この研究は、カナダの自然科学・工学研究評議会（NSERC）とカナダ健康研究所（CIHR）からの助成によって部分的に支えられています。ウイニペグのビクトリア総合病院とウイニペグのセブンオークス総合病院の応用臨床教育研究所は、ヒト被験者から臨床サンプルを管理していただき、ありがとうございました。 Hagit Peretz-Soroka博士に、アッセイ操作の戦略についての有益な議論に感謝します。 <style type="text/css">
</style>ワイルドー大学のCarolyn Ren教授とXiaoming（Cody）Chen博士に、撮影プロセスにおける豊富なサポートに感謝します。

すべてのヒト試料採取プロトコールは、ウィニペグのマニトバ大学の共同学部研究倫理委員会によって承認された。 マイクロフルイディックデバイス製造（ 図1A ） <ol><li> デザインと印刷透明マスク。 <ol><li>前に詳述したようにデバイスを設計してください。 図1Aを参照のこと。 注記：デバイスには2つのレイヤーがあります。第1の層（高さ4μm）は、勾配チャネルの横の細胞を捕捉するための細胞ドッキングバリアチャネルを規定する。第2の層（高さ60μm）は、勾配生成チャネル、細胞装填のためのポートおよびチャネル、化学的入口リザーバおよび廃棄物出口を規定する。アライメントマークは、2つの層に対して設計されている。第2の層の場合、上流の蛇行入力チャネルの長さおよび幅は、それぞれ60mmおよび200μmであり、下流の長さと幅蛇行入力チャンネルはそれぞれ6mmと280μmです。 </li><li>高解像度プリンタを使用して、第1および第2のレイヤーのフィーチャを透明マスクに印刷します。 注：印刷解像度は、デザインの最小機能によって異なります。現在の設計では、10μmの最小フィーチャに対して32,000dpiが選択された。 </li></ol></li><li> シリコンウェーハをクリーニングします。 <ol><li>プラズマクリーナにシリコンウェーハを3枚入れます。 3分間真空を適用する。 </li><li>プラズマパワーをオンにし、レベルをHIGHに設定します。シリコンウェハを30分間処理するために酸素プラズマを使用する。 </li><li>プラズマクリーナーをオフにしてシリコンウェーハを取り出します。シリコンウェーハはデバイスモールドを製造する準備が整う。 </li></ol></li><li> クリーンルーム施設でフォトリソグラフィーによって第1の層を製作する。 注記：正確な製造パラメータは、製造施設によって異なる場合があります。 <ol><li> 10mLのSU-8 2025を10mLのSU-8 2000をガラスブレーカに入れて設計されたフォトレジストを調製した。泡が消えるまで、混合物をヒュームフードに10分間放置する。 </li><li>洗浄したシリコンウェーハを注意深くスピナーに適切なチャックで置き、真空をかけてシリコンウェーハを固定します。 </li><li>慎重に、3 mLのフォトレジスト混合物をシリコンウェーハの中心に注ぎます。 500rpmで5秒間回転させる。次に、3000rpmで30秒間回転させて、シリコンウェーハ上に最終的な4μmの厚さのフォトレジストコーティングを得る。 </li><li>慎重にスピンナーからシリコンウェーハを取り出し、ホットプレート上でシリコンウェーハを95℃で4分間ベークします。 </li><li>マスクアライナーにシリコンウェーハを慎重に置き、UV暴露時間を6秒に設定します。粘着テープを使用して透明ガラス板上に第1層の透明マスクを慎重に取り付ける。 </li><li>マスクが貼られた透明ガラス板をアライナーに静かに置き、マスクをシリコンウェーハに合わせます。 siを公開するliconウェーハをUVに曝して細胞ドッキング構造をパターニングする。 </li><li>慎重にガラス板を取り外し、露出したシリコンウェーハを取り出します。 95℃で4分間、ホットプレート上でシリコンウェーハを焼く。 </li><li>シリコンウェーハをヒュームフードに移し、SU-8デベロッパーが入っているガラスパンに置きます。これを30秒間静かに振ってください。 </li><li>新鮮なSU-8現像液を使用してシリコンウェーハを洗浄し、次にヒュームフード内のイソプロピルアルコール（IPA）を洗浄します。ヒュームフード内の窒素ガスでシリコンウェーハを乾燥させる。最初のレイヤーが準備完了です。 </li></ol></li><li> 第1層の第2層を製作する。 <ol><li>接着テープを使用して、第1層のアライメントマークをカバーします。慎重に、スピナーの真空チャック上に第1の層を有するシリコンウェーハを置き、真空を適用してシリコンウェーハを固定する。 </li><li>シリコンウェーハ上に3 mLのSU-8 2025フォトレジストを注ぎます。シリコンウェーハを500 rpmで5秒間回転させます。次に2000rpmで30分間回転させるシリコンウェーハ上に最終的な厚さ60μmのフォトレジストコーティングを得る。 </li><li>スピンナーからシリコンウェーハを慎重に取り出し、ホットプレートに移します。 65℃で2分間焼く。 </li><li>粘着テープを静かに取り外して、第1層のアライメントマークを露出させます。ホットプレート上にシリコンウェーハを置き、95℃で6分間ベークします。 </li><li>マスク・アライナにシリコン・ウェーハを慎重に置き、UV照射時間を18秒に設定します。 </li><li>透明なガラス板の上に第2層の透明マスクを粘着テープで注意深く取り付けます。 </li><li>アライナーのガラスにマスクを貼った状態で慎重にアライナーに置き、アライナーの検査用顕微鏡を使用して、交差アライメントマークでマスクと第1層をシリコンウェハー上に合わせます。 </li><li>フォトレジストでコーティングされたシリコンウェハをUVに暴露して、細胞負荷および勾配チャネルをパターン化する。 </li><li>慎重にガラス板を取り出してシリコンwを取り出しますアファー。シリコンウェーハをホットプレート上で65℃で2分間ベークし、次にシリコンウェーハを別の95℃ホットプレートに移し、6分間ベークする。 </li><li>シリコンウェーハをヒュームフードに移し、SU-8デベロッパーが入ったガラス皿に置きます。静かに6分間振とうする。 </li><li>新鮮なSU-8現像液を使用してシリコンウエハを洗浄し、次にヒュームフード内のIPAを洗浄する。 </li><li>ヒュームフード内の窒素ガスを用いてシリコンウェーハを乾燥させます。ホットプレート上にシリコンウェーハを置き、金型を150℃で30分間ハードベークします。第2層は準備ができている。 </li></ol></li><li> マスターモールド表面改質。 注：ソフトリソグラフィにおけるモールドからのポリジメチルシロキサン（PDMS）の放出を容易にするために、SU-8モールドにシラン処理表面改質工程を適用する。 <ol><li> 10μLのトリデカフルオロ-1,1,2,2-テトラヒドロオクチル（トリクロロシラン）溶液をマイクロピペットチップに入れます。マイクロピペットチップを15mLプラスチックチューブに入れ、チューブのキャップを緩めます。 </li><li>チューブとSU-8パターニングされたシリコンウェーハをデシケータの中に置き、1時間真空を適用する。マスクモールドは、PDMSデバイスを製造する準備が整う。 </li></ol></li><li> PDMSデバイスを製作します。 <ol><li>プラスチックビーカーにPDMSベース40gと硬化剤4gを混合してPDMS溶液を調製します。準備されたSU - 8マスター型をペトリ皿に置き、44g PDMS溶液を注意深く鋳型上に注ぐ。 </li><li>ペトリ皿をデシケーターに入れ、PDMS溶液を20分間脱気するために真空を適用する。次に、ペトリ皿をオーブンに入れ、PDMSを80℃で2時間硬化させます。 </li><li>ベーキング後、ペトリ皿を取り出してクリーンベンチに置きます。 PDMSスラブを慎重に切断してSU-8モールドから剥がします。 </li><li>直径3mmのパンチャーを使用して、細胞ローディングポートを打ち抜きます。直径6mmのパンチャーを使用して、化学薬品注入口リザーバーと廃棄物排出口を打ち抜きます。 </li><li>埃を取り除く粘着テープを使用してPDMSスラブの表面に塗布する。 PDMSスラブときれいなスライドガラスをプラズマ装置に入れます。真空を3分間適用する。 </li><li>プラズマパワーをオンにし、レベルをHIGHに設定します。