Maximilian Boeschはオーストリア科学基金FWFのErwinSchrödingerFellowship（助成金番号J-3807）の支援を受けています。

このプロトコルは、標準的な制度倫理審査委員会のガイドラインを完全に遵守しています。ここに示すプロトコールを用いてヒトまたは動物の組織を調査する場合、研究者はその機関または国の関連する審査委員会からの承認を得ることが義務付けられている。 注意：生物学的サンプルを安全に取り扱うための標準的な予防措置がこのプロトコルに適用されます。これには、手袋とラボコートを着用し、できる限りバイオセーフティキャビネットの下で作業を行うことが含まれます。 1.細胞の調製<ol><li> 癌細胞株 <ol><li>適切な培地（ 例えば 、10％（ v / v ）FBS、2mM L-グルタミンおよび1×ペニシリン/ストレプトマイシンを補充したRPMI 1640）中で、37℃でそれぞれのヒトまたはマウス癌細胞株を培養し、収穫する0.05％トリプシン-EDTAまたはいくつかの他の脱アタッチメントによる消化を用いて、サブコンフルエンス（ すなわち、 70〜90％）の細胞審査手続。細胞数を測定し、カウントチャンバーおよびトリパンブルー染色を使用して生存率をチェックする。生存細胞の割合は85％を超えるべきである。 注：SP区画を含むヒト癌細胞株の例には、MCF7 / HTB-22およびSKBR3 / HTB-30（乳癌）、A2780およびSKOV-3 / HTB-77（卵巣癌）およびA549（肺癌） 26が含まれる 。 </li></ol></li><li> 生体外の腫瘍組織 <ol><li>新鮮な外科的腫瘍標本を採取するか、あるいは移植可能なまたは遺伝子操作されたマウス腫瘍モデルから腫瘍組織を採取する。 200〜1,000mgの組織を採取し、機械的解離（ 例えば 、はさみまたはメスを使用）および酵素消化（ 例えば 、コラゲナーゼ/ディスパーゼ/ DNaseカクテルを使用）によって単一細胞懸濁液を生成する。 </li><li>サンプルを70μmカットオフストレーナーでろ過する。細胞数を決定し、カウントチャンバーおよびトリパンblを用いて生存率をチェックする。染色する。 注：消化カクテルには、200μg/ mLコラゲナーゼP、0.8 U / mLディスパーゼおよび25μg/ mL DNase Iが含まれていることが多く、インキュベーション時間は通常20〜50分です。理想的には、組織解離は、調査中の組織27,28,29に最適化されたプロトコルに従って行われる。 </li></ol></li></ol> 2.サンプルのテスト<ol><li>新鮮な培養液中で細胞濃度を1×10 6 cells / mLに調整してください（栄養素を含むビヒクルは、色素の抽出が活性なエネルギーを消費するプロセスで重要です）。最後に、1mLのサンプルを通常のフローサイトメトリー/ FACS丸底チューブ（「試験」と表示）に移す。 注：最適な結果を得るには、細胞濃度を滴定する必要があります（例えば、5 x 10 5 -1 x 10 6 -2.5 x 106細胞/ mL）が、19より高い解像度が得られる。最大数のSP細胞を回収するソートのアプリケーションでのみ、細胞濃度を1×10 7細胞/ mLまで上げることを推奨します。 </li><li>穏やかなボルテックスまたは3〜5倍の再懸濁のいずれかにより、10μMのDCVを試料に加え、よく混合する。阻害コントロールに進む。 注：最適な結果はトリガー色素の滴定（例えば2.5; 5; 10;20μM）に依存するかもしれませんが、より高い色素濃度は一般により高い解像度19をもたらす。 </li></ol> 3.阻害制御<ol><li> 250μLの色素含有細胞懸濁液を新しいフローサイトメトリー/ FACS丸底チューブ（「対照」と表示）に移す。 50μMのベラパミルまたは20μMのFTCを添加し、ピペッティングによりよく混合する。 注：ベラパミルおよびFTCは、SP分析のための最も確立された阻害剤であるが、異なる流出ポンプ特異性を有するy：ベラパミルは、ABCB1およびABCB5を含むいくつかのABC薬物トランスポーターを阻害するが、FTCはABCG2に特異的である（6,19）。個々のサンプルのSP状態が不明な場合、別のチューブでベラパミルとFTCの両方を使用することを推奨します。 </li></ol> 4.染色<ol><li> &#39;テスト&#39;チューブと &#39;コントロール&#39;チューブの両方をキャップし、37℃で暗所で90分間インキュベートし、15分おきに穏やかに攪拌します。 