著者らはDrs。 Fahad BafakihとJim Mandellによる患者サンプルの取得と同定、Garrett F. Beeghlyの免疫組織化学補助、Biorepository and Tissue Research Facility、心血管研究センターHistology Core、およびバージニア大学のBiomolecular Analysis Facility試料採取、免疫組織化学、および画像化が含まれる。

このプロトコルは、ホルマリン固定パラフィン包埋（FFPE）サンプル中の細胞成分を同定する。パラフィン包埋により、細胞形態および組織形態の最良の維持が可能になるばかりでなく、切片の長寿命が向上する。この分析に用いたサンプルは、University of Virginia Biorepository and Tissue Research Facilityを介してアクセスしました。患者サンプルは、2010年から2013年の間にバージニア大学で腫瘍切除術を完了したグリア芽細胞腫（星状細胞腫、WHOグレードIV）の確定診断に基づいて神経病理学者によって選択され、この分析の前に同定解除された11 。 FFPEサンプル脱パラフィンおよび再水和注：プロトコルのこの部分は、FFPEサンプルに固有です。パラフィン包埋されたサンプルは、細胞およびtの保存のために、この分析のためにより有用であり得るが形態解析を行う場合、この解析はフリーズしたセクションでも行うことができます。凍結切片を使用する場合は、この部分を省略して、発色免疫組織化学に直接進むことができる。 <ol><li>キシレン、キシレン、100％エタノール、100％エタノール、95％エタノール、95％エタノール、70％エタノール、脱イオン水、脱イオン水</li></ol>抗原検索注：プロトコールのこの部分は、FFPEサンプルのホルマリン固定中に形成されたメチレン架橋を破壊し、抗体が結合する抗原部位を露出させるために必要である。 <ol><li>トリスをベースとする高pH抗原非マスキング溶液を蒸留水中の製造業者推奨で希釈する。 </li><li>マイクロウェーブを用いて熱媒介抗原回収を行う。他の形態の熱媒介回収（圧力鍋、野菜蒸し器、または沸騰水など）でも十分である。 <ol><li>希釈されたマスク除去溶液を密封されていない電子レンジに加える容器。スライドを容器に入れる。スライドを電子レンジに置きます。 </li><li>高出力で20分間沸騰させる。蒸発のための液体レベルをモニターし、必要に応じて蒸留水を補充します。 </li></ol></li><li>試料を室温で1時間溶液中で冷却させる。 </li></ol> 3.発色免疫組織化学<ol><li>サンプルをカバーするために必要な試薬の量を最小限にするために、疎水性ペンで組織サンプルを輪郭を描きます。 注：組織サンプルを水和させた状態に保ち、染色効果に影響するため乾燥させないでください。 </li><li>組織サンプル（典型的には約100〜200μL）を覆うのに十分な透過性溶液（トリス緩衝化生理食塩水（TBS）+ 0.01％Triton-X）をピペットで加える。 </li><li>溶液を除去して廃棄し、ステップ3.2を繰り返す。 </li><li>ブロッキング溶液（2.5％ウマ血清+透過液）で室温でサンプルをインキュベートする。 </li><li>サンプルを4℃で一晩インキュベートし、一次抗体を希釈ブロッキング溶液中でインキュベートする。 注：ここで使用したすべての一次抗体は1：200で希釈しますが、製造業者の推奨事項から始めて連続希釈を使用して最適希釈を決定することができます。このプロトコールで使用される抗体の詳細な情報は、以前に公開された11 。 </li><li>最初の抗体宿主動物に対応する西洋ワサビペルオキシダーゼポリマー試薬を使用して、製造元のプロトコルに従って、一次抗体を検出する。 </li><li>組織試料を覆い、5分間インキュベートするのに十分な透過性溶液をピペットで加える。 </li><li>溶液を除去して廃棄し、ステップ3.7を繰り返す。 </li><li>スライドを1x TBS中の0.3％H 2 O 2中で15分間インキュベートする。 </li><li>所望の染色強度が得られるまで、ペルオキシダーゼジアミノベンジジン（DAB）基質を用いて2〜10分間サンプルを展開する。 </li><li>サンプルを対比染色し、ヘマトキシリンなどの細胞核を、製造業者のプロトコルに従って同定する。 </li><li>サンプルを100％脱水し、エタノールおよびキシレン。 </li><li>サンプルをマウントメディアで恒久的にマウントします。 </li></ol> 4.関心領域<ol><li>高解像度画像が可能な明視野顕微鏡下の画像スライド。 注：イメージングセルラーコンポーネントは、最低20倍の解像度で使用してください。 </li><li>組織サンプル全体の関心領域にカメラを移動します。 </li><li>定量化のために画像をTIFFファイルとして保存します。 </li></ol> 5.画像解析<ol><li>カバレッジ率の定量化のためImageJで画像を開きます。 </li><li>ヘマトキシリン染色された核から紫色を除去するには、Threshold Colorプラグインを使用します。 </li><li>画像を8ビットに変換します。 </li><li>暗い背景なしでしきい値を追加します。 </li><li> 17個の予めロードされたImageJ閾値フィルタ（ すなわち MaxEntropy）の1つを使用して画像を処理し、DAB染色部分のみが閾値に含まれるようにする。 注：minimizの最適な事前ロードされたしきい値フィルタを選択してくださいバックグラウンド染色の包含。これは、抗体の染色性および特異性に依存し得る。各患者サンプル内のすべての技術的複製に同じ閾値を使用する。 </li><li>しきい値を適用します。 </li><li>閾値処理された画像の面積％を測定する。 </li><li>各サンプル内の複数の領域の平均カバレッジ面積。 </li></ol>