静かに空気弁を調整し、PDMSスラブとガラススライドを3分間プラズマで満たします。 </li><li>プラズマパワーをオフにし、真空を解放する。慎重に、ピンセットを使用してPDMSスラブとスライドガラスを取り出します。 </li><li>スライドガラスの上にPDMSスラブを（直面しているフェイスダウンの）チャンネル構造に直ちに置きます。軽くPDMSスラブを押してガラスに接着させます。すぐに脱イオン水でマイクロ流体チャネルを満たしてください。マイクロ流体デバイスの製造および組み立てが完了する。 </li></ol></li></ol> 2.マイクロ流体細胞の移動アッセイの準備<ol><li> マイクロ流体装置の準備。 <ol><li>ストックフィブロネクチン溶液（1 mg / mL）50μLを950に希釈して50μg/ mLのフィブロネクチン溶液を調製する81;バイオセーフティーキャビネット内のLダルベッコリン酸緩衝食塩水（DPBS）。 </li><li> Roswell Park Memorial Institute培地（RPMI-1640）9 mLとRPMI-1640 1 mLを4％ウシ血清アルブミン（BSA）と混合して遊走培地を調製する。 </li><li>装置から脱イオン水を除去する。 </li><li>フィブロネクチン溶液100μLをコンセントからデバイスに加えます。全てのチャンネルがフィブロネクチン溶液で満たされるように3分間待つ。カバーされたペトリ皿にマイクロ流体デバイスを室温で1時間置く。 </li><li>デバイスからフィブロネクチン溶液を除去する。出口から100μLの移動培地を加える。 3分間待って、すべてのチャンネルが移動媒体で満たされていることを確認します。 </li><li>デバイスを室温でさらに1時間インキュベートする。この装置は次に走化性実験の準備が整う。 </li></ol></li><li> ケモタキシス実験のための化学誘引物質溶液調製。 <ol><li> tで100nMのfMLP溶液を調製する。1mLの移動培地で培養した。ストック溶液FITC-デキストラン（10kDa、1mM）5μLをfMLP溶液と1.5mLチューブに混合する。 注：FITC-Dextranはグラジエント測定に使用されます。あるいは、グラジエントインジケータとしてRhodamineを使用してください。次いで、fMLP化学誘引物質溶液は、走化性実験のために準備される。 </li></ol></li><li> 喀痰試料の調製。 注：COPD患者の喀痰標本の勾配によって誘発された好中球走化性を、このオールオンチップ法の臨床診断用途として試験した。 <ol><li> COPD患者から喀痰サンプルを採取するためのヒト倫理プロトコールを取得する。 注：ウィニペグのセブンオークス総合病院（マニトバ大学認可）でサンプルを採取する承認を取得しました。 </li><li>すべての被験者から書面による同意書を入手する。 </li><li> COPD患者の自発的な喀痰検体を採取する。 500μLの喀痰サンプルを1.5mLのチューブに入れます。 </li><li> 500μLの0.1％ジチオトレイトールを1.5mLチューブに入れ、静かに混合する。チューブを37℃の水浴に15分間置きます。 </li><li>サンプルを753×gで10分間遠心分離し、上清を集める。上清を865×gで5分間遠心分離し、最終上清を集める。使用前に、回収した上清を-80℃冷凍庫に保存してください。 </li><li>走化性実験の準備ができたら、痰溶液を解凍する。 900μLの移動培地を1.5mLチューブに移し、バイオセーフティキャビネット内で100μLの痰溶液と混合する。次に、喀痰溶液は走化性実験の準備が整う。 </li></ol></li><li> 血液サンプル収集。 <ol><li>健康なドナーから血液サンプルを採取するための人間倫理プロトコールを取得する。すべての献血者から書面による同意書を入手する。 注：ここでのサンプルは、ウィニペグのヴィクトリア総合病院で得られたものである（マニトウ大学共同学術研究倫理委員会）。 </li><li>静脈穿刺により血液試料を採取し、EDTA被覆チューブに試料を入れる。実験の前にチューブをバイオセーフティキャビネットに保管してください。 </li></ol></li></ol> 3.オールオンチップ走化性アッセイ操作<ol><li> オンチップの細胞分離（ 図1B ）。 <ol><li>バイオセーフティキャビネット内の1.5 mLチューブに全血10μLを入れる。 注：血液サンプル採取の詳細はセクション2.4にある。 </li><li>好中球単離キット（材料の表を参照）から2 mLの抗体カクテル（Ab）と2μLの磁性粒子（MP）を1.5 mLチューブに添加し、穏やかに混合する。これは、好中球以外の血液中の細胞を標識する。 </li><li>血液-Ab-MP混合物を室温で5分間インキュベートする。 注：これは、血液中の抗体標識細胞を磁気的に標識する。 </li><li> 2つの小さな磁気ディスクをセルローディングpの両側に取り付けますデバイスのort。装置のすべてのポートから培地を吸引します。 </li><li> 2μLの血液-Ab-MP混合物を細胞装填口からマイクロ流体装置にゆっくりとピペットで移す。 注意：磁気標識された細胞は、細胞ローディングポートの側壁に捕捉され、一方、好中球は、デバイスに流入し、細胞ドッキング構造に捕捉される。 </li><li>十分な好中球が細胞ドッキング領域に閉じ込められるまで数分間待ちます。 </li></ol></li><li> 走化性アッセイ（ 図1C ）。 <ol><li>マイクロ流体装置を37℃の温度制御された顕微鏡ステージ上に置く。 </li><li> 2つのピペッターを使用して、100μLの化学誘引物質溶液（fMLPまたは痰溶液）および100μLの移動培地を指定の注入口リザーバーに加えます。これは、加圧によって補助される連続的な層流化学的混合によって、勾配チャネル中に化学誘引剤勾配を生成するバランス構造。 注：COPD患者の喀痰採集の詳細は2.3節に記載されている。 <ol><li>培地対照実験では、両方の入口リザーバに移動培地を加えるだけです。 </li></ol></li><li>勾配チャネル中のFITC-デキストランの蛍光画像を取得する。 </li><li>コマンド &quot;File | Open&quot;を使用してImageJソフトウェアにイメージをインポートします。 </li><li> &quot;Analyze | Plot Profile&quot;コマンドを使用して、グラジエントチャンネルの蛍光強度プロファイルを測定します。 </li><li>さらにプロットするために測定データをスプレッドシートにエクスポートします。 </li><li>温度制御された顕微鏡ステージまたは従来の細胞培養インキュベーターで15分間装置をインキュベートする。 </li><li>データ分析のために細胞の最終位置を記録するために10X対物レンズを用いてグラジエントチャネルをイメージ化する。 </li><li>必要に応じて、デバイス内の細胞移動を経時顕微鏡で記録します。 </li></ol></li></ol> 4.細胞移動Data分析（ 図1C ） <ol><li>下記のように、ドッキング構造からの細胞移動距離を計算することにより、走化性アッセイを分析する。 図1Cを参照のこと。 </li><li>イメージをNIH ImageJソフトウェアにインポートします（ver.1.45）。 </li><li>グラデーションチャンネルに移動した各セルの中心を選択します。 </li><li>選択したセルの座標を最終的な位置として測定します。ドッキング構造の端にある点の座標を初期基準位置として測定します。 </li><li>測定された座標データをスプレッドシートソフトウェア（Excelなど）にエクスポートします。セルの移動距離を、セルの最終位置と勾配方向に沿った初期基準位置との間の差として計算する。 </li><li>マイクロメーターまでの距離を較正する。走化性の尺度として全細胞の移動距離の平均および偏差を計算する。 </li><li> Migの比較スチューデントt検定を用いた培地対照実験に対する化学誘引物質勾配の存在下での非定量距離。 </li><li>細胞移動の時間経過画像が記録されている場合、細胞の移動および走化性を細胞追跡分析15によってさらに分析することができる。 注：オールオンチップ走化性アッセイを構築および実施するために必要な材料は、材料表に詳述されている。 </li></ol>

