Name: ビデオ: Video Tracking Protocol to Screen Deterrent Chemistries for Honey Bees
Uploaded: 2017-06-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 19 s

ビジュアルトラッキングソフトウェアと機器の使用についてDr. Thomas Kuharに感謝します。私たちはJames WilsonとScott O&#39;Nealに技術的支援をしてくれてありがとう。

1.シュガー・アガロース・キューブの調製<ol><li> 8gの砂糖を秤量し、50mLの三角フラスコに入れる。 </li><li>三角フラスコに20mLの脱イオン水を満たします。フラスコを旋回させて砂糖を溶解する。 </li><li> 170 mgのアガロースを秤量し、砂糖溶液に加える。 </li><li>砂糖 - アガロース溶液をマイクロ波で25秒間高温に加熱する。アガロースを糖溶液に溶解する。 </li><li> フラスコと糖 - アガロース溶液を冷ます。 注：フラスコは冷たくて触ってはいけませんが、溶液が凝固しないようにしてください。 <ol><li>対照処理のために糖 - アガロースキューブを調製するために、半冷却糖 - アガロース溶液を計量ボート型に注ぐ。 注：計量ボートの型は、1.5 x 1.5 x 0.3 cm 3の寸法です。 </li><li>忌避剤処理のための糖 - アガロース - 化合物立方体を調製するために、所望量の化合物を半冷却溶液に添加する（ 例えば 、1％DEET in sウガ - アガロース溶液（v / v））。フラスコを旋回させて化合物を混合し、次に溶液を計量ボート型に注ぐ。 注：この時点で、8個の制御型と8個の試験型が準備されます。制御型には忌避剤が含まれていません。 </li></ol></li><li>冷蔵庫でカビの糖 - アガロースの立方体を5〜10分間冷ます。秤量ボート型から凝固した糖 - アガロースの立方体を取り出し、湿らせたペーパータオルを入れたプラスチック容器に入れる。 </li><li>コンテナを冷蔵庫に入れて保管します。砂糖 - アガロースの立方体は、調製から7日以内に使用する必要があります。 </li></ol> 2.ビデオトラッキングソフトウェアのプログラミングと実験的セットアップ<ol><li> 画面の左側にある実験エクスプローラバー（トラッキングソフトウェアの「材料表」を参照）の下で、正しいカメラが選択され、ビデオレコーディングがペトリ皿の中央にあることを確認します。<ol><li>ビデオの録画を中央に配置する必要がある場合は、カメラの設定とAOIコントロールの下にある中央のXとYの中央のオプションを選択します。 </li></ol></li><li> [実験設定]で、アリーナの数を16に変更します。[追跡される機能]で、[中心点検出]を選択します。 </li><li> アレーナ設定を選択して、アッセイに必要なアリーナを設定します。 <ol><li> 16個のペトリ皿をカメラの下に置かれたライトボックスの上に4 x 4パターンで置きます（ 図1 ）。 注：これらの料理は録音場を作成するために使用され、空です。 </li></ol></li></ol><img alt="図1" src="/files/ftp_upload/55603/55603fig1.jpg" /> 図1：ライトボックス上のペトリ皿配置。ペトリ皿はライトボックスの上に4 x 4ブロックで配置されています。この配置は、vのための制御および忌避剤処理の容易な識別を提供する事実追跡プロトコル。 <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55603/55603fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。</a> <ol start="4"><li>アリーナの設定では、右側のツールパネルにあるグラブの背景ボタンを使用して、16枚のペトリ皿を撮影します。これは、アリーナをセットアップするためのテンプレートとして使用されます。 </li><li>アリーナの設定画面の上部にあるツールバーの &quot;楕円の作成&quot;を選択し、イメージ内のペトリ皿の1つの直径に一致する円を作成します。アリーナ1マーカーを円に配置します（ 図2 ）。 </li></ol><img alt="図2" src="/files/ftp_upload/55603/55603fig2.jpg" /> 図2：ビジュアルトラッキングソフトウェアアリーナ設定のスクリーンショット円内の斜めの縞の観察は、円内の検出領域の確認を提供する。 A<html>ゾーン1のマーカーは、各四角に対して提供され、各ペトリ皿のターゲットゾーンを定義します。 <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55603/55603fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。</a> <ol start="6"><li>右側のツールパネルのArena 1にある「Zone Group 1」を選択します。画面上部のツールバーから「長方形を作成」を選択します。これを使用して30 x 30ピクセルの正方形を作成し、前の手順で作成した円の中心に配置します。上部のツールバーから「ゾーンを追加」を選択し、四角形の中央をクリックします。ゾーン1マーカーが正方形になるように移動します。 注：作成された四角は給餌ゾーンであり、給餌ゾーンは糖アガロースキューブよりわずかに大きい限り、記載されているサイズと正確に同じである必要はありません。 </li></ol>les / ftp_upload / 55603 / 55603fig3.jpg &quot;/&gt; 図3：Completed Arena Settingsのスクリーンショット完成したアリーナの設定はこの例のようになります。 <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55603/55603fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。</a> <ol start="7"><li> 右側のツールパネルで[Arena 1]を選択し、[完全なアリーナを複製]をクリックします。ドロップダウンメニューから「All Other Arenas」を選択し、「OK」をクリックします。複製されたアリーナの設定をグラブ画像の残りのペトリ皿に移動します（図3）。 <ol><li> &quot;Arena 1&quot;を選択し、上部のツールバーで &quot;目盛りの校正&quot;を選択します。アリーナ1ペトリ皿の直径全体に較正線を描きます。直径測定値を9cmに変更する（使用しているペトリ皿の直径）。右側のツールパネルで[アリーナ設定の検証]を選択します。 </li></ol></li><li>選択 &quot;左のコントロールバーの「検出設定」を選択します。 </li><li> 「検出設定1」を選択し、右側のツールボックスにあるドロップダウンメニューで「グレースケール」を選択します。検出下では、範囲を0〜83に設定します（ 図4A ）。 </li><li> 「検出設定」を右クリックして、「検出設定2」という名前の新しい設定を作成します。 「グレースケール」が選択されていることを確認しますが、他のパラメータは変更しないでください。 注：ビデオウィンドウには、アリーナの上に大きな黄色の円が表示されます。