the presence of cytokines for two days prior to retroviral transduction. After another two days, GFP+ cells are isolated by fluorescence-activated cell sorting (FACS) and mixed with a methylcellulose-containing semisolid medium supplemented with cytokines and incubated till colonies appear on the surface, typically 14 days. The number and morphology of the colonies are documented. Cells are then removed from the plates, washed, counted, and subjected to flow cytometry and morphologic examination. Flow cytometry with antibodies specific to the cell surface markers expressed during hematopoiesis provides information about lineage and maturation stage. Morphological studies of individual cells under a microscope after Wright- Giemsa staining provide further information with regard to lineage and maturation. Comparison of cells transduced with control empty vector to those transduced with an oncogene reveals the effects of the oncogene on hematopoietic differentiation.

Colony Forming Cell CFC Assay for Human Hematopoietic Cells

The colony forming cell (CFC) assay is an in vitro assay in which hematopoietic progenitors form colonies in a semi-solid medium. A combination of colony morphology, cell morphology, and flow cytometry are used to assess the ability of the progenitors to proliferate and differentiate along the different hematopoietic lineages.

ヒト造血細胞のためのコロニー形成細胞（CFC）アッセイ

Human hematopoietic stem/progenitor cells are usually obtained from bone marrow, cord blood, or peripheral blood and are used to study hematopoiesis and ...

Single Drosophila Ommatidium Dissection and Imaging

The fruit fly Drosophila melanogaster has made invaluable contributions to neuroscience research and has been used widely as a model for neurodegenerative diseases because of its powerful genetics1. The fly eye in particular has been the organ of choice for neurodegeneration research, being the most accessible and life-dispensable part of the Drosophila nervous system. However the major caveat of intact eyes is the difficulty, because of the intense autofluorescence of the pigment, in imaging intracellular events, such as autophagy dynamics2, which are paramount to understanding of neurodegeneration.
We have recently used the dissection and culture of single ommatidia3 that has been essential for our understanding of autophagic dysfunctions in a fly model of Dentatorubro-Pallidoluysian Atrophy (DRPLA)3, 4.
We now report a comprehensive description of this technique (Fig. 1), adapted from electrophysiological studies5, which is likely to expand dramatically the possibility of fly models for neurodegeneration. This method can be adapted to image live subcellular events and to monitor effective drug administration onto photoreceptor cells (Fig. 2). If used in combination with mosaic techniques6-8, the responses of genetically different cells can be assayed in parallel (Fig. 2).

Single Drosophila Ommatidium Dissection and Imaging

The limiting factor in the use of the adult Drosophila eye to study neurodegeneration and cell biology is the difficult imaging of intracellular processes. We describe the dissection of single ommatidia to generate a bona-fide primary neuronal cell culture, which can be subject to drug treatment and advanced imaging.

シングルショウジョウバエ個眼の解剖とイメージング

The fruit fly Drosophila melanogaster has made invaluable contributions to neuroscience research and has been used widely as a model for neurodegenerative ...

神経科学

Assessing the Cellular Immune Response of the Fruit Fly, Drosophila melanogaster, Using an In Vivo Phagocytosis Assay

In all animals, innate immunity provides an immediate and robust defense against a broad spectrum of pathogens. Humoral and cellular immune responses are the main branches of innate immunity, and many of the factors regulating these responses are evolutionarily conserved between invertebrates and mammals. Phagocytosis, the central component of cellular innate immunity, is carried out by specialized blood cells of the immune system. The fruit fly, Drosophila melanogaster, has emerged as a powerful genetic model to investigate the molecular mechanisms and physiological impacts of phagocytosis in whole animals. Here we demonstrate an injection-based in vivo phagocytosis assay to quantify the particle uptake and destruction by Drosophila blood cells, hemocytes. The procedure allows researchers to precisely control the particle concentration and dose, making it possible to obtain highly reproducible results in a short amount of time. The experiment is quantitative, easy to perform, and can be applied to screen for host factors that influence pathogen recognition, uptake, and clearance.

Assessing the Cellular Immune Response of the Fruit Fly, Drosophila melanogaster, Using an In Vivo Phagocytosis Assay

This protocol describes an in vivo phagocytosis assay in adult Drosophila melanogaster to quantify phagocyte recognition and clearance of microbial infections.

