Name: protein-trna agarose gel retardation assays for the analysis of the n6-threonylcarbamoyladenosine tcda function
Uploaded: 2017-06-21T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 3 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Protein-tRNA Agarose Gel Retardation Assays for the Analysis of the N6-threonylcarbamoyladenosine TcdA Function at JoVE.com

MCV הוא חבר של CIB Intramural תוכנית &quot;מולקולרית מכונות לחיים טובים יותר&quot; (MACBET). המחקר המוביל לתוצאות אלו קיבל מימון מהמוסד הספרדי של סאלוד קרלוס השלישי (PI12 / 01667 ל- MCV), ה- Ministerio de Economía y Competitividad (CTQ2015-66206-C2-2-R ו- SAF2015-72961-EXP ל- MCV ), הממשלה האזורית של מדריד (S2010 / BD-2316 ל MCV), ואת הנציבות האירופית (Framework Program 7 (FP7)) פרויקט ComplexINC (חוזה מס &#39;279039 כדי MCV). למממנים לא היה תפקיד בתכנון המחקר, איסוף הנתונים וניתוחם, ההחלטה לפרסם או הכנת כתב היד.

זהירות: עיין בכל הגיליונות הרלוונטיים של נתוני בטיחות החומרים (MSDS) לפני השימוש. כמה מן הכימיקלים המשמשים בפרוטוקול זה רעילים ומאכל. השתמש בשיטות המתאימות בעת ביצוע החילוץ של tRNA באמצעות פנול, כולל שימוש במכסה אדים ובציוד מגן אישי (משקפי מגן, כפפות, מעיל מעבדה, מכנסיים באורך מלא, נעלי אצבע סגורות וכו &#39; ). פרוטוקול זה משתמש שאינו רעיל כתם חומצה גרעין. השימוש בכתמים חלופיים עשוי לדרוש אמצעי זהירות נוספים וסילוק מיוחד של סוכן מכתים אם רעילים ו / או מסרטנים ( למשל , ethidium bromide). 1. הכנת ג&#39;ל Agarose <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשקול 2 גרם של agarose ולהוסיף אותו בקבוק זכוכית להכין 2% w / v agelose ג&#39;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 100 מ&quot;ל של 1x tris-borate-ethylenediaminetetraacetic חומצה (EDTA) (TBE) פועל חיץ בקבוק המכיל agarose. ממיסים על ידי חימום במיקרוגל. במרווחים של 30 שניות, מערבולת את התוכן כדי לערבבגם לחזור על שלב זה עד agarose הוא מומס לחלוטין. אפשר פתרון agarose להתקרר עד כ 50-60 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קלטת את הקצוות הפתוחים של מגש ג&#39;ל כדי ליצור עובש, במקום מסרק מתאים כדי ליצור את הבארות ולטיל את agarose מותכת לתוכו. הימנע היווצרות בועה ולתת לו לחזק בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר מוצק, במקום מגש ג&#39;ל ביחידה אלקטרופורזה ולמלא אותו עם חיץ TBE עד הג &#39;ל מכוסה לחלוטין. </li></ol> 2. הכנת tRNA <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אקספרס tRNA (UUU) ב E. coli <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בבוקר, השתמש בבקבוקון של E. coli BL21 קפוא (DE3) שהפך עם וקטור הביטוי pET23d-EcUUU 2 (הנמל קידוד גנים E. coli tRNA (UUU)), כדי להקטין את מלח לוריא נמוך מלח (LB) צלחת בתוספת 100 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​ampicillin. להפוך את הצלחת ומניחים אותו לתוך 37 ° C חממה עד מושבות להופיע (מאוחר אחר הצהרייםOon). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחסן אחד גדל היטב, מושבה אחת ב 5 מ&quot;ל LB בתוספת 100 מיקרוגרם / mL ampicillin ולגדול לילה בסל&quot;ד 220 ב 37 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למחרת בבוקר, גלולה התאים (6,500 XG במשך 10 דקות ב 4 ° C), להחליף בינוני עם 5 מ&quot;ל טרי LB בתוספת 100 מיקרוגרם / mL ampicillin ו resuspend. השתמש ההשעיה לחסן 200 מ&quot;ל LB בתוספת 100 מיקרוגרם / mL ampicillin. לגדול במשך 5 שעות ב 220 סל&quot;ד ב 37 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר צפיפות אופטית של התרבות ב 590 ננומטר (OD 590 ) הגיע 0.6 - 0.8, להוסיף 1 mM IPTG לתרבות כדי להפעיל את הביטוי של הגן tUNA (UUU). לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 3 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קציר התאים על ידי centrifuging את התרבות ב XG 6,500 במשך 10 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תמוגה ומיצוי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend תא גלולה במאגר 5 תמוגה מ&quot;ל (0.3 M אצטט אצטט, 10 מ&quot;מ EDTA). מנקודה זו ואילך, מאגרים autoclaved בשימוש ולשמור את כל דגימות המכילות tRNA ב 4 ° C כדי למנוערנ&quot;א השפלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף נפח 1 של פנול חומצה (pH 4.3) כדי גל גלולה resuspended במכסה המנוע קטר. מערבבים במשך 1 דקות על ידי היפוך lyse התאים צנטריפוגות ב XG 10,000 (10 דקות, 4 ° C). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף את השלב מימית העליון המכיל את tRNA מסיסים (UUU) (וריכוזים קטנים יותר של בריכות tRNA אחרים) באמצעות פיפטה מקפיד לא לשאוב את השלב האורגני (התחתון). מחק את השכבה התחתונה ואת גלולה, אשר מורכב השלב אורגני פסולת התא, לתוך מיכל הולם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לזרז את tRNA על ידי ערבוב יסודי של המסיסים (מימית) שלב עם נפח 2.5% 100 / V אתנול v על ידי היפוך במשך שעה 1 ב 4 ° C. צנטריפוגה התערובת ב XG 15,000 (30 דקות, 4 ° C). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למזוג את supernatant בזהירות resuspend גלולה עשיר tRNA ב 4 מ&quot;ל חיץ סינון ג&#39;ל (20 מ&quot;מ נתרן פוספט או אשלגן פוספט, pH 7.4, 0.1 מ&quot;מ EDTA). הפעל 5 μL של הבריכה tRNA resuspended על 2% w / v agelose ג&#39;ל. הערה:איכות טובה tRNA מופיע כלהקה אחת (גודל מולקולרי בין 50-100 bp). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טיהור של tRNA (UUU) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר תרגול כרומטוגרפי סטנדרטי 12 , לטעון את tRNA resuspended (UUU) על עמודה סינון ג&#39;ל המכינה ברזולוציה גבוהה (מידות: 16 x 600 מ&quot;מ, נפח המיטה: 120 מ&quot;ל, טווח רזולוציה: 1,000-70,000 דה) בעבר equilibrated ב חיץ סינון ג&#39;ל (שלב נייד). הגדר את קצב הזרימה 1 מ&quot;ל / דקות כדי elute דגימות. הערה: נקודת השיא של ה- tRNA (UUU) משתרעת על 75.5 מ&quot;ל. בדרך כלל, תשואה של 0.5-1.0 מ&quot;ג / L tRNA של התרבות ניתן להשיג. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח את דגימות בנפחים אלוטי נציג ידי electrophoresing 5-10 μL של כל מדגם על 2% w / v agelose ג&#39;ל. </li></ol></li></ol> 3. הכנת דגימה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אקספרס ולטהר TcdA על פי López-Estepa et al . 2 . הערה: עד 250 מיקרומטרTCDA ניתן להשתמש עבור המחקר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה את הסכום המקביל של TcdA לפי טבלה 1 לתוך שכותרתו כראוי 1.5 צינורות צנטריפוגה מ&quot;ל. הוסף 1.6 מ&quot;מ טריס (2-carboxyethyl) פוספין (TCEP) (ריכוז סופי) ו לערבב בעדינות באמצעות פיפטה. סגור את המכסה לדגור את התערובת בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 10 מיקרומטר של טריפוספט אדנוזין (ATP) ו 50 מ&quot;מ MgCl 2 (ריכוז סופי). מערבבים עם פיפטה לדגור את התערובת במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף מטוהרים tRNA (UUU) (סעיף 2.3) לפי טבלה 1 , לערבב עם פיפטה ו דגירה בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף פוספט שנאגרו מלוחים (PBS) עד 100 נפח סופי μL. מערבבים כראוי ולהוסיף גליצרול לריכוז סופי של 10% v / v. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> וורטקס המדגם בקצרה לסובב את תוכן הצינור (10,000 xg, 1 דקות, 4 ° C). </li></ol> 4. ג&#39;ל טוען ופיתוח אלקטרופורזה<ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים יחידת אלקטרופורזה לתוך מגש מלא קרח כתוש כדי לשמור על החדר ב 4 מעלות צלזיוס במהלך לרוץ אלקטרופורזה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות, פיפטה 5 μL של כל מדגם לתוך המקביל היטב. הוסף סמן מתאים DNA גודל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חבר את האלקטרודות לחריצים המתאימים של יחידת אספקת החשמל. הפעל את יחידת אספקת החשמל ולהגדיר את המתח ל 100 V ולהפעיל את הג &#39;ל במשך 90 דקות. </li></ol> 5. מכתים ג &#39;ל כדי לראות אינטראקציה חלבון tRNA <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את הפתרון מכתים על ידי ערבוב 50 מ&quot;ל של TBE עם 1x של כתם ה- DNA מתאים. הימנע חשיפת הפתרון מכתים לאור השמש על ידי כיסוי המכיל מכתים עם רדיד אלומיניום. הערה: כתמי ה- DNA מאוחסנים בדרך כלל כ -10,000 או 20,000 מניות מרוכזות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 90 דקות של אלקטרופורזה, להסיר בזהירות את הג&#39;ל מהמגש ומניחים אותו במיכל עם פתרון מכתים. מניחים אותו על נדנדה במהירות נמוכה נדנדה בטמפרטורת החדרUre עבור 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הג &#39;ל agarose מהמכל מכתים, הקש עליו בזהירות על פיסת תאית או נייר סינון כדי להסיר נוזלים עודפים, ומניחים אותו ישירות על transilluminator. להדליק את האור UV לדמיין להקות המכילות tRNA. צלם תמונה של הג&#39;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חלבון מכתים (אופציונלי). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחק את הפתרון מכתים ה- DNA בבטחה (על פי נהלי הבטיחות) ולהחליף אותו עם 50 מ&quot;ל CoLassie מבריק כחול (CBB) פתרון. מניחים את המגש על נדנדה בטמפרטורת החדר ואת הכתם לילה (&gt; 12 שעות). מחק את הפתרון מכתים CBB ולהחליף אותו עם 50 מ&quot;ל PBS להסיר צבע עודף. Destain עבור 1 שעות על נדנדה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחזות חלבון המכילים מתחמי tRNA תחת transilluminator אור ולקחת תמונות של ג &#39;ל להשוות עם תמונה tRNA UV ג&#39;ל. </li></ol>