<ol>
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ここで提案された我々の方法は、伝統的な発色免疫組織化学を用いて染色された組織学的試料を分析する定量的アプローチである。このタイプの分析のための現在の方法論には、同様の染色プロトコール、続いて独立した病理学者による採点が含まれる。この方法は信頼性がありましたが、多くのアプリケーションでは、腫瘍に関連する異種性のより良い理解やin vitro研究のための腫瘍の正確な再現など、細胞構成のより正確な理解が必要です。 このプロトコルは、脳腫瘍微小環境内のグリア細胞の集団を定量的に分析するための直接的な技術を実証する。この技術は広く適応可能であり、血管、ケモカインなどの微小環境の他の多くの成分、ならびに乳房または膵臓のような他の癌を同定するために拡大することができ、腫瘍切除術ではより大きい実質領域。さらに、この技術は、細胞の形状、さらにより複雑な形態学的結果等方性、クラスター化、方向付けなどを評価するために、細胞のカウントおよび細胞周囲などの他の測定値を取得するために適合させることができる。これらの技術はまた、癌に限定されるものではない、という点で、これらの染色および定量化の方法論は、任意の脳のために使用することができる健康な組織の私達の代表タンパク質アトラスの定量化、およびてんかん脳組織11との以前に発表された比較で示したように、分析しています。 このプロトコール内の重要なステップには、適切なインキュベーションと発色二次発色が含まれます。発色色素が過度に発達しないように注意しなければならない。これにより、陽性染色とバックグラウンドとを区別することが困難になる。展開時間は、使用される基質試薬および一次抗体の親和性に依存して変化する。明るいフィールドを使用しますバックグラウンド染色を最小限に抑えながら最適な染色を保証するために、顕微鏡を用いて発色をモニターする。染色後、分析中の適切な閾値処理は、バックグラウンドを陽性染色から区別するのに役立ち得る。この方法の主な制限は、発色染色の使用のために同じ組織サンプル内の複数の成分を染色することができないことである。免疫蛍光分析も同様の方法で行うことができるが、この方法で論じたツールの改変が必要である。 グリア芽腫に特異的に、患者サンプルを分析するために使用された多数のマーカーおよび細胞染色が存在する。これらはIDH1 14、15、16のEGFRvIII、予後マーカーとして17、ならびにCD11bおよびCD45ミクログリアおよびマクロファージ18,19を含みます。我々の方法はこのタイプの分析を拡大するグリア芽細胞腫の腫瘍微小環境のしばしば見落とされる成分である細胞微小環境に影響を及ぼす。研究は、腫瘍20、21、22、並びにアストロサイト9、23、24の寄与におけるミクログリアの存在および密度を見てきました。ここで我々は、脳腫瘍の微小環境において、グリア星状細胞、ミクログリアおよび希突起膠細胞のすべてを調べるプロトコールを開発し、腫瘍の隣接または侵襲領域を腫瘍バルクから区別した。これを行うことで、患者内の異質性を判断したため、患者の状況をより正確に評価できると考えており、以前の発表では、これらの部位の分析と統計モデルへの組み込みは、neまたは全体のサンプル11 。神経膠芽腫の侵略がとてもびまん性であるので、それは難しい完全に1、2を切除すること、我々は隣接する領域内の組織が避けられない再発に寄与し、切除後に残さ侵襲的な組織、より多くの代表であると考えています。したがって、膠芽細胞腫患者の治療に先立って切除された伝統的に研究されたバルク組織とは対照的に、隣接領域のより良い理解は、疾患の再発および患者治療計画についてのより多くの情報を提供し得る。