SP細胞の色素抽出の大半は最初の45分以内に起こるが、非SP細胞（分解に寄与する）の色素蓄積は75〜90分後に最大である。 </li><li>染色が完了した後、細胞を3〜4mLの氷冷PBSで洗浄し、100μL（PBSも同様）の容量でペレットを再懸濁する。細胞を暗所に保ち、氷上で冷却し、追加のマーカーの染色に進む。あるいは、フローサイトメトリーアナライト溶解。 </li></ol> 5.他のマーカーの費用<ol><li> DCVで染色した細胞に所望の蛍光色素結合抗体パネルを加え、よく混合し、4〜4℃で暗所で20〜30分間インキュベートする。細胞を3〜4 mLの氷冷PBSで洗浄し、死細胞の識別に進む。 注：DCVとの互換性があり実質的に補償を必要としない抗体フォーマットには、PerCPまたはPerCP-Cy5.5、PE-Cy7、APC、Alexa Fluor 647、APC-Cy7、APC-H7、BV711、Alexa Fluor 750およびBV786 。 DCVと互換性があるが補償が必要なフォーマットには、FITC、Alexa Fluor 488、PE、BV650などがあります。実質的にDCVと互換性のないフォーマットには、BV421、V450、V500などがあります。 </li><li>特定の製造業者が推奨する濃度でDCV染色細胞に7-AAD（またはPI）を添加し、暗所で5〜10分間サンプルをインキュベートする。 70μmのカットオフストレーナーを通してサンプルを濾過し、フローサイトメトリー分析に進む。</li></ol>フローサイトメトリー分析注：染色工程中に各フローサイトメトリー機器をオンにしておくと、サンプルの準備が整うとすぐにすべてが設定されます。これには、システム性能の追跡やタンク補充などの標準保守手順も含まれます。 <ol><li> フローサイトメーター上の細胞を取得し、二変量FSC / SSCドットプロット（図1B）でそれらをゲート。 FSCの異なるシグナル（ すなわち、高さ、幅、面積）を比較することにより、ダブレットおよび凝集物を除外する（図1C）。 <ol><li>死細胞マーカーが含まれている場合、生存細胞画分（ 例えば 、7-AAD陰性）上にゲートする（ 図1D ）。生存可能な一重項細胞を「青色」および「赤色」のDCV発光について二変量点プロット上で可視化する。この目的のために、y軸上に「青色」蛍光チャネル（ 例えば 、450/50）を表示し、X軸上の「赤色」蛍光チャネル（ 例えば 、525/50）。 </li><li>両方のチャンネルをリニアモードに切り替え、それに対応して検出器の電圧を調整して、SPが左下象限のプロットの側面に位置するようにします。逆に、非SPは、細胞周期分布（G1およびG2）を反映するプロットの右上象限に位置する。 SPをゲートし、捕捉を停止する（ 図1E ）。 注：DCVで定義されたSP細胞は、紫色レーザー励起源（ すなわち 、405nmレーザーライン）を備えたフローサイトメトリー機器を用いて検出することができる。放出された蛍光が線形モードで測定され、二変量ドットプロット上に表示された2つの別個のチャネルにおいて測定されることは、SP分析に特有のものである。 DCVの「青色」発光は約450nmで測定され（ 例えば 、450/40標準フィルターで）、DCVの「赤色」発光は約510-585nmで測定される（ 例えば 、510/50、a 525/50または585/15フィルター） 19 。アッセイの特定の化学的性質のために、SPおよび非SP細胞間の分離は、一般に、「赤色」蛍光チャネル19においてより高い。 </li></ol></li><li>禁止コントロールをロードし、データを取得します。 SP細胞は、現在消失しているか、または実質的に減少している（ 図1F ）。必要に応じて、これらのデータに基づいてSPゲートを調整します。 </li><li> SP細胞による表面マーカー発現を調べるために、x軸上にDCVの「赤色」蛍光を残し、対数モード（ 例えば 、APC）でy軸上にそれぞれの蛍光チャネルを表示する。それに対応して検出器の電圧を調整し、調べられたマーカーについて陽性に染色されたSP細胞の画分をゲートする（ 図1G ）。 SP細胞による特定のマーカーの同時発現は、プロット30の左上象限にそれぞれのシグナルを生じる。 </li><li>そのSPセルをデータ化および/またはソートする。 </li></ol>

