私たちは、フィルタ処理された超常磁性ナノ粒子のTEM像を取得する際、そのX線分析を行う上での技術サポートのためにG.フルダ（電子顕微鏡センター、ロストック大学、ドイツ）を感謝したいと思います。 RTCロストックで行わ作品は、連邦教育研究省ドイツ（FKZ 0312138A、FKZ 316159およびVIP + 03VP00241）とEU構造基金と国家メクレンブルク=フォアポンメルン州（ESF / IV-WM-B34-によってサポートされていました0030/10及びESF / IV-BM-B35-0010 / 12）とDFG（DA 1296から1）、ダンプ・財団、ドイツ心臓財団（F / 01/12）。フランク・ウィークホースト EU FP7の研究プログラム &quot;ナノMAG&quot; FP7-NMP-2013-LARGE-7でサポートされていました。

我々は、開示することは一切競合する金融利害関係を持っていません。

それらのさらなる磁気的に制御指導のための超常磁性ナノ粒子を搭載した遺伝子操作された細胞の生産は現在のプロトコルに提示されています。この戦略の成功した適用は、移植のために標的化可能細胞生成物を提供することによって、そのような損傷した領域2、3、4における低い保持および乏しい生着などの細胞療法のいくつかの問題の解決を可能にします。また、適切に選択された遺伝物質の同時導入は、細胞の性質を促進することができ、したがって、機能的利益41を増大させる可能性があります。 現在のプロトコルは、モデルとしてのHUVEC上で開発されてきました。これらの細胞をトランスフェクトすることが困難と毒性影響18、19、20の影響を受けやすいことが知られています。 DEMPEI / MNPトランスフェクション後に95％を超えるフルオロフォア標識のmiR取り込みのonstratedレベルは、典型的には、PEIベースのベクターおよび一般的に使用されるカチオン性脂質ベースのトランスフェクション試薬（ 例えば、リポフェクタミン）42で得られます。 NP 40 - 加えて、25の最適なNP比が20の以前に公表された値に対応します。それにもかかわらず、テストした蛍光団タグ付きのmiRの非常に効率的な取り込みは必ずしも配達43の後に適切なのmiR処理や機能を保証するものではありません。この点は、NAのその緊密な静電凝縮して、PEIの場合に特に適切です。したがって、送達されたmiRの得られた機能的能力も試験しなければなりません。ここで、機能性のmiRは内因HUVEC中で発現、MIR-92A 31は 、選択された、及びそれに対する抗該miRはPEIおよびPEI / MNPを使用して送達しました。その結果、対象のmiR-92aのほぼ完全ノックダウンは、抗のmiR Fの効率的な放出を証明しましたトランスフェクション複合体をROM。 重要なことに、先行研究において、PEI / MNPベクターの成功裏の適用は接着性の両方、他の細胞型にプラスミドDNA（pDNAを）およびmiRの送達のために実証された（ 例えば、COS7、ヒト間葉系幹細胞15、16）および懸濁液（ 例えば、骨髄由来CD133 +造血幹細胞44）。すべてのこれらの実験は、トランスフェクション効率および毒性は、細胞の種類に依存し45であることが知られて事実を確認しています。したがって、最適なベクター組成物の選択（ 即ち、該miR量、NP比、及びMNP鉄の量）は、基準点として以前に確立された最適条件を使用して、すべての特定の細胞型のために行われるべきです。 また、達成の遺伝子改変の過渡文字が考慮されるべきです。一方で、私Tは、成長因子の短期送達として、特定の機能に非常に適しています。一方、発現の持続時間は、長期発現を必要とする様々な目的のために十分に長くは続かないかもしれません。条件をさらに最適化された後にもかかわらず、PEI / MNPベクトルの実証済みの安全性は、その可能な反復投与をサポートしています。 PEIおよびその誘導体は、一般的に、他の非ウイルスビヒクルおよび7の変形例に柔軟性に比べてその高い効率のために使用されます。しかし、in vitroおよびin vivoでの PEIの成功にもかかわらず、臨床試験への応用は非常に限られている（ すなわち、いくつかのフェーズ1と2の試行または癌患者）7、PEIの毒性7、13による14。私たちのグループ16と同様に、このプロトコルの以前の作品としては、MNPのを証明しています大幅PEIの毒性を減少することができます。特に、該miR / PEIトランスフェクションは、それによってこれらの細胞のためのin vitro機能テスト主に失敗し、そのマトリックスに管を形成するHUVECの能力を損傷しました。対照的に、該miR / PEI / MNP-HUVECの管形成性能は、未処理細胞に匹敵しました。特に、PEIの毒性のこの減少は、生体適合性及び日常ヒト被験者40における造影試薬として使用される酸化鉄のような構成要素の低レベルを導入することによって達成されました。 別に機能的特性を維持するから、この機能は、細胞治療移植後46を適切に統合するために必要であるように改変された細胞は、細胞間通信を確立することが可能であることが重要です。加えて、改変された細胞は、損傷した組織47への治療のmiRの送達のための担体として利用することができます。この場合には、そのCapaciの隣接セルを有する分子を交換するTYは、車両としての成功を定義します。 PEI / MNPトランスフェクションは、修飾のHUVECでGJICを可能にするので、 インビボでの統合の可能性を有しており、損傷領域へのmiR送達を提供します。 注目すべきは、その後の標的化のためのセルの磁化の以前に発表された作品は、セル〜4のロードおよび鉄/セル48、49、50、51の30 PGを報告しています。これらの数は大幅にin vitroでの静的および動的シミュレート条件にNA / PEI / MNP-HUVECの標的化のために十分であった値〜0.16から0.7 PG /細胞を超え。このような低鉄量は、安全性の面で有利である：（ すなわち、活性酸素種（ROS）の産生）を直接INTEの量と関連することが知られている酸化鉄ナノ粒子に関連した毒性の一般的に知られているメカニズムナノ粒子40を rnalized。加えて、いくつかの研究では、酸化鉄ナノ粒子の高い細胞内レベルは、用量依存性細胞骨格の崩壊および損傷52、53をもたらすことができることを実証しました。重要なのは、ほとんどが遺伝的細胞操作を含まない目的を標的とするために、セルの磁化の症例を報告しました。対照的に、該miR / PEI / MNPベクターを同時に細胞を改変し、磁気特性を追加する機会を提供します。 しかし、低MNP負荷は、血流と乱流環境で標的に磁気のためには十分ではないかもしれません。 インビボ状況で挑戦に近づくために、動的条件は、インビトロでシミュレートした。懸濁液中の磁化のmiR / PEI / MNP-HUVECを有する培養プレートを回転振盪器34上に置きました。この実験は、明らかに発生するすべての相互作用をカバーすることはできません生体内。しかし、それはPEI / MNP-修飾された細胞の標的に可能性のより良い理解につながりました。培地もアクティブ振盪は、磁石54に向かって細胞移動を妨害しなかった場合、結果として、高効率な細胞標的を実証しました。この目的のために、のmiR-修正HUVECを鉄/セルの少なくとも〜0.16 PGを負荷しました。また、磁気応答性細胞をソートすることができます。現在の研究に適用される磁石ベースの細胞分離手順は、miR / PEI / MNP細胞の生存能力を損ないませんでした。重要なことは、（ すなわち、12のための磁場を印加関わる実験ターゲット- 24時間）静磁場の適用は、標的細胞に有害な影響を及ぼしませんでした。したがって、磁化遺伝的に改変された細胞の実証された生産は、磁気力により確保細胞保持の効率をアドレッシングインビボ研究でさらにための基礎を提供します。特に、目E 51、54、55に使用される細胞保持局所投与の代わりに細胞誘導後の静脈内注射後の磁化の細胞の標的化を用いたin vivo試験で最も成功しました。したがって、注射の部位での磁石ベースの保持は、miR / PEI / MNP修飾細胞のインビボでの用途にさらにために望ましい現れます。