これは、記録前にペトリ皿を正しい位置に配置するのを助けます（ 図4B ）。 </li></ol><img alt="図4" src="/files/ftp_upload/55603/55603fig4.jpg" /> 図4：検出設定1と2のスクリーンショット （ A ）アレーナがどのように表示され、グレースケールがシャーベットのハチミツ。 （ B ）試行の間にペトリ皿の配置を行うことができるように、アリーナ検出領域を示す。 <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55603/55603fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。</a> <ol start="11"><li> Experimental Explorerで &quot;Trial List&quot;を選択し、上部ツールバーの &quot;Add Variable&quot;をクリックします。ユーザー定義変数に「治療」と名前を付けます。ユーザが定義したTreatmentカラムの &quot;Predefined Values&quot;ドロップダウンバーを選択し、C（コントロール）とT（治療）をPredefined Valuesとして追加します。上部のツールバーにある「トライアルの追加」ボタンを選択します。 2つの試行を追加し、各競技場がコントロールアリーナ（C）か治療アリーナ（T）かを選択する（ 図5 ）。 </li></ol><img alt="図5" src="/files/ftp_upload/55603/55603fig5.jpg" /> Fi図5：試用リストのスクリーンショット。プログラムがここで情報を使用してデータを分離し、それを統計的に分析するので、アリーナに正しくラベルを付けることが重要です。 <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55603/55603fig5large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。</a> <ol start="12"><li> Experiment Explorerパネルの下の &quot;Data Profile&quot;を選択します。左側の列で、 &quot;User-defined Independent Variables&quot;見出しの下にある &quot;Treatment&quot;を選択します。これは、フローチャートにある領域に「フィルタ」ボックスを追加します。ポップアップボックスで &quot;C&quot;を選択し、新しく作成したフィルターを &quot;開始&quot;ボックスと &quot;結果1&quot;ボックスの間に置きます。フローチャートの矢印は、開始ボックスからフィルタ、最後に結果1を指すように調整する必要があります。 <ol><li>手順2.12を繰り返しますが、今回はフィルタの &quot;T&quot;を選択してから、「共通要素」セクションの下の「結果」をクリックします。新しく作成したボックスをフローチャート領域に移動し、矢印でボックスを接続します（ 図6 ）。 </li></ol></li></ol><img alt="図6" src="/files/ftp_upload/55603/55603fig6.jpg" /> 図6：データプロファイルのスクリーンショットこれは、統計分析で適切な分離を得るためにフローチャートがどのように設定されるべきかを示しています。 <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55603/55603fig6large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。</a> <ol start="13"><li>ファイルを保存します。 </li></ol> 3.ハチミツ個体を集める<ol><li>保護服を着て、ミツバチ（主に飼い犬）を集めるハイブを選択してください。 </li><li>ハイブの外側カバーと内側カバーを取り外します。ハイブツールを使用して、巣箱を含まないトップハイブボディのフレームを選択します。ハイブボックスからフレームを静かに持ち上げます。 </li><li>ミツバチ女王のためのフレームを点検しなさい。彼女がそこにいない場合は、輸送のためにフレームからコンテナにミツバチ労働者を掃除します。十分な個体を集めて、試験する各化合物について2回の完全試験を行うことができるようにする（対照で試験ごとに16人が利用される）。 注：収集された個体は、主に飼料作物であるべきである。しかし、コレクションに含まれる看護師のような他の高齢者がいるかもしれません。 </li><li>ミツバチが取り除かれた時期を書き留めます。それらを空気孔を含む9cm×7cm×9cmのプラスチックボックスに移し、32℃および70％相対湿度のインキュベーターに入れる。 </li><li>ミツバチを15時間飢えさせる。 注：これは通常、テストの前に蜂蜜が収集される場合に最適です。 </li></ol> 4.ビジュアルトラッキングアッセイの実施<ol><li>ビジュアルトラッキングプログラムを起動し、保存を開きますこのアッセイのために作成された実験ファイル。 </li><li> 「検出設定2」を選択します。 </li><li>コントロールの砂糖 - アガロースの立方体を16のペトリ皿のうちの8つの中心に置きます。残りの8種類の砂糖 - アガロース - 化合物（抑止力）キューブでこのプロセスを繰り返します。 </li><li>鉗子を使用して、プラスチック箱から単一のミツバチを取り出し、コントロールのペトリ皿の1つに入れます。 </li><li>残りの15ペトリ皿について、ステップ4.4を繰り返す。 </li><li>すべての皿をライトボックスに置き、ペトリ皿の各アリーナにアリーナ検出領域（検出設定2が選択されているときはコンピュータ画面に表示されている）が収まるように配置します。赤いスペクトルに設定された一連のLEDライトでライトボックスを下から照らします。箱とカメラ全体を黒いプラスチックシートで包み、外光をなくし、アリーナ内の影を減らします。 </li><li>ペトリ皿をセットした後、「検出設定1」が選択された設定。 注：この時点で、ビジュアルトラッキングソフトウェアは、ペトリ皿のアリーナ内のミツバチのみをピックアップする必要があります。 </li><li> Experiment Explorerから「Acquisition」を選択します。録音を開始するには、右側のAcquisition Controlポップアップボックスにある緑色の「試用開始」ボタンを押します。 </li><li>アッセイを10分間実行し、その後、Acquisition Controlポップアップボックスの赤い &quot;Stop Trial&quot;ボタンをクリックして、記録を停止します。 </li><li>ペトリ皿から個体を取り出し、別々の容器に入れて2回検査しないでください。 </li><li>同じ化合物の2回目の試行について、4.4-4.10のステップを繰り返します。 注：このメソッドは、ユーザーが必要に応じて治療ごとのミツバチの数を増やすように変更することができます。 </li><li>実験エクスプローラで[統計]を選択し、[計算]をクリックします。 </li><li>データをデータ・マネージャ・ソフトウェアにエクスポートし、重要度のデータを分析するには、aを使用します。Tukeyの事後検定による分散分析、および好ましい統計ソフトウェアプログラムを用いた不対t検定が含まれる。 </li></ol>