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著者らは宣言する利益相反はない。原稿の作成には、著者以外の人の関与もない。

癌の臨床管理の進歩は、CSCを標的とする治療様式の開発にも依存する。生物学的サンプルからのCSCの確実な単離を可能にする方法は、適切な標的の同定を促進し、したがって、この努力において非常に重要である。 SP分析は、ABCの薬物トランスポーターを発現するCSC集団を同定するための確立された、そして貴重な技術であり、DCVの実施は、標準的なフローサイトメトリー機器へのその適用性を拡大した。メカニズム的には、SP識別は、ABC薬物輸送体による活性色素流出を利用して、低い蛍光に基づいてCSCを検出し、対応する非SPに残されたプロットの下側に特徴的な局在を伴う。重要なことに、DCVベースのSP検出は、堅牢で直接的な方法であり、最も重要なステップは、細胞の調製（ii）染色プロセス（iii）適切な阻害剤の選択そして（iv）フローサイトメトリー分析。色素押出は活性なエネルギーを消費するプロセスであるため、特に良好な細胞生存率で開始することが重要です。生存可能な（薬物輸送体を発現する）細胞のみがSPを産生することができる。さらに、色素濃度と細胞密度との比を最適化し、それによってSP細胞の分離を増強することがしばしば意味をなさない（これは、DCVと細胞の両方の滴定を必要とする）。一般的な規則は、より高い色素濃度およびより低い細胞濃度の両方が、改善された分離をもたらすことである19 。成功したDCV実験の鍵は、ABC薬物トランスポーター活性の薬理学的阻害剤を用いたSPの機能的検証である。以前に述べたように、ベラパミルおよびFTCは、SP分析のための最も確立された阻害剤であり、異なるポンプ特異性を有する（FTCはABCG2に特異的であるが、ベラパミルはいくつかのポンプを阻害する）。未知のSP状態を有するサンプルについては、したがって、両方を使用することが推奨されるインヒビターを別々のチューブに入れる。別の選択肢は、pan-ABC薬物輸送体阻害剤レセルピン4の使用である。しかし、研究者は、この化合物の自家蛍光が潜在的にDCVシグナル19を妨げる可能性があることを認識すべきである19 。細胞が青色および赤色のDCV発光について分析されたら、両方の集団（ すなわち SPおよび非SP）が最大の分離で見えるように、検出器電圧を調整しなければならない。画像が奇妙に見える場合は、対数スケーリングが理由です（この場合、両方のチャンネルをリニアモードに戻す）。 また、DCVベースのSPアッセイは、癌に特異的でもなく、もともと腫瘍学に応用するために開発されたものでもないことに注意することも重要です。代わりに、それはABCの薬物輸送体に特異的であり、したがって、系統- Sca-1 + c-kit +細胞のような生理学的（組織）幹細胞の検出および単離も容易にする。造血幹細胞25 。さらに、重大な身体部位に専用障壁を確立する分化細胞タイプも、SP特性を示す可能性がある20 。したがって、DCVに基づくSP検出を原発組織に適用することは、適切なマーカーを用いて標的細胞集団の特異的な識別を必要とする。 CSC集団9,23の間での薬物流出ポンプの高い保存性を考慮すると、DCVベースのSP検出は広範に適用可能であり、これはまた、異なる胚葉起源の物質を含む腫瘍実体（例えば、 18 。他の利点には、（i）薬物耐性に直接関係する細胞が同定される（特に、疾患再発を媒介する臨床的に関連する癌細胞サブセットに取り組むために重要である（ii）静的ではなく機能的なパラメータの検出は、より多くのアッセイ特異性を付与し、解像度を改善することができることを示している19,31,32。概念的/技術的側面から、DCVに基づくSP検出は抗体媒介性の表面染色とは明らかに異なる：（i）標的構造は細胞内局在を示し、タンパク質ではなく核酸を表す。 （ii）アッセイは、単なる存在または密度ではなく、タンパク質活性を検出する。 （iii）標的細胞は、陽性シグナルではなく、低蛍光のために定義される。 （iv）DNA結合色素として、DCVは染色中の細胞または色素濃度のわずかな変動にも敏感である19 。 （v）DCV蛍光は線形モードで測定され、対数的には測定されない。 （vi）DCV蛍光（ すなわち 、単一の蛍光団によって生成された蛍光）を、2つの別々のチャネル、すなわちn単一の波長範囲内にある。これらの詳細にもかかわらず、DCVベースのSP分析は容易に実行でき、明らかにCSC研究のためのフローサイトメトリーツールボックスを拡張します。 DCVベースのSP分析はまた、従来の抗体媒介性表面染色（可能な多数のフォーマット）およびALDH酵素活性を検出する商業的アッセイの両方に適合する、他のマーカーの費用をかけるための多くの可能性を提供する。しかしながら、ここでは表面染色に焦点を当て、ALDH活性の共検出に関する方法論的詳細を見るために、読者は公開された文献4を参照する。いずれの場合でも、DCV誘発性SP分析は死細胞識別と組み合わせなければならず、この目的のための明白な試薬は7-AADおよびPIである。 注目すべきは、対応するフローサイトメトリー機器の選別アプリケーションを使用して、DCV規定SP細胞（および非SP対照細胞）をライブ精製することができることである。 SPアッセイは機能的PAを検出するので生存細胞のみが産生するラメラでは、回収されたSP細胞の生存率は一般的に高い（時にはほぼ100％）と予想される。それにもかかわらず、仕分け後の生存性に問題がある場合は、ソーターノズルのサイズ、緩衝剤の性質、選別中の温度など、さまざまな技術的パラメータを確認することができます。より大きなノズルは依然として非常に微妙な細胞に役立つかもしれない）。回収された細胞は、qRT-PCR、ウェスタンブロッティングおよび包括的発現プロファイリング（ 例えば 、遺伝子アレイまたはより最近のRNASeq技術を使用する）などの下流分析に供され得る。さらに、単離されたSP細胞は、機能性幹細胞の特性（ 例えば単細胞のクローン原性および連続移植）について調べることができ、または数ヶ月間安定しているかもしれない豊富または純粋なSP細胞の細胞系を樹立するために継代培養される。私たちの中で本発明者らは、通常の培地および従来の2Dプラスチックフラスコを用いてDCV規定のCSC 9を継代培養したが、足場非依存性/ 3D培養条件および特殊培地などの幹細胞選択様式もまた実現可能である。我々は、所定のSPコンパートメントのインビトロ拡大のための最も好ましい条件は、個々の基準でチェックする必要があることを提案する。 要約すると、ここでは、DCVベースのSP分析によるCSC識別/分離の詳細な実験的ワークフローを示す。我々の論文は、CSC研究者がこの有用な方法を自分たちの研究室で実施し、確立することを支援し、癌の臨床管理改善のための治療的抗CSC戦略の解明を促進しなければならない。