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	<li>Kolaczkowska, E., Kubes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+recruitment+and+function+in+health+and+inflammation.">Neutrophil recruitment and function in health and inflammation.</a> Nat Rev Immunol. 13 (13), 159-175 (2013).</li><li>Luster, A. D., Alon, R., von Andrian, U. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+cell+migration+in+inflammation:+present+and+future+therapeutic+targets.">Immune cell migration in inflammation: present and future therapeutic targets.</a> Nat Immunol. 6 (12), 1182-1190 (2005).</li><li>Griffith, J. W., Luster, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+cells+in+motion:+migrating+toward+improved+therapies.">Targeting cells in motion: migrating toward improved therapies.</a> Eur. J. Immunol. 43 (6), 1430-1435 (2013).</li><li>Laird, D. J., von Andrian, U. H., Wagers, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cell+trafficking+in+tissue+development,+growth,+and+disease.">Stem cell trafficking in tissue development, growth, and disease.</a> Cell. 132 (4), 612-630 (2008).</li><li>Condeelis, J., Segall, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+imaging+of+cell+movement+in+tumours.">Intravital imaging of cell movement in tumours.</a> Nat Rev Cancer. 3 (12), 921-930 (2003).</li><li>Kruger, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophils:+between+host+defence,+immune+modulation,+and+tissue+injury.">Neutrophils: between host defence, immune modulation, and tissue injury.</a> PLoS Pathog. 11 (3), e1004651 (2015).</li><li>M&#243;csai, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diverse+novel+functions+of+neutrophils+in+immunity,+inflammation,+and+beyond.">Diverse novel functions of neutrophils in immunity, inflammation, and beyond.</a> J Exp Med. 210 (7), 1283-1299 (2013).</li><li>Foxman, E. F., Campbell, J. J., Butcher, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multistep+navigation+and+the+combinatorial+control+of+leukocyte+chemotaxis.">Multistep navigation and the combinatorial control of leukocyte chemotaxis.</a> J Cell Biol. 139 (7), 1349-1360 (1997).</li><li>Tazzyman, S., Niaz, H., Murdoch, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil-mediated+tumour+angiogenesis:+subversion+of+immune+responses+to+promote+tumour+growth.">Neutrophil-mediated tumour angiogenesis: subversion of immune responses to promote tumour growth.</a> Semin Cancer Biol. 23 (3), 149-158 (2013).</li><li>Boyden, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chemotactic+effect+of+mixtures+of+antibody+and+antigen+on+polymorphonuclear+leucocytes.">The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes.</a> J Exp Med. 115 (3), 453-466 (1962).</li><li>Wu, J., Wu, X., Lin, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+developments+in+microfluidics-based+chemotaxis+studies.">Recent developments in microfluidics-based chemotaxis studies.</a> Lab Chip. 13 (13), 2484-2499 (2013).</li><li>Sackmann, E. K., Fulton, A. L., Beebe, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+present+and+future+role+of+microfluidics+in+biomedical+research.">The present and future role of microfluidics in biomedical research.</a> Nature. 507 (7491), 181-189 (2014).</li><li>Kim, S., Kim, H. J., Jeon, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+applications+of+microfluidic+gradient+devices.">Biological applications of microfluidic gradient devices.</a> Integr Biol. 2 (11-12), 584-603 (2010).</li><li>Irimia, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+system+for+measuring+neutrophil+migratory+responses+to+fast+switches+of+chemical+gradients.">Microfluidic system for measuring neutrophil migratory responses to fast switches of chemical gradients.</a> Lab Chip. 6 (2), 191-198 (2006).</li><li>Lin, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+migration+in+opposing+chemoattractant+gradients+using+microfluidic+chemotaxis+devices.">Neutrophil migration in opposing chemoattractant gradients using microfluidic chemotaxis devices.</a> Ann Biomed Eng. 33 (4), 475-482 (2005).</li><li>Ambravaneswaran, V., Wong, I. Y., Aranyosi, A. J., Toner, M., Irimia, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directional+decisions+during+neutrophil+chemotaxis+inside+bifurcating+channels.">Directional decisions during neutrophil chemotaxis inside bifurcating channels.</a> Integr Biol. 2 (11-12), 639-647 (2010).</li><li>Jones, C. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spontaneous+neutrophil+migration+patterns+during+sepsis+after+major+burns.">Spontaneous neutrophil migration patterns during sepsis after major burns.</a> PloS One. 9 (12), e114509 (2014).</li><li>Butler, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Burn+injury+reduces+neutrophil+directional+migration+speed+in+microfluidic+devices.">Burn injury reduces neutrophil directional migration speed in microfluidic devices.</a> PloS One. 5 (7), e11921 (2010).</li><li>Wu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microfluidic+platform+for+evaluating+neutrophil+chemotaxis+induced+by+sputum+from+COPD+patients.">A microfluidic platform for evaluating neutrophil chemotaxis induced by sputum from COPD patients.</a> PloS One. 10 (5), e0126523 (2015).</li><li>Sackmann, E. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+kit-on-a-lid:+a+versatile+platform+for+neutrophil+chemotaxis+assays.">Microfluidic kit-on-a-lid: a versatile platform for neutrophil chemotaxis assays.</a> Blood. 120 (14), e45-e53 (2012).</li><li>Agrawal, N., Toner, M., Irimia, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+migration+assay+from+a+drop+of+blood.">Neutrophil migration assay from a drop of blood.</a> Lab Chip. 8 (12), 2054-2061 (2008).</li><li>Jones, C. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+platform+for+measuring+neutrophil+chemotaxis+from+unprocessed+human+whole+blood.">Microfluidic platform for measuring neutrophil chemotaxis from unprocessed human whole blood.</a> J Vis Exp. (88), (2014).</li><li>Jones, C. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+assay+for+precise+measurements+of+mouse,+rat,+and+human+neutrophil+chemotaxis+in+whole-blood+droplets.">Microfluidic assay for precise measurements of mouse, rat, and human neutrophil chemotaxis in whole-blood droplets.</a> J Leukocyte Biol. 100 (1), 241-247 (2016).</li><li>Sackmann, E. K. -. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+asthma+from+a+drop+of+blood+using+neutrophil+chemotaxis.">Characterizing asthma from a drop of blood using neutrophil chemotaxis.</a> P Natl Acad Sci. 111 (16), 5813-5818 (2014).</li><li>Wu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+all-on-chip+method+for+testing+neutrophil+chemotaxis+induced+by+fMLP+and+COPD+patient's+sputum.">An all-on-chip method for testing neutrophil chemotaxis induced by fMLP and COPD patient's sputum.</a> Technology. 04 (02), 104-109 (2016).</li></ol>