<ol>
	<li>Scott, V., Clark, A. R., Docherty, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+gel+retardation+assay.">The gel retardation assay.</a> Methods Mol Biol. 31, 339-347 (1994).</li><li>L&#243;pez-Estepa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+crystal+structure+and+small-angle+X-ray+analysis+of+CsdL/TcdA+reveal+a+new+tRNA+binding+motif+in+the+MoeB/E1+superfamily.">The crystal structure and small-angle X-ray analysis of CsdL/TcdA reveal a new tRNA binding motif in the MoeB/E1 superfamily.</a> Plos One. 10 (4), e0118606 (2015).</li><li>Miyauchi, K., Kimura, S., Suzuki, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cyclic+form+of+N6-threonylcarbamoyladenosine+as+a+widely+distributed+tRNA+hypermodification.">A cyclic form of N6-threonylcarbamoyladenosine as a widely distributed tRNA hypermodification.</a> Nat Chem Biol. 9 (2), 105-111 (2013).</li><li>Bolstad, H. M., Botelho, D. J., Wood, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+analysis+of+protein-protein+interactions+within+the+Cysteine+Sulfinate+Desulfinase+Fe-S+cluster+biogenesis+system.">Proteomic analysis of protein-protein interactions within the Cysteine Sulfinate Desulfinase Fe-S cluster biogenesis system.</a> J Proteome Res. 9 (10), 5358-5369 (2010).</li><li>Loiseau, L., Ollagnier-de Choudens, S., Lascoux, D., Forest, E., Fontecave, M., Barras, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+heteromeric+CsdA-CsdE+cysteine+desulfurase,+assisting+Fe-S+cluster+biogenesis+in+Escherichia+coli.">Analysis of the heteromeric CsdA-CsdE cysteine desulfurase, assisting Fe-S cluster biogenesis in Escherichia coli.</a> J Biol Chem. 280 (29), 26760-26769 (2005).</li><li>Fried, M. G., Crothers, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Equilibrium+studies+of+the+cyclic+AMP+receptor+protein-DNA+interaction.">Equilibrium studies of the cyclic AMP receptor protein-DNA interaction.</a> J Mol Biol. 172 (3), 241-262 (1984).</li><li>Garner, M. M., Revzin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+gel+electrophoresis+method+for+quantifying+the+binding+of+proteins+to+specific+DNA+regions:+application+to+components+of+the+Escherichia+coli+lactose+operon+regulatory+system.">A gel electrophoresis method for quantifying the binding of proteins to specific DNA regions: application to components of the Escherichia coli lactose operon regulatory system.</a> Nucleic Acids Res. 9 (13), 3047-3060 (1981).</li><li>Rio, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophoretic+mobility+shift+assays+for+RNA-protein+complexes.">Electrophoretic mobility shift assays for RNA-protein complexes.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2014 (4), 435-440 (2014).</li><li>Ryder, S. P., Recht, M. I., Williamson, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+protein-RNA+interactions+by+gel+mobility+shift.">Quantitative analysis of protein-RNA interactions by gel mobility shift.</a> Methods Mol Biol. 488, 99-115 (2008).</li><li>Yakhnin, A. V., Yakhnin, H., Babitzke, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gel+mobility+shift+assays+to+detect+protein-RNA+interactions.">Gel mobility shift assays to detect protein-RNA interactions.</a> Methods Mol Biol. 905, 201-211 (2012).</li><li>Ream, J. A., Lewis, L. K., Lewis, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+agarose+gel+electrophoretic+mobility+shift+assay+for+quantitating+protein:+RNA+interactions.">Rapid agarose gel electrophoretic mobility shift assay for quantitating protein: RNA interactions.</a> Anal Biochem. 511, 36-41 (2016).</li><li>Hagel, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gel-filtration+chromatography.">Gel-filtration chromatography.</a> Curr Protoc Mol Biol. , (2001).</li></ol>

למחברים אין מה לחשוף.

