Simone Puntは、オランダ癌協会の助成金UL2010-4801の支援を受けました。我々は、このJoVEプロトコルが基づいている元の論文の共著者すべてに感謝したいと思います：Emilie A. Dronkers、Marij JP Welters、Renske Goedemans、SenadaKoljenović、Elisabeth Bloemena、Peter JF Snijders、Arko Gorter、Sjoerd vanバーグ。

患者サンプルは、オランダの生物医学社会連合（www.federa.org）のヒト組織の適切な二次的使用のための行動規範に記載された医学的倫理ガイドラインに従って取り扱われた。 1.スライドの準備<ol><li>切除された材料を使用する医療倫理委員会の許可を得た後、病理部門から切除された組織材料（あらゆる種類の組織）を入手する。 注：現在の実験では、前治療（n = 162） 13として選択された1970年から2011年の間、オランダのライデン大学メディカルセンターで診断された原発性口腔咽頭腫瘍から前処置腫瘍サンプルを得た。組織の大きさは、腫瘍内部の4つの顕微鏡画像を確実に採取するのに十分な量の腫瘍組織の必要性によってのみ制限されていた。 </li><li>最低12時間、4％緩衝化ホルマリン中で組織を固定する。 agの組織を脱水するエタノールを放出した。それをキシレンで洗浄し、パラフィンワックスに自動ティッシュプロセッサーを用いて包埋する。 </li><li> ミクロトームを用いてガラススライド上に4μm厚のホルマリン固定、パラフィン包埋（FFPE）組織切片を切断する。標準手順を使用して組織ブロックをマイクロトーンティッシュホルダーに置きます。 <ol><li>組織のリボンを切断し、45℃の脱イオン水を入れた水浴の表面に置きます。免疫組織化学的染色に適したスライドを使用して、セクションのすぐ下の水にスライドを置くことによってセクションを釣り上げる。慎重にスライドを斜め上に動かし、セクションを水中から取り出してスライドに貼り付けます。 </li></ol></li><li>スライドを一晩37℃で乾燥させる。 </li><li> FFPEスライドを新鮮な100％キシレンに完全に浸すことにより脱パラフィンし、それぞれ5分間3回。新鮮な100％エタノール、70％エタノール、および50％エタノールで2回それぞれ5分間浸漬することにより、スライドを再水和する。。 </li></ol> 2.抗原検索を実行する<ol><li>スライドを脱イオン水で5分間洗浄する。 </li><li>マイクロ波を用いてトリス - エチレンジアミン四酢酸（EDTA）緩衝液（10mM Tris + 1mM EDTA、pH9.0）を沸騰温度まで予熱する。予熱されたEDTAバッファー中にスライドを浸し、この温度で10分間マイクロ波でバッファーを保持することによって抗原回収を行う。 注：900 Wのパワーを持つあらゆる電子レンジを使用できます。 </li><li>スライドを2時間緩衝液中で冷却させる。 </li></ol> 3.組織スライドを染色する<ol><li>リン酸緩衝生理食塩水（PBS）でスライドを2回それぞれ5分間洗浄する。 </li><li>疎水性ペンで組織の周りに円を描き、希釈された抗体がスライドからこぼれるのを防ぎます。もう一度PBSで洗浄する。これはオプションです。 </li><li> 1％w / vウシ血清aで希釈した一次抗体（抗CD3 1:50、抗FoxP3 1：200および抗IL-17 1:50）で組織をインキュベートする。PBS中、室温で一晩インキュベートした。 注：1スライドあたりのボリュームは、組織のサイズに依存しますが、通常は50〜150μLです。 CD3、CD8、およびFoxP3抗体（ すなわち、ウサギIgアイソタイプ対照抗体、マウスIgG1アイソタイプ対照抗体およびヤギ抗体と同じ希釈でネガティブコントロールスライドに対する未知の特異性を有する同じアイソタイプクラスの抗体で一次抗体を置換するIgGアイソタイプ対照抗体）。 </li><li>スライドを5分間PBSで3回洗浄する。 </li><li> 一次抗体種および/またはアイソタイプ（ すなわち、ロバ抗ヤギIgG Alexa 488、ロバ抗ウサギIgG A546およびロバ抗マウスA647の1：200）を標的とする蛍光標識された二次抗体の組合せで組織をインキュベートする。 1％BSA含有PBS中、室温で1時間インキュベートする。 注：1スライドあたりのボリュームは、組織のサイズに依存しますが、通常50〜150μLです。 <ol><li>後二次抗体を添加し、暗箱に保管するか、ボックスをアルミ箔で包むことにより、スライドを可能な限り光から保護する。 </li></ol></li></ol> 4.マウントおよび対比組織スライド<ol><li>スライドを5分間PBSで3回洗浄する。 </li><li>核対比染色剤（ 例えば、 DAPI）を含有する水性防フェード装着培地を用いてスライドをマウントする。できるだけ早く（2週間以内に）蛍光顕微鏡を用いてスライドを分析する。分析するまで4℃で暗所にスライドを保存する。 </li></ol> 5.染色された組織スライドを分析する<ol><li> 20〜25倍の対物レンズを備えた蛍光顕微鏡を用いて各スライドの4つの画像を取得する。スライドに含まれる全腫瘍領域のランダムな場所で画像を撮影し、腫瘍の代表的な部分をキャプチャします。 注：250倍の標準倍率を使用する必要があります。任意の蛍光o使用される蛍光色素を視覚化するのに必要なフィルターおよびレーザーを備えていれば、レーザー走査顕微鏡を使用することができる。 <ol><li> Alexa 488の視覚化のために、励起最大値490、最大発光量525を使用します。 Alexa 546の視覚化のために、励起最大値は556、発光最大値は573である。 Alexa 647の可視化のために、励起最大値650および発光最大値665を使用する。 DAPIの視覚化のために、励起最大値を358、発光最大値を461とする。 </li><li>イメージをイメージファイル（ すなわち、 jpegおよびtiff）として、ユーザが利用可能なソフトウェアに保存する。 </li></ol></li><li> 病理学者に相談した後、腫瘍上皮細胞と間質細胞の核および細胞の形状に基づいて、腫瘍上皮と腫瘍間質領域とを区別する。 <ol><li>総間質の表面積を決定するには、（腫瘍細胞ではなく）間質細胞が占めるすべての領域の周りに線を引いて、顕微鏡の製造元が提供する画像分析ソフトウェアを使用して表面積を測定する。 <ol><li>画像の下にある「オーバーレイ」タブをクリックします。 「閉じたポリライン」シェイプを選択し、それをクリックします。腫瘍の上皮と間質の境界を境に、最初の点に再び到達するまでその領域をクリックします。これは、その領域の尺度となります。 注：形状が閉じられると、数は、選択された画像（A = X 2ミクロン）の表面領域を取り囲む形状の横に表示されます。 </li></ol></li><li>この表面積を総画像表面積（画像特性で提供される）から差し引いて、上皮表面積を計算する。提供された領域のサイズを記録し、それを上皮表面領域から差し引くことによって、血管、壊死および自家蛍光領域を取り除く。 </li><li>すべての表面積の数値をスプレッドシートファイルに保存して平均表面積を計算し、1スライドあたりの細胞数。 </li><li>画像解析ソフトウェアを使用して、4つのチャンネルすべての蛍光をチェックすることにより、細胞が単一陽性か、二重陽性か、または三重陽性かを決定する。 <ol><li> ImageJを使用して、各画像の一重、二重および三重陽性細胞を数えます。 <ol><li> ImageJをダウンロードしてください。 &quot;ファイル&quot;と &quot;開く&quot;をクリックして画像を開き、分析する画像を選択します。 「ポイントツール」（4行の真ん中の赤い四角形）を右クリックし、「マルチポイントツール」を選択します。 「マルチポイントツール」をダブルクリックして、各セルタイプごとに異なるカウンター番号を選択して、画像内の異なるセルタイプの数を数えます。 注：1つ、2つ、または3つの蛍光色の存在によって識別されるように、それぞれの異なる細胞タイプのすべての細胞を数えます。この核対比染色はすべての細胞に存在し、腫瘍細胞を免疫細胞と区別するために使用されるため、DAPIを除外する。各セルタイプがカウントされます別のカウンター番号を使用します。毎回異なるカウンター番号を選択することによって、腫瘍上皮および間質領域で別々に各細胞型の細胞数を数えます。血管や大部分の自家蛍光領域内の細胞は計数しないでください。 </li><li>スプレッドシートファイルに各画像の各カウンタービンで分析されたセルの数を記録します。 </li><li>分析された腫瘍上皮および腫瘍間質の総表面積にわたって各細胞型の総細胞数を割る。 </li></ol></li></ol></li></ol></li></ol> 6.統計分析注：すべての統計分析は、データの品質を保証するために統計学者と協議する必要があります。一般的な統計については、任意の医療統計ガイド14を使用してください。 <ol><li>スピアマンのランク相関rho検定を用いて細胞頻度間の相関関係を試験する。 </li><li>陽性細胞数の統計的差異を試験するWilcoxon Mann-Whitney検定を使用して、患者群間で評価した。 </li><li> Kaplan-Meier曲線生成および対数較正を用いて、細胞数と無病生存率（ すなわち、診断から死亡または疾患の局所再発または遠隔再発までの時間）の相関を試験する。ランク分析15 。 </li><li> Cox比例ハザード回帰分析を使用して多変量解析を実行します。 </li></ol>