開示する利益相反はありません。

この論文では、全血から好中球を直接単離した後、走化性試験を単一のマイクロ流体チップ上に直接行うための詳細なプロトコールが記載されている。このメソッドは、簡単な操作、高純度好中球のネガティブ選択、迅速なサンプルから結果の走化性試験、試薬とサンプルの使用量の削減、正確な細胞移動データ解析の有用な機能を提供します。大まかな見積もりとして、入力全血試料からの好中球の少なくとも25％が装置内のドッキング構造に効果的に入り、Giemsa染色により、好中球の純度が高いことがわかった。 この開発されたオール・オン・チップの走化性分析法は、様々な細胞移動研究および臨床応用において大きな可能性を秘めている。この方法の研究適用は、培地単独での好中球走化性をfMLP勾配と比較することによって実証された。同様に、この方法を用いてCOPD spuの好中球走化性を試験することができる臨床診断のための細胞機能性バイオマーカーの開発の例として、この方法により、研究者は、異なる化学誘引物質に対する好中球走化性を個々にまたは組み合わせて容易に試験することができる。研究者はまた、この方法を用いて潜在的に変化した走化性応答について、患者からの複雑な化学走化性因子に対する好中球走化性を試験することができ、または疾患患者からの好中球を試験することもできる。この一体型オールオンチップ法は、特殊な細胞培養および生存細胞イメージング施設を持たない研究室または臨床研究室で試験を実施するのに特に有用である。試験は、このプロトコールに従って研究者または臨床医によって容易に操作することができる。より高度な研究アプリケーションのために、この方法は、個々の細胞の動きを追跡するために経時顕微鏡法を可能にする。 一般的に、このオール・オン・チップ方式は操作が簡単で、その結果は堅牢です。いくつかのテクニカルリマインダーは、実験の成功をさらに保証します。まず、thPDMSレプリカは、非常に薄いバリアチャネルの損傷を避けるために、プラズマボンディングの間にクラス基板上に静かに押し付けられるべきである。第2に、細胞装填口における培地の蒸発は、化学勾配を乱す可能性がある。走化性試験中は、細胞ローディングポートをシーリングタブで覆うことを推奨します。第3に、血液サンプルは、化学走性実験の前に細胞をバリアチャネル上に押し込むことができる高い圧力を避けるために、デバイス上に静かに装填すべきである。第4に、現在の設定では、望ましくない細胞がチャネルに入るのを防ぐために、走化性アッセイ中に磁石を細胞ローディングポートに取り付けたままにすることを推奨します。あるいは、貫通穴を有する別個のPDMS片および磁気ディスクが、デバイスのセル装填口に整列され得る。この場合、磁気ディスクおよびトラップされたセルを有する上部PDMS部分は、セル分離後にデバイスから取り外すことができる。 このオールオンチャンネル現在の制限を克服し、その機能を改善し、拡張するために、ip方法をさらに開発することができる。第1に、現在のデバイスは、一度に1つのアッセイのみを可能にし、スループットを制限する。複数の並列試験ユニットを有する装置のさらなる開発は、実験的スループット要求を改善する。第2に、現在のフローベース化学勾配発生器は、1Dにおける勾配発生を制限する。 2Dまたは3Dフローフリー勾配ジェネレーターのさらなる開発は、生理学的勾配条件をよりよく模倣するであろう。第3に、好中球に加えて、このオールオンチップ法を原理的に使用して、同様の磁気細胞分離キットを用いてT細胞、B細胞およびNK細胞などの他の白血球細胞を試験することができる。この方法が、より低い頻度で血液細胞集団を試験するため、および走化性試験の前にオンチップ活性化および培養を必要とする細胞を効果的に試験することができるかどうかを研究することは重要である。その後、オールオンチップの細胞分離法ca他のアプリケーションではさらに拡張する必要があります。異なるバリアチャネルの厚さを試験したところ、結果は、3-4μmが好中球遊走実験に最も適していることを示した。すなわち、刺激されていない細胞を十分に閉じ込め、刺激の際に細胞がバリアチャネルを通過することを可能にした。障壁チャネルの寸法は、異なる細胞タイプに対して最適化されるべきである。最後に、この統合された迅速な走化性試験により、研究者は関連する臨床応用を探索することが可能になる。診療所での実地試験を可能にするために、マイクロ流体装置、温度およびステージ制御、スマートフォンベースの光学イメージングおよびデータ解析モジュールを統合したポータブルシステムが開発されました。この論文で示されたCOPD関連の研究に加えて、このオールオンチップ法を用いて慢性腎疾患などの他の関連疾患の細胞移動が試験されている。