החלבון tRNA agarose ג&#39;ל פיגור assay המתואר כאן ניתן לשנות במספר דרכים. ראשית, אחוז agarose בג&#39;ל ניתן לצמצם על מנת לאפשר הפרדה והדמיה של מתחמי חלבון tRNA גדול באופן משמעותי מאשר אחד ניתח כאן (120 kDa). שנית, אם חלבון המטרה הוא thermolabile, יש לנקוט אמצעי זהירות נוספים כדי להבטיח כי הטמפרטורה נשמרת מתחת לטמפרטורה המקסימלית המקובלת על ידי הזזת מנגנון אלקטרופורזה לחדר קר או באמצעות חבילות קרח בתוך החדר אלקטרופורזה מיד להפיג את החום המיוצר במהלך הריצה. חיבורים אחרים חיץ ( למשל , 0.5X TB, tris-borate) ופרמטרים פועל (20 V / cm) ניתן לשנות כדי לקצר את זמן הריצה במידת הצורך או מקובל על דגימות 11 . הציע ריכוז MgCl 2 יכול להיות מופחת אם השפלה RNA הוא ציין במהלך שלב הכנה המדגם, מאז cival divalentOns יכול פוטנציאל catalyze של מחשוף של חומצות גרעין. המגבלה העיקרית של הטכניקה היא כי הלהקות tRNA חלבון הם בדרך כלל קצת יותר מפוזר מאלה לראות acrylamide מבוססי ג &#39;ל שיטות פיגור, אשר נוטים להיות חדות וברורות יותר. מגבלה נוספת היא כי ג &#39;ל רחב יותר, ייתכן שיהיה צורך ניתוח סימולטני של דגימות מרובות ואם מתחמי חלבון tRNA בגדלים שונים תשלום הם להיפתר. בהשוואה לשיטות הקיימות, assayose חלבון tRNA agarose ג&#39;ל פיגור מעניק הפחתה משמעותית של זמן עבודה מהכנה המדגם לניתוח. Acrylamide ג&#39;לים, מכילים כימיקלים מזיקים, הם מייגעים להכין ולקחת זמן רב יותר כדי לפלמר. לעומת זאת, ג&#39;ל agarose הם פשוטים, מהר כדי להטיל ולהגדיר, ואינם כרוכים כימיקלים רעילים. הניסוי ניתן להשלים 2 שעות. זה כולל 30 דקות עבור ג &#39;ל להגדיר, 15 דקות להכנת המדגם (אשר יכול להיותנעשה תוך הקירור agarose), 90 דקות עבור אלקטרופורזה להדמיה. יישומים עתידיים של השיטה עשויה לחדד את שיטות האיתור המשמשות בפרוטוקול זה וליישם אותו לזיהוי של מיני רנ&quot;א פחות בשפע, יציב יותר, או מתחמי חלבון אשר עשוי להתבטא רק בכמויות קטנות מאוד. תיוג ה- RNA או מרכיב החלבון עם fluorophores רגישים מאוד יאפשר זיהוי של כמויות קטנות יותר של חלבונים- RNA קומפלקסים. יתר על כן, באמצעות fluorophores עם פליטה שאינם חופפים / פסגות עירור יכול לאפשר ניסויים multiplexing שבו מינים שונים של חלבון ו / או RNA יכול להיות דמיינו בו זמנית בניסוי אחד. קיימים שלושה שלבים קריטיים בפרוטוקול זה. הצעד הקריטי הראשון והבולט ביותר הוא הביטוי והטיהור של tRNA (UUU). אם כמות tRNA מטוהרים (UUU) הוא מתחת לגבול מסוים זיהוי מינימלי (בין 25-200 ng tRNA לכל הלהקה), או להפיץ השפעות להתברר כמו נמוך מזהמים גודל מולקולרי, tRNA צריך להיות מושלך מחדש מטוהרים. באמצעות פנול חומצה (pH 4.3) במהלך החילוץ tRNA הוא חיוני שכן הוא משקע באופן סלקטיבי DNA תוך שמירה על RNA מסיס. הצעד הקריטי השני נוגע הכנת דגימות חלבון tRNA לניתוח. כמויות מספיקות של חלבון ו tRNA יש להשתמש כדי לאפשר זיהוי חזק של כל מתחמי נוצר. יחסי חלבון tRNA טוחנת חייב להיות מותאם כדי לעקור את שיווי המשקל לעבר היווצרות מורכבת. הצעד הקריטי השלישי הוא אלקטרופורזה. המאגר TBE יש להשתמש טרי (לא בשימוש חוזר) ויש צורך לשמור על agarose ג&#39;לים בטמפרטורות שבו מתחמי חלבון tRNA יציבים ולא להכחיש (בדרך כלל, 4-10 מעלות צלזיוס). הטיפול חייב להיות מיושם כדי לשמור על agarose ג&#39;ל קר במהלך אלקטרופורזה כולו, למשל, על ידי הסובבים את החדר אלקטרופורזה עם קרח, במידת האפשר, הפעלת הניסוילא בחדר קר ב 4 ° C. הוכחנו שיטה פשוטה לניתוח, אפיון מתחמי חלבון tRNA באמצעות TCDA-tRNA (UUU) כמערכת מודל, באמצעות אלקטרופורזה agarose ג&#39;ל במקום אלקטרופורזה acrylamide. האחרון לוקח זמן רב יותר כדי להשלים הוא הרבה יותר מייגע. באמצעות שיטה זו, הפרדה אלקטרופורטי על 2% w / v ג&#39;ל agarose (8 ס&quot;מ פורמטים ג&#39;ל) ניתן להשיג פחות מ 90 דקות. זהו כלי נוח לניתוח של אינטראקציות חלבון tRNA ומאפשר ניתוח סימולטני של דגימות מרובות. גרסאות של tRNA ו / או מוטציות חלבון ניתן לבדוק מחייב ויציבות באמצעות שיטה זו.