<ol>
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著者は何も開示することはない。

このビジュアルトラッキングプロトコールは、比較的容易かつ容易にハチミツの化学抑制剤をスクリーニングする簡単なアプローチを提供する。ミツバチに対する化学的抑止力の実験室試験の推奨プロトコールはありません。以前の半および全圃場研究では、ミツバチの忌避剤14,15 ;記載されたプロトコルは時間がかかり、労働集約的であり、一般的な研究室の外に追加の設備資源を必要とする。このプロトコールは、ミツバチを用いたこのような化合物の半減試験の前に化学抑制剤の前提条件評価として設計された。 ハイブ以外のミツバチの化学的抑止力を評価するために個人をスクリーニングする際には問題があります。例えば、ミツバチは社会的な昆虫であり、行動に影響を与えるハイブ内のフェロモンに依存している14 。このプロトコル要求飢えに加えてフェロモンの手がかりをもはや受け取らない個体の使用を再開する。個々のミツバチの摂食反応を標準化するには、飢餓が必要です。飢餓時間は、24時間の時間経過研究によって決定された。飢餓は、個々のミツバチに有害な影響を与える可能性があることに留意すべきである。例えば、ミツバチは、ハイブから収集してから18時間後に嗜眠性になる。これらの観察に基づいて、ミツバチは、ハイブから収集してから15時間飢えていた。 失敗したスクリーニングを避けるためにこのプロトコールに関連する重要なステップは以下を含む：（1）少なくとも12時間の飢餓後に試験を行う; （2）飢餓が18-19時間を超えた後に試験を実施することを避ける。これはミツバチの活力を低下させるためである。 （3）各試験の対照個体を交換する; （4）アリーナ内の外光および制御シャドウの管理。さらに、新しい化合物scをスクリーニングする前にペトリ皿を交換する必要がありますレイン。場合によっては、ミツバチは録音中にペトリ皿の中で排泄されます。これは、通常、録音やデータ収集を妨げません。すべてのペトリ皿は、砂糖 - アガロースおよび化合物残渣ならびにミツバチの糞便を除去するために、各スクリーンの後に完全に洗浄されるべきである。 このプロトコルは主にミツバチの抑止のために化合物をスクリーニングするように設計されていますが、他の昆虫種の抑止を識別するために容易に適合させることができます。ビジュアルトラッキングソフトウェアを使用する大きな利点 それは各化合物のスクリーニングのための完全なビデオ録画を行うということです。調査者は、各録音を確認して分析する必要がある場合、関心のあるファイルを選択して、同じパラメータまたは新しいパラメータを使用して迅速に画面を再現することができます。ビジュアルトラッキングソフトウェアには、ミツバチよりも小さい個々の昆虫を検出する機能もあります。しかしながら、これは、カメラフィールドの視界が減少し、アリーナが少なくなる1つの画面に記録することができます。このプロトコルの強みは、実験室環境での抑止効果のために数分以内に化合物をスクリーニングする能力である。このように、関心のある化合物ライブラリを選択された数の野外試験の候補に減らすことによって、時間と資金を節約することができます。