神経膠芽腫（GBM）、最も一般的な悪性脳腫瘍は、周囲の健康な脳実質1,2に原発腫瘍塊から高度に拡散侵入によって特徴付けられます。この拡散侵入は完全に切除する腫瘍は特に難しくなり、治療後のまま侵入癌細胞は避けられない再発2、3、4のための最も一般的な理由です。以前、我々は、しかし、少しはGBM浸潤に貢献する複雑なメカニズムについて知られている、5治療上有益であることがびまん性神経膠腫細胞の浸潤を阻害することが分かりました。腫瘍微小環境、または癌を取り囲む組織は、複数の癌6,7における腫瘍の進行に関与しています。グリア芽腫腫瘍の微小環境、p星状細胞、ミクログリアおよび希突起膠細胞などの複数のグリア細胞、ならびに細胞外マトリックス、可溶性因子および生物物理学的因子を構成する、比較的特徴が低く、独特に複雑である。実験的に、アストロサイトおよびミクログリアは10、9、神経膠腫の進行および浸潤8を増加させることが示されているが、天然のヒトの脳の微小環境内のすべてのグリア細胞の組成は不明です。 我々は以前微小環境のコンポーネントが定量的に神経膠芽腫微小環境の細胞成分を分析し、比例ハザードモデル11に、私たちの分析を組み込むことにより、患者の生存を予測することができます示しました。ここでは、グリア芽細胞腫患者からの腫瘍切除の腫瘍バルクおよび隣接領域内のグリア細胞の集団を同定するための定量分析方法を説明するs。我々は、グリア細胞集団を同定するために発色免疫組織化学を使用し、各グリア集団の染色のカバレッジ率を分析するためにImageJを使用した。カバレッジ率を評価すると、細胞、特にがん細胞との相互作用によって影響を受ける細胞の形態学的相違を決定するための簡単な測定が行われます。組織病理学的染色を定量化するための以前の研究では、抗体ベースの免疫組織化学染色の特異性を利用していないヘマトキシリンおよびエオシン12またはマッソントリクロム13などの標準染色を使用しています。本発明者らの方法は、グリア芽細胞腫患者の腫瘍切除物中のグリア個体群を直接定量化するために開発されたものであり、これは複雑なグリア芽細胞腫の微小環境を解明することを目的とする。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="573">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Xylene</td>
			<td style="width:71px;">Fisher Chemical</td>
			<td style="width:119px;">X3P</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ethanol</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">High pH antigen unmasking solution</td>
			<td style="width:71px;">Vector Labs</td>
			<td>H-3301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">TBS</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Triton-X</td>
			<td style="width:71px;">Amresco</td>
			<td style="width:119px;">9002-93-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Horse serum</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Anti-ALDH1L1&#160;</td>
			<td style="width:71px;">abcam&#160;</td>
			<td style="width:119px;">ab56777</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Anti-Iba1&#160;</td>
			<td style="width:71px;">abcam&#160;</td>
			<td style="width:119px;">ab5076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Anti-Oligodendrocyte Specific Protein1&#160;</td>
			<td style="width:71px;">abcam&#160;</td>
			<td style="width:119px;">ab53041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">ImmPRESS anti-goat</td>
			<td style="width:71px;">Vector Labs</td>
			<td style="width:119px;">MP-7405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">ImmPRESS Universal (anti-mouse/rabbit)</td>
			<td style="width:71px;">Vector Labs</td>
			<td style="width:119px;">MP-7500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Hydrogen peroxide</td>
			<td style="width:71px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">216763</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">ImmPACT DAB substrate</td>
			<td style="width:71px;">Vector Labs</td>
			<td style="width:119px;">SK-4105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Hematoxylin counterstain</td>
			<td style="width:71px;">ThermoScientific</td>
			<td style="width:119px;">72404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Histochoice Mounting Media</td>
			<td style="width:71px;">Amresco</td>
			<td style="width:119px;">H157-475</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Aperio Scanscope</td>
			<td style="width:71px;">Leica Biosystems</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Image Scanscope</td>
			<td style="width:71px;">Leica Biosystems</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Super HT PAP Pen</td>
			<td style="width:71px;">Research Products International</td>
			<td style="width:119px;">195506</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantitative immunohistochemistry of the cellular microenvironment in patient glioblastoma resections

腫瘍の微小環境への関心が高まっているため、致命的で最も侵襲性の脳腫瘍であるグリア芽細胞腫の患者サンプル内の微小環境成分を特異的に決定する方法を開発しました。定量的方法は、病変組織を正確に記述するのに有益であるばかりでなく、より正確な予後、診断、および組織工学システムおよび置換の開発に潜在的に寄与し得る。グリア芽細胞腫では、グリア細胞（例えば、ミクログリアおよび星状細胞）は、病理学者のグレーディングに基づいて予後不良と独立に相関している。しかしながら、これらの細胞および他のグリア細胞成分の状態は、定量的に十分に記載されていない。これは、これらのグリア細胞を標識する大きなプロセスのために困難であり得る。さらに、大部分の組織学的分析は、全体的な組織サンプルに焦点を当てるか、または腫瘍の大部分内のみに焦点を当てるが、領域に基づく定量化を描写するのではなく高度に異種の組織である。ここで、我々は、グリア芽細胞腫患者からの腫瘍切除の腫瘍バルクおよび隣接領域内のグリア細胞の集団を同定し、定量的に分析するための方法を記載する。本発明者らは、染色体免疫組織化学を用いて、患者の腫瘍切除におけるグリア細胞集団を同定し、ImageJは、各グリア集団についての染色のカバレッジ率を分析した。これらの技術を用いて、神経膠腫腫瘍微小環境の領域全体にわたってグリア細胞をよりよく記述することができる。