<html> Assay ג&#39;ל פיגור 1 (הידוע גם בשם assay ניטור אלקטרופורטי ניידות, EMSA) היא שיטה אלקטרופורטית שנועדה ללמוד ולאפיין אינטראקציות חומצה חלבון-חלבון. זה מאפשר ניתוח של DNA- חלבון כמו גם אינטראקציות חלבון- RNA ובמיוחד, אינטראקציות בין tRNA ו tRNA מחייב חלבונים, תוך שימוש ברכיבים מטוהרים או תערובות מורכבות של חלבונים ( למשל , lysates התא) או חומצות גרעין ( למשל , tRNA בריכות). יש לנו להחיל מבחני פיגור ג&#39;ל לחקר האינטראקציה בין tRNA מטוהרים (UUU) ו TcdA, N 6- threonylcarbamoyladenosine (לא 6 A) dehydratase, אשר cyclizes את שרשרת הצד threonylcarbamoyl המצורפת A37 ב לולאה גזע ליקוד (ASL) של tRNAs למחזורי t 6 (ct 6 A) 2 , 3 . TcdA ידוע גם בשם CsdL 3 ,F.&gt; 4. הגן tcdA / csdL יוצר אשכול עם csdA ו- csdE גנים 5 , אשר לקודד את desulfurase ציסטאין ואת acceptor גופרית של מערכת cystinase desulfinate cystinase (CSD) מערכת והוא נדרש כדי לשמור על פונקציית TCDA ב vivo 3 . הרציונל מאחורי מבחני הפיגור ג&#39;ל הוא, בעוד מולקולות חומצות גרעין חופשי נודדות במהירות לחזית של ג&#39;ל acrylamide או agarose מכוח המטען השלילי הגדול שלהם, את הניידות האלקטרופורטית של קומפלקסים חלבונים של חומצות גרעין אותו מופחת באופן דרמטי. צמצום הניידות הוא דמיינו כמו &quot;משמרת&quot; של קומפלקס חומצות גרעין, אשר לפתור כמו להקות נפרדות. טעון חיוביים גדול מורכבים חומצה גרעין מורכבים להראות שינוי גדול יותר או ירידה ניידות על ג&#39;ל. מאז ניטרול המטען של המתחם היא תופעה אוניברסליתעבור מתחמי חומצה גרעין חלבונים, assay פיגור ג&#39;ל ניתן ליישם מגוון רחב של קומפלקסים סוגי חומצה גרעין. השיטה היא פשוטה, זול, והוא יכול להתבצע במעבדות עם ציוד מינימלי. זה דורש רק כמויות קטנות של חלבונים ו tRNA. זהו יתרון על פני טכניקות ביופיסיקליות חלופיות, שבדרך כלל צורכות כמויות גדולות יותר של מדגם. Assay פיגור ג&#39;ל כבר בשימוש נרחב לחקר גורמי שעתוק. Assay שימש כדי לנתח קינטיקה מחייב, כוח, וספציפיות של גורמי שעתוק עבור רצפי DNA שונים. זה היה באמת בתחום זה כי EMSA פותחה לראשונה 6 , 7 . ג&#39;ל מבחני פיגור עם RNA 8 , 9 , 10 , 11 ו מולקולות tRNA שימשו גם במחקר ריבוזוםוכדי לנתח, כפי שאנו עושים כאן, האנזימים שמשנים נוקליאוזידים tRNA לאחר תעתיק. פרמטרים שונים רבים משפיעים על התוצאה של assay פיגור ג&#39;ל כגון טמפרטורה, איכות החלבון מדגם tRNA, ואת כוחו של הכריכה. תכנון וביצוע זהיר של הניסוי הוא קריטי עבור הפרשנות של התוצאות של חומצה גרעין חופשי מינים הקשורים חלבון. כאן, השתמשנו גנים סינתטיים קידוד tRNA (UUU) משובטים לתוך וקטור ביטוי אשר יזם חסר האתר Shine-Dalgarno ריבוזום מחייב, המוביל סינתזה של כמויות גדולות של tRNA 2 . פרוטוקול מפורט זה נועד לספק מדריך ברור לביצוע ניסויי tRNA ג&#39;ל פיגור תוך הימנעות טעויות נפוצות.

<table><tbody><tr><td>&lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt; BL21(DE3)</td><td>Novagen</td><td>70235</td><td>DE3 lysogen contains T7 polymerase upon IPTG induction.</td></tr><tr><td>pET23d</td><td>Novagen</td><td>69748-3</td><td>pET23d confers resistance to ampicillin; T7 promoter.</td></tr><tr><td>LB Broth, Low Salt (Lennox L Broth), Granulated</td><td>Melford</td><td>GL1703</td><td>Conventional LB Broth, High Salt, can also be used.</td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10419313</td><td></td></tr><tr><td>Incubator Shaker (Thermostated)</td><td>NBS</td><td>Excella E24&amp;nbsp;</td><td>Any shaker incubator with temperature control can be used.</td></tr><tr><td>Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside (IPTG), &gt;=99%</td><td>Acros Organics</td><td>BP1755</td><td></td></tr><tr><td>Sodium acetate, anhydrous, &gt;99%</td><td>Melford</td><td>B4017</td><td></td></tr><tr><td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), Disodium salt, &gt;99%</td><td>Acros Organics</td><td>AC327205000</td><td>Harmful if inhaled.</td></tr><tr><td>Centrifuge (refrigerated)</td><td>Eppendorf</td><td>5430</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge (refrigerated) rotor</td><td>Eppendorf</td><td>5430/5430P</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Sorvall</td><td>RC5C</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge rotor</td><td>Sorvall</td><td>SLA-3000</td><td></td></tr><tr><td>Phenol solution, Saturated with 0.1 M citrate buffer, pH 4.3 &amp;plusmn; 0.2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4682</td><td>Acute toxicity (oral, dermal, inhalation), corrosive</td></tr><tr><td>Ethanol absolute for analysis, 100% v/v</td><td>Merck Millipore</td><td>100983</td><td></td></tr><tr><td>Sodium phosphate dibasic dihydrate, Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;, &gt;=99%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71643</td><td></td></tr><tr><td>Potassium dihydrogen phosphate, KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Merck</td><td>48,730,250</td><td></td></tr><tr><td>HiLoad 16/60 Superdex 75&amp;nbsp;</td><td>GE Healthcare</td><td>28989333</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Melford</td><td>MB1200</td><td></td></tr><tr><td>Tris [Tris(hydroxymethyl) aminomethane HCl]</td><td>Melford</td><td>T1513</td><td></td></tr><tr><td>Boric Acid</td><td>Melford</td><td>B0503</td><td></td></tr><tr><td>Microwave</td><td>Haier</td><td>HDA-2070M</td><td></td></tr><tr><td>TCEP [Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride]</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4706</td><td>Corrosive to metals and skin.</td></tr><tr><td>ATP [Adenosine 5&amp;prime;-triphosphate disodium salt hydrate], Grade I, &gt;=99%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2383</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium chloride (MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;), anhydrous, &gt;=98%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>Sodium chloride (NaCl), &gt;99%</td><td>Fisher Bioreagents</td><td>BP358</td><td></td></tr><tr><td>Potassium chloride (KCl), &gt;99%</td><td>Melford</td><td>P0515</td><td></td></tr><tr><td>NZYDNA Ladder VI</td><td>NZYtech</td><td>MB8901</td><td></td></tr><tr><td>Power supply</td><td>Consort</td><td>EV261</td><td></td></tr><tr><td>Electrophoresis unit</td><td>Real Laboratory</td><td>RELSMINI10</td><td></td></tr><tr><td>Real Safe nucleic acid staining</td><td>Real Laboratory</td><td>RBMSAFE</td><td>20,000X stock</td></tr><tr><td>UV Transilluminator (G:Box/EF)</td><td>Syngene</td><td>2216498</td><td></td></tr><tr><td>Coomassie Brilliant Blue G</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B0770</td><td></td></tr><tr><td>Rocker (Gyro-Rocker)</td><td>Stuart</td><td>SSL3</td><td></td></tr><tr><td>Mixer Vortex&amp;nbsp;</td><td>Fisher brand</td><td>13214789</td><td></td></tr></tbody></table>

protein-trna agarose gel retardation assays for the analysis of the n6-threonylcarbamoyladenosine tcda function