ヨーロッパのミツバチ、 Apis melliferaL。世界的に2,000億ドル以上の受粉サービスを提供する、経済的かつ農業上重要な昆虫である1 。米国とヨーロッパでは、ミツバチのコロニー数は減少しています。米国はカリフォルニア州を失っている。 1947年から2008年にかけて管理されたミツバチのコロニーの60％を占めていました。 1961〜2007年の27％ 2、3 。寄生虫の侵入、病原体の感染、養蜂の実践、殺虫剤の使用などがありますが、これらに限定されません。 ハチミツは、2つの主要経路を介して農薬に暴露される可能性があります。ハイブ以外の農薬の暴露は、餌を食べる人が農作物と接触するときに起こります害虫からの保護のための化学薬品を噴霧されている。蜂蜜中の農薬の暴露は、養蜂者がダニ、バクテリア、微胞子虫などの病害虫や病原菌を防除するために化学物質を利用する場合に発生する可能性があります4 。米国とカナダの24の養蜂場のワックス、花粉、ミツバチのサンプルで農薬残留物が確認されている5,6。蜜蜂への農薬の接触の影響には、急性毒性ならびに麻痺、失見当識、および行動および健康の変化などの亜致死的影響が含まれる1,7。現代の農業では農作物収量を維持するために農薬を使用する必要があるため、これらの化学物質は将来も引き続き信頼されます2 。殺虫剤暴露からミツバチをより良く保護するためには、新しい議定書と規制の開発が必要である5 。保護のための1つの可能なアプローチは、餌を餌取りする間、ミツバチが農薬にさらされるのを減らすための忌避剤の使用である。 節足動物防除剤（IR）は、典型的には、節足動物の病原菌に対する個人的な咬傷保護手段として用いられてきた8 。 60年以上前に開発された最も広く使用され成功したIRはDEET 8,9です。これは昆虫忌避試験のゴールドスタンダードとみなされ、世界保健機関と環境保護庁が忌避スクリーニングのためのポジティブコントロールとして使用されています10 。さらに、DEETはミツバチを脅威から彼らのコロニーに分散させることが判明している11 。個人用IRに関連する現在の属性には、（1）広範な節足動物に対する持続的な効果、 （2）皮膚または衣類に適用したときに使用者に対して非刺激性であること; （3）無臭または楽しいにおい; （4）衣服への影響なし。 （5）皮膚に塗布し、使用者の発汗、洗浄、および拭きに耐えるときに油状の外観を示さない。 （6）一般的に使用されるプラスチックには影響を与えない。 （7）化学的に安定であり、広範な使用のために手頃な価格12 。ミツバチに使用される忌避剤は、永続的な効果、アプリケータに対する非刺激性、無臭または快適な臭気、化学的に安定で広範な使用のために手頃な価格、およびミツバチに対する無毒性のようないくつかの属性を必要とするだけである。しかしながら、これらの属性を深く探究する前に、高いスループットで忌避/抑止のための化合物をスクリーニングする方法が必要とされている。ここでは、ハチミツの抑止のための化合物をスクリーニングする実験室アッセイのプロトコールについて説明します。これは、忌避性を決定する重要なステップです。以下のプロトコールは、ミツバチに対する殺虫剤の致死効果を評価するための視覚的追跡方法を記述した以前の研究から変更されている13 。ハウこのプロトコルは、農薬処理された作物からミツバチを抑える可能性がある候補忌避物質の効果を測定するように設計されているという点で異なる。ミツバチに対する化学的抑止剤の実験室試験に推奨されるプロトコールはないので、このプロトコールはそのような化合物をスクリーニングする簡単なアプローチを提供する。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="573">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">50 mL Erlenmeyer flask</td>
			<td style="width:71px;">Kimax</td>
			<td style="width:119px;">26500-50</td>
			<td style="width:167px;">used for making the sugar/agarose cubes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sugar</td>
			<td style="width:71px;">Kroger</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>any similar product will sufffice</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Deionized water</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>acquired in house</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Agarose</td>
			<td style="width:71px;">Apex</td>
			<td style="width:119px;">20-102</td>
			<td>used for making the sugar/agarose cubes</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Mold for agarose cubes (Weigh Boat)</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>any mold that will provide the researcher with a 1.5 X 1.5 X 0.3 cm sugar/agarose cube will suffice</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">EthoVision XT</td>
			<td style="width:71px;">Noldus</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>visual tracking software</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">633 nm LEDs</td>
			<td style="width:71px;">Cyron</td>
			<td>HTP904E</td>
			<td>These lights were placed into a constructed light box to illuminate the arenas from below.&#160; The box was a simple wooden structure with a frosted plastic/plexi glass cover that allowed the light to disperse upwards without any glare.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Laptop or PC</td>
			<td style="width:71px;">Dell</td>
			<td style="width:119px;">Inspiron One 2305</td>
			<td>necessary for video tracking software. Any pc device capable of runnin tbe visual tracking software will suffice</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Bee Keeping protective clothing</td>
			<td style="width:71px;">Dadant &#38; Sons Inc</td>
			<td style="width:119px;">V0126</td>
			<td>any protective hood and jacket will suffice</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Hive tool</td>
			<td style="width:71px;">Dadant &#38; Sons Inc</td>
			<td style="width:119px;">M00757</td>
			<td>used to open honey bee hive</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Container for honey bees</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>any container suitable for housing and storing honey bees will suffice</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Featherweight forceps narrow tip</td>
			<td style="width:71px;">Bioquip</td>
			<td align="right" style="width:119px;">4748</td>
			<td>used to select individual honey bees</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">9 cm (diameter) petri dish</td>
			<td style="width:71px;">Fisher Scientific&#160;</td>
			<td style="width:119px;">S01778</td>
			<td>arena used to contain individual honey bees during video tracking</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Recording Device (Camera)</td>
			<td style="width:71px;">Basler</td>
			<td style="width:119px;">acA-1300-60gm</td>
			<td>any device that can record the subject clearly and transfer the file to a computer will suffice</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">GraphPad Prism</td>
			<td style="width:71px;">Graphpad</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>any statistical software package will suffice</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

video tracking protocol to screen deterrent chemistries for honey bees

ヨーロッパミツバチApis mellifera L.は、毎年何十億ドルもの費用を生み出す、経済的にも農業的にも重要な花粉媒介者です。ハチミツのコロニー数は、1947年以来、米国および多くのヨーロッパ諸国で減少しています。この減少には、ミツバチの殺虫剤への意図しない曝露を含む多くの要因が影響します。新しい方法と規制の開発は、これらの花粉媒介者への農薬の曝露を減らすために保証されている。 1つのアプローチは、最近の農薬処理された作物からミツバチを抑える忌避化学物質の使用である。ここでは、選択された忌避化学物質にさらされたミツバチの抑止を識別するためのプロトコルについて説明します。ハチミツの飼料を採取し、試験の15時間前にインキュベーターで一晩飢えさせる。個々のミツバチを、砂糖 - アガロースキューブ（対照処理）または砂糖 - アガロース - 複合キューブ（撥水処理）を入れたペトリ皿に入れる料理の真ん中に。ペトリ皿は、ビデオトラッキングソフトウェアを使用してミツバチの歩行活動を記録するライトボックス内のカメラの下に配置されたアリーナとして機能する。合計8つの対照および8つの忌避剤処理を10分間分析し、各処理を新しいミツバチと重複させた。ここでは、ハチミツは化合物処理をした糖 - アガロースのキューブに抑えられているが、ミツバチは添加化合物なしで糖 - アガロースのキューブに引き寄せられることを示している。