<ol>
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著者は商業的または財務的に利益相反を宣言していません。

記載されたプロトコールについて、最も重要な工程の1つは、使用される一次抗体の正確な希釈を決定することである。これらの特異的なAlexa標識抗体の製造元が推奨するように、標識二次抗体の希釈度は1：200であった。一次抗体の希釈は、好ましくは意図された組織型の2つの異なる試料（この場合はOPSCC）を用いて連続希釈によって決定されるべきである。最適な作業希釈は、バックグラウンドノイズなしで同じ濃度の陰性対照についてのシグナルがない場合に、明確なシグナルが得られる希釈である。入手可能な顕微鏡のタイプおよび研究者の好みに応じて、使用される二次抗体のタイプおよび使用される装着媒体に関して改変を行うことができる。意図した結果が得られない場合は、背景信号に問題を引き起こすことが知られているスライドガラスのタイプを調べることをおすすめします<html>特定の種類の染色溶液（ 例えば、 Perma Blue）のために使用される。第二に、いくつかの抗原は、熱誘導性エピトープ回収の使用によって混乱する可能性がある。この場合、研究者は緩衝液の加熱工程を酵素誘発性エピトープ回収のような他の技術と置き換えることができる。第3に、疎水性ペンを使用する場合、マーキングは、染色溶液が適切に機能するのを妨げるので、組織に近すぎないようにすべきである。 1標本あたりの切片数および1切片あたりの必要な画像数に関しては、十分な統計力で研究問題に答えるために必要な数を決定することは、研究者および特定の研究課題次第である。分析のために、サンプルあたり1つのセクションとセクションごとに4つのセクションを使用しました。最後に、免疫蛍光染色を使用する場合は、ネイルポリッシュを使用してカバースリップを密封するときは、マニキュア液に含まれるアルコールが蛍光シグナルに影響を与える可能性があるので注意が必要です。 このステップを自動化しようとしましたが、細胞の大きさと形態の主観的解釈は、当時利用可能なソフトウェアパッケージを用いた解析の自動化を複雑にしていました。染色は大いに自動化することができ、細胞の計数は手動で行った。 本発明者らは、記載されたプロトコールを用いて、試験した浸潤性T細胞サブセットと臨床転帰との間の相関を研究することができた。腫瘍内IL-17 +非T細胞の数が少ない患者において、多数のT細胞が無病生存期間の改善と相関することが見出された。これは、IL-17 +非T細胞がOPSCCにおける貧弱な免疫応答に関連し得ることを示唆しており、これはIL-17と癌患者における生存不良との間に記載される相関と一致する16 。 Impr現在、このステップを自動化するために商用化されており、手動セルの観測とカウントを置き換えており、より信頼性が高く、客観的で、再現性があり、高速な結果が得られます。 さらに、蛍光免疫組織化学マーカーの多重化を可能にする市販キットの入手可能性は、現在上昇している17 。これにより、最大7種類の異なる免疫マーカー/バイオマーカーを核対比染色剤と組み合わせて多重化することが可能になります。しかし、ここで報告されたプロトコルは、マルチスペクトル染色分析のための複雑で高価なインフラストラクチャー、顕微鏡、およびソフトウェアパッケージがない検査室で、より効率的かつ容易に適用されると考えています。