אנו מדגימים שיטות הביטוי וטיהור של tRNA (UUU) ב Escherichia coli ואת הניתוח על ידי מבחני ג&#39;ל פיגור של הכריכה של tRNA (UUU) כדי TcdA, N 6- threonylcarbamoyladenosine (לא 6 א) דהידראטאז, אשר cyclizes threonylcarbamoyl בצד שרשרת A37 ב לולאה גזע anticodon (ASL) של tRNAs כדי מחזורי לא 6 A (Ct 6 A). תמלול של גנים סינתטיים קידוד tRNA (UUU) הוא המושרה ב coli עם 1 מ&quot;מ isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) ואת התאים המכילים tRNA נקצרים 24 שעות שלאחר אינדוקציה. חלק RNA הוא מטוהרים באמצעות שיטת חומצה פנול החילוץ. טהור tRNA מתקבל על ידי כרומטוגרפיה סינון ג&#39;ל כי ביעילות מפריד את מולקולות tRNA בגודל קטן מחומצות גרעין שלם שלם או מקוטעת. כדי לנתח TCDA מחייב tRNA (UUU), TcdA מעורבב עם tRNA (UUU) ומופרדים על ג&#39;ל agarose יליד על 4 מעלות צלזיוס.TRNA חופשי (UUU) נודדת מהר יותר, בעוד TCDA-tRNA (UUU) מתחמי עוברים פיגור ניידות כי ניתן לצפות על מכתים של ג &#39;ל. אנו מראים כי TcdA הוא אנזים tRNA (UUU) מחייב. זה assay פיגור ג&#39;ל ניתן להשתמש כדי ללמוד מוטציות TCDA ואת ההשפעות של תוספים וחלבונים אחרים על הכריכה.

כמויות גדולות של tRNA (UUU) ניתן להשיג על ידי להביע את הגן tRNA ב E. coli תחת שליטתו של מקדם T7 חזק inducible. TRNA לידי ביטוי (UUU) מצטבר בציטופלסמה מועשר מעל הבריכה של tRNAs בשפע טבעי. תהליך טיהור דו-שלבי הכולל שלב ללכידה / מיצוי וג&#39;ל סינון / ליטוש צעד נוצל להשיג tRNA בכיתה EMSA. שלב הלכידה / החילוץ משתמש בפנול 4.3 pH כדי להשיג את המשקעים בו-זמנית של חלבון, פסולת התא, DNA, והפקת tRNA (ומולקולות רנ&quot;א אחרות). בשלב זה, כמות הבריכה tRNA הכולל ניתן להעריך על ידי אלקטרופורזה על 2% w / v agelose ג&#39;ל. השלב השני משלב כרומטוגרפיה ג&#39;ל סינון המפריד מינים RNA לפי גודל המולקולרי שלהם. עקבות UV ב 254 ננומטר משמש לפקח על ההפרדה ולזהות את הפסגות elution הראשי ( איור 1)למעלה). נציג aliquots של שברים שיא היו לרוץ על 2% w / v agelose ג&#39;ל לניתוח ( איור 1 תחתית ). רוב המולקולות tRNA שיתוף elute בשיא אחד (באמצע) של לרוץ כרומטוגרפיה (כאן, 75.5 מ&quot;ל בעמודה 120 מ&quot;ל בגודל המיטה). כאשר הפרדת בריכות המכילות מינים יחיד overexpressed, כמו tRNA (UUU), יותר מ 90% של מולקולות tRNA בבריכה שייכים tRNA ספציפי, ואילו מולקולות הנותרים מתאימות tRNAs בשפע טבעי. פסגות משניות נצפות הן לפני והן אחרי השיא המרכזי המכיל tRNA. שיא (ים) לפני להכיל חלקית מושפל יותר מולקולות RNA (שברים 26 ו - 32, ברים באיור 1 ), ואת השיא (ים) בסוף לרוץ טיהור מכילים RNAs קטנים מאוד מזהמים (שברים 45 ו - 51; ברים באיור 1 ). לאחר איגום השברים מתחת לשיא המרכזי (שברים 39-43; ברים באיור 1 ), כמות tRNA מטוהרים ניתן לכמת על ידי ספקטרוסקופיה UV ו / או על ידי השוואה עם סטנדרטים גודל מולקולרי על 2% w / v agelose ג&#39;ל. TCDA ו tRNA (UUU) דגימות ניתן לערבב ביחסים טוחנת שונים מ 1.0 ל 10.0 באמצעות ערכת הדגימה חצי לוגריתמי ( טבלה 1 ) ומופרדים על 2% w / v ג &#39;ל agarose ( איור 2 ). בהתאם ליציבות של מתחמי חלבון tRNA ואת stoichiometry של מחייב, אחד או כמה להקות יכול להיות דמיינו על הג&#39;ל. עבור TcdA-tRNA (UUU), מורכב stoichiometric נוצר כי פועל כמו להקה מבודד המכיל גם חלבון ו tRNA. בדרך כלל, tRNA חופשי נודדת מהר יותר וניתן לראות בתחתית הג&#39;ל, בעוד מתחמי חלבון tRNA, אשר טעונים פחות שלילי גדולים יותר, נוטים להגר לאט. איור 2 מציג ייצוג<html> Ative 2% w / v agelose ג&#39;ל של TCDA-tRNA (UUU) מתחמי. באיור 2 , TCDA בלבד ו- tRNA רק להקות לשמש שולטת שלילית. כמו TRCA: tRNA (UUU) יחס טוחנת מגדילה, את כמות TCDA-tRNA (UUU) מתחמים נוצרו על חשבון הלהקה tRNA חופשי, מגביר. שים לב כי עוצמת tRNA חופשי פוחתת כמו כמות של TCDA מגביר. המורכב הראשון להרכיב הוא קומפלקס stoichiometric 2: 1 המכיל מולקולה אחת tRNA לכל dimer TcdA (גלוי בנתיבים עם 10, 20 או 30 מיקרומטר TCDA). ב TCDA רוויה, גדול יותר מולקולרית במשקל TCDA-tRNA (UUU) מורכבות המכילה קומפלקס stoichiometric 2: 2, שבו הן יחידות TcdA קשורות מולקולה אחת tUNA (UUU) כל אחד (גלוי נתיבים עם 30, 50 או 75 מיקרומטר). שני הנתיבים האחרונים עם TcdA (50 או 75 מיקרומטר) יש קשרו את כל tRNA בתגובה וחסר להקה tRNA חינם. Tp_upload / 55638 / 55638fig1.jpg &quot;/&gt; איור 1: טיהור של tRNA (UUU) על ידי פילטרציה ג&#39;ל. Chromatogram (העליון) של סינון ג&#39;ל של tRNA (UUU) על גבי ברזולוציה גבוהה הגה פילטר סינון נרשם ב 254 ננומטר. הפסגה הגבוהה ביותר, המכילה את הבריכה tRNA מועשר ב tRNA (UUU) הוא eluted ב ~ 75.5 מ&quot;ל. A 2% w / v agelose ג&#39;ל (התחתון) היה לרוץ עם aliquots מ שברים שונים elution tRNA. M, סולם גודל מולקולרי. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55638/55638fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55638/55638fig2.jpg" /> איור 2: Assay פיגור ג &#39;ל עם TCDA ו tRNA (UUU). EMSA מספק ראיות מחייב פיזי של tRNA ל TcdA. דוגמאות היו לרוץ על 2% w / v agelose ג&#39;ל ב 4 מעלות צלזיוס למשך 90 דקות. כמות קבועה של tRNA (UUU), 7.5 μM, היה מעורבב עם כמויות משתנות של TcdA (ראה טבלה 1 ), ו-חלבונים tRNA חלבון הופרדו במהלך לרוץ אלקטרופורזה. הג&#39;ל היה מוכתמים דמיינו על transilluminator UV. כל מסלול מכיל 5 μL של המדגם. M, סולם גודל מולקולרי. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55638/55638fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Protein-tRNA Agarose Gel Retardation Assays for the Analysis of the N6-threonylcarbamoyladenosine TcdA Function at JoVE.com