砂糖 - アガロース（コントロール処理）または糖 - アガロース - 複合キューブ（抑止処置）のいずれかを用いて、ミツバチが標的ゾーンに費やした時間を記録する視覚追跡プロトコルを開発した。記録された時間は、統計的ソフトウェアプログラムを用いて分析され、目標ゾーンにおける平均±標準誤差が棒グラフとして報告された。昆虫忌避剤/抑止試験のためのゴールドスタンダードであるDEETを、このプロトコールで陽性対照として用いた。砂糖アガロースキューブ（ネガティブコントロール）を与えたミツバチは標的ゾーンで343±26秒を費やしたが、砂糖アガロースDEET（忌避剤）を与えたミツバチは標的ゾーンで16±4秒を費やした（ 図7 ）。 DEETは、標的ゾーンのミツバチが消費した時間をcaで大幅に削減しました。 95％であった。 次いで、このプロトコルにより、ミツバチに対する抑止を決定するために興味のあった化合物をスクリーニングした。図8Aは、標的ゾーンの食物源からミツバチを抑止しない化合物を表す。対照皿の標的ゾーンでミツバチが費やした平均時間は約2時間であった。 352±60秒、 ca.化合物Aを注入した糖 - アガロースキューブを有するペトリ皿内のミツバチについては282±43秒であった。 図8Bは個々のミツバチに対する同様の抑止効果を有するDEET以外の化合物を表す。対照のペトリ皿の中にあるハチミツは、平均時間の間、標的ゾーンにとどまった。 493±31秒、 ca.化合物Bを注入した糖 - アガロースキューブを含有するペトリ皿中のミツバチについては23±3秒。これらの結果は、ミツバチの化学的抑止剤のスクリーニングにこのプロトコルを使用することを立証した。目的の化合物でこのプロトコルを実行する前に、ミツバチの飢餓時間の量を決定するためにタイムコースの試験を行う必要があります。 <img alt="図7" src="/files/ftp_upload/55603/55603fig7.jpg" /> 図7： ビジュアルトラッキングソフトウェア抑止プロトコル陽性対照DEETの結果例ハチミツは夕方にハイブから集められ、除去時間が記録されます。次いでそれらは、空気孔を含むプラスチック容器に移される。箱を32℃に設定したインキュベーターに置き、15時間一晩保持する。翌朝、個体を対照糖 - アガロースキューブまたはDEET-注入糖 - アガロースキューブのいずれかを含むペトリ皿に入れる。記述された抑止プロトコルが次に実行される。この図に示された結果は、撥水性ゴールドスタンダードDEETの典型的なものです。この図から、飢えたミツバチが給餌に費やす平均時間は、コントロールキューブ（ 約 343秒）を有するものは、個人がDEET（ 約 16秒）を含浸させた立方体を有する給餌ゾーンで過ごす平均時間よりも有意に大きい（P &lt;0.0001）。 <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55603/55603fig7large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。</a> <img alt="図8" src="/files/ftp_upload/55603/55603fig8.jpg" /> 図8： ビジュアルトラッキングソフトウェアテスト済み化合物の結果例 （ A ）コントロールディッシュ（ 約 352秒）中の標的ゾーン中の個体が過ごした平均時間が、化合物Aを用いたテストディッシュ（ 約 282秒）中の標的ゾーンで過ごした平均時間と有意差がないことを示すデータを表す）。 （ B ）対照区と対照区との間の標的区域で費やされた平均時間の有意差を示すデータを表すes（ 約 493s）および化合物B注入キューブ（ 約23s ）。無作為t検定を行って有意性を決定した（P &lt;0.0001; DF 15）。 <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55603/55603fig8large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。</a>

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Video Tracking Protocol to Screen Deterrent Chemistries for Honey Bees

ミツバチコロニーの喪失は、作物受粉サービスに挑戦している。現在の受粉者保護の実践は、忌避化学物質を用いてハチミツと有害な農薬との接触を最小限に抑えるための別のアプローチを保証する。ここでは、ミツバチに対する抑止力をスクリーニングするための視覚追跡プロトコルの詳細な方法を提供します。

ハチミツの抑止化学物質をスクリーニングするためのビデオトラッキングプロトコル

The European honey bee, Apis mellifera L., is an economically and agriculturally important pollinator that generates billions of dollars annually. Honey ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Environment

6.6K ビュー.  Virginia Tech. ミツバチコロニーの喪失は、作物受粉サービスに挑戦している。現在の受粉者保護の実践は、忌避化学物質を用いてハチミツと有害な農薬との接触を最小限に抑えるための別のアプローチを保証する。ここでは、ミツバチに対する抑止力をスクリーニングするための視覚追跡プロトコルの詳細な方法を提供します。 

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A Technique to Screen American Beech for Resistance to the Beech Scale Insect (Cryptococcus fagisuga Lind.)