原発性癌治療の有効性は、この疾患の遺伝的および分子的理解の魅力的進歩、治療用抗体および小分子阻害剤などの標的薬物の出現のために、過去10年間で実質的に改善されている。対照的に、転移性および再発性の疾患は依然として典型的に治癒不可能であり、罹患率および死亡率はこれらの臨床的状況において依然として高いままである。 CSCは、腫瘍内の別個の亜集団を表し、クローン原性/腫瘍原性、多剤耐性および非対称細胞分裂1,2などの標準的な幹細胞特性を付与される。したがって、CSCは、転移性の進行および腫瘍の異種性を促進するだけでなく、患者の再発の素因となる治療中も持続する。したがって、治療的CSC除去は、疾患の再発を予防し、がんの長期治癒を可能にする重要な医学的必要性である3 </sup&gt;。 脆弱性の特定およびCSCを根絶する戦略の解明は、その後の発現プロファイリングおよび/または機能検査のための生物学的サンプルからの精製を可能にする方法に大きく依存する。次に、そのような方法は、これらの細胞に特異的な表面、細胞内または機能的マーカーに依存する。 CSC特異的表面マーカーには、CD44、CD133、CD24およびCD90が含まれるが、これらに限定されず、乳癌および大腸癌を含む様々な腫瘍実体におけるCSC集団を同定するために使用されてきた4 。別のマーカーであるアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ALDH）は、細胞内局在を示し、機能的に検出することができ、その酵素的変換により光を生じるそれぞれの基質を提供することができる。この試験を用いて、CSC集団は多様な腫瘍実体においても同定されている5 。一般にSP分析と呼ばれ、ここではm<html> ABC薬物輸送体による活性色素流出を利用して、蛍光dim型幹様細胞の小さな集団を同定する6,7,8。これを達成するために、所与の試料を、受動拡散によってすべての細胞に入り、結合のために核およびミトコンドリアDNAを標的とする親油性DNA結合フルオロフォアの存在下でインキュベートする。 ABC薬物輸送体発現を欠いている非CSCsは染料を蓄積し、明るい蛍光をもたらし、CSCsは蛍光を減少させる染料を能動的に押し出す。薬物輸送体活性の薬理学的阻害は、SP表現型を排除し機能的に確認し、制御目的に使用すべきである。 SP特性を示すCSC集団が、とりわけ、卵巣癌9,10 、前立腺癌11 、&gt; 12、乳癌13 、肺癌14 、子宮内膜癌15 、神経膠腫16,17および骨肉腫18 。重要なことには、特定の腫瘍細胞識別戦略（ある種の宿主細胞集団もSP特性を示すことができる）のような追加の課題があるにもかかわらず、SPアッセイは癌細胞株および原発腫瘍組織の両方に適合する19,20 。 2つの最も確立されたSPを与える薬物輸送体は、ABCB1 / P-糖タンパク質/ MDR1 / CD243およびABCG2 / Bcrp1 / CD338である。しかし、他の薬物トランスポーターもSP表現型の分子決定因子（ 例えば 、ABCB5）であり得る22 。 ABCB1ABCG2の活性は、fumitremorgin C（FTC）6,19を用いて特異的に排除することができるが、ベラパミルで効率的にブロックすることができる。 SP分析の特別な強さは、他の染色（ 例えば 、表面マーカーおよびALDH）と組み合わせることができ、生細胞の回収を可能にし、下流の機能検査と互換性があることである。さらに、SPC検出は、CSC集団の中でABC薬物輸送体の高い保存率のために広く適用可能である（9,23）。 もともと、SP検出は、Hoechst 33342をトリガー色素24として用いて行われている。この染料は優れた解像度を達成するが、紫外線レーザー励起を必要とする。したがって、その適用性は当然、ハイエンドフローサイトメトリー機器に限定される。 DyeCycle Violet（DCV） 25の登場により、新しいAvenuこの方法を紫外線レーザー源を欠く標準的なフローサイトメトリー機器（DCV-SP細胞を分解するのに紫色レーザー源で十分）に応用することができました。重要なことに、Hoechst 33342およびDCVは共通のポンプ特異性を共有しており、どちらの色素も同じ細胞集団を同定する必要があることを示しています。 ここでは、DCVベースのSP分析の詳細な実験プロトコルを提供し、独立したラボで素早く簡単に再生することができます。我々は、この有用な細胞生物学的方法の最適化と標準化に貢献すべきであるCSC研究者のための資料としてこの論文を認識する。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Vybrant DyeCycle Violet</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>V35003</td>
			<td>Ready to use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Verapamil hydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>V4629</td>
			<td>Dissolve in ethanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fumitremorgin C</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F9054</td>
			<td>Dissolve in DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7-AAD (or propidium iodide)</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>420403</td>
			<td>Ready to use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard cell culture reagents (e.g., medium, FBS, L-glutamine, antibiotics, PBS, trypsin-EDTA, etc.)</td>
			<td>Different suppliers</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sample/cells of interest (e.g., human or murine cancer cell line, human or murine tumor tissue)</td>
			<td>Different suppliers</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cytometric instrument (analyzer or cell sorter)</td>
			<td>Different suppliers</td>
			<td></td>
			<td>Violet laser source required</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS tubes (round-bottom)</td>
			<td>Different suppliers</td>
			<td></td>
			<td>Tubes with cap recommended</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#181;m cut-off strainers</td>
			<td>Different suppliers</td>
			<td></td>
			<td>Optional but recommended</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digestion enzyme mix (e.g., collagenase/dispase/Dnase)</td>
			<td>Different suppliers</td>
			<td></td>
			<td>Only relevant for tissue dissociation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flurochrome-conjugated antibodies against surface markers of interest</td>
			<td>Different suppliers</td>
			<td></td>
			<td>Optional</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ALDEFLUOR Kit</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>01700</td>
			<td>Optional</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

harnessing the dna dye-triggered side population phenotype to detect and purify cancer stem cells from biological samples