口腔咽頭扁平上皮癌（OPSCC）は、口腔咽頭に由来する扁平上皮細胞癌の異種群である。 OPSCCの危険因子は、ヒトパピローマウイルス（HPV）感染症とアルコールとタバコの使用1、2が挙げられます。免疫反応の役割とこれを臨床現場でどのように使用するかは、まだ検討され始めています。腫瘍微小環境は、癌部位に引き付けられる免疫細胞によって浸潤される。 OPSCC患​​者3では、高いCD8 +細胞傷害性T細胞頻度が改善された生存と相関しているが、TregおよびTh17細胞を含む他のT細胞サブセットの役割は依然として不明である4 。 Th1およびTh17細胞は、腫瘍細胞を標的とする免疫応答を助長すると考えられているが、Tregsは、他のT細胞の活性を抑制する能力に関してよく知られている5 。しかしながら、Tregsは、異なる腫瘍のタイプ6における好都合な反応および好ましくない反応の両方と相関することが見出されている6 。血液中に存在する全ての免疫細胞が腫瘍に同程度まで浸潤するわけではないので、局所腫瘍微小環境を研究することは、腫瘍に対して指向される免疫応答の最も信頼できる尺度を提供する。この研究の目的は、免疫細胞の数とタイプと臨床結果との間の相関関係を決定することである。我々は、ヒトOPSCCにおける種々のT細胞亜集団の数および局在を分析するために、4色蛍光IHCイメージングを使用した。 我々は、分化経路がTh17細胞と密接に関連しているトータルTリンパ球（CD3 + ）、Th17細胞、および免疫抑制性FoxP3 + Tregsに焦点を当てた。 Th17細胞は、CD3とIL-17との組み合わせによって特徴付けられる。サイトカインIL-17はまた、非T細胞によって産生され得る7 。我々は、イントラ - エピトープの分布を決定したヘリカルおよび間質性T細胞、Tregs、Th17、およびIL-17 +非T細胞を、OPSCC症例の大規模シリーズで分析し、患者の生存との相関を分析した。多色蛍光IHCを使用して、CD3、Foxp3、およびIL-17の発現を、DAPI対比染色剤と組み合わせて同定した。このアッセイは、腫瘍細胞（DAPI核染色を使用）および浸潤T細胞集団（異なるマーカーの組み合わせを使用する）の両方の容易かつ明確な同定を可能にした。試料の調製および染色の後、蛍光顕微鏡および画像化ソフトウェアを使用して、使用される異なる蛍光色を分離し、腫瘍上皮および腫瘍関連間質の両方に存在する細胞の数および型を決定した。 免疫細胞集団を定量化および表現する別のアッセイは、フローサイトメトリー分析、または腫瘍または末梢サンプル（ すなわち血液または腹水）の飛行時間（CyTOF）分析によるサイトメトリーである。これを使用する異なる細胞型の局在化および相対的分布に関するすべての情報が失われる。末梢サンプルの使用および分析はまた、どの細胞が腫瘍微小環境に浸潤できるかについての情報を提供しない。血液および腹水免疫細胞の分析は、腫瘍組織8,9の免疫細胞浸潤の表現型および頻度を反映しないことが示されています。 もう一つの選択肢は、明視野顕微鏡の使用である。蛍光イメージングに対するこの技術の利点は、組織自己蛍光がないことである。いくつかの試料はより多くの自家蛍光、特に赤血球を含有するが、好中球顆粒球を含む他の細胞型も含まれるが、これらの領域はほとんどすべての試料の分析において容易に除去することができる。免疫蛍光法は、標的蛍光体のパネルを使用することにより、1つの試料中の複数のマーカーを分析する利点を提供するnt個の波長を有する。これは、特定の抗原についての十分な数の標識および市販の抗体アイソタイプの欠如のために、明視野顕微鏡法については現在同じ程度には不可能である。 ここで説明した多色蛍光IHC技術は、例えば、ヒト白血球抗原（HLA）とPD-L1 10、11などの異なる免疫細胞集団、ならびに腫瘍細胞発現分子を研究する癌の種類及び抗体の組合せさまざまに使用されています12 。このプロトコールは、多くの異なるタイプのサンプルおよび抗体を用いて確立され、検証されている。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1379">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">Pathos Delta Ultra Rapid Tissue Processor</td>
			<td style="width:167px;">Milestone and Histostar</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td style="width:696px;">Automated tissue processor</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">Histostar</td>
			<td style="width:167px;">Thermo Scientific&#160;</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td style="width:696px;">Tissue block embedding machine</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">Formaldehyde</td>
			<td style="width:167px;">Baker</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">Xylol</td>
			<td style="width:167px;">Merck</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">Ethanol</td>
			<td style="width:167px;">Merck</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">milliQ water</td>
			<td style="width:167px;">Elaga Purelab Chorus</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">Paraffin wax/Paraclean</td>
			<td style="width:167px;">Klinipath</td>
			<td style="width:143px;">5079A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">Microtome tissue holder&#160;</td>
			<td style="width:167px;">Leica</td>
			<td style="width:143px;">RM225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Flex IHC side</td>
			<td style="width:167px;">Dako</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td>Tissue slide</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">Tris</td>
			<td style="width:167px;">Merk-Milipore</td>
			<td style="width:143px;">1,083,821,000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">EDTA</td>
			<td style="width:167px;">Baker</td>
			<td style="width:143px;">1073</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">PBS</td>
			<td style="width:167px;">Bio-Rad</td>
			<td>BUF036A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">BSA</td>
			<td style="width:167px;">Sigma</td>
			<td style="width:143px;">A9647</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">Rabbit anti-CD3</td>
			<td style="width:167px;">Abcam</td>
			<td style="width:143px;">ab828</td>
			<td>Titrate required antibody dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">Mouse IgG1 anti-FoxP3</td>
			<td style="width:167px;">Abcam</td>
			<td style="width:143px;">ab20034</td>
			<td>Titrate required antibody dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">Goat IgG anti-IL-17</td>
			<td style="width:167px;">R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:143px;">AF-317-NA</td>
			<td>Titrate required antibody dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">Rabbit Ig isotype control antibody</td>
			<td style="width:167px;">Abcam</td>
			<td>ab27472</td>
			<td>Use at same final concentration as anti-CD3</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">Mouse IgG1 isotype control antibody</td>
			<td style="width:167px;">Abcam</td>
			<td>ab91353</td>
			<td>Use at same final concentration as anti-FoxP3</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">Goat IgG isotype control antibody</td>
			<td style="width:167px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:143px;">02-6202</td>
			<td>Use at same final concentration as anti-IL-17</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">Donkey anti-rabbit IgG A546</td>
			<td style="width:167px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:143px;">A10040</td>
			<td>Dilute 1:200 in 1% BSA/PBS</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">Donkey anti-mouse-A647</td>
			<td style="width:167px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:143px;">A31571</td>
			<td>Dilute 1:200 in 1% BSA/PBS</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">Donkey anti-goat IgG A488</td>
			<td style="width:167px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:143px;">A11055</td>
			<td>Dilute 1:200 in 1% BSA/PBS</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">VectaShield containing DAPI</td>
			<td style="width:167px;">Vector Laboratories</td>
			<td style="width:143px;">H-1200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">LSM700 confocal laser scanning microscope&#160;</td>
			<td style="width:167px;">Zeiss</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">LCI Plan-Neofluar 25x/0.8 Imm Korr DIC M27 objective</td>
			<td style="width:167px;">Zeiss</td>
			<td>420852-9972-720</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">LSM Zen Software</td>
			<td style="width:167px;">Zeiss</td>
			<td>version 2009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">LSM Image Browser</td>
			<td style="width:167px;">Zeiss</td>
			<td style="width:143px;">version 4.2.0.121</td>
			<td>Available to download at www.zeiss.com/microscopy/int/website/downloads/lsm-image-browser.html.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">SPSS</td>
			<td style="width:167px;">IBM Corp.</td>
			<td style="width:143px;">version 20.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">ImageJ</td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td style="width:143px;">version 1.50i</td>
			<td>Available to download at http://rsb.info.nih.gov/ij.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