Beech bark disease (BBD) results in high levels of initial mortality, leaving behind survivor trees that are greatly weakened and deformed.&#160;The disease is initiated by feeding activities of the invasive beech scale insect, Cryptococcus fagisuga, which creates entry points for infection by one of the Neonectria species of fungus.&#160;Without scale infestation, there is little opportunity for fungal infection. Using scale eggs to artificially infest healthy trees in heavily BBD impacted stands demonstrated that these trees were resistant to the scale insect portion of the disease complex1.&#160;Here we present a protocol that we have developed, based on the artificial infestation technique by Houston2, which can be used to screen for scale-resistant trees in the field and in smaller potted seedlings and grafts.&#160;The identification of scale-resistant trees is an important component of management of BBD through tree improvement programs and silvicultural manipulation.

A Technique to Screen American Beech for Resistance to the Beech Scale Insect Cryptococcus fagisuga Lind.

Beech bark disease is initiated by feeding activities of the beech scale insect that create fungal entry points in the bark.&#160;Trees that are resistant to the scale insect are also disease resistant.&#160;Here we present the protocol we have developed to screen individual beech trees for beech scale resistance.

ブナスケール昆虫への抵抗のためのアメリカのブナを（画面ための技術<em&gt;クリプトコッカスfagisuga</em&gt;リンド。）

Beech bark disease (BBD) results in high levels of initial mortality, leaving behind survivor trees that are greatly weakened and deformed.&#160;The ...

環境学

Experimental Protocol for Manipulating Plant-induced Soil Heterogeneity

Coexistence theory has often treated environmental heterogeneity as being independent of the community composition; however biotic feedbacks such as plant-soil feedbacks (PSF) have large effects on plant performance, and create environmental heterogeneity that depends on the community composition. Understanding the importance of PSF for plant community assembly necessitates understanding of the role of heterogeneity in PSF, in addition to mean PSF effects. Here, we describe a protocol for manipulating plant-induced soil heterogeneity. Two example experiments are presented: (1) a field experiment with a 6-patch grid of soils to measure plant population responses and (2) a greenhouse experiment with 2-patch soils to measure individual plant responses. Soils can be collected from the zone of root influence (soils from the rhizosphere and directly adjacent to the rhizosphere) of plants in the field from conspecific and heterospecific plant species. Replicate collections are used to avoid pseudoreplicating soil samples. These soils are then placed into separate patches for heterogeneous treatments or mixed for a homogenized treatment. Care should be taken to ensure that heterogeneous and homogenized treatments experience the same degree of soil disturbance. Plants can then be placed in these soil treatments to determine the effect of plant-induced soil heterogeneity on plant performance. We demonstrate that plant-induced heterogeneity results in different outcomes than predicted by traditional coexistence models, perhaps because of the dynamic nature of these feedbacks. Theory that incorporates environmental heterogeneity influenced by the assembling community and additional empirical work is needed to determine when heterogeneity intrinsic to the assembling community will result in different assembly outcomes compared with heterogeneity extrinsic to the community composition.

Understanding the role of environmental heterogeneity in species coexistence has typically focused on types of heterogeneity that are extrinsic to the community&#8217;s species composition. We provide novel detailed methods for creating soil heterogeneity treatments using soils subject to plant-soil feedback conditioning, or heterogeneity intrinsic to the community composition.

の操作植物に誘導される土壌の不均一性のための実験プロトコール

Coexistence theory has often treated environmental heterogeneity as being independent of the community composition; however biotic feedbacks such as ...

A Protocol for Conducting Rainfall Simulation to Study Soil Runoff

Rainfall is a driving force for the transport of environmental contaminants from agricultural soils to surficial water bodies via surface runoff. The objective of this study was to characterize the effects of antecedent soil moisture content on the fate and transport of surface applied commercial urea, a common form of nitrogen (N) fertilizer, following a rainfall event that occurs within 24&#160;hr&#160;after fertilizer application. Although urea is assumed to be readily hydrolyzed to ammonium and therefore not often available for transport, recent studies suggest that urea can be transported from agricultural soils to coastal waters where it is implicated in harmful algal blooms. A rainfall simulator was used to apply a consistent rate of uniform rainfall across packed soil boxes that had been prewetted to different soil moisture contents. By controlling rainfall and soil physical characteristics, the effects of antecedent soil moisture on urea loss were isolated. Wetter soils exhibited shorter time from rainfall initiation to runoff initiation, greater total volume of runoff, higher urea concentrations in runoff, and greater mass loadings of urea in runoff. These results also demonstrate the importance of controlling for antecedent soil moisture content in studies designed to isolate other variables, such as soil physical or chemical characteristics, slope, soil cover, management, or rainfall characteristics. Because rainfall simulators are designed to deliver raindrops of similar size and velocity as natural rainfall, studies conducted under a standardized protocol can yield valuable data that, in turn, can be used to develop models for predicting the fate and transport of pollutants in runoff.

A rainfall simulator was used to apply a consistent rate of uniform rainfall to packed soil boxes in a study of the fate and transport of urea, a nonpoint source environmental contaminant. Under uniform soil and rainfall conditions, antecedent soil moisture content exerted strong control over urea loss in surface runoff.

土壌流出を研究する降雨シミュレーションを行うためのプロトコル

Rainfall is a driving force for the transport of environmental contaminants from agricultural soils to surficial water bodies via surface runoff. The ...