がんは幹細胞に起因する疾患であり、これらの細胞の根絶が主要な治療目標となっている。 Cancer Stem Cells（CSCs）の脆弱性を解読し、適切な分子標的を特定することは、細胞系やex vivo腫瘍組織などの異種試料での特異的差別を可能にする方法に依存しています。フローサイトメトリー/ FACSは、単一細胞レベルで生物学的サンプルをマルチパラメトリックに解剖するための強力な技術であり、下流の分析のために生きた細胞を回収するための選択方法である。 CD44およびCD133のような表面マーカーならびにアルデヒドデヒドロゲナーゼ酵素活性の検出は、FACSによる腫瘍サンプルからのCSCを定義および分類するためにしばしば用いられてきた。ここで方法論的詳細に示されている相補的アプローチは、一般に側方集団（SP）と呼ばれる蛍光dim細胞の明確な集団を同定するABC薬物トランスポーターによる機能的色素押出を利用する。 SPがん細胞は、標準的な幹細胞の特徴を示し、色素押し出し薬物輸送体（最も頻繁にはABCB1 / P-糖タンパク質/ MDR1 / CD243およびABCG2 / Bcrp1 / CD338）を阻害する物質を使用して廃止され、機能的に確認され得る。さらに、SPアッセイは、表面抗原の染色、アルデヒドデヒドロゲナーゼ検出、および死細胞識別（ 例えば 、7-AADまたはヨウ化プロピジウム（PI））などの他のフローサイトメトリー評価と適合する。したがって、我々は、表現型パラメータではなく機能的に基づいて、CSC同定、単離およびサブキャラクタリゼーションを機械的に行うための価値ある、広く適用可能な方法を記載する。もともとHoechst 33342をトリガー色素として使用していましたが、ここではバイオレットレーザー光源を備えたフローサイトメーターで分解可能な、より新しいViolet色素に基づくSP表現型に焦点を当てます。

A2780細胞の代表的なSP分析であり、これは、以前に細胞の1％未満を占めるSPを保持することが示されたヒト卵巣癌細胞株である9 。細胞を、10％（ v / v ）FBS、2mM L-グルタミンおよび1×ペニシリン/ストレプトマイシンを補充したRPMI1640中で37℃で培養し、0.05％トリプシン-EDTAでの処理を用いて85％コンフルエンシーで採取した。細胞をPBSで洗浄し、70μmのカットオフストレーナーで濾過した。計数チャンバおよびトリパンブルー染色を使用して細胞数を測定し、1×10 6細胞/ mL（新鮮培地）を10μMDCVで暗所で37℃で90分間染色した。並行して、そのアリコートを全く同じ条件下で20μMのFTCの存在下でインキュベートした。細胞を4mLのPBSで洗浄し、ABCG2に対するAPC結合抗体を、事前に滴定した濃度で「試験管」に添加した。インキュベート後4℃で25分間、細胞をPBSで洗浄し、7-AADを添加して死細胞を標識した。試料を氷上で冷却し、FACS装置で分析した。描写されたゲーティング戦略は、組織標本からの試料のような非常に不均一な材料が特定の表面マーカー（ 例えば 、EpCAM、CD45、CD31）を用いて標的細胞画分の事前定義を必要とする場合でも、多かれ少なかれ普遍的に他の試料に適用可能である。示された結果は、他のラボでのDCVベースのSP検出の基準となることを意図しています。したがって、調査された細胞集団の相対的な局在化は、独立した生物学的サンプルを有する他の研究者によって得られたものとほぼ同等であるが、必ずしも同一ではないはずである。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/55634/55634fig1.jpg" /> 図1：ワークフローと代表的な結果 （A）DCV染色を用いたSP検出のための主要フローチャートg。追加のマーカーのコストはオプションですが、死細胞の識別が強く推奨されます。 （ BG ）FACS装置で実施されたA2780ヒト卵巣癌細胞の代表的なSP分析。細胞は、FSC / SSC特性（B）に従ってゲートされ、ダブレットおよび凝集は、FSCの異なるパラメータ（ 例えば 、高さおよび幅）（ C ）を比較することによって除外される。その後、7-AAD陰性（またはPI陰性）細胞画分（ D ）をゲーティングすることによって、死細胞を識別する。次いで、生存単一細胞を、青色および赤色のDCV発光のための線形二変量ドットプロット上に表示し、SP（および対応する非SP）をゲートする（ E ）。それぞれの阻害コントロール（この場合はFTCが使用された）で同じ分析が行われ、これはSPゲート（ F ）内の細胞のほぼ完全な消失をもたらすはずである。最後に、特定されたSPは、 例えば 、dete色素の押し出しの原因となる可能性のあるABC薬物トランスポーターを停止させ、それによってSP表現型（この場合、FTC感受性に沿ったABCG2）を付与する。 （ G ）。 FTC、フミトレモリンC; ALDH、アルデヒドデヒドロゲナーゼ。 <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55634/55634fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。</a>

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Harnessing the DNA Dye-triggered Side Population Phenotype to Detect and Purify Cancer Stem Cells from Biological Samples

生物学的試料からの幹細胞集団の特徴付けおよび単離を可能にする方法は、癌およびそれを超える幹細胞標的化治療の進歩にとって重要である。ここでは、色素誘発性の側方集団表現型を用いた癌幹細胞単離のための詳細なプロトコールを提供する。

生物学的サンプルからの癌幹細胞の検出と精製のためのDNA色素誘発側母集団表現型の活用

Cancer is a stem cell-driven disease and eradication of these cells has become a major therapeutic goal. Deciphering vulnerabilities of Cancer Stem Cells ...

harnessing-dna-dye-triggered-side-population-phenotype-to-detect

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Cancer Research

7.6K ビュー.  Kantonsspital St. Gallen. 生物学的試料からの幹細胞集団の特徴付けおよび単離を可能にする方法は、癌およびそれを超える幹細胞標的化治療の進歩にとって重要である。ここでは、色素誘発性の側方集団表現型を用いた癌幹細胞単離のための詳細なプロトコールを提供する。 

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Cell-Free DNA Integrity Analysis in Urine Samples