ミバエショウジョウバエVivo で貪食能アッセイを使用しての細胞性免疫能を評価します。

In all animals, innate immunity provides an immediate and robust defense against a broad spectrum of pathogens. Humoral and cellular immune responses are ...

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

The proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal development in all metazoan organisms. Apoptotic cell clearance is a highly dynamic process intimately associated with cell death; unengulfed apoptotic cells are barely seen in vivo under normal conditions. In order to understand the different steps of apoptotic cell clearance and to compare 'professional' phagocytes - macrophages and dendritic cells to 'non-professional' - tissue-resident neighboring cells, in vivo live imaging of the process is extremely valuable. Here we describe a protocol for studying apoptotic cell clearance in live Drosophila embryos. To follow the dynamics of different steps in phagocytosis we use specific markers for apoptotic cells and phagocytes. In addition, we can monitor two phagocyte systems in parallel: 'professional' macrophages and 'semi-professional' glia in the developing central nervous system (CNS). The method described here employs the Drosophila embryo as an excellent model for real time studies of apoptotic cell clearance.

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Here we describe an effective method for studying dynamics of apoptotic cell clearance in vivo. This method employs live Drosophila embryos as a powerful model for monitoring phagocytosis of apoptotic cells using specific labeling of apoptotic cells and phagocytes.

アポトーシス細胞のクリアランスのイメージング中に生きる<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;胚

The  proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and  subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal  ...

生物学

In vitro Quantitative Imaging Assay for Phagocytosis of Dead Neuroblastoma Cells by iPSC-Macrophages

Microglia orchestrate neuroimmune responses in several neurodegenerative diseases, including Parkinson&#39;s disease and Alzheimer&#39;s disease. Microglia clear up dead and dying neurons through the process of efferocytosis, a specialized form of phagocytosis. The phagocytosis function can be disrupted by environmental or genetic risk factors that affect microglia. This paper presents a rapid and simple in vitro&#160;microscopy protocol for studying microglial efferocytosis in an induced pluripotent stem cell (iPSC) model of microglia, using a human neuroblastoma cell line (SH-SY5Y) labeled with a pH-sensitive dye for the phagocytic cargo. The procedure results in a high yield of dead neuroblastoma cells, which display surface phosphatidylserine, recognized as an &#34;eat-me&#34; signal by phagocytes. The 96-well plate assay is suitable for live-cell time-lapse imaging, or the plate can be successfully fixed prior to further processing and quantified by high-content microscopy. Fixed-cell high-content microscopy enables the assay to be scaled up for screening of small molecule inhibitors or assessing the phagocytic function of genetic variant iPSC lines. While this assay was developed to study phagocytosis of whole dead neuroblastoma cells by iPSC-macrophages, the assay can be easily adapted for other cargoes relevant to neurodegenerative diseases, such as synaptosomes and myelin, and other phagocytic cell types.

Neurodegenerative diseases are associated with dysregulated microglia functions. This article outlines an in vitro assay of phagocytosis of neuroblastoma cells by iPSC-macrophages. Quantitative microscopy readouts are described for both live-cell time-lapse imaging and fixed-cell high-content imaging.

iPSCマクロファージによる死んだ神経芽細胞の食細胞に対するインビトロ定量イメージングアッセイ

Microglia orchestrate neuroimmune responses in several neurodegenerative diseases, including Parkinson&#39;s disease and Alzheimer&#39;s disease. ...

Assessing the Age-Specific Phagocytic Ability of Adult Drosophila melanogaster Hemocytes using an In Vivo Phagocytosis Assay

Phagocytosis is an essential function of the innate immune response. This process is carried out by phagocytic hemocytes whose primary function is to recognize a wide range of particles and destroy microbial pathogens. As organisms age, this process begins to decline, yet little is known about the underlying mechanisms or the genetic basis of immunosenescence. Here, an injection based in vivo phagocytosis assay is used to assess age related changes in different aspects of phagocytosis, such as binding, engulfment, and degradation of internalized particles, by quantifying phagocytic events in hemocytes in adult Drosophila. Drosophila melanogaster has become an ideal model to investigate age related changes in innate immune function for many reasons. For one, many genetic components and functions of the innate immune response, including phagocytosis, are evolutionarily conserved between Drosophila and mammals. Because of that, results obtained from using this protocol are likely to be widely relevant to understanding the age related changes in immune function in a variety of organisms. Additionally, we note that this method provides quantitative estimates of hemocyte phagocytic ability, which could be useful for a variety of research topics, and need not be limited to studies of aging.