A Push-pull Protocol to Reduce Colonization of Bird Nest Boxes by Honey Bees

Introduction of the invasive Africanized honey bee (AHB) into the Neotropics is a serious problem for many cavity nesting birds, specifically parrots. These bees select cavities that are suitable nest sites for birds, resulting in competition. The difficulty of removing bees and their defensive behavior makes a prevention protocol necessary. Here, we describe a push-pull integrated pest management protocol to deter bees from inhabiting bird boxes by applying a bird safe insecticide, permethrin, to repel bees from nest boxes, while simultaneously attracting them to pheromone-baited swarm traps. Shown here is an example experiment using Barn Owl nest boxes. This protocol successfully reduced colonization of Barn Owl nest boxes by Africanized honey bees. This protocol is flexible, allowing adjustments to accommodate a wide range of bird species and habitats. This protocol could benefit conservation efforts where AHB are located.

Preventing colonization of bird nest boxes by invasive Africanized honey bees is important for conservation efforts of nest-site limited birds. We provide an integrated pest management approach to &#34;push&#34; bees away from nest boxes with a repellant insecticide, permethrin, and &#34;pull&#34; them toward pheromone baited swarm traps.

ミツバチによって植民地化鳥の巣箱を削減するためのプッシュプルプロトコル

Introduction of the invasive Africanized honey bee (AHB) into the Neotropics is a serious problem for many cavity nesting birds, specifically parrots. ...

A Protocol for Collecting and Constructing Soil Core Lysimeters

Leaching of nutrients from land applied fertilizers and manure used in agriculture can lead to accelerated eutrophication of surface water. Because the landscape has complex and varied soil morphology, an accompanying disparity in flow paths for leachate through the soil macropore and matrix structure is present. The rate of flow through these paths is further affected by antecedent soil moisture. Lysimeters are used to quantify flow rate, volume of water and concentration of nutrients leaching downward through soils. While many lysimeter designs exist, accurately determining the volume of water and mass balance of nutrients is best accomplished with bounded lysimeters that leave the natural soil structure intact. 
Here we present a detailed method for the extraction and construction of soil core lysimeters equipped with soil moisture sensors at 5 cm and 25 cm depths. Lysimeters from four different Coastal Plain soils (Bojac, Evesboro, Quindocqua and Sassafras) were collected on the Delmarva Peninsula and moved to an indoor climate controlled facility. Soils were irrigated once weekly with the equivalent of 2 cm of rainfall to draw down soil nitrate-N concentrations. At the end of the draw down period, poultry litter was applied (162 kg TN ha-1) and leaching was resumed for an additional five weeks. Total recovery of applied irrigation water varied from 71% to 85%. Nitrate-N concentration varied over the course of the study from an average of 27.1 mg L-1 before litter application to 40.3 mg L-1 following litter application. While greatest flux of nutrients was measured in soils dominated by coarse sand (Sassafras) the greatest immediate flux occurred from the finest textured soil with pronounced macropore development (Quindocqua).

A detailed method for extraction and assembly of intact soil core lysimeters and their use for study of leachate and associated loss of nutrients from surface applied poultry litter is demonstrated.

土壌コアLysimetersを収集し、構築するためのプロトコル

Leaching of nutrients from land applied fertilizers and manure used in agriculture can lead to accelerated eutrophication of surface water. Because the ...

Protocol for Microplastics Sampling on the Sea Surface and Sample Analysis

Microplastic pollution in the marine environment is a scientific topic that has received increasing attention over the last decade. The majority of scientific publications address microplastic pollution of the sea surface. The protocol below describes the methodology for sampling, sample preparation, separation and chemical identification of microplastic particles. A manta net fixed on an &#187;A frame&#171; attached to the side of the vessel was used for sampling. Microplastic particles caught in the cod end of the net were separated from samples by visual identification and use of stereomicroscopes. Particles were analyzed for their size using an image analysis program and for their chemical structure using ATR-FTIR and micro FTIR spectroscopy. The described protocol is in line with recommendations for microplastics monitoring published by the Marine Strategy Framework Directive (MSFD) Technical Subgroup on Marine Litter. This written protocol with video guide will support the work of researchers that deal with microplastics monitoring all over the world.

The protocol below describes the methodology for: microplastics sampling on the sea surface, separation of microplastic and chemical identification of particles. This protocol is in line with the recommendations for microplastics monitoring published by the MSFD Technical Subgroup on Marine Litter.

海面とサンプル分析にMicroplasticsサンプリングのためのプロトコル

Microplastic pollution in the marine environment is a scientific topic that has received increasing attention over the last decade. The majority of ...

Evaluating the Effect of Environmental Chemicals on Honey Bee Development from the Individual to Colony Level

The presence of pesticides in the beekeeping environment is one of the most serious problems that impacts the life of a honey bee. Pesticides can be brought back to the beehive after the bees have foraged on flowers that have been sprayed with pesticides. Pesticide contaminated food can be exchanged between workers which then feed larvae and therefore can potentially affect the development of honey bees. Thus, residual pesticides in the environment can become a chronic damaging factor to honey bee populations and gradually lead to colony collapse. In the presented protocol, honey bee feeding methods are described and applied to either an individual honey bee or to a colony. Here, the insect growth regulator (IGR) pyriproxyfen (PPN), which is widely used to control pest insects and is harmful to the development of honey bee larvae and pupae, is used as the pesticide. The presenting procedure can be applied to other potentially harmful chemicals or honeybee pathogens for further studies.

Herein we present a method to feed pesticide contaminated food to both an individual honey bee and a beehive colony. The procedure evaluates the pesticide effect on individual honey bees by in vivo feeding of basic larval diet and also on the natural condition of beehive colony.