遺伝子や細胞治療は、CVD処理における現在の課題を解決する可能性を持っている強力なツールです。これらのアプローチの両方が、現在臨床試験で検証されているという事実にもかかわらず、彼らはまだ広い臨床応用1のための準備ができていません。特に、遺伝子や細胞治療の課題に取り組むための一般的なアプローチは、臨床応用に適した多機能の遺伝子送達ベクターを開発することです。安全かつ効率的な遺伝子送達システムの欠如は遺伝子治療の主要な関心事です。同時に、移植前に細胞産物の遺伝子工学は、 例えば、心臓の分野では、機能改善のわずか約5％がポスト幹細胞移植1を達成している（例えば、低効率として、細胞治療の深刻な課題を克服することができ時間Poに数分以内に10％ - ）と損傷部位での貧弱な保持/移植は（ すなわち、細胞保持は5を下回りますST-アプリケーションにかかわらず、投与経路2、3、4）。 現在までに、ウイルスベクターは大きく、臨床試験におけるそれらの広い応用をもたらした効率の点で、非ウイルス系（〜67％）5上回ります。しかし、ウイルスビヒクルは、免疫原性などの重大なリスク（およびその後の炎症性の重篤な合併症を伴う応答、）、発癌性、および実施遺伝物質6の大きさに制限を運びます。これらの安全性の問題およびウイルスベクターの生産の高コストのため、非ウイルス系の使用は、特定のケース7,8で好ましいです。このような（CVD処理用など）血管新生を制御する成長因子の発現のような一過性の遺伝的補正を必要とする障害、又はdeliveに特に適していますワクチンのRY。 我々のグループでは、送達システムは、分枝25-kDaのポリエチレンイミン（PEI）及びビオチン-ストレプトアビジン相互作用9によって一緒に結合された超常磁性酸化鉄ナノ粒子（MNP）を組み合わせることにより設計しました。このベクターは、移植前に彼らの同時磁化を考慮して、細胞の遺伝子工学のための潜在的なツールです。後者は、高度な磁気ターゲティング技術が成功10を開発されているように、最近特に有望である磁気誘導/維持のための基礎を提供します。また、得られた磁気応答性細胞は、非侵襲的磁気共鳴画像法（MRI）または磁性粒子イメージング11,12によって監視される可能性を有しています。 PEI / MNPベクターの場合には、ポリアミンは、核酸縮合従って因子を分解からの保護を確実にします<html> sの、細胞内でのベクターの内在、およびエンドソーム脱出5。 MNPは、磁気誘導の観点からだけでなく、公知のPEIの毒性7、13、14を還元することによってだけでなく、PEIの特性を補完します。以前に、PEI / MNPベクトル特性は、線維芽細胞およびヒト間葉系幹細胞15、16を用いて送達効率（ すなわち、のpDNAおよびmiRNA）及び安全性の点で調整しました。 本稿において、miRNA修飾細胞の生成のためのPEI /のMNPのアプリケーションに関する詳細なプロトコールは、17に記載されています。この目的のために、HUVECを用い、in vitroでの血管新生のために確立されたモデルを表しています。彼らは、トランスフェクトするために挑戦していると毒性影響18、19の影響を受けやすいですお尻= &quot;外部参照&quot;&gt; 20。また、我々は彼らの標的化、細胞間コミュニケーション、およびMRI検出を含むin vitroでのこのような細胞を、評価するためのアルゴリズムを提供します。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="653">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:197px;">PEI 25 kDa</td>
			<td style="width:159px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">408727</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:197px;">EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin</td>
			<td style="width:159px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">21335</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:197px;">PD-10 Desalting Columns</td>
			<td style="width:159px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:119px;">17085101</td>
			<td style="width:179px;">Containing Sephadex G-25 Medium</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:197px;">Ninhydrin Reagent solution 2%</td>
			<td style="width:159px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">7285</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:197px;">Glycine</td>
			<td style="width:159px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">410225</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:197px;">Pierce Biotin Quantitation Kit</td>
			<td style="width:159px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">28005</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:197px;">&#160;Microplate reader Model 680</td>
			<td style="width:159px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:197px;">Streptavidin MagneSphere Paramagnetic Particles</td>