Assessing the Age-Specific Phagocytic Ability of Adult Drosophila melanogaster Hemocytes using an In Vivo Phagocytosis Assay

This protocol describes an in vivo assay of phagocytosis used to assess and quantify the ability of young and aged Drosophila melanogaster hemocytes to phagocytose bacteria.

インビボファゴサイトーシスアッセイを用いた成人ショウジョウバエのメラノガステル血球の年齢特異的食細胞能力の評価

Phagocytosis is an essential function of the innate immune response. This process is carried out by phagocytic hemocytes whose primary function is to ...

An In Vivo Assay to Quantify Bacterial Phagocytosis in Adult Drosophila Flies

Source: Nazario-Toole, A. E., et al. <a href="https://app-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/v/59543">Assessing the Cellular Immune Response of the Fruit Fly, Drosophila melanogaster, Using an In Vivo Phagocytosis Assay.</a> J. Vis. Exp. (2019)
This video demonstrates an in vivo assay designed to measure bacterial phagocytosis in adult Drosophila flies. Following the injection of fluorescently labeled bacteria into the abdomen of adult flies, hemocytes associated with the dorsal vessel engage in phagocytosis. The introduction of trypan blue dye serves to quench the fluorescence emitted by extracellular, non-phagocytosed bacteria. This quenching process enhances the identification of phagocytosed bacteria when observed under a fluorescence microscope.

成虫のショウジョウバエにおける細菌性食作用を定量するためのIn vivoアッセイ

1. Prepare Fluorescein particles for injection

	Reconstitute 10 mg of commercially available, heat-killed bacteria particles labeled with fluorescein ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

免疫学

免疫診断

画像化および視覚化技術

The Phagocytosis Assay: An Immunostaining Technique to Visualize Apoptotic Cell Engulfment in the Embryonic Cells of Drosophila melanogaster

Source: Nonaka, S. et al. <a href="https://app-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/v/56352">Phagocytosis Assay for Apoptotic Cells in Drosophila Embryos.</a> J. Vis. Exp. (2017).
This video demonstrates an immunostaining technique to visualize apoptotic cell engulfment in the homogenized embryonic cells of Drosophila melanogaster. This method provides insights into cellular physiology by determining the extent of apoptotic cell engulfment.

食作用アッセイ:ショウジョウバエの胚細胞におけるアポトーシス細胞の包みを視覚化するための免疫染色技術

Source: Nonaka, S. et al. Phagocytosis Assay for Apoptotic Cells in Drosophila Embryos. J. Vis. Exp. (2017).
This video demonstrates an immunostaining ...

生物学的手法

アッセイ技術

細胞ベースのアッセイ

Fixed Cell Efferocytosis Assay: A Method to Study Efferocytic Uptake of Apoptotic Cells by Macrophages Using Fluorescence Microscopy

Source: Taruc, K., et al. <a href="https://app-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/v/58149">Quantification of Efferocytosis by Single-cell Fluorescence Microscopy.</a> J. Vis. Exp. (2018).
In this video, we demonstrate the efferocytosis assay to study the clearance of apoptotic cells using confocal microscopy. Efferocytosis is a multi-step process where apoptotic cells are engulfed by phagocytes and degraded within vesicles called efferosomes. This protocol provides a method to visualize internalized and non-internalized portions of individual apoptotic cells and quantify efferocytosis.

Fixed Cell Efferocytosis Assay:蛍光顕微鏡を用いたマクロファージによるアポトーシス細胞のエフェロサイトーシス取り込みを研究する方法

Source: Taruc, K., et al. Quantification of Efferocytosis by Single-cell Fluorescence Microscopy. J. Vis. Exp. (2018).
In this video, we demonstrate the ...

アポトーシス細胞の食作用アッセイ

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