Although the presence of circulating cell-free DNA in plasma or serum has been widely shown to be a suitable source of biomarkers for many types of cancer, few studies have focused on the potential use of urine cell-free (UCF) DNA. Starting from the hypotheses that normal apoptotic cells produce highly fragmented DNA and that cancer cells release longer DNA, the potential role of UCF DNA integrity was evaluated as an early diagnostic marker capable of distinguishing between patients with prostate or bladder cancer and healthy individuals.
A UCF DNA integrity analysis is proposed on the basis of four quantitative real-time PCRs of four sequences longer than 250 bp: c-MYC, BCAS1, HER2, and AR. Sequences that frequently have an increased DNA copy number in bladder and prostate cancers were chosen for the analysis, but the method is flexible, and these genes could be substituted with other genes of interest. The potential utility of UCF DNA as a source of biomarkers has already been demonstrated for urologic malignancies, thus paving the way for further studies on UCF DNA characterization. The UCF DNA integrity test has the advantage of being non-invasive, rapid, and easy to perform, with only a few milliliters of urine needed to carry out the analysis.

A method for analyzing DNA integrity in the cell-free supernatant fraction of urine samples is proposed. The method is suitable for early detection of urological malignancies and has proven accurate for the early diagnosis of bladder cancer.

尿サンプル中の無細胞DNAインテグリティ解析

Although the presence of circulating cell-free DNA in plasma or serum has been widely shown to be a suitable source of biomarkers for many types of ...

がん研究

Simple and Rapid Method to Obtain High-quality Tumor DNA from Clinical-pathological Specimens Using Touch Imprint Cytology

It is critical to determine the mutational status in cancer before administration and treatment of specific molecular targeted drugs for cancer patients. In the clinical setting, formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissues are widely used for genetic testing. However, FFPE DNA is generally damaged and fragmented during the fixation process with formalin. Therefore, FFPE DNA is sometimes not adequate for genetic testing because of low quality and quantity of DNA. Here we present a method of touch imprint cytology (TIC) to obtain genomic DNA from cancer cells, which can be observed under a microscope. Cell morphology and cancer cell numbers can be evaluated using TIC specimens. Furthermore, the extraction of genomic DNA from TIC samples can be completed within two days. The total amount and quality of TIC DNA obtained using this method was higher than that of FFPE DNA. This rapid and simple method allows researchers to obtain high-quality DNA for genetic testing (e.g., next generation sequencing analysis, digital PCR, and quantitative real time PCR) and to shorten the turnaround time for reporting results.

Obtaining high-quality genomic DNA from tumor tissues is an essential first step for analyzing genetic alterations using next generation sequencing. In this article, we present a simple and rapid method to enrich tumor cells and obtain intact DNA from touch imprint cytology specimens.

タッチ捺印細胞診を用いた臨床病理標本から質の高い腫瘍 DNA を取得する簡易法

It is critical to determine the mutational status in cancer before administration and treatment of specific molecular targeted drugs for cancer patients. ...

Modeling Osteosarcoma Using Li-Fraumeni Syndrome Patient-derived Induced Pluripotent Stem Cells

Li-Fraumeni syndrome (LFS) is an autosomal dominant hereditary cancer disorder. Patients with LFS are predisposed to a various type of tumors, including osteosarcoma--one of the most frequent primary non-hematologic malignancies in the childhood and adolescence. Therefore, LFS provides an ideal model to study this malignancy. Taking advantage of iPSC methodologies, LFS-associated osteosarcoma can be successfully modeled by differentiating LFS patient iPSCs to mesenchymal stem cells (MSCs), and then to osteoblasts--the cells of origin for osteosarcomas. These LFS osteoblasts recapitulate oncogenic properties of osteosarcoma, providing an attractive model system for delineating the pathogenesis of osteosarcoma. This manuscript demonstrates a protocol for the generation of iPSCs from LFS patient fibroblasts, differentiation of iPSCs to MSCs, differentiation of MSCs to osteoblasts, and in vivo tumorigenesis using LFS osteoblasts. This iPSC disease model can be extended to identify potential biomarkers or therapeutic targets for LFS-associated osteosarcoma.

Here, we present a protocol for the generation of induced pluripotent Stem Cells (iPSCs) from Li-Fraumeni Syndrome (LFS) patient derived fibroblasts, differentiation of iPSCs via mesenchymal stem cells (MSCs) to osteoblasts, and modeling in vivo tumorigenesis using LFS patient-derived osteoblasts.

李 Fraumeni 症候群患者由来の誘導多能性幹細胞を用いた骨肉腫をモデリング

Li-Fraumeni syndrome (LFS) is an autosomal dominant hereditary cancer disorder. Patients with LFS are predisposed to a various type of tumors, including ...

Mesenchymal Stem Cell Isolation from Pulp Tissue and Co-Culture with Cancer Cells to Study Their Interactions

Cancer as a multistep process and complicated disease is not only regulated by individual cell proliferation and growth but also controlled by tumor environment and cell-cell interactions. Identification of cancer and stem cell interactions, including changes in extracellular environment, physical interactions, and secreted factors, might enable the discovery of new therapy options. We combine known co-culture techniques to create a model system for mesenchymal stem cells (MSCs) and cancer cell interactions. In the current study, dental pulp stem cells (DPSCs) and PC-3 prostate cancer cell interactions were examined by direct and indirect co-culture techniques. Condition medium (CM) obtained from DPSCs and 0.4 &#181;m pore sized trans-well membranes were used to study paracrine activity. Co-culture of different cell types together was performed to study direct cell-cell interaction. The results revealed that CM increased cell proliferation and decreased apoptosis in prostate cancer cell cultures. Both CM and trans-well system increased cell migration capacity of PC-3 cells. Cells stained with different membrane dyes were seeded into the same culture vessels, and DPSCs participated in a self-organized structure with PC-3 cells under this direct co-culture condition. Overall, the results indicated that co-culture techniques could be useful for cancer and MSC interactions as a model system.