			<td style="width:159px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">Z5481</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:197px;">Millex-HV PVDF Filter</td>
			<td style="width:159px;">Merck</td>
			<td style="width:119px;">SLHV013SL</td>
			<td style="width:179px;">0.45&#181;m</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:197px;">Libra 120 transmission electron microscope&#160;</td>
			<td style="width:159px;">Zeiss</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:179px;">Acceleration Voltage 120KV</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:197px;">Sapphire X-ray detector</td>
			<td style="width:159px;">EDAX-Amatek</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:197px;">Cell culture plastic</td>
			<td style="width:159px;">TPP</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:197px;">NHS-Esther Atto 565</td>
			<td style="width:159px;">ATTO-TEC GmbH</td>
			<td style="width:119px;">AD 565-31</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:197px;">NHS-Esther Atto 488&#160;</td>
			<td style="width:159px;">ATTO-TEC GmbH</td>
			<td style="width:119px;">AD 488-31</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:197px;">Cy5 miRNA Label IT kit</td>
			<td style="width:159px;">Mirus Bio</td>
			<td style="width:119px;">MIR 9650</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:197px;">Biotin Atto 565</td>
			<td style="width:159px;">ATTO-TEC GmbH</td>
			<td style="width:119px;">AD 565-71</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:197px;">Collagense Type IV Gibco</td>
			<td style="width:159px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">17104019</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:197px;">Endothelial growth medium, EGM-2</td>
			<td style="width:159px;">Lonza</td>
			<td style="width:119px;">CC-3156 &#38; CC-4176</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:197px;">Penicillin/Streptomycin</td>
			<td style="width:159px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">15140122</td>
			<td style="width:179px;">100 U/ml, 100&#181;g/ml</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:197px;">Matrigel</td>
			<td style="width:159px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">356234</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:197px;">anti-PECAM-1 antibody</td>
			<td style="width:159px;">Santa Cruz</td>
			<td style="width:119px;">sc-1506</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:197px;">MS MACS columns</td>
			<td style="width:159px;">Miltenyi Biotec&#160;</td>
			<td style="width:119px;">130-042-201</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:197px;">Near-IR Live/Dead Cell Stain Kit</td>
			<td style="width:159px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">L10119</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:197px;">Cy3 Dye-Labeled Pre-miR Negative Control</td>
			<td style="width:159px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">AM17120</td>
			<td style="width:179px;">&#34;Cy3-miR&#34; or &#34;Cyanine-miR3&#34; in the manuscript</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:197px;">Pre-miR miRNA Precursor Molecules - Negative Control&#160;</td>