Protein-tRNA Agarose Gel Retardation Assays for the Analysis of the N6-threonylcarbamoyladenosine TcdA Function

פרוטוקול מוצג לייצור tRNA (UUU) וניתוח של tRNA (UUU) במורכבות עם TDAA אנזים ידי מבחני ג &#39;ל agarose פיגור.

פרוטאין tRNA Agarose ג&#39;ל מבחני פיגור לניתוח של<em&gt; N</em<sup&gt; 6</sup&gt; -Treonylcarbamoyladenosine TCDA פונקציה

We demonstrate methods for the expression and purification of tRNA(UUU) in Escherichia coli and the analysis by gel retardation assays of the binding of ...

protein-trna-agarose-gel-retardation-assays-for-analysis-n6

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Protein-tRNA Agarose Gel Retardation Assays for the Analysis of the N6-threonylcarbamoyladenosine TcdA Function

9.8K Views.  Spanish National Research Council (CSIC).  פרוטוקול מוצג לייצור tRNA (UUU) וניתוח של tRNA (UUU) במורכבות עם TDAA אנזים ידי מבחני ג 'ל agarose פיגור. 

Video: Protein-tRNA Agarose Gel Retardation Assays for the Analysis of the N6-threonylcarbamoyladenosine TcdA Function

Preparation and In Vivo Use of an Activity-based Probe for N-acylethanolamine Acid Amidase

Activity-based protein profiling (ABPP) is a method for the identification of an enzyme of interest in a complex proteome through the use of a chemical probe that targets the enzyme&#39;s active sites. A reporter tag introduced into the probe allows for the detection of the labeled enzyme by in-gel fluorescence scanning, protein blot, fluorescence microscopy, or liquid chromatography-mass spectrometry. Here, we describe the preparation and use of the compound ARN14686, a click chemistry activity-based probe (CC-ABP) that selectively recognizes the enzyme N-acylethanolamine acid amidase (NAAA). NAAA is a cysteine hydrolase that promotes inflammation by deactivating endogenous peroxisome proliferator-activated receptor (PPAR)-alpha agonists such as palmitoylethanolamide (PEA) and oleoylethanolamide (OEA). NAAA is synthesized as an inactive full-length proenzyme, which is activated by autoproteolysis in the acidic pH of the lysosome. Localization studies have shown that NAAA is predominantly expressed in macrophages and other monocyte-derived cells, as well as in B-lymphocytes. We provide examples of how ARN14686 can be used to detect and quantify active NAAA ex vivo in rodent tissues by protein blot and fluorescence microscopy.

Preparation and In Vivo Use of an Activity-based Probe for N-acylethanolamine Acid Amidase

Here, we describe the preparation and use of an activity-based probe (ARN14686, undec-10-ynyl-N-[(3S)-2-oxoazetidin-3-yl]carbamate) that allows for the detection and quantification of the active form of the proinflammatory enzyme N-acylethanolamine acid amidase (NAAA), both in vitro and ex vivo.

הכנה<em&gt; In vivo</em&gt; השתמש של Probe פעילות מבוססת עבור<em&gt; N</em&gt; -acylethanolamine חומצה Amidase

Activity-based protein profiling (ABPP) is a method for the identification of an enzyme of interest in a complex proteome through the use of a chemical ...

In vitro tRNA Methylation Assay with the Entamoeba histolytica DNA and tRNA Methyltransferase Dnmt2 (Ehmeth) Enzyme

Protozoan parasites are among the most devastating infectious agents of humans responsible for a variety of diseases including amebiasis, which is one of the three most common causes of death from parasitic disease. The agent of amebiasis is the amoeba parasite Entamoeba histolytica that exists under two stages: the infective cyst found in food or water and the invasive trophozoite living in the intestine. The clinical manifestations of amebiasis range from being asymptomatic to colitis, dysentery or liver abscesses. E. histolytica is one of the rare unicellular parasite with 5-methylcytosine (5mC) in its genome. 1, 2 It contains a single DNA methyltransferase, Ehmeth, that belongs to the Dnmt2 family. 2 A role for Dnmt2 in the control of repetitive elements has been established in E. histolytica, 3 Dictyostelium discoideum 4,5 and Drosophila. 6 Our recent work has shown that Ehmeth methylates tRNAAsp, and this finding indicates that this enzyme has a dual DNA/tRNAAsp methyltransferase activity. 7 This observation is in agreement with the dual activity that has been reported for D. discoideum and D. melanogaster. 8 The functional significance of the DNA/tRNA specificity of Dnmt2 enzymes is still unknown. To address this question, a method to determine the tRNA methyltransferase activity of Dnmt2 proteins was established. In this video, we describe a straightforward approach to prepare an adequate tRNA substrate for Dnmt2 and a method to measure its tRNA methyltransferase activity.

In vitro tRNA Methylation Assay with the Entamoeba histolytica DNA and tRNA Methyltransferase Dnmt2 Ehmeth Enzyme

This protocol describes the preparation of a synthetic tRNA substrate for the Entamoeba histolytica DNA/tRNA methyltransferase 2 (Dnmt2) homolog Ehmeth and the measure of its methyltransferase activity. This experimental approach can be used for investigating the activity of other Dnmt2 proteins.

ב Assay tRNA מתילציה במבחנה עם histolytica Entamoeba דנ&quot;א Dnmt2 tRNA methyltransferase (Ehmeth) אנזימים

Protozoan parasites are among the most devastating infectious agents of humans responsible for a variety of diseases including amebiasis, which is one of ...

Immunology and Infection

Semi-quantitative Detection of RNA-dependent RNA Polymerase Activity of Human Telomerase Reverse Transcriptase Protein

Human telomerase reverse transcriptase (TERT) is the catalytic subunit of telomerase, and it elongates telomere through RNA-dependent DNA polymerase activity. Although TERT is named as a reverse transcriptase, structural and phylogenetic analyses of TERT demonstrate that TERT is a member of right-handed polymerases, and relates to viral RNA-dependent RNA polymerases (RdRPs) as well as viral reverse transcriptase. We firstly identified RdRP activity of human TERT that generates complementary RNA stand to a template non-coding RNA and contributes to RNA silencing in cancer cells. To analyze this non-canonical enzymatic activity, we developed RdRP assay with recombinant TERT in 2009, thereafter established in vitro RdRP assay for endogenous TERT. In this manuscript, we describe the latter method. Briefly, TERT immune complexes are isolated from cells, and incubated with template RNA and rNTPs including radioactive rNTP for RdRP reaction. To eliminate single-stranded RNA, reaction products are treated with RNase I, and the final products are analyzed with polyacrylamide gel electrophoresis. Radiolabeled RdRP products can be detected by autoradiography after overnight exposure.