We provide protocols for evaluation of mesenchymal stem cells isolated from dental pulp and prostate cancer cell interactions based on direct and indirect co-culture methods. Condition medium and trans-well membranes are suitable to analyze indirect paracrine activity. Seeding differentially stained cells together is an appropriate model for direct cell-cell interaction.

それらの相互作用を研究する歯髄組織と癌細胞との共培養から間葉系幹細胞の分離

Cancer as a multistep process and complicated disease is not only regulated by individual cell proliferation and growth but also controlled by tumor ...

Obtaining Cancer Stem Cell Spheres from Gynecological and Breast Cancer Tumors

Cancer stem cells (CSC) are a small population with self-renewal and plasticity which are responsible for tumorigenesis, resistance to treatment and recurrent disease. This population can be identified by surface markers, enzymatic activity and a functional profile. These approaches per se are limited, due to phenotypic heterogeneity and CSC plasticity. Here, we update the sphere-forming protocol to obtain CSC spheres from breast and gynecological cancers, assessing functional properties, CSC markers and protein expression. The spheres are obtained with single-cell seeding at low density in suspension culture, using a semi-solid methylcellulose medium to avoid migration and aggregates. This profitable protocol can be used in cancer cell lines but also in primary tumors. The tridimensional non-adherent suspension culture thought to mimic the tumor microenvironment, particularly the CSC-niche, is supplemented with epidermal growth factor and basic fibroblast growth factor to ensure CSC signaling. Aiming for robust identification of CSC, we propose a complementary approach, combining functional and phenotypic evaluation. Sphere-forming capacity, self-renewal and sphere projection area establish CSC functional properties. Additionally, characterization comprises flow cytometry evaluation of the markers, represented by CD44+/CD24- and CD133, and Western blot, considering ALDH. The presented protocol was also optimized for primary tumor samples, following a sample digestion procedure, useful for translational research.

The aim of this methodology is to identify cancer stem cells (CSC) in cancer cell lines and primary human tumor samples with the sphere-forming protocol, in a robust manner, using functional assays and phenotypic characterization with flow cytometry and Western blot.

婦人科腫瘍および乳がん腫瘍から癌幹細胞球体を取得する

Cancer stem cells (CSC) are a small population with self-renewal and plasticity which are responsible for tumorigenesis, resistance to treatment and ...

Analysis of Side Population in Solid Tumor Cell Lines

Cancer stem cells (CSCs) are an important cause of tumor growth, metastasis, and recurrence. Isolation and identification of CSCs are of great significance for tumor research. Currently, several techniques are used for the identification and purification of CSCs from tumor tissues and tumor cell lines. Separation and analysis of side population (SP) cells are two of the commonly used methods. The methods rely on the ability of CSCs to rapidly expel fluorescent dyes, such as Hoechst 33342. The efflux of the dye is associated with the ATP-binding cassette (ABC) transporters and can be inhibited by ABC transporter inhibitors. Methods for staining cultured tumor cells with Hoechst 33342 and analyzing the proportion of their SP cells by flow cytometry are described. This assay is convenient, fast, and cost-effective. Data generated in this assay can contribute to a better understanding of the effect of genes or other extracellular and intracellular signals on the stemness properties of tumor cells.

A convenient, fast, and cost-effective method to measure the proportion of side population cells in solid tumor cell lines is presented.

固形腫瘍細胞株における側集団の解析

Cancer stem cells (CSCs) are an important cause of tumor growth, metastasis, and recurrence. Isolation and identification of CSCs are of great ...

Detection of Cell-Free DNA in Blood Plasma Samples of Cancer Patients

Identifying mutations in tumors of cancer patients is a very important step in disease management. These mutations serve as biomarkers for tumor diagnosis as well as for the treatment selection and its response in cancer patients. The current gold standard method for detecting tumor mutations involves a genetic test of tumor DNA by means of tumor biopsies. However, this invasive method is difficult to be performed repeatedly as a follow-up test of the tumor mutational repertoire. Liquid biopsy is a new and emerging technique for detecting tumor mutations as an easy-to-use and non-invasive biopsy approach.
Cancer cells multiply rapidly. In parallel, numerous cancer cells undergo apoptosis. Debris from these cells are released into a patient&#8217;s circulatory system, together with finely fragmented DNA pieces, called cell-free DNA (cfDNA) fragments, which carry tumor DNA mutations. Therefore, for identifying cfDNA based biomarkers using liquid biopsy technique, blood samples are collected from the cancer patients, followed by the separation of plasma and buffy coat. Next, plasma is processed for the isolation of cfDNA, and the respective buffy coat is processed for the isolation of a patient&#39;s genomic DNA. Both nucleic acid samples are then checked for their quantity and quality; and analyzed for mutations using next-generation sequencing (NGS) techniques.
In this manuscript, we present a detailed protocol for liquid biopsy, including blood collection, plasma, and buffy coat separation, cfDNA and germline DNA extraction, quantification of cfDNA or germline DNA, and cfDNA fragment enrichment analysis.

In this paper we present a detailed protocol for non-invasive liquid biopsy technique, including blood collection, plasma and buffy coat separation, cfDNA and germline DNA extraction, quantification of cfDNA or germline DNA, and cfDNA fragment enrichment analysis.