この分析のために、原発腫瘍バルクおよび拡散した浸潤性癌細胞を有する健康な組織（ 図1A 、 1B ）を主に含む隣接領域の2つの関心領域を、ヘマトキシリンおよびエオシン染色患者の神経病理学者と共同して同定したサンプル。各患者サンプル内で、発色免疫組織化学によるアストロサイト（ 図1C ）、ミクログリア（ 図1D ）、および希突起膠細胞（ 図1E ）の陽性染色が同定された。これらの集団は、それぞれ一次抗体ALDH1L1、Iba1、および乏突起膠細胞特異的タンパク質（OSP1）を用いて同定された11 。抗体希釈液の最適化と、染色が正確で陽性であるかどうかを確認するための製造業者のプロトコールとの協議が推奨される<html> （ 図2 ）。例えば、陰性対照（ 図2A ）、製造業者推奨（ 図2B ）、およびさらなる希釈（ 図2C 、 2D ）のために一次抗体を用いずに染色を行った（ 図2C ）。抗ALDH1L1抗体のバックグラウンドを最小限に抑えた、細胞体およびプロセスの最適な陽性染色。 ImageJを用いて、OSP1 +希突起膠細胞染色の被覆率を定量化し、最終的に関心領域の差異を比較した（ 図3A ）。陽性DAB染色のみを評価するために、Threshold Colorプラグインを使用して画像から対比染色された核を除去した（ 図3B ）。画像を8ビットに変換した後（ss = &quot;xfig&quot;&gt;図3C）、我々は残りの陽性DAB染色（ 図3D ）にMaxEntropyデフォルト閾値を適用した。ここでは、MaxEntropyしきい値のデフォルト値を使用しました。これは、この特定のデフォルトしきい値がバックグラウンドを最小限に抑えながらポジティブなシングを捕捉したためですが、異なるしきい値を使用して関心のある集団の分析を確実に行うことができます。適切な閾値が画像に適用されると（ 図3E ）、閾値からのカバレッジ率を測定することができ（ 図3F ）、複数の患者について比較することができる。ここでは、関心領域の総面積に応じて、各関心領域内の3〜5領域を定量し、GraphPad Prismソフトウェアとのペアt検定を使用して比較したグループを比較した。我々はまた、我々のGBM分析を、プロテインアトラスデータベース（ 図3F ）の健康な脳組織に見られる対応する染色と比較した。私たちの中で<html>前回の発表では、この分析を33人の患者の複数の微小血管成分（星状細胞、小膠細胞、乏突起膠細胞および血管）に使用して、患者全体の生存率を予測するための比例ハザードモデルを開発した11 。 <img alt="図1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56025/56025fig1.jpg" /> 図1 ：グリア細胞に対する腫瘍バル​​クおよび腫瘍隣接領域の比較。 A）ヘマトキシリンおよびエオシンで染色された患者63の全腫瘍サンプルは、バルクおよび隣接領域が示されている。 B）ヘマトキシリンおよびエオシン染色、 C） ALDH1L1 +星状細胞、 D） Iba1 +ミクログリアおよびE）乏突起膠細胞特異的タンパク質-1（OSP1）+乏突起膠細胞。スケールバー=100μm。<html> 25fig1large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt;この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。 <img alt="図2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56025/56025fig2.jpg" /> 図2 ：抗ALDH1L1抗体の滴定の例。 A）陰性対照、 B）ストックから1:70の製造業者推奨希釈、 C）ストックからの1：200希釈、およびD）ストックからの1：400希釈。 1：200希釈を、細胞体の最適な陽性染色およびバックグラウンドを最小にするプロセスのために、染色および分析に使用した。スケールバー=100μm。 <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56025/56025fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。</a> jpg &quot;/&gt; 図3 ：乏突起膠細胞のAreaJの画像解析と定量化。 A）オリジナルのOSP1 +患者52の染色。B） Threshold_Colourプラグインを使用して紫色の核を除去する。 C） 8ビットへの変換。 D） MaxEntropy閾値を捕捉し、 E）バックグラウンド染色を最小限に抑えるために適用した。 F） OSP1 +カバレッジ率について、プロテインアトラスを介した健康な脳組織と同様に、5人の患者サンプルにおける隣接領域およびバルク領域の比較。 *** p &lt;0.001、**** p &lt;0.0001。スケールバー=100μm。 <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56025/56025fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。</a>

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Quantitative Immunohistochemistry of the Cellular Microenvironment in Patient Glioblastoma Resections

患者の膠芽細胞腫切除における細胞微小環境の定量的免疫組織化学

このプロトコールは、発色免疫組織化学およびImageJを用いたグリア芽腫患者切除における腫瘍微小環境成分を定量的に同定するために開発された。

With the growing interest in the tumor microenvironment, we set out to develop a method to specifically determine the microenvironment components within ...

quantitative-immunohistochemistry-cellular-microenvironment-patient

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Medicine

9.6K ビュー.  University of Virginia. このプロトコールは、発色免疫組織化学およびImageJを用いたグリア芽腫患者切除における腫瘍微小環境成分を定量的に同定するために開発された。 

ビデオ: Quantitative Immunohistochemistry of the Cellular Microenvironment in Patient Glioblastoma Resections

Quantitative Visualization and Detection of Skin Cancer Using Dynamic Thermal Imaging