four-color fluorescence immunohistochemistry of t-cell subpopulations in archival formalin-fixed, paraffin-embedded human oropharyngeal squamous cell carcinoma samples

4色蛍光免疫組織化学（IHC）技術は、それらの相対的分布および組織におけるそれらの局在を考慮に入れながら、目的の細胞集団を定量する方法である。この技術は、様々な腫瘍型の免疫浸潤を研究するために広く適用されている。腫瘍微小環境は、腫瘍部位に引き付けられる免疫細胞によって浸潤される。異なる免疫細胞集団は、腫瘍微小環境において異なる役割を果たすこと、および疾患の転帰に異なる影響を有することが見出されている。この原稿では、口腔咽頭扁平上皮癌（OPSCC）上の多パラメータ蛍光IHCの使用を例として説明します。この技術は、他の組織サンプルおよび目的の細胞型に拡張することができる。提示された研究では、大きなOPSCCコホート（n = 162）の上皮内および間質コンパートメントを分析した。我々は、全Tリンパ球（CD3 + ）、免疫抑制性調節間質から腫瘍上皮を区別するために核対比染色を用いて、T細胞（Tregs; すなわち FoxP3 + ）およびTヘルパー17（Th17）細胞（ すなわち、 IL-17 + CD3 +腫瘍内IL-17 +非T細胞の数が少ない患者において、多数のT細胞が無病生存期間の改善と相関することが見出された。これは、IL-17 +非T細胞がOPSCCにおける貧弱な免疫応答と相関し得ることを示唆し、これはIL-17と癌患者における生存率の間の相関と一致する。現在、7つまでの異なる蛍光色素を用いて新規なマルチパラメータ蛍光IHC技術が開発されており、腫瘍微小環境における免疫細胞のより正確な特徴付けおよび局在化が可能になる。