がん患者の血漿サンプルにおける無細胞DNAの検出

Identifying mutations in tumors of cancer patients is a very important step in disease management. These mutations serve as biomarkers for tumor diagnosis ...

Isolation and Functional Assessment of Human Breast Cancer Stem Cells from Cell and Tissue Samples

Breast cancer stem cells (BCSCs) are cancer cells with inherited or acquired stem cell-like characteristics. Despite their low frequency, they are major contributors to breast cancer initiation, relapse, metastasis and therapy resistance. It is imperative to understand the biology of breast cancer stem cells in order to identify novel therapeutic targets to treat breast cancer. Breast cancer stem cells are isolated and characterized based on expression of unique cell surface markers such as CD44, CD24 and enzymatic activity of aldehyde dehydrogenase (ALDH). These ALDHhighCD44+CD24- cells constitute the BCSC population and can be isolated by fluorescence-activated cell sorting (FACS) for downstream functional studies. Depending on the scientific question, different in vitro and in vivo methods can be used to assess the functional characteristics of BCSCs. Here, we provide a detailed experimental protocol for isolation of human BCSCs from both heterogenous populations of breast cancer cells as well as primary tumor tissue obtained from breast cancer patients. In addition, we highlight downstream in vitro and in vivo functional assays including colony forming assays, mammosphere assays, 3D culture models and tumor xenograft assays that can be used to assess BCSC function.

This experimental protocol describes the isolation of BCSCs from breast cancer cell and tissue samples as well as the in vitro and in vivo assays that can be used to assess BCSC phenotype and function.

細胞および組織サンプルからのヒト乳がん幹細胞の単離と機能評価

Breast cancer stem cells (BCSCs) are cancer cells with inherited or acquired stem cell-like characteristics. Despite their low frequency, they are major ...

Pooled shRNA Library Screening to Identify Factors that Modulate a Drug Resistance Phenotype

Understanding clinically relevant driver mechanisms of acquired chemo-resistance is crucial for elucidating ways to circumvent resistance and improve survival in patients with acute myeloid leukemia (AML). A small fraction of leukemic cells that survive chemotherapy have a poised epigenetic state to tolerate chemotherapeutic insult. Further exposure to chemotherapy allows these drug persister cells to attain a fixed epigenetic state, which leads to altered gene expression, resulting in the proliferation of these drug-resistant populations and eventually relapse or refractory disease. Therefore, identifying epigenetic modulations that necessitate the survival of drug-resistant leukemic cells is critical. We detail a protocol to identify epigenetic modulators that mediate resistance to the nucleoside analog cytarabine (AraC) using pooled shRNA library screening in an acquired cytarabine-resistant AML cell line. The library consists of 5,485 shRNA constructs targeting 407 human epigenetic factors, which allows high-throughput epigenetic factor screening.

High-throughput RNA interference (RNAi) screening using a pool of lentiviral shRNAs can be a tool to detect therapeutically relevant synthetic lethal targets in malignancies. We provide a pooled shRNA screening approach to investigate the epigenetic effectors in acute myeloid leukemia (AML).

薬物耐性表現型を調節する因子を同定するためのプールされたshRNAライブラリースクリーニング

Understanding clinically relevant driver mechanisms of acquired chemo-resistance is crucial for elucidating ways to circumvent resistance and improve ...

Simple and Fast Rolling Circle Amplification-Based Detection of Topoisomerase 1 Activity in Crude Biological Samples

Isothermal amplification-based techniques such as the rolling circle amplification have been successfully employed for the detection of nucleic acids, protein amounts, or other relevant molecules. These methods have shown to be substantial alternatives to PCR or ELISA for clinical and research applications. Moreover, the detection of protein amount (by Western blot or immunohistochemistry) is often insufficient to provide information for cancer diagnosis, whereas the measurement of enzyme activity represents a valuable biomarker. Measurement of enzyme activity also allows for the diagnosis and potential treatment of pathogen-borne diseases. In all eukaryotes, topoisomerases are the key DNA-binding enzymes involved in the control of the DNA topological state during important cellular processes and are among the important biomarkers for cancer prognosis and treatment.
Over the years, topoisomerases have been substantially investigated as a potential target of antiparasitic and anticancer drugs with libraries of natural and synthetic small-molecule compounds that are investigated every year. Here, the rolling circle amplification method, termed rolling circle enhanced enzyme activity detection (REEAD) assay that allows for the quantitative measurement of topoisomerase 1 (TOP1) activity in a simple, fast, and gel-free manner is presented.By cleaving and ligating a specially designed DNA substrate, TOP1 converts a DNA oligonucleotide into a closed circle, which becomes the template for rolling circle amplification, yielding ~103 tandem repeat rolling circle products. Depending on the nucleotide incorporation during the amplification, there is the possibility of different readout methods, from fluorescence to chemiluminescence to colorimetric. As each TOP1-mediated cleavage-ligation generates one closed DNA circle, the assay is highly sensitive and directly quantitative.

A protocol for the sensitive and quantitative detection of topoisomerase 1 activity using the rolling circle enhanced enzyme activity detection assay is described. The method allows detection of topoisomerase 1 activity from purified components or cell/tissue extracts. This protocol has wide-ranging applications in any field involving detection of enzymatic activity.

粗生物学的サンプル中のトポイソメラーゼ1活性のシンプルで高速なローリングサークル増幅ベースの検出

Isothermal amplification-based techniques such as the rolling circle amplification have been successfully employed for the detection of nucleic acids, ...