			<td style="width:159px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">AM17110</td>
			<td style="width:179px;">&#34;scr-miR&#34; in the manuscript</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:197px;">Anti-hsa-miR92a-3p synthetic Inhibitor&#160;</td>
			<td style="width:159px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">AM10916</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:197px;">LSM 780 ELYRA PS.1 system</td>
			<td style="width:159px;">Zeiss</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:197px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:159px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">158127</td>
			<td style="width:179px;">4% solution in PBS</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:197px;">DAPI nuclear stain</td>
			<td style="width:159px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">D1306</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:197px;">NucleoSpin RNA isolation Kit</td>
			<td style="width:159px;">Machery-Nagel</td>
			<td style="width:119px;">740955</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:197px;">mirVana miRNA Isolation Kit</td>
			<td style="width:159px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">AM1560</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:197px;">TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit</td>
			<td style="width:159px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">4366596</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:197px;">StepOnePlus Real-Time PCR System</td>
			<td style="width:159px;">Applied Biosystems</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:197px;">High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit</td>
			<td style="width:159px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">4368814</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:197px;">hsa-miR-92a TaqMan assay</td>
			<td style="width:159px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">000431</td>
			<td style="width:179px;">Mature miRNA Sequence: UAUUGCACUUGUCCCGGCCUGU</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FastGene Taq Ready Mix</td>
			<td style="width:159px;">Nippon Genetics</td>
			<td style="width:119px;">LS27</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:197px;">ITGA5 TaqMan assay</td>
			<td style="width:159px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">Hs01547673_m1</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:197px;">RNU6B TaqMan assay</td>
			<td style="width:159px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">001093</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:197px;">18S rRNA Endogenous Control</td>
			<td style="width:159px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">4333760F</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:197px;">Gelatin</td>
			<td style="width:159px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">G7041</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:197px;">CellTrace Calcein Red-Orange</td>
			<td style="width:159px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">C34851</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:197px;">PBS</td>
			<td style="width:159px;">Pan Biotech</td>