前述したように選択された1970年から2011年の間にライデン大学医療センター、ライデン、オランダで診断原発口腔咽頭腫瘍から得られたFFPE前処理腫瘍サンプルのシリーズ、（N = 162）は、13に記載のプロトコルを用いて染色しました。各スライドの1から4つのランダム画像を分析した（ 図1 ）。いくつかの自家蛍光細胞が示されており、完全な黄色の外観によって明確に区別することができる。真に二重または三重陽性の細胞は、予想される局在化（この場合、細胞膜または核である）において特定の抗体に対して陽性にしか染色されない。陰性対照スライドは、バックグラウンド組織自己蛍光よりも特異的な染色を示さず（ 図2および図4 ）、すべてのシグナルがプライマリによって認識された標的に特異的であることを確認した抗体。全ての腫瘍試料は、CD3 + T細胞によって種々の程度まで浸潤することが見出された。 FoxP3 + Tregsは常にCD3を発現し、主要な浸潤性T細胞集団の1つであった。 IL-17（Th17細胞）を発現するCD3細胞は、浸潤性T細胞の小集団であった。 CD3 -細胞によって発現されるIL-17は、豊富な浸潤細胞集団であった。 IL-17 + FoxP3 +細胞は、全FoxP3 +細胞の0.01％以下を構成した。 すべての統計的検定は両側であり、0.05未満のp値は有意であると考えられた14 。間質または全細胞数と患者の生存との間の相関が類似しているので、上皮内または総細胞数と生存との間の相関が示される。多数の全浸潤CD3 + T細胞が、無病生存率の改善との相関傾向を示した（0.086、 図5A ）と比較して、低いT細胞数（ すなわち、最低四分位数）と比較した。少数のIL-17 +細胞を特異的に研究した場合、多数の全浸潤T細胞が無病生存率の改善と相関していた（p = 0.012、 図5B ）。多数の腫瘍浸潤IL-17 +細胞を有する患者の群において、腫瘍浸潤性T細胞の予後効果は失われた（データ示さず）。したがって、OPSCCにおける腫瘍浸潤性T細胞の効果は、存在するIL-17 +細胞の数が少ないことに関連している可能性がある。 <img alt="図1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55589/55589fig1.jpg" /> 図1：四色蛍光IHCによって染色されたFFPE卵管卵巣組織。 CD3（ A 、赤色）、IL-17（ B </str<html> ong&gt;、green）、FoxP3（ C 、青）、およびDAPI（灰色）（ D ）と結合されたマージ画像です。 2つの自家蛍光細胞を矢印で示す。 <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55589/55589fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。</a> <img alt="図2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55589/55589fig2.jpg" /> 図2：CD3の陰性対照。抗CD3抗体を未知の特異性を有するウサギIgアイソタイプ対照抗体で置換して、プロトコールに記載のように染色したFFPE口腔咽頭癌組織の代表的な画像。 IL-17（ B 、緑色）、FoxP3（ C 、青色）、およびDAPI（ D 、灰色）の染色と組み合わせたウサギIg（ A 、赤色）の染色は示されていない。2large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt;この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。 <img alt="図3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55589/55589fig3.jpg" /> 図3：IL-17の陰性対照。プロトコールに記載されているように染色され、抗IL-17抗体を未知の特異性を有するヤギIgアイソタイプ対照抗体で置換したFFPE口腔咽頭癌組織の代表的な画像。 CD3（ A 、赤色）、FoxP3（ C 、青色）およびDAPI（ D 、灰色）の染色と組み合わせたヤギIg（ B 、緑色）の染色は示されていない。 <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55589/55589fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。</a> <img alt="図4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55589/55589fig4.jpg" /> F図4：FoxP3の陰性対照。プロトコルに記載されているように染色されたFFPE口腔咽頭癌組織の代表的な画像で、抗FoxP3抗体を未知の特異性を有するマウスIgG1アイソタイプコントロール抗体で置換する。 CD3（ A 、赤色）、IL-17（ B 、緑色）およびDAPI（ D 、灰色）の染色と組み合わせたマウスIgG1（ C 、青色）の染色は示されていない。 <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55589/55589fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。</a> <img alt="図5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55589/55589fig5.jpg" /> 図5：カプラン - マイヤー生存曲線。 IL-17 +細胞/ mm 2未満の中央値を有する患者では、無病生存曲線は、非常に低い（ すなわち、最低四分位数）対多数の総数全腫瘍領域中のT細胞数（ A ）および全T細胞数（ B ）の低い（ すなわち、中央値未満） Cancer Immunotherapy Immunotherapyジャーナルの許可を得て再現13 。 <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55589/55589fig5large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。</a>

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Four-color Fluorescence Immunohistochemistry of T-cell Subpopulations in Archival Formalin-fixed, Paraffin-embedded Human Oropharyngeal Squamous Cell Carcinoma Samples

多パラメータ蛍光免疫組織化学を用いて、腫瘍微小環境における免疫細胞集団の数、相対分布、および局在を評価することができる。この文献は、口腔咽頭癌におけるT細胞亜集団を分析するためのこの技術の使用を記載している。

ホルマリン固定パラフィン包埋ヒト卵黄扁平上皮癌試料におけるT細胞亜集団の四色蛍光免疫組織化学

The four-color fluorescence immunohistochemistry (IHC) technique is a method to quantify cell populations of interest while taking into account their ...

four-color-fluorescence-immunohistochemistry-t-cell-subpopulations

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Cancer Research

9.6K ビュー.  Leiden University Medical Center. 多パラメータ蛍光免疫組織化学を用いて、腫瘍微小環境における免疫細胞集団の数、相対分布、および局在を評価することができる。この文献は、口腔咽頭癌におけるT細胞亜集団を分析するためのこの技術の使用を記載している。 

ビデオ: Four-color Fluorescence Immunohistochemistry of T-cell Subpopulations in Archival Formalin-fixed, Paraffin-embedded Human Oropharyngeal Squamous Cell Carcinoma Samples

A Model for Perineural Invasion in Head and Neck Squamous Cell Carcinoma

Perineural invasion (PNI) is found in approximately 40% of head and neck squamous cell carcinomas (HNSCC). Despite multimodal treatment with surgery, radiation, and chemotherapy, locoregional recurrences and distant metastases occur at higher rates, and overall survival is decreased by 40% compared to HNSCC without PNI. In vitro studies of the pathways involved in HNSCC PNI have historically been challenging given the lack of a consistent, reproducible assay. Described here is the adaptation of the dorsal root ganglion (DRG) assay for the examination of PNI in HNSCC. In this model, DRG are harvested from the spinal column of a sacrificed nude mouse and placed within a semisolid matrix. Over the subsequent days, neurites are generated and grow in a radial pattern from the cell bodies of the DRG. HNSCC cell lines are then placed peripherally around the matrix and invade preferentially along the neurites toward the DRG. This method allows for rapid evaluation of multiple treatment conditions, with very high assay success rates and reproducibility.