化学走性は、可溶性化学物質濃度勾配への細胞の移動の過程であり、免疫応答1,2,3 、組織発生4および癌転移5を含む多くの生物学的過程に決定的に関与する。好中球は最も豊富な白血球のサブセットであり、身体の本来の宿主防御機能を可能にし、適応免疫応答を媒介するのに重要な役割を果たす6,7 。好中球には、高度に制御された走化性機構が装備されており、これらの運動性免疫細胞は、病原体由来の化学誘引物質（ 例えば、 fMLP）および宿主由来の化学誘引物質（ 例えば、インターロイキン-8）好中球遊走および走化性は、様々な生理学的問題を媒介する炎症や癌などの疾患1,9。したがって、好中球走化性の正確な評価は、好中球の生物学および関連疾患を研究するための重要な機能的読出しを提供する。 広く使用されている従来の走化性アッセイ（ 例えば、トランスウェルアッセイ10 ）と比較して、マイクロ流体デバイスは、正確に制御された化学勾配の生成および小型化のために、細胞遊走および走化性の定量的評価に大きな期待を寄せている11,12,13 。過去20年の間に、様々な生物学的細胞型、特に好中球11の走化性を研究するために、様々なマイクロ流体装置が開発されてきた。時空間複合体における好中球遊走の特徴づけに多大な努力を注いだ<html>マイクロ流体デバイス14,15内に構成されたマイクログラディエントを含む。生物学的研究と並んで、マイクロ流体デバイスの応用は、疾患評価のために臨床試料を試験するために拡張されている17,18,19。しかしながら、多くのマイクロ流体デバイスの使用は、専門の研究室に限られており、大量の血液サンプルから長時間の好中球単離を必要とする。したがって、迅速な好中球走化性分析のための統合されたマイクロ流体デバイスを、一滴の全血から直接的に開発する傾向が高まっている（20,21,22,23 ）ef &quot;&gt; 23,24。 この方向に向かって、磁気陰性好中球精製とそれに続く走化性アッセイとを単一のマイクロ流体装置25に統合したオールオンチップ法が開発された。このオールオンチップ法は、1）接着に基づく細胞捕捉または細胞サイズに基づく濾過によって好中球を血液から単離する従来のオンチップ戦略とは対照的に、この新しい方法は、少量の全血からの好中球のオンチップ磁気分離、ならびに化学誘引物質刺激による走化性測定; 2）細胞ドッキング構造は、好中球の初期位置を化学勾配チャネルに近づけるのを助け、単一細胞追跡なしで簡単な走化性分析を可能にする。 3）好中球単離とケモトの統合単一のマイクロ流体デバイス上での軸解析により、実験ステップ間に中断がない場合、25分で迅速なサンプル - 結果の走化性分析が可能になる。 このペーパーでは、このオールオンチップ走化性アッセイの構築、操作およびデータ解析方法の詳細なプロトコールを提供します。この論文は、既知の組換え化学誘引物質および複雑な走化性試料を患者から試験し、続いてトラブルシューティングの戦略、限界および将来の方向性について議論することによって、好中球走化性を行うための開発された方法の有効な使用を実証する。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="581">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:581px;">Device fabrication</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Mask aligner</td>
			<td>ABM</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Spinner</td>
			<td>Solitec</td>
			<td>5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Hotplate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>11301-022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Plasma cleaner</td>
			<td>Harrick Plasma</td>
			<td>PDC-001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Vacuum dessicator</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-594-15A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Digital scale</td>
			<td>Ohaus</td>
			<td>CS200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">SU-8 2000 thinner</td>
			<td>Microchem</td>
			<td>SU-8 2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">SU-8 2025 photoresist</td>
			<td>Microchem</td>
			<td>SU-8 2025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">SU-8 developer</td>
			<td>Microchem</td>
			<td>SU-8 developer</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Si wafer</td>
			<td>Silicon, Inc</td>
			<td>LG2065</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">isopropyl alcohol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A416-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="52">
			<td height="52" style="height:52px;width:159px;">(tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl) trichlorosilane</td>
			<td>Gelest</td>
			<td>78560-45-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:159px;">Polydimethylsiloxane 
			(PDMS)</td>
			<td>Ellsworth Adhesives</td>
			<td>2065622</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Petri Dish</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875714</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Glass slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-544-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cutting pad</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Custom-made</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Punchers</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Custom-made</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:159px;">Name </td>
			<td>Source</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">On-chip cell isolation and chemotaxis assay</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:159px;">RPMI 1640</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SH3025502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DPBS</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SH3002802</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:159px;">Bovine serum albumin 
			(BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SH3057402</td>
			<td style="width:164px;"></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;">Fibronectin</td>
			<td>VWR</td>
			<td>CACB356008</td>
			<td style="width:164px;"></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;">fMLP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F3506-10MG</td>
			<td style="width:164px;"></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:159px;">Magnetic disks</td>
			<td style="width:124px;">Indigo Instruments</td>
			<td>44202-1</td>
			<td style="width:164px;">5 mm in diameter, 
			1 mm thick</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:159px;">FITC-Dextran</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>FD10S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"> Rhodamine</td>
			<td> 
			Sigma-Aldrich</td>
			<td>R4127-5G</td>
			<td style="width:164px;"></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:159px;">Giemsa stain solution</td>
			<td style="width:124px;">Rowley Biochemical Inc.</td>
			<td style="width:135px;">G-472-1-8OZ</td>
			<td style="width:164px;"></td>
		</tr>
		<tr height="52">
			<td height="52" style="height:52px;width:159px;">EasySep Direct Human 
			Neutrophil Isolation 
			Kit</td>
			<td style="width:124px;">STEMCELL 
			Technologies Inc</td>
			<td>19666</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:159px;">Dithiothreitol</td>
			<td style="width:124px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>D0632</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:159px;"> Nikon Ti-U inverted fluorescent microscope </td>
			<td style="width:124px;">Nikon</td>
			<td>Ti-U</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:159px;">Microscope environmental chamber.</td>
			<td style="width:124px;">InVivo Scientific</td>
			<td>N/A</td>
			<td style="width:164px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:159px;"> CCD camera</td>
			<td style="width:124px;">Nikon</td>
			<td>DS-Fi1</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an all-on-chip method for rapid neutrophil chemotaxis analysis directly from a drop of blood

好中球の移動と走化性は私たちの体の免疫系にとって重要です。マイクロ流体デバイスは、リアルタイムビジュアライゼーション、化学濃度勾配生成の正確な制御、および試薬およびサンプル消費の低減におけるそれらの利点のために、好中球移動および走化性を調べるためにますます使用されている。近年、全血から直接的に、統合された、容易に操作される微小流体走化性分析システムを開発するために、マイクロ流体研究者によってますます努力がなされている。この方向では、最初のオールオンチップ法が、好中球の磁気陰性浄化と小血液量試料からの走化性アッセイとを統合するために開発された。この新しい方法は、25分で迅速なサンプル - 結果好中球走化性試験を可能にする。本稿では、このオールオンチップ走化性アッセイの詳細な構築、操作、およびデータ分析方法について、トラブルシューティング戦略、limi将来の方向性を示しています。この全オンチップ法を用いて、定義された化学誘引物質、 N-ホルミル-Met-Leu-Phe（fMLP）および慢性閉塞性肺疾患（COPD）患者からの痰を試験する好中球走化性アッセイの代表的結果を示す。この方法は、多くの細胞移動関連の調査および臨床応用に適用可能である。

好中球は、マイクロ流体デバイス内の直接の一滴の全血から陰性に選択される。単離された好中球の純度は、Giemsa染色で確認され、その結果は、好中球の典型的なリング形状およびローブ形状の核を示した（ 図2A ）。これは、少量の全血から高純度で効果的なオンチップ好中球単離を示す。さらに、ドッキング構造は、化学勾配（ 図2B ） 25を適用する前に、勾配チャネルの隣の細胞を効果的に整列させることができる。 勾配の生成は、連続的な層流化学混合に基づいており、流れは、入口および出口溶液の異なるレベルからの圧力差によって駆動される。外部ポンプは不要です。化学勾配tは、勾配チャネルを横切るFITC-デキストランの蛍光強度プロファイルによって特徴付けられる、微小流体装置内で数分以内に確立される。勾配は少なくとも1時間安定であり、これは現在の好中球走化性実験のための十分な時間である（ 図1C ）。 細胞移動研究のためのオールオンチップ法の使用を実証するために、培地単独またはfMLP勾配中の好中球走化性を比較した。試験結果は、培地対照実験において障壁チャネルを通過した細胞がほとんどないことを示した。対照的に、多くの好中球は急速に障壁チャネルを通って移動し、100nMのfMLP勾配（ 図2B ）に向かって移動した25 。細胞移動試験は、移動距離によって定量的に測定され、培地対照よりもfMLP勾配に対して有意に高い（ 25 。 さらに、培地単独での好中球遊走とCOPD患者由来の喀痰標本の勾配とを比較することにより、潜在的臨床応用について全オンチップ法を実証した。結果は、培地コントロール（ 図2B〜C ） 25と比較して有意に高い移動距離によって定量的に示されるCOPD喀痰勾配への強力な細胞移動を示した。 <img alt="図1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55615/55615fig1.jpg" /> 図1：好中球走化性解析のためのオールオンチップ法の図。 （ A ）マイクロ流体装置の図。この装置は2つの層を含む。第1の層（高さ4μm）は、セルlグラジエントチャネルの横にある細胞をトラップするバリアチャネルをドッキングする。第2の層（高さ60μm）は、勾配生成チャネル、細胞装填のためのポートおよびチャネル、化学的入口リザーバおよび廃棄物出口を規定する。アライメントマークは、2つのレイヤーに対して設計されています。第2の層の場合、上流の蛇行入力チャネルの長さおよび幅は、それぞれ60mmおよび200μmであり、下流の蛇行入力チャネルの長さおよび幅はそれぞれ6mmおよび280μmであり、 （ B ）オールオンチップ細胞単離法の図。 （ C ）走化性試験の説明。 <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55615/55615fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。</a> <img alt="図2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55615/55615fig2.jpg" /> 図2：オールオンチップ好中球走化性分析25 。 （ A ）マイクロ流体チャネル中の全オンチップ単離細胞のGiemsa染色画像（60倍対物レンズを使用）。 （ B ）培地対照における細胞分布、100nM fMLP勾配およびCOPD痰勾配の比較; （ C ）培地対照における勾配チャネルにおける平均細胞移動距離、fMLP勾配およびCOPD痰勾配。エラーバーは、平均の標準誤差（SEM）を示す。 *は、スチューデントのt検定からp &lt;0.05を示す。数値は、World Scientific Publishingの許可を得て、参考文献25から適合させた。 <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55615/55615fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。</a>