In 2010 approximately 68,720 melanomas will be diagnosed in the US alone, with around 8,650 resulting in death 1. To date, the only effective treatment for melanoma remains surgical excision, therefore, the key to extended survival is early detection 2,3. Considering the large numbers of patients diagnosed every year and the limitations in accessing specialized care quickly, the development of objective in vivo diagnostic instruments to aid the diagnosis is essential. New techniques to detect skin cancer, especially non-invasive diagnostic tools, are being explored in numerous laboratories. Along with the surgical methods, techniques such as digital photography, dermoscopy, multispectral imaging systems (MelaFind), laser-based systems (confocal scanning laser microscopy, laser doppler perfusion imaging, optical coherence tomography), ultrasound, magnetic resonance imaging, are being tested. Each technique offers unique advantages and disadvantages, many of which pose a compromise between effectiveness and accuracy versus ease of use and cost considerations. Details about these techniques and comparisons are available in the literature 4.
Infrared (IR) imaging was shown to be a useful method to diagnose the signs of certain diseases by measuring the local skin temperature. There is a large body of evidence showing that disease or deviation from normal functioning are accompanied by changes of the temperature of the body, which again affect the temperature of the skin 5,6. Accurate data about the temperature of the human body and skin can provide a wealth of information on the processes responsible for heat generation and thermoregulation, in particular the deviation from normal conditions, often caused by disease. However, IR imaging has not been widely recognized in medicine due to the premature use of the technology 7,8 several decades ago, when temperature measurement accuracy and the spatial resolution were inadequate and sophisticated image processing tools were unavailable. This situation changed dramatically in the late 1990s-2000s. Advances in IR instrumentation, implementation of digital image processing algorithms and dynamic IR imaging, which enables scientists to analyze not only the spatial, but also the temporal thermal behavior of the skin 9, allowed breakthroughs in the field.
In our research, we explore the feasibility of IR imaging, combined with theoretical and experimental studies, as a cost effective, non-invasive, in vivo optical measurement technique for tumor detection, with emphasis on the screening and early detection of melanoma 10-13. In this study, we show data obtained in a patient study in which patients that possess a pigmented lesion with a clinical indication for biopsy are selected for imaging. We compared the difference in thermal responses between healthy and malignant tissue and compared our data with biopsy results. We concluded that the increased metabolic activity of the melanoma lesion can be detected by dynamic infrared imaging.

We demonstrated that malignant pigmented lesions with increased metabolic activity generate quantifiable amounts of heat and the measurement of the transient thermal response of the skin to a cooling excitation allows quantitative identification of melanoma and other skin cancers (vs. non-proliferative nevi) at an early stage of the disease.

定量的な可視化と動的な熱画像を用いた皮膚癌の発見

In 2010 approximately 68,720 melanomas will be diagnosed in the US alone, with around 8,650 resulting in death 1. To date, the only effective treatment ...

医学

Identification and Isolation of Slow-Dividing Cells in Human Glioblastoma Using Carboxy Fluorescein Succinimidyl Ester (CFSE)

Tumor heterogeneity represents a fundamental feature supporting tumor robustness and presents a central obstacle to the development of therapeutic strategies1. To overcome the issue of tumor heterogeneity, it is essential to develop assays and tools enabling phenotypic, (epi)genetic and functional identification and characterization of tumor subpopulations that drive specific disease pathologies and represent clinically relevant targets. It is now well established that tumors exhibit distinct sub-fractions of cells with different frequencies of cell division, and that the functional criteria of being slow cycling is positively associated with tumor formation ability in several cancers including those of the brain, breast, skin and pancreas as well as leukemia2-8. The fluorescent dye carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) has been used for tracking the division frequency of cells in vitro and in vivo in blood-borne tumors and solid tumors such as glioblastoma2,7,8. The cell-permeant non-fluorescent pro-drug of CFSE is converted by intracellular esterases into a fluorescent compound, which is retained within cells by covalently binding to proteins through reaction of its succinimidyl moiety with intracellular amine groups to form stable amide bonds9. The fluorescent dye is equally distributed between daughter cells upon divisions, leading to the halving of the fluorescence intensity with every cell division. This enables tracking of cell cycle frequency up to eight to ten rounds of division10. CFSE retention capacity was used with brain tumor cells to identify and isolate a slow cycling subpopulation (top 5% dye-retaining cells) demonstrated to be enriched in cancer stem cell activity2. 
This protocol describes the technique of staining cells with CFSE and the isolation of individual populations within a culture of human glioblastoma (GBM)-derived cells possessing differing division rates using flow cytometry2. The technique has served to identify and isolate a brain tumor slow-cycling population of cells by virtue of their ability to retain the CFSE labeling.

Identification and Isolation of Slow-Dividing Cells in Human Glioblastoma Using Carboxy Fluorescein Succinimidyl Ester CFSE

This video protocol demonstrates the application of the fluorescent dye carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) for the identification and separation of different sub-populations of cells in human glioblastoma based on frequency of cell division.

カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル（CFSE）を用いてヒト神経膠芽腫のスロー非分裂細胞の同定および単離

Tumor heterogeneity represents a fundamental feature supporting tumor robustness and presents a central obstacle to the development of therapeutic ...