Perineural invasion (PNI) is a common feature of head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC), conferring lower survival rates. Its mechanisms are poorly understood. Utilizing neurites generated from murine dorsal root ganglia confined to a semisolid matrix, the pathways involved in the PNI of HNSCC cell lines can be investigated.

頭頸部扁平上皮癌における神経周囲の浸潤のためのモデル

Perineural invasion (PNI) is found in approximately 40% of head and neck squamous cell carcinomas (HNSCC). Despite multimodal treatment with surgery, ...

がん研究

Therapy Testing in a Spheroid-based 3D Cell Culture Model for Head and Neck Squamous Cell Carcinoma

Current treatment options for advanced and recurrent head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC) enclose radiation and chemo-radiation approaches with or without surgery. While platinum-based chemotherapy regimens currently represent the gold standard in terms of efficacy and are given in the vast majority of cases, new chemotherapy regimens, namely immunotherapy are emerging. However, the response rates and therapy resistance mechanisms for either chemo regimen are hard to predict and remain insufficiently understood. Broad variations of chemo and radiation resistance mechanisms are known to date. This study describes the development of a standardized, high-throughput in vitro assay to assess HNSCC cell line&#39;s response to various therapy regimens, and hopefully on primary cells from individual patients as a future tool for personalized tumor therapy. The assay is designed to being integrated into the quality-controlled standard algorithm for HNSCC patients at our tertiary care center; however, this will be subject of future studies. Technical feasibility looks promising for primary cells from tumor biopsies from actual patients. Specimens are then transferred into the laboratory. Biopsies are mechanically separated followed by enzymatic digestion. Cells are then cultured in ultra-low adhesion cell culture vials that promote the reproducible, standardized and spontaneous formation of three-dimensional, spheroid-shaped cell conglomerates. Spheroids are then ready to be exposed to chemo-radiation protocols and immunotherapy protocols as needed. The final cell viability and spheroid size are indicators of therapy susceptibility and therefore could be drawn into consideration in future to assess the patients&#39; likely therapy response. This model could be a valuable, cost-efficient tool towards personalized therapy for head and neck cancer.

We describe the evolution of a spheroid-based, three-dimensional in vitro model that enables us to test the current standard of experimental therapy regimens for head and neck squamous cell carcinoma on cell lines, aiming at evaluating therapy susceptibility and resistance on primary cells from human specimens in the future.

治療の頭頸部扁平上皮癌に対する回転楕円体に基づく 3 D 細胞培養モデルのテスト

Current treatment options for advanced and recurrent head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC) enclose radiation and chemo-radiation approaches with ...

Fabrication of Tongue Extracellular Matrix and Reconstitution of Tongue Squamous Cell Carcinoma In Vitro

In order to construct an effective and realistic model for tongue squamous cell carcinoma (TSCC) in vitro, the methods were created to produce decellularized tongue extracellular matrix (TEM) which provides functional scaffolds for TSCC construction. TEM provides an in vitro niche for cell growth, differentiation, and cell migration. The microstructures of native extracellular matrix (ECM) and biochemical compositions retained in the decellularized matrix provide tissue-specific niches for anchoring cells. The fabrication of TEM can be realized by deoxyribonuclease (DNase) digestion accompanied with a serious of organic or inorganic pretreatment. This protocol is easy to operate and ensures high efficiency for the decellularization. The TEM showed favorable cytocompatibility for TSCC cells under static or stirred culture conditions, which enables the construction of the TSCC model. A self-made bioreactor was also used for the persistent stirred condition for cell culture. Reconstructed TSCC using TEM showed the characteristics and properties resembling clinical TSCC histopathology, suggesting the potential in TSCC research.

Fabrication of Tongue Extracellular Matrix and Reconstitution of Tongue Squamous Cell Carcinoma In Vitro

A method is shown here for the preparation of the tongue extracellular matrix (TEM) with efficient decellularization. The TEM can be used as functional scaffolds for the reconstruction of a tongue squamous cell carcinoma (TSCC) model under static or stirred culture conditions.

舌の細胞外マトリックスと舌扁平上皮癌生体外の再構成の作製

In order to construct an effective and realistic model for tongue squamous cell carcinoma (TSCC) in vitro, the methods were created to produce ...

Determination of Protein Expression Level in Cultured Cells by Immunocytochemistry on Paraffin-embedded Cell Blocks

Immunofluorescent staining is currently the method of choice for determination of protein expression levels in cell-culture systems when morphological information is also necessary. The protocol of immunocytochemical staining on paraffin-embedded cell blocks, presented herein, is an excellent alternative to immunofluorescent staining on non-paraffin-embedded fixed cells. In this protocol, a paraffin cell block from HeLa cells was prepared using the thromboplastin-plasma method, and immunocytochemistry was performed for the evaluation of two proliferation markers, CKAP2 and Ki-67. The nuclei and cytoplasmic morphology of the HeLa cells were well preserved in the cell-block slides. At the same time, the CKAP2 and Ki-67 staining patterns in the immunocytochemistry were quite similar to those in immunohistochemical staining in paraffin cancer tissues. With modified cell-culture conditions, including pre-incubation of HeLa cells under serum-free conditions, the effect could be evaluated while preserving architectural information. In conclusion, immunocytochemistry on paraffin-embedded cell blocks is an excellent alternative to immunofluorescent staining.