Human telomerase reverse transcriptase (TERT) synthesizes not only telomeric DNA but also double-stranded RNA through RNA-dependent RNA polymerase activity. Here, we describe a newly established assay to detect RNA-dependent RNA polymerase activity of endogenous TERT.

גילוי הכמותיים למחצה של RNA תלוית RNA פולימראז פעילות החלבון רוורס טרנסקריפטאז טלומראז אנושי

Human telomerase reverse transcriptase (TERT) is the catalytic subunit of telomerase, and it elongates telomere through RNA-dependent DNA polymerase ...

Genetics

Efficient Purification and LC-MS/MS-based Assay Development for Ten-Eleven Translocation-2 5-Methylcytosine Dioxygenase

The epigenetic transcription regulation mediated by 5-methylcytosine (5mC) has played a critical role in eukaryotic development. Demethylation of these epigenetic marks is accomplished by sequential oxidation by ten-eleven translocation dioxygenases (TET1-3), followed by the thymine-DNA glycosylase-dependent base excision repair. Inactivation of the TET2 gene due to genetic mutations or by other epigenetic mechanisms is associated with a poor prognosis in patients with diverse cancers, especially hematopoietic malignancies. Here, we describe an efficient single step purification of enzymatically active untagged human TET2 dioxygenase using cation exchange chromatography. We further provide a liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) approach that can separate and quantify the four normal DNA bases (A, T, G, and C), as well as the four modified cytosine bases (5-methyl, 5-hydroxymethyl, 5-formyl, and 5-carboxyl). This assay can be used to evaluate the activity of wild type and mutant TET2 dioxygenases.

Here, we present a protocol for an efficient single step purification of the active untagged human ten-eleven translocation-2 (TET2) 5-methylcytosine dioxygenase using ion-exchange chromatography and its assay using a liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS)-based approach.

טיהור יעיל ופיתוח Assay LC-MS/MS-מבוסס על 10-11 טרנסלוקציה-2 5-Methylcytosine Dioxygenase

The epigenetic transcription regulation mediated by 5-methylcytosine (5mC) has played a critical role in eukaryotic development. Demethylation of these ...

An In Vitro Assay to Detect tRNA-Isopentenyl Transferase Activity

N6-isopentenyladenosine RNA modifications are functionally diverse and highly conserved among prokaryotes and eukaryotes. One of the most highly conserved N6-isopentenyladenosine modifications occurs at the A37 position in a subset of tRNAs. This modification improves translation efficiency and fidelity by increasing the affinity of the tRNA for the ribosome. Mutation of enzymes responsible for this modification in eukaryotes are associated with several disease states, including mitochondrial dysfunction and cancer. Therefore, understanding the substrate specificity and biochemical activities of these enzymes is important for understanding of normal and pathologic eukaryotic biology. A diverse array of methods has been employed to characterize i6A modifications. Herein is described a direct approach for the detection of isopentenylation by Mod5. This method utilizes incubation of RNAs with a recombinant isopentenyl transferase, followed by RNase T1 digestion, and 1-dimensional gel electrophoresis analysis to detect i6A modifications. In addition, the potential adaptability of this protocol to characterize other RNA-modifying enzymes is discussed.

An In Vitro Assay to Detect tRNA-Isopentenyl Transferase Activity

Here, we describe a protocol for the biochemical characterization of the yeast RNA-modifying enzyme, Mod5, and discuss how this protocol could be applied to other RNA-modifying enzymes.

Assay ב Vitro לגילוי פעילות טרנספראז tRNA-Isopentenyl

N6-isopentenyladenosine RNA modifications are functionally diverse and highly conserved among prokaryotes and eukaryotes. One of the most highly conserved ...

Antibody-Free Assay for RNA Methyltransferase Activity Analysis

There are more than 100 chemically distinct modifications of RNA, two thirds of which consist of methylations. Interest in RNA modifications, and especially methylations, has re-emerged due to the important roles played by the enzymes that write and erase them in biological processes relevant to disease and cancer. Here, a sensitive in vitro assay for accurate analysis of RNA methylation writer activity on synthetic or in vitro transcribed RNAs is provided. This assay uses a tritiated form of S-adenosyl-methionine, resulting in direct labeling of methylated RNA with tritium. The low energy of tritium radiation makes the method safe, and pre-existing methods of tritium signal amplification, make it possible to quantify and to visualize the methylated RNA without the use of antibodies, which are commonly prone to artifacts. While this method is written for RNA methylation, few tweaks make it applicable to the study of other RNA modifications that can be radioactively labeled, such as RNA acetylation with 14C acetyl coenzyme A. Overall, this assay allows to quickly assess RNA methylation conditions, inhibition with small molecule inhibitors, or the effect of RNA or enzyme mutants, and provides a powerful tool to validate and expand results obtained in cells.

Here, an antibody-free in vitro assay for direct analysis of methyltransferase activity on synthetic or in vitro transcribed RNA is described.

טיפול ללא נוגדנים עבור RNA מתילטרנספראז ניתוח פעילות

There are more than 100 chemically distinct modifications of RNA, two thirds of which consist of methylations. Interest in RNA modifications, and ...

An In Vitro Enzymatic Assay to Measure Transcription Inhibition by Gallium(III) and H3 5,10,15-tris(pentafluorophenyl)corroles

Chemotherapy often involves broad-spectrum cytotoxic agents with many side effects and limited targeting. Corroles are a class of tetrapyrrolic macrocycles that exhibit differential cytostatic and cytotoxic properties in specific cell lines, depending on the identities of the chelated metal and functional groups. The unique behavior of functionalized corroles towards specific cell lines introduces the possibility of targeted chemotherapy.
Many anticancer drugs are evaluated by their ability to inhibit RNA transcription. Here we present a step-by-step protocol for RNA transcription in the presence of known and potential inhibitors. The evaluation of the RNA products of the transcription reaction by gel electrophoresis and UV-Vis spectroscopy provides information on inhibitive properties of potential anticancer drug candidates and, with modifications to the assay, more about their mechanism of action.
Little is known about the molecular mechanism of action of corrole cytotoxicity. In this experiment, we consider two corrole compounds: gallium(III) 5,10,15-(tris)pentafluorophenylcorrole (Ga(tpfc)) and freebase analogue 5,10,15-(tris)pentafluorophenylcorrole (tpfc). An RNA transcription assay was used to examine the inhibitive properties of the corroles. Five transcription reactions were prepared: DNA treated with Actinomycin D, triptolide, Ga(tpfc), tpfc at a [complex]:[template DNA base] ratio of 0.01, respectively, and an untreated control.
The transcription reactions were analyzed after 4 hr using agarose gel electrophoresis and UV-Vis spectroscopy. There is clear inhibition by Ga(tpfc), Actinomycin D, and triptolide.
This RNA transcription assay can be modified to provide more mechanistic detail by varying the concentrations of the anticancer complex, DNA, or polymerase enzyme, or by incubating the DNA or polymerase with the complexes prior to RNA transcription; these modifications would differentiate between an inhibition mechanism involving the DNA or the enzyme. Adding the complex after RNA transcription can be used to test whether the complexes degrade or hydrolyze the RNA. This assay can also be used to study additional anticancer candidates.