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An All-on-chip Method for Rapid Neutrophil Chemotaxis Analysis Directly from a Drop of Blood

この記事では、全血からのチップ上の好中球単離と、単一のマイクロ流体チップ上の走化性試験とを統合することにより、迅速な好中球走化性アッセイを行う詳細な方法を提供する。

血液滴からの迅速な好中球走化性解析のためのオールオンチップ法

Neutrophil migration and chemotaxis are critical for our body's immune system. Microfluidic devices are increasingly used for investigating neutrophil ...

an-all-on-chip-method-for-rapid-neutrophil-chemotaxis-analysis

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

17.0K ビュー.  Chinese Academy of Sciences. この記事では、全血からのチップ上の好中球単離と、単一のマイクロ流体チップ上の走化性試験とを統合することにより、迅速な好中球走化性アッセイを行う詳細な方法を提供する。 

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A 1.5 Hour Procedure for Identification of Enterococcus Species Directly from Blood Cultures

Enterococci are a common cause of bacteremia with E. faecalis being the predominant species followed by E. faecium. Because resistance to ampicillin and vancomycin in E. faecalis is still uncommon compared to resistance in E. faecium, the development of rapid tests allowing differentiation between enterococcal species is important for appropriate therapy and resistance surveillance. The E. faecalis OE PNA FISH assay (AdvanDx, Woburn, MA) uses species-specific peptide nucleic acid (PNA) probes in a fluorescence in situ hybridization format and offers a time to results of 1.5 hours and the potential of providing important information for species-specific treatment. Multicenter studies were performed to assess the performance of the 1.5 hour E. faecalis/OE PNA FISH procedure compared to the original 2.5 hour assay procedure and to standard bacteriology methods for the identification of enterococci directly from a positive blood culture bottle.

A 1.5 Hour Procedure for Identification of Enterococcus Species Directly from Blood Cultures

A rapid protocol for the direct identification of Enterococcus faecalis and other Enterococcus species from a positive blood culture using a Peptide Nucleic Acid fluorescent in situ hybridization assay (PNA FISH).

の識別のための1.5時間の手順腸球菌</em直接血液培養から>種

Enterococci are a common cause of bacteremia with E. faecalis being the predominant species followed by E. faecium.  Because resistance to ampicillin and ...

免疫・感染学

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the initial and determining step of the pathogenesis. Although experimentally adhesion is mostly studied in static conditions adhesion actually takes place in the presence of flowing liquid. First encounters between bacteria and their host often occur at the mucosal level, mouth, lung, gut, eye, etc. where mucus flows along the surface of epithelial cells. Later in infection, pathogens occasionally access the blood circulation causing life-threatening illnesses such as septicemia, sepsis and meningitis. A defining feature of these infections is the ability of these pathogens to interact with endothelial cells in presence of circulating blood. The presence of flowing liquid, mucus or blood for instance, determines adhesion because it generates a mechanical force on the pathogen. To characterize the effect of flowing liquid one usually refers to the notion of shear stress, which is the tangential force exerted per unit area by a fluid moving near a stationary wall, expressed in dynes/cm2. Intensities of shear stress vary widely according to the different vessels type, size, organ, location etc. (0-100 dynes/cm2). Circulation in capillaries can reach very low shear stress values and even temporarily stop during periods ranging between a few seconds to several minutes 1. On the other end of the spectrum shear stress in arterioles can reach 100 dynes/cm2 2. The impact of shear stress on different biological processes has been clearly demonstrated as for instance during the interaction of leukocytes with the endothelium 3. To take into account this mechanical parameter in the process of bacterial adhesion we took advantage of an experimental procedure based on the use of a disposable flow chamber 4. Host cells are grown in the flow chamber and fluorescent bacteria are introduced in the flow controlled by a syringe pump. We initially focused our investigations on the bacterial pathogen Neisseria meningitidis, a Gram-negative bacterium responsible for septicemia and meningitis. The procedure described here allowed us to study the impact of shear stress on the ability of the bacteria to: adhere to cells 1, to proliferate on the cell surface 5and to detach to colonize new sites 6 (Figure 1). Complementary technical information can be found in reference 7. Shear stress values presented here were chosen based on our previous experience1 and to represent values found in the literature. The protocol should be applicable to a wide range of pathogens with specific adjustments depending on the objectives of the study.

During the infection process, a key step is the adhesion of pathogens with host cells. In most instances this adhesion step occurs in the presence of mechanical stress generated by flowing liquid. We describe a technique that introduces shear stress as an important parameter in the study of bacterial adhesion.

細菌付着の研究ではせん断応力を導入する

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

Tracking Neutrophil Intraluminal Crawling, Transendothelial Migration and Chemotaxis in Tissue by Intravital Video Microscopy

The recruitment of circulating leukocytes from blood stream to the inflamed tissue is a crucial and complex process of inflammation1,2. In the postcapillary venules of inflamed tissue, leukocytes initially tether and roll on the luminal surface of venular wall. Rolling leukocytes arrest on endothelium and undergo firm adhesion in response to chemokine or other chemoattractants on the venular surface. Many adherent leukocytes relocate from the initial site of adhesion to the junctional extravasation site in endothelium, a process termed intraluminal crawling3. Following crawling, leukocytes move across endothelium (transmigration) and migrate in extravascular tissue toward the source of chemoattractant (chemotaxis)4. Intravital microscopy is a powerful tool for visualizing leukocyte-endothelial cell interactions in vivo and revealing cellular and molecular mechanisms of leukocyte recruitment2,5. In this report, we provide a comprehensive description of using brightfield intravital microscopy to visualize and determine the detailed processes of neutrophil recruitment in mouse cremaster muscle in response to the gradient of a neutrophil chemoattractant. To induce neutrophil recruitment, a small piece of agarose gel (~1-mm3 size) containing neutrophil chemoattractant MIP-2 (CXCL2, a CXC chemokine) or WKYMVm (Trp-Lys-Tyr-Val-D-Met, a synthetic analog of bacterial peptide) is placed on the muscle tissue adjacent to the observed postcapillary venule. With time-lapsed video photography and computer software ImageJ, neutrophil intraluminal crawling on endothelium, neutrophil transendothelial migration and the migration and chemotaxis in tissue are visualized and tracked. This protocol allows reliable and quantitative analysis of many neutrophil recruitment parameters such as intraluminal crawling velocity, transmigration time, detachment time, migration velocity, chemotaxis velocity and chemotaxis index in tissue. We demonstrate that using this protocol, these neutrophil recruitment parameters can be stably determined and the single cell locomotion conveniently tracked in vivo.