Currently, immunofluorescent staining on fixed cells is the method of choice for determination of protein expression levels when morphological information is also necessary. This protocol presented herein provides for an alternative method of immunocytochemistry on paraffin-embedded cell blocks.

セルのパラフィン包埋ブロックの免疫細胞化学による培養細胞の蛋白質発現レベルの定量

Immunofluorescent staining is currently the method of choice for determination of protein expression levels in cell-culture systems when morphological ...

Elastic Staining on Paraffin-embedded Slides of pT3N0M0 Gastric Cancer Tissue

The elastic lamina, which is usually located in the sub-mesothelial layer, adjacent to the peritoneum mesothelial cells, is amphiphilic on hematoxylin and eosin (H&amp;E) staining but can be visualized through elastic staining. One of the important benefits of elastic staining is that it makes it easy to determine whether tumor cells have invaded beyond the elastic lamina. This helps in examining the extent of peritoneal surface invasion, thereby distinguishing the pT3 and pT4 stages in gastrointestinal cancer. In this study, we present a protocol to identify elastic fibers in the formalin-fixed, paraffin-embedded pT3N0M0 gastric cancer tissue sections. We prepare 5-&#181;m paraffin sections fixed on slides, and then all the slides are deparaffinated and rehydrated during the staining procedure. Subsequently, all the sections are oxidized by potassium permanganate, bleached by oxalic acid, stained by elastic staining, and counterstained by Van Gieson's. Finally, we examine the effect of staining; elastic lamina is stained blue-black and collagen fibers are stained red, while the cancer cells are stained in varying shades of yellow. We also describe in detail the methods used for determining the positional relationship between cancer cells and elastic lamina. This method is simple, low-cost, and widely applicable in the identification of peritoneal surface invasion in gastrointestinal cancer because of its outstanding selectivity for elastic fibers and authentic results.

Here, we present a protocol of elastic staining to identify elastic fibers in pT3N0M0 gastric cancer tissues on formalin-fixed, paraffin-embedded sections. Subsequently, we describe a method to determine whether tumor cells invade beyond the elastic lamina.

pT3N0M0胃癌組織のパラフィン埋め込みスライド上の弾性染色

The elastic lamina, which is usually located in the sub-mesothelial layer, adjacent to the peritoneum mesothelial cells, is amphiphilic on hematoxylin and ...

Automated Multiplex Immunofluorescence Panel for Immuno-oncology Studies on Formalin-fixed Carcinoma Tissue Specimens

Continued developments in immuno-oncology require an increased understanding of the mechanisms of cancer immunology. The immunoprofiling analysis of tissue samples from formalin-fixed, paraffin-embedded (FFPE) biopsies has become a key tool for understanding the complexity of tumor immunology and discovering novel predictive biomarkers for cancer immunotherapy. Immunoprofiling analysis of tissues requires the evaluation of combined markers, including inflammatory cell subpopulations and immune checkpoints, in the tumor microenvironment. The advent of novel multiplex immunohistochemical methods allows for a more efficient multiparametric analysis of single tissue sections than does standard monoplex immunohistochemistry (IHC). One commercially available multiplex immunofluorescence (IF) method is based on tyramide-signal amplification and, combined with multispectral microscopic analysis, allows for a better signal separation of diverse markers in tissue. This methodology is compatible with the use of unconjugated primary antibodies that have been optimized for standard IHC on FFPE tissue samples. Herein we describe in detail an automated protocol that allows multiplex IF labeling of carcinoma tissue samples with a six-marker multiplex antibody panel comprising PD-L1, PD-1, CD68, CD8, Ki-67, and AE1/AE3 cytokeratins with 4&#8242;,6-diamidino-2-phenylindole as a nuclear cell counterstain. The multiplex panel protocol is optimized in an automated IHC stainer for a staining time that is shorter than that of the manual protocol and can be directly applied and adapted by any laboratory investigator for immuno-oncology studies on human FFPE tissue samples. Also described are several controls and tools, including a drop-control method for fine quality control of a new multiplex IF panel, that are useful for the optimization and validation of the technique.

A detailed protocol for a six-marker multiplex immunofluorescence panel is optimized and performed, using an automated stainer for more consistent results and a shorter procedure time. This approach can be directly adapted by any laboratory for immuno-oncology studies.

ホルマリン固定癌組織標本の腫瘍免疫研究の自動多重蛍光パネル

Continued developments in immuno-oncology require an increased understanding of the mechanisms of cancer immunology. The immunoprofiling analysis of ...

Evaluation of Biomarkers in Glioma by Immunohistochemistry on Paraffin-Embedded 3D Glioma Neurosphere Cultures

Analysis of protein expression in glioma is relevant for several aspects in the study of its pathology. Numerous proteins have been described as biomarkers with applications in diagnosis, prognosis, classification, state of tumor progression, and cell differentiation state. These analyses of biomarkers are also useful to characterize tumor neurospheres (NS) generated from glioma patients and glioma models. Tumor NS provide a valuable in vitro model to assess different features of the tumor from which they are derived and can more accurately mirror glioma biology. Here we describe a detailed method to analyze biomarkers in tumor NS using immunohistochemistry (IHC) on paraffin-embedded tumor NS.

Neurospheres grown as 3D cultures constitute a powerful tool to study glioma biology. Here we present a protocol to perform immunohistochemistry while maintaining the 3D structure of glioma neurospheres through paraffin embedding. This method enables the characterization of glioma neurosphere properties such as stemness and neural differentiation.

パラフィン埋め込まれた 3 D 神経膠腫 Neurosphere 文化に免疫組織化学による神経膠腫におけるバイオ マーカーの評価

Analysis of protein expression in glioma is relevant for several aspects in the study of its pathology. Numerous proteins have been described as ...