Live Imaging of Drug Responses in the Tumor Microenvironment in Mouse Models of Breast Cancer

The tumor microenvironment plays a pivotal role in tumor initiation, progression, metastasis, and the response to anti-cancer therapies. Three-dimensional co-culture systems are frequently used to explicate tumor-stroma interactions, including their role in drug responses. However, many of the interactions that occur in vivo in the intact microenvironment cannot be completely replicated in these in vitro settings. Thus, direct visualization of these processes in real-time has become an important tool in understanding tumor responses to therapies and identifying the interactions between cancer cells and the stroma that can influence these responses. Here we provide a method for using spinning disk confocal microscopy of live, anesthetized mice to directly observe drug distribution, cancer cell responses and changes in tumor-stroma interactions following administration of systemic therapy in breast cancer models. We describe procedures for labeling different tumor components, treatment of animals for observing therapeutic responses, and the surgical procedure for exposing tumor tissues for imaging up to 40 hours. The results obtained from this protocol are time-lapse movies, in which such processes as drug infiltration, cancer cell death and stromal cell migration can be evaluated using image analysis software.

We describe a method for imaging response to anti-cancer treatment in vivo and at single cell resolution.

乳癌のマウスモデルにおいて腫瘍微小環境における薬剤応答のイメージングを生きる

The tumor microenvironment plays a pivotal role in tumor initiation, progression, metastasis, and the response to anti-cancer therapies. Three-dimensional ...

Cell-based Assay Protocol for the Prognostic Prediction of Idiopathic Scoliosis Using Cellular Dielectric Spectroscopy

This protocol details the experimental and analytical procedure for a cell-based assay developed in our laboratory as a functional test to predict the prognosis of idiopathic scoliosis in asymptomatic and affected children. The assay consists of the evaluation of the functional status of Gi and Gs proteins in peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) by cellular dielectric spectroscopy (CDS), using an automated CDS-based instrument, and the classification of children into three functional groups (FG1, FG2, FG3) with respect to the profile of imbalance between the degree of response to Gi and Gs proteins stimulation. The classification is further confirmed by the differential effect of osteopontin (OPN) on response to Gi stimulation among groups and the severe progression of disease is referenced by FG2. Approximately, a volume of 10 ml of blood is required to extract PBMCs by Ficoll-gradient and cells are then stored in liquid nitrogen. The adequate number of PBMCs to perform the assay is obtained after two days of cell culture. Essentially, cells are first incubated with phytohemmaglutinin (PHA). After 24 hr incubation, medium is replaced by a PHA-free culture medium for an additional 24 hr prior to cell seeding and OPN treatment. Cells are then spectroscopically screened for their responses to somatostatin and isoproterenol, which respectively activate Gi and Gs proteins through their cognate receptors. Both somatostatin and isoproterenol are simultaneously injected with an integrated fluidics system and the cells&#39; responses are monitored for 15 min. The assay can be performed with fresh or frozen PBMCs and the procedure is completed within 4 days.

A structured protocol is presented for a cell-based assay as a functional test to predict the prognosis of idiopathic scoliosis using cellular dielectric spectroscopy (CDS). The assay can be performed with fresh or frozen peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) and the procedure is completed within 4 days.

携帯誘電分光法による特発性側弯症の予後予測のための細胞ベースのアッセイプロトコール

This protocol details the experimental and analytical procedure for a cell-based assay developed in our laboratory as a functional test to predict the ...

Tumor Treating Field Therapy in Combination with Bevacizumab for the Treatment of Recurrent Glioblastoma

A novel device that employs TTF therapy has recently been developed and is currently in use for the treatment of recurrent glioblastoma (rGBM). It was FDA approved in April 2011 for the treatment of patients 22 years or older with rGBM. The device delivers alternating electric fields and is programmed to ensure maximal tumor cell kill1.
Glioblastoma is the most common type of glioma and has an estimated incidence of approximately 10,000 new cases per year in the United States alone2. This tumor is particularly resistant to treatment and is uniformly fatal especially in the recurrent setting3-5. Prior to the approval of the TTF System, the only FDA approved treatment for rGBM was bevacizumab6. Bevacizumab is a humanized monoclonal antibody targeted against the vascular endothelial growth factor (VEGF) protein that drives tumor angiogenesis7. By blocking the VEGF pathway, bevacizumab can result in a significant radiographic response (pseudoresponse), improve progression free survival and reduce corticosteroid requirements in rGBM patients8,9. Bevacizumab however failed to prolong overall survival in a recent phase III trial26. A pivotal phase III trial (EF-11) demonstrated comparable overall survival between physicians&#8217; choice chemotherapy and TTF Therapy but better quality of life were observed in the TTF arm10.
There is currently an unmet need to develop novel approaches designed to prolong overall survival and/or improve quality of life in this unfortunate patient population. One appealing approach would be to combine the two currently approved treatment modalities namely bevacizumab and TTF Therapy. These two treatments are currently approved as monotherapy11,12, but their combination has never been evaluated in a clinical trial. We have developed an approach for combining those two treatment modalities and treated 2 rGBM patients. Here we describe a detailed methodology outlining this novel treatment protocol and present representative data from one of the treated patients.