We describe a protocol of brightfield intravital microscopy for measuring dynamic neutrophil-endothelial cell interactions during neutrophil recruitment in response to the source of a neutrophil chemoattractant in vivo. Neutrophil intraluminal crawling, transendothelial migration and chemotaxis in mouse cremaster muscle tissue are visualized with time-lapsed video photography and tracked with ImageJ.

生体内ビデオ顕微鏡による組織内好中球腔内クロールを追跡、経内皮移動と走

The recruitment of circulating leukocytes from blood stream to the inflamed tissue is a crucial and complex process of inflammation1,2. In the ...

Intravital Microscopy of the Spleen: Quantitative Analysis of Parasite Mobility and Blood Flow

The advent of intravital microscopy in experimental rodent malaria models has allowed major advances to the knowledge of parasite-host interactions 1,2. Thus, in vivo imaging of malaria parasites during pre-erythrocytic stages have revealed the active entrance of parasites into skin lymph nodes 3, the complete development of the parasite in the skin 4, and the formation of a hepatocyte-derived merosome to assure migration and release of merozoites into the blood stream 5. Moreover, the development of individual parasites in erythrocytes has been recently documented using 4D imaging and challenged our current view on protein export in malaria 6. Thus, intravital imaging has radically changed our view on key events in Plasmodium development. Unfortunately, studies of the dynamic passage of malaria parasites through the spleen, a major lymphoid organ exquisitely adapted to clear infected red blood cells are lacking due to technical constraints.
Using the murine model of malaria Plasmodium yoelii in Balb/c mice, we have implemented intravital imaging of the spleen and reported a differential remodeling of it and adherence of parasitized red blood cells (pRBCs) to barrier cells of fibroblastic origin in the red pulp during infection with the non-lethal parasite line P.yoelii 17X as opposed to infections with the P.yoelii 17XL lethal parasite line 7. To reach these conclusions, a specific methodology using ImageJ free software was developed to enable characterization of the fast three-dimensional movement of single-pRBCs. Results obtained with this protocol allow determining velocity, directionality and residence time of parasites in the spleen, all parameters addressing adherence in vivo. In addition, we report the methodology for blood flow quantification using intravital microscopy and the use of different colouring agents to gain insight into the complex microcirculatory structure of the spleen. 
Ethics statement
All the animal studies were performed at the animal facilities of University of Barcelona in accordance with guidelines and protocols approved by the Ethics Committee for Animal Experimentation of the University of Barcelona CEEA-UB (Protocol No DMAH: 5429). Female Balb/c mice of 6-8 weeks of age were obtained from Charles River Laboratories.

We show the method for performing intravital microscopy of the spleen using GFP transgenic malaria parasites and the quantification of parasite mobility and blood flow within this organ.

脾臓の生体顕微鏡検査：寄生虫モビリティと血流​​の定量的解析

The advent of intravital microscopy in experimental rodent malaria models has allowed major advances to the knowledge of parasite-host interactions 1,2. ...

High-throughput Detection Method for Influenza Virus

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, precise diagnosis of the infecting strain and rapid high-throughput screening of vast numbers of clinical samples is paramount to control the spread of pandemic infections. Current clinical diagnoses of influenza infections are based on serologic testing, polymerase chain reaction, direct specimen immunofluorescence and cell culture 1,2.
Here, we report the development of a novel diagnostic technique used to detect live influenza viruses. We used the mouse-adapted human A/PR/8/34 (PR8, H1N1) virus 3 to test the efficacy of this technique using MDCK cells 4. MDCK cells (104 or 5 x 103 per well) were cultured in 96- or 384-well plates, infected with PR8 and viral proteins were detected using anti-M2 followed by an IR dye-conjugated secondary antibody. M2 5 and hemagglutinin 1 are two major marker proteins used in many different diagnostic assays. Employing IR-dye-conjugated secondary antibodies minimized the autofluorescence associated with other fluorescent dyes. The use of anti-M2 antibody allowed us to use the antigen-specific fluorescence intensity as a direct metric of viral quantity. To enumerate the fluorescence intensity, we used the LI-COR Odyssey-based IR scanner. This system uses two channel laser-based IR detections to identify fluorophores and differentiate them from background noise. The first channel excites at 680 nm and emits at 700 nm to help quantify the background. The second channel detects fluorophores that excite at 780 nm and emit at 800 nm. Scanning of PR8-infected MDCK cells in the IR scanner indicated a viral titer-dependent bright fluorescence. A positive correlation of fluorescence intensity to virus titer starting from 102-105 PFU could be consistently observed. Minimal but detectable positivity consistently seen with 102-103 PFU PR8 viral titers demonstrated the high sensitivity of the near-IR dyes. The signal-to-noise ratio was determined by comparing the mock-infected or isotype antibody-treated MDCK cells.
Using the fluorescence intensities from 96- or 384-well plate formats, we constructed standard titration curves. In these calculations, the first variable is the viral titer while the second variable is the fluorescence intensity. Therefore, we used the exponential distribution to generate a curve-fit to determine the polynomial relationship between the viral titers and fluorescence intensities. Collectively, we conclude that IR dye-based protein detection system can help diagnose infecting viral strains and precisely enumerate the titer of the infecting pathogens.

This method describes the use of Infrared dye based imaging system for detection of H1N1 in bronchioalveolar lavage (BAL) fluid of infected mice at a high sensitivity. This methodology can be performed in a 96- or 384-well plate, requires &lt;10 &mu;l volume of test material and has the potential for concurrent screening of multiple pathogens.

インフルエンザウイルスのためのハイスループット検出方法

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, ...

Rapid Identification of Gram Negative Bacteria from Blood Culture Broth Using MALDI-TOF Mass Spectrometry

An important role of the clinical microbiology laboratory is to provide rapid identification of bacteria causing bloodstream infection. Traditional identification requires the sub-culture of signaled blood culture broth with identification available only after colonies on solid agar have matured. MALDI-TOF MS is a reliable, rapid method for identification of the majority of clinically relevant bacteria when applied to colonies on solid media. The application of MALDI-TOF MS directly to blood culture broth is an attractive approach as it has potential to accelerate species identification of bacteria and improve clinical management. However, an important problem to overcome is the pre-analysis removal of interfering resins, proteins and hemoglobin&#160;contained in blood culture specimens which, if not removed, interfere with the MS spectra and can result in insufficient or low discrimination identification scores. In addition it is necessary to concentrate bacteria to develop spectra of sufficient quality. The presented method describes the concentration, purification, and extraction of Gram negative bacteria allowing for the early identification of bacteria from a signaled blood culture broth.

The application of matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight (MALDI-TOF) mass spectrometry (MS) directly to blood culture broth expedites the identification of bacteria. The presented method is a rapid and reliable method for identification of Gram negative bacteria directly from blood culture broth.

MALDI-TOF質量分析法を使用した血液培養ブロスからのグラム陰性菌の迅速な同定

An important role of the clinical microbiology laboratory is to provide rapid identification of bacteria causing bloodstream infection. Traditional ...