個々のコロニーレベルにミツバチ開発に関する環境化学物質の影響を評価します

The presence of pesticides in the beekeeping environment is one of the most serious problems that impacts the life of a honey bee. Pesticides can be ...

Development of New Methods for Quantifying Fish Density Using Underwater Stereo-video Tools

The use of video camera systems in ecological studies of fish continues to gain traction as a viable, non-extractive method of measuring fish lengths and estimating fish abundance. We developed and implemented a rotating stereo-video camera tool that covers a full 360 degrees of sampling, which maximizes sampling effort compared to stationary camera tools. A variety of studies have detailed the ability of static, stereo-camera systems to obtain highly accurate and precise measurements of fish; the focus here was on the development of methodological approaches to quantify fish density using rotating camera systems. The first approach was to develop a modification of the metric MaxN, which typically is a conservative count of the minimum number of fish observed on a given camera survey. We redefine MaxN to be the maximum number of fish observed in any given rotation of the camera system. When precautions are taken to avoid double counting, this method for MaxN may more accurately reflect true abundance than that obtained from a fixed camera. Secondly, because stereo-video allows fish to be mapped in three-dimensional space, precise estimates of the distance-from-camera can be obtained for each fish. By using the 95% percentile of the observed distance from camera to establish species-specific areas surveyed, we account for differences in detectability among species while avoiding diluting density estimates by using the maximum distance a species was observed. Accounting for this range of detectability is critical to accurately estimate fish abundances. This methodology will facilitate the integration of rotating stereo-video tools in both applied science and management contexts.

We describe a new method for counting fishes, and estimating relative abundance (MaxN) and fish density using rotating stereo-video camera systems. We also demonstrate how to use distance from camera (Z distance) to estimate species-specific detectability.

水中ステレオ ビデオのツールを使用して魚の密度を定量化する新方式の開発

The use of video camera systems in ecological studies of fish continues to gain traction as a viable, non-extractive method of measuring fish lengths and ...

Experimental Protocol for Detecting Mitochondrial Function in Hepatocytes Exposed to Organochlorine Pesticides

This paper presents detailed methods on detecting hepatic mitochondrial function for a better understanding the cause of metabolic disorders caused by environmental organochlorine pesticides (OCPs) in hepatocytes. HepG2 cells were exposed to &#946;-hexachlorocyclohexane (&#946;-HCH) for 24 h at an equivalent dose of internal exposure in general population. Ultrastructure in hepatocytes was examined by transmission electron microscopy (TEM) to show the damage of mitochondria. Mitochondrial function was further evaluated by mitochondrial fluorescence intensity, adenosine 5'-triphosphate (ATP) levels, oxygen consumption rate (OCR) and mitochondrial membrane potential (MMP) in HepG2 cells incubated with &#946;-HCH. The mitochondria fluorescence intensity after stained by mitochondrial green fluorescent probe was observed with a fluorescence microscopy. The luciferin-luciferase reaction was used to determine ATP levels. The MMP was detected by the cationic dye JC-1 and analyzed under flow cytometry. OCR was measured with an extracellular flux analyzer. In summary, these protocols were used in detecting mitochondrial function in hepatocytes with to investigate mitochondria damages.

Understanding the influence of environmental organochlorine pesticides (OCPs) on mitochondrial function in hepatocytes is important in exploring the mechanism of OCPs causing metabolic disorders. This paper presents detailed methods on detecting hepatic mitochondrial function.

有機塩素系農薬に曝露した肝細胞におけるミトコンドリア機能の検出実験プロトコル

This paper presents detailed methods on detecting hepatic mitochondrial function for a better understanding the cause of metabolic disorders caused by ...

In Vitro Rearing of Solitary Bees: A Tool for Assessing Larval Risk Factors

Although solitary bees provide crucial pollination services for wild and managed crops, this species-rich group has been largely overlooked in pesticide regulation studies. The risk of exposure to fungicide residues is likely to be especially high if the spray occurs on, or near host plants while the bees are collecting pollen to provision their nests. For species of Osmia that consume pollen from a select group of plants (oligolecty), the inability to use pollen from non-host plants can increase their risk factor for fungicide-related toxicity. This manuscript describes protocols used to successfully rear oligolectic mason bees, Osmia ribifloris sensu lato, from egg to prepupal stage within cell culture plates under standardized laboratory conditions. The in vitro-reared bees are subsequently used to investigate the effects of fungicide exposure and pollen source on bee fitness. Based on a 2 &#215; 2 fully crossed factorial design, the experiment examines the main and interactive effects of fungicide exposure and pollen source on larval fitness, quantified by prepupal biomass, larval developmental time, and survivorship. A major advantage of this technique is that using in vitro-reared bees reduces natural background variability and allows the simultaneous manipulation of multiple experimental parameters. The described protocol presents a versatile tool for hypotheses testing involving the suite of factors affecting bee health. For conservation efforts to be met with significant, lasting success, such insights into the complex interplay of physiological and environmental factors driving bee declines will prove to be critical.

In Vitro Rearing of Solitary Bees: A Tool for Assessing Larval Risk Factors

Fungicide sprays on flowering plants may expose solitary bees to high concentrations of pollen-borne fungicide residues. Using laboratory-based experiments involving in vitro-reared bee larvae, this study investigates the interactive effects of consuming fungicide-treated pollen derived from host and non-host plants.

体外孤独な蜂の飼育: 幼虫の危険因子を評価するためのツール

Although solitary bees provide crucial pollination services for wild and managed crops, this species-rich group has been largely overlooked in pesticide ...