A novel methodology that is employed for the treatment of recurrent glioblastomas is described. This treatment approach employs the application of alternating electric tumor treating fields (TTFields), known as TTF Therapy in combination with bevacizumab, a targeted agent that is currently FDA approved as monotherapy.

再発神経膠芽腫の治療のためのベバシズマブと組み合わせてフィールド療法の治療腫瘍

A novel device that employs TTF therapy has recently been developed and is currently in use for the treatment of recurrent glioblastoma (rGBM). It was FDA ...

A "Patient-Like" Orthotopic Syngeneic Mouse Model of Hepatocellular Carcinoma Metastasis

The majority of cancer-related deaths are caused by the metastasis of the cancer rather than the primary tumor itself. Yet, the underlying mechanisms of cancer metastasis are still unclear. Animal models are essential for elucidating the mechanisms and for evaluating novel strategies for the treatment of metastatic cancers. Here, an in-depth description of a &#8220;patient-like&#8221; orthotopic syngeneic mouse model for exploring the mechanisms of metastasis of solid organ tumors is provided. The survival surgical implantation of BNL 1ME A.7R.1 mouse hepatocellular carcinoma cells directly into the liver (the organ of origin) of the inbred wild-type immune competent laboratory mouse strain, BALB/c is described. The success and reproducibility of this methodology recommends it for widespread use in elucidating the biological mechanisms of solid organ cancer metastasis.

The metastatic spread of cancer is the major cause of cancer-related deaths. We provide an in-depth description of our survival surgery methodology for establishing a &#8220;patient-like&#8221; orthotopic syngeneic mouse model system for studying the mechanisms of metastasis in solid organ tumors.

肝細胞癌転移の「患者様」同所同系マウスモデル

The majority of cancer-related deaths are caused by the metastasis of the cancer rather than the primary tumor itself. Yet, the underlying mechanisms of ...

A Human Glioblastoma Organotypic Slice Culture Model for Study of Tumor Cell Migration and Patient-specific Effects of Anti-Invasive Drugs

Glioblastoma (GBM) continues to carry an extremely poor clinical prognosis despite surgical, chemotherapeutic, and radiation therapy. Progressive tumor invasion into surrounding brain parenchyma represents an enduring therapeutic challenge. To develop anti-migration therapies for GBM, model systems that provide a physiologically relevant background for controlled experimentation are essential. Here, we present a protocol for generating slice cultures from human GBM tissue obtained during surgical resection. These cultures allow for ex vivo experimentation without passaging through animal xenografts or single cell cultures. Further, we describe the use of time-lapse laser scanning confocal microscopy in conjunction with cell tracking to quantitatively study the migratory behavior of tumor cells and associated response to therapeutics. Slices are reproducibly generated within 90 min of surgical tissue acquisition. Retrovirally-mediated fluorescent cell labeling, confocal imaging, and tumor cell migration analyses are subsequently completed within two weeks of culture. We have successfully used these slice cultures to uncover genetic factors associated with increased migratory behavior in human GBM. Further, we have validated the model&#39;s ability to detect patient-specific variation in response to anti-migration therapies. Moving forward, human GBM slice cultures are an attractive platform for rapid ex vivo assessment of tumor sensitivity to therapeutic agents, in order to advance personalized neuro-oncologic therapy.

Current ex vivo models of glioblastoma (GBM) are not optimized for physiologically relevant study of human tumor invasion. Here, we present a protocol for generation and maintenance of organotypic slice cultures from fresh human GBM tissue. A description of time-lapse microscopy and quantitative cell migration analysis techniques is provided.

腫瘍細胞移動の研究および抗浸潤性薬物の患者特異的効果の研究のためのヒト神経膠芽腫の器官型スライス培養モデル

Glioblastoma (GBM) continues to carry an extremely poor clinical prognosis despite surgical, chemotherapeutic, and radiation therapy. Progressive tumor ...

Generation of Microtumors Using 3D Human Biogel Culture System and Patient-derived Glioblastoma Cells for Kinomic Profiling and Drug Response Testing

The use of patient-derived xenografts for modeling cancers has provided important insight into cancer biology and drug responsiveness. However, they are time consuming, expensive, and labor intensive. To overcome these obstacles, many research groups have turned to spheroid cultures of cancer cells. While useful, tumor spheroids or aggregates do not replicate cell-matrix interactions as found in vivo. As such, three-dimensional (3D) culture approaches utilizing an extracellular matrix scaffold provide a more realistic model system for investigation. Starting from subcutaneous or intracranial xenografts, tumor tissue is dissociated into a single cell suspension akin to cancer stem cell neurospheres. These cells are then embedded into a human-derived extracellular matrix, 3D human biogel, to generate a large number of microtumors. Interestingly, microtumors can be cultured for about a month with high viability and can be used for drug response testing using standard cytotoxicity assays such as 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) and live cell imaging using Calcein-AM. Moreover, they can be analyzed via immunohistochemistry or harvested for molecular profiling, such as array-based high-throughput kinomic profiling, which is detailed here as well. 3D microtumors, thus, represent a versatile high-throughput model system that can more closely replicate in vivo tumor biology than traditional approaches.