An In Vitro Enzymatic Assay to Measure Transcription Inhibition by GalliumIII and H3 5,10,15-trispentafluorophenylcorroles

Gallium(III) 5,10,15-(tris)pentafluorophenylcorrole and its freebase analogue exhibit low micromolar cell cytotoxicity. This manuscript describes an RNA transcription reaction, imaging RNA with an ethidium bromide-stained gel, and quantifying RNA with UV-Vis spectroscopy, in order to assess transcription inhibition by corroles and demonstrates a straightforward method of evaluating anticancer candidate properties.

<em&gt; במבחנה</em&gt; אנזימתי Assay למדוד תמלול עיכוב על ידי גליום (III) ו- H<sub&gt; 3</sub&gt; 5,10,15-טריס corroles (pentafluorophenyl)

Chemotherapy often involves broad-spectrum cytotoxic agents with many side effects and limited targeting. Corroles are a class of tetrapyrrolic ...

Bioengineering

Nucleocapsid Annealing-Mediated Electrophoresis (NAME) Assay Allows the Rapid Identification of HIV-1 Nucleocapsid Inhibitors

RNA or DNA folded in stable tridimensional folding are interesting targets in the development of antitumor or antiviral drugs. In the case of HIV-1, viral proteins involved in the regulation of the virus activity recognize several nucleic acids. The nucleocapsid protein NCp7 (NC) is a key protein regulating several processes during virus replication. NC is in fact a chaperone destabilizing the secondary structures of RNA and DNA and facilitating their annealing. The inactivation of NC is a new approach and an interesting target for anti-HIV therapy. The Nucleocapsid Annealing-Mediated Electrophoresis (NAME) assay was developed to identify molecules able to inhibit the melting and annealing of RNA and DNA folded in thermodynamically stable tridimensional conformations, such as hairpin structures of TAR and cTAR elements of HIV, by the nucleocapsid protein of HIV-1. The new assay employs either the recombinant or the synthetic protein, and oligonucleotides without the need of their previous labeling. The analysis of the results is achieved by standard polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) followed by conventional nucleic acid staining. The protocol reported in this work describes how to perform the NAME assay with the full-length protein or its truncated version lacking the basic N-terminal domain, both competent as nucleic acids chaperones, and how to assess the inhibition of NC chaperone activity by a threading intercalator. Moreover, NAME can be performed in two different modes, useful to obtain indications on the putative mechanism of action of the identified NC inhibitors.

Nucleocapsid Annealing-Mediated Electrophoresis NAME Assay Allows the Rapid Identification of HIV-1 Nucleocapsid Inhibitors

This protocol describes NAME, an assay that allows the rapid identification of molecules able to inhibit in vitro the chaperone activities of HIV-1 nucleocapsid protein.

חישול בתיווך Nucleocapsid אלקטרופורזה (NAME) Assay מאפשר זיהוי המהיר של HIV-1 Nucleocapsid המעכבים

RNA or DNA folded in stable tridimensional folding are interesting targets in the development of antitumor or antiviral drugs. In the case of HIV-1, viral ...

Telomerase Activity in the Various Regions of Mouse Brain: Non-Radioactive Telomerase Repeat Amplification Protocol (TRAP) Assay

Telomerase, a ribonucleoprotein, is responsible for maintaining the telomere length and therefore promoting genomic integrity, proliferation, and lifespan. In addition, telomerase protects the mitochondria from oxidative stress and confers resistance to apoptosis, suggesting its possible importance for the surviving of non-mitotic, highly active cells such as neurons. We previously demonstrated the ability of novel telomerase activators to increase telomerase activity and expression in the various mouse brain regions and to protect motor neurons cells from oxidative stress. These results strengthen the notion that telomerase is involved in the protection of neurons from various lesions. To underline the role of telomerase in the brain, we here compare the activity of telomerase in male and female mouse brain and its dependence on age. TRAP assay is a standard method for detecting telomerase activity in various tissues or cell lines. Here we demonstrate the analysis of telomerase activity in three regions of the mouse brain by non-denaturing protein extraction using CHAPS lysis buffer followed by modification of the standard TRAP assay.
In this 2-step assay, endogenous telomerase elongates a specific telomerase substrate (TS primer) by adding TTAGGG 6 bp repeats (telomerase reaction). The telomerase reaction products are amplified by PCR reaction creating a DNA ladder of 6 bp increments. The analysis of the DNA ladder is made by 4.5% high resolution agarose gel electrophoresis followed by staining with highly sensitive nucleic acid stain.
Compared to the traditional TRAP assay that utilize 32P labeled radioactive dCTP&#39;s for DNA detection and polyacrylamide gel electrophoresis for resolving the DNA ladder, this protocol offers a non-toxic time saving TRAP assay for evaluating telomerase activity in the mouse brain, demonstrating the ability to detect differences in telomerase activity in the various female and male mouse brain region.

Telomerase Activity in the Various Regions of Mouse Brain: Non-Radioactive Telomerase Repeat Amplification Protocol TRAP Assay

Telomerase is expressed in the neonatal brain and also in distinct regions of the adult brain. We present a non-toxic time saving TRAP assay for the analysis of telomerase activity in various regions of the mouse brain and detection of differences in telomerase activity between male and female mouse brains.

פעילות telomerase באזורים שונים של מוח עכבר: הטלומרז לא רדיואקטיבי חזור הגברה פרוטוקול Assay (TRAP)

Telomerase, a ribonucleoprotein, is responsible for maintaining the telomere length and therefore promoting genomic integrity, proliferation, and ...

Neuroscience

Genome-wide Analysis of Aminoacylation (Charging) Levels of tRNA Using Microarrays

tRNA aminoacylation, or charging, levels can rapidly change within a cell in response to the environment[1]. Changes in tRNA charging levels in both prokaryotic and eukaryotic cells lead to translational regulation which is a major cellular mechanism of stress response. Familiar examples are the stringent response in E. coli and the Gcn2 stress response pathway in yeast ([2-6]). Recent work in E. coli and S. cerevisiae have shown that tRNA charging patterns are highly dynamic and depends on the type of stress experienced by cells [1, 6, 7]. The highly dynamic, variable nature of tRNA charging makes it essential to determine changes in tRNA charging levels at the genomic scale, in order to fully elucidate cellular response to environmental variations. In this review we present a method for simultaneously measuring the relative charging levels of all tRNAs in S. cerevisiae . While the protocol presented here is for yeast, this protocol has been successfully applied for determining relative charging levels in a wide variety of organisms including E. coli and human cell cultures[7, 8].

Genome-wide Analysis of Aminoacylation Charging Levels of tRNA Using Microarrays

We describe a method for microarray analysis to determine relative aminoacylation levels of all tRNAs from S. cerivisiae.

הגנום כולו ניתוח (טעינה) רמות Aminoacylation של tRNA שימוש microarrays

tRNA aminoacylation, or charging, levels can rapidly change within a cell in response to the environment[1]. Changes in tRNA charging levels in both ...

פרוטאין tRNA Agarose ג'ל מבחני פיגור לניתוח של

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

הכנה

ב Assay tRNA מתילציה במבחנה עם histolytica Entamoeba דנ"א Dnmt2 tRNA methyltransferase (Ehmeth) אנזימים