Preparation of a Blood Culture Pellet for Rapid Bacterial Identification and Antibiotic Susceptibility Testing

Bloodstream infections and sepsis are a major cause of morbidity and mortality. The successful outcome of patients suffering from bacteremia depends on a rapid identification of the infectious agent to guide optimal antibiotic treatment. The analysis of Gram stains from positive blood culture can be rapidly conducted and already significantly impact the antibiotic regimen. However, the accurate identification of the infectious agent is still required to establish the optimal targeted treatment. We present here a simple and fast bacterial pellet preparation from a positive blood culture that can be used as a sample for several essential downstream applications such as identification by MALDI-TOF MS, antibiotic susceptibility testing (AST) by disc diffusion assay or automated AST systems and by automated PCR-based diagnostic testing. The performance of these different identification and AST systems applied directly on the blood culture bacterial pellets is very similar to the performance normally obtained from isolated colonies grown on agar plates. Compared to conventional approaches, the rapid acquisition of a bacterial pellet significantly reduces the time to report both identification and AST. Thus, following blood culture positivity, identification by MALDI-TOF can be reported within less than 1 hr whereas results of AST by automated AST systems or disc diffusion assays within 8 to 18 hr, respectively. Similarly, the results of a rapid PCR-based assay can be communicated to the clinicians less than 2 hr following the report of a bacteremia. Together, these results demonstrate that the rapid preparation of a blood culture bacterial pellet has a significant impact on the identification and AST turnaround time and thus on the successful outcome of patients suffering from bloodstream infections.

A rapid bacterial pellet preparation from a positive blood culture can be used as a sample for applications such as identification by MALDI-TOF, Gram staining, antibiotic susceptibility testing and PCR-based test. The results can be rapidly communicated to clinicians to improve the outcome of patients suffering from bloodstream infections.

迅速な細菌同定および抗生物質感受性試験のための血液培養ペレットの調製

Bloodstream infections and sepsis are a major cause of morbidity and mortality. The successful outcome of patients suffering from bacteremia depends on a ...

An Efficient and High Yield Method for Isolation of Mouse Dendritic Cell Subsets

Dendritic cells (DCs) are professional antigen-presenting cells primarily responsible for acquiring, processing and presenting antigens on antigen presenting molecules to initiate T-cell-mediated immunity. Dendritic cells can be separated into several phenotypically and functionally heterogeneous subsets. Three important subsets of splenic dendritic cells are plasmacytoid, CD8&#945;Pos and CD8&#945;Neg cells. The plasmacytoid DCs are natural producers of type I interferon and are important for anti-viral T cell immunity. The CD8&#945;Neg DC subset is specialized for MHC class II antigen presentation and is centrally involved in priming CD4 T cells. The CD8&#945;Pos DCs are primarily responsible for cross-presentation of exogenous antigens and CD8 T cell priming. The CD8&#945;Pos DCs have been demonstrated to be most efficient at the presentation of glycolipid antigens by CD1d molecules to a specialized T cell population known as invariant natural killer T (iNKT) cells. Administration of Flt-3 ligand increases the frequency of migration of dendritic cell progenitors from bone marrow, ultimately resulting in expansion of dendritic cells in peripheral lymphoid organs in murine models. We have adapted this model to purify large numbers of functional dendritic cells for use in cell transfer experiments to compare in vivo proficiency of different DC subsets.

Distinct dendritic cell subsets exist as rare populations in lymphoid organs, and therefore are challenging to isolate in sufficient numbers and purity for immunological experiments. Here we describe a high efficiency, high yield method for isolation of all of the currently known major subsets of mouse splenic dendritic cells.

マウスの樹状細胞サブセットの単離のための効率的かつ高収率方法

Dendritic cells (DCs) are professional antigen-presenting cells primarily responsible for acquiring, processing and presenting antigens on antigen ...

A RAPID Method for Blood Processing to Increase the Yield of Plasma Peptide Levels in Human Blood

Research in the field of food intake regulation is gaining importance. This often includes the measurement of peptides regulating food intake. For the correct determination of a peptide&#39;s concentration, it should be stable during blood processing. However, this is not the case for several peptides which are quickly degraded by endogenous peptidases. Recently, we developed a blood processing method employing Reduced temperatures, Acidification, Protease inhibition, Isotopic exogenous controls and Dilution (RAPID) for the use in rats. Here, we have established this technique for the use in humans and investigated recovery, molecular form and circulating concentration of food intake regulatory hormones. The RAPID method significantly improved the recovery for 125I-labeled somatostatin-28 (+39%), glucagon-like peptide-1 (+35%), acyl ghrelin and glucagon (+32%), insulin and kisspeptin (+29%), nesfatin-1 (+28%), leptin (+21%) and peptide YY3-36 (+19%) compared to standard processing (EDTA blood on ice, p&#160;&#60;0.001). High performance liquid chromatography showed the elution of endogenous acyl ghrelin at the expected position after RAPID processing, while after standard processing 62% of acyl ghrelin were degraded resulting in an earlier peak likely representing desacyl ghrelin. After RAPID processing the acyl/desacyl ghrelin ratio in blood of normal weight subjects was 1:3 compared to 1:23 following standard processing (p&#160;= 0.03). Also endogenous kisspeptin levels were higher after RAPID compared to standard processing (+99%, p&#160;= 0.02). The RAPID blood processing method can be used in humans, yields higher peptide levels and allows for assessment of the correct molecular form.

The RAPID blood processing method can be used in humans and yields higher peptide levels as well as allows for assessment of the correct molecular form. Therefore, this method will be a valuable tool in peptide research.

血液処理のための迅速な方法は、ヒト血液中の血漿ペプチドレベルの収量を増やすには

Research in the field of food intake regulation is gaining importance. This often includes the measurement of peptides regulating food intake. For the ...

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

Bacterial resistance to traditional antibiotics has driven research attempts to identify new drug targets in recently discovered regulatory pathways. Regulatory systems that utilize intracellular cyclic di-GMP (c-di-GMP) as a second messenger are one such class of target. c-di-GMP is a signaling molecule found in almost all bacteria that acts to regulate an extensive range of processes including antibiotic resistance, biofilm formation and virulence. The understanding of how c-di-GMP signaling controls aspects of antibiotic resistant biofilm development has suggested approaches whereby alteration of the cellular concentrations of the nucleotide or disruption of these signaling pathways may lead to reduced biofilm formation or increased susceptibility of the biofilms to antibiotics. We describe a simple high-throughput bioreporter protocol, based on green fluorescent protein (GFP), whose expression is under the control of the c-di-GMP responsive promoter cdrA, to rapidly screen for small molecules with the potential to modulate c-di-GMP cellular levels in Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa). This simple protocol can screen upwards of 3,500 compounds within 48 hours and has the ability to be adapted to multiple microorganisms.

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

This article describes the high-throughput assay that has been successfully established to screen large libraries of small molecules for their potential ability to manipulate cellular levels of cyclic di-GMP in Pseudomonas aeruginosa, providing a new powerful tool for antibacterial drug discovery and compound testing.

調節するc-ジ-GMPシグナリングで、小さな分子をスクリーニングするためのハイスループットセットアップの確立<em&gt;緑膿菌</em

Bacterial resistance to traditional antibiotics has driven research attempts to identify new drug targets in recently discovered regulatory pathways. ...