Intramucosal Inoculation of Squamous Cell Carcinoma Cells in Mice for Tumor Immune Profiling and Treatment Response Assessment

Head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC) is a debilitating and deadly disease with a high prevalence of recurrence and treatment failure. To develop better therapeutic strategies, understanding tumor microenvironmental factors that contribute to the treatment resistance is important. A major impediment to understanding disease mechanisms and improving therapy has been a lack of murine cell lines that resemble the aggressive and metastatic nature of human HNSCCs. Furthermore, a majority of murine models employ subcutaneous implantations of tumors which lack important physiological features of the head and neck region, including high vascular density, extensive lymphatic vasculature, and resident mucosal flora. The purpose of this study is to develop and characterize an orthotopic model of HNSCC. We employ two genetically distinct murine cell lines and established tumors in the buccal mucosa of mice. We optimize collagenase-based tumor digestion methods for the optimal recovery of single cells from established tumors. The data presented here show that mice develop highly vascularized tumors that metastasize to regional lymph nodes. Single-cell multiparametric mass cytometry analysis shows the presence of diverse immune populations with myeloid cells representing the majority of all immune cells. The model proposed in this study has applications in cancer biology, tumor immunology, and preclinical development of novel therapeutics. The resemblance of the orthotopic model to clinical features of human disease will provide a tool for enhanced translation and improved patient outcomes.

Here we present a reproducible method for developing an orthotopic murine model of head and neck squamous cell carcinoma. Tumors demonstrate clinically relevant histopathological features of the disease, including necrosis, poor differentiation, nodal metastases, and immune infiltration. Tumor-bearing mice develop clinically relevant symptoms including dysphagia, jaw displacement, and weight loss.

腫瘍免疫プロファイル用のマウスおよび治療応答評価における扁平上皮癌細胞の粘膜接種

Head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC) is a debilitating and deadly disease with a high prevalence of recurrence and treatment failure. To develop ...

Multidimensional Coculture System to Model Lung Squamous Carcinoma Progression

Tumor-stroma interactions play a critical role in the development of lung squamous carcinoma (LUSC). However, understanding how these dynamic interactions contribute to tissue architectural changes observed during tumorigenesis remains challenging due to the lack of appropriate models. In this protocol, we describe the generation of a 3D coculture model using a LUSC primary cell culture known as TUM622. TUM622 cells were established from a LUSC patient-derived xenograft (PDX) and have the unique property to form acinar-like structures when seeded in a basement membrane matrix. We demonstrate that TUM622 acini in 3D coculture recapitulate key features of tissue architecture during LUSC progression as well as the dynamic interactions between LUSC cells and components of the tumor microenvironment (TME), including the extracellular matrix (ECM) and cancer-associated fibroblasts (CAFs). We further adapt our principal 3D culturing protocol to demonstrate how this system could be utilized for various downstream analyses. Overall, this organoid model creates a biologically rich and adaptable platform that enables one to gain insight into the cell-intrinsic and extrinsic mechanisms that promote the disruption of epithelial architectures during carcinoma progression and will aid the search for new therapeutic targets and diagnostic markers.

An in vitro model system was developed to capture tissue architectural changes during lung squamous carcinoma (LUSC) progression in a 3-dimensional (3D) co-culture with cancer-associated fibroblasts (CAFs). This organoid system provides a unique platform to investigate the roles of diverse tumor cell-intrinsic and extrinsic changes that modulate the tumor phenotype.

肺扁平上皮癌進行をモデル化する多次元共培養システム

Tumor-stroma interactions play a critical role in the development of lung squamous carcinoma (LUSC). However, understanding how these dynamic interactions ...

Expanding the Comprehension of the Tumor Microenvironment using Mass Spectrometry Imaging of Formalin-Fixed and Paraffin-Embedded Tissue Samples

Advances in immune-based therapies have revolutionized cancer treatment and research. This has triggered growing demand for the characterization of the tumor immune landscape. Although standard immunohistochemistry is suitable for studying tissue architecture, it is limited to the analysis of a small number of markers. Conversely, techniques such as flow cytometry can evaluate multiple markers simultaneously, although information about tissue morphology is lost. In recent years, multiplexed strategies that integrate phenotypic and spatial analysis have emerged as comprehensive approaches to the characterization of the tumor immune landscape. Herein, we discuss an innovative technology combining metal-labeled antibodies and secondary ion mass spectrometry focusing on the technical steps in assay development and optimization, tissue preparation, and image acquisition and processing. Before staining, a metal-labeled antibody panel must be developed and optimized. This hi-plex image system supports up to 40 metal-tagged antibodies in a single tissue section. Of note, the risk of signal interference increases with the number of markers included in the panel. After panel design, particular attention should be given to the metal isotope assignment to the antibody to minimize this interference. Preliminary panel testing is performed using a small subset of antibodies and subsequent testing of the entire panel in control tissues. Formalin-fixed, paraffin-embedded tissue sections are obtained and mounted on gold-coated slides and further stained. The staining takes 2 days and closely resembles standard immunohistochemical staining. Once samples are stained, they are placed in the image acquisition instrument. Fields of view are selected, and images are acquired, uploaded, and stored. The final stage is image preparation for the filtering and removal of interference using the system&#39;s image processing software. A disadvantage of this platform is the lack of analytical software. However, the images generated are supported by different computational pathology software.

In the era of cancer immunotherapy, interest in elucidating tumor microenvironment dynamics has increased strikingly. This protocol details a mass spectrometry imaging technique with respect to its staining and imaging steps, which allow for highly multiplexed spatial analysis.

ホルマリン固定およびパラフィン包埋組織サンプルの質量分析イメージングを用いた腫瘍微小環境の理解を広げる

Advances in immune-based therapies have revolutionized cancer treatment and research. This has triggered growing demand for the characterization of the ...