Patient-derived xenografts of glioblastoma multiforme can be miniaturized into living microtumors using 3D human biogel culture system. This in vivo-like 3D tumor assay is suitable for drug response testing and molecular profiling, including kinomic analysis.

Kinomicプロファイリングと薬物反応検査のための3D人間バイオゲル培養システムと患者由来の神経膠芽腫細胞を用いた微小腫瘍の発生

The use of patient-derived xenografts for modeling cancers has provided important insight into cancer biology and drug responsiveness. However, they are ...

Extended Time-lapse Intravital Imaging of Real-time Multicellular Dynamics in the Tumor Microenvironment

In the tumor microenvironment, host stromal cells interact with tumor cells to promote tumor progression, angiogenesis, tumor cell dissemination and metastasis. Multicellular interactions in the tumor microenvironment can lead to transient events including directional tumor cell motility and vascular permeability. Quantification of tumor vascular permeability has frequently used end-point experiments to measure extravasation of vascular dyes. However, due to the transient nature of multicellular interactions and vascular permeability, the kinetics of these dynamic events cannot be discerned. By labeling cells and vasculature with injectable dyes or fluorescent proteins, high-resolution time-lapse intravital microscopy has allowed the direct, real-time visualization of transient events in the tumor microenvironment. Here we describe a method for using multiphoton microscopy to perform extended intravital imaging in live mice to directly visualize multicellular dynamics in the tumor microenvironment. This method details cellular labeling strategies, the surgical preparation of a mammary skin flap, the administration of injectable dyes or proteins by tail vein catheter and the acquisition of time-lapse images. The time-lapse sequences obtained from this method facilitate the visualization and quantitation of the kinetics of cellular events of motility and vascular permeability in the tumor microenvironment.

This protocol describes the use of multiphoton microscopy to perform extended time-lapse imaging of multicellular interactions in real time, in vivo at single cell resolution.

腫瘍微小環境におけるリアルタイム多細胞ダイナミクスの拡張タイムラプス生体内イメージング

In the tumor microenvironment, host stromal cells interact with tumor cells to promote tumor progression, angiogenesis, tumor cell dissemination and ...

Quantitative [18F]-Naf-PET-MRI Analysis for the Evaluation of Dynamic Bone Turnover in a Patient with Facetogenic Low Back Pain

Imaging techniques that reflect dynamic bone turnover may aid in characterizing a wide range of bone pathologies. Bone is a dynamic tissue undergoing continuous remodeling with the competing activity of osteoblasts, which produce the new bone matrix, and osteoclasts, whose function is to eliminate mineralized bone. [18F]-NaF is a positron emission tomography (PET) radiotracer that enables visualization of bone metabolism. [18F]-NaF is chemically absorbed into hydroxyapatite in the bone matrix by osteoblasts and can thus noninvasively detect osteoblastic activity, which is occult to conventional imaging techniques. Kinetic modeling of dynamic [18F]-NaF-PET data provides detailed quantitative measures of bone metabolism. Conventional semi-quantitative PET data, which utilizes standardized uptake values (SUVs) as a measure of radiotracer activity, is referred to as a static technique due to its snapshot of tracer uptake in time.&#160; Kinetic modeling, however, utilizes dynamic image data where tracer levels are continuously acquired providing tracer uptake temporal resolution. From the kinetic modeling of dynamic data, quantitative values like blood flow and metabolic rate (i.e., potentially informative metrics of tracer dynamics) can be extracted, all with respect to the measured activity in the image data. When combined with dual modality PET-MRI, region-specific kinetic data can be correlated with anatomically registered high-resolution structural and pathologic information afforded by MRI. The goal of this methodological manuscript is to outline detailed techniques for performing and analyzing dynamic [18F]-NaF-PET-MRI data. The lumbar facet joint is a common site of degenerative arthritis disease and a common cause for axial low back pain.&#160; Recent studies suggest [18F]-NaF-PET may serve as a useful biomarker of painful facetogenic disease.&#160; The human lumbar facet joint will, therefore, be used as a prototypical region of interest for dynamic [18F]-NaF-PET-MRI analysis in this manuscript.

Quantitative [18F]-Naf-PET-MRI Analysis for the Evaluation of Dynamic Bone Turnover in a Patient with Facetogenic Low Back Pain

Imaging techniques that reflect dynamic bone turnover may aid in characterizing a wide range of bone pathologies. We present detailed methodologies for performing and analyzing dynamic [18F]-NaF-PET-MRI data in a patient with facetogenic low back pain using the lumbar facet joints as a prototypical region of interest.

顔面性腰痛患者における動的骨回転率の評価に関する定量的[18F]-Naf-PET-MRI分析

Imaging techniques that reflect dynamic bone turnover may aid in characterizing a wide range of bone pathologies. Bone is a dynamic tissue undergoing ...