			<td style="width:119px;">P04-53500</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:197px;">BSA</td>
			<td style="width:159px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:197px;">MACS buffer</td>
			<td style="width:159px;">Miltenyi Biotec&#160;</td>
			<td style="width:119px;">130-091-221</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:197px;">Agarose</td>
			<td style="width:159px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A9539</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:197px;">7.1 Tesla animal MRI system</td>
			<td style="width:159px;">Bruker Corporation</td>
			<td style="width:119px;">A7906</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:197px;">ImageJ software</td>
			<td style="width:159px;">National Institutes of Health</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:179px;">upgraded with an AngiogenesisAnalyzer (NIH)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:197px;">MPS device</td>
			<td style="width:159px;">Bruker Biospin</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:197px;">Matlab software</td>
			<td style="width:159px;">Mathworks</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:197px;">Ring Neodym Magnet&#160;</td>
			<td style="width:159px;">magnets4you GmbH</td>
			<td style="width:119px;">RM-10x04x05-G</td>
			<td style="width:179px;">&#248; 10 mm; remanescence is ~1.3T, coercivity &#8805; 955 kA/m</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:197px;">Click-iT EdU Alexa Fluor 647 Imaging Kit</td>
			<td style="width:159px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">C10340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:197px;">FluorSave Reagent</td>
			<td style="width:159px;">Merck</td>
			<td style="width:119px;">345789</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:197px;">Ultrasonic bath</td>
			<td style="width:159px;">Bandelin electronic</td>
			<td style="width:119px;">Type: RK 100 SH</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation and in vitro characterization of magnetized mir-modified endothelial cells

現在までに、心血管疾患（CVD）のために利用できる外科および薬理学的治療は限られており、多くの場合、姑息されています。同時に、遺伝子や細胞療法は、CVD処理のための非常に有望な代替的なアプローチです。しかし、遺伝子治療の広範な臨床応用を大幅に適当な遺伝子送達系の欠如によって制限されます。適切な遺伝子送達ベクターの開発は、細胞療法における現在の課題に対する解決策を提供することができます。特に、このような負傷者の臓器における限ら効率と低い細胞保持などの既存の欠点は、移植前に、適切な細胞工学（ すなわち、遺伝）によって克服することができます。提示プロトコルは、ポリエチレンイミン超常磁性ナノ粒子（PEI / MNP）に基づく送達ベクターを使用して、内皮細胞の効率的かつ安全な過渡変形を記載しています。また、セルの特性評価のためのアルゴリズムおよび方法が定義されています。成功intracelluヒト臍帯静脈内皮細胞（HUVEC）へのマイクロRNA（MIR）のLAR送達は、細胞生存率、機能、または細胞間通信に影響を与えることなく達成されました。また、このアプローチは、導入された外因性のmiRに強い機能的な効果を引き起こすことが証明されました。重要なことに、このMNPベースのベクターの適用は、磁気ターゲットと非侵襲的MRIトレースの可能性を伴って、細胞磁化を確実にします。これは、MRIで非侵襲的に監視することができる磁気誘導、遺伝的に操作された細胞治療のための基礎を提供することができます。

提案されたプロトコルの主な目的は、磁気応答性のmiR-改変細胞を生成し、それらの正確な特性（ 図1）を行うことです。その結果、磁気選択および誘導およびMRIで検出可能に反応効率的にトランスフェクトされた細胞は、得られるべきです。 まず、単離されたHUVECの同一性は、内皮マーカーCD31（PECAM）（ 図2A）を有する典型的な染色によって、適切な基底膜マトリックス（ 図2B）に管を形成する能力によって確認しました。得られた細胞は、miRは非常に効率的にPEI / MNPによって導入され始めました。顕微鏡検査は、すべてのセルがタグ付けされたmiR（Cy3の）24時間トランスフェクション後（ 図3A）の信号に対して陽性であったことを実証しました。重要なことには、全く細胞死は、未処理細胞（ 図3B）と比較して、記録されなかったとnormal外観は（ 図3A）に維持しました。共焦点レーザー顕微鏡を用いて観察されたように、Cy3でのmiRの信号は、主に細胞の内部に位置していました。また、トランスフェクションベクターおよびmiRのすべての部分の細胞内局在の詳細な調査は、高解像度3色標識複合体を用いて行きました。 SIM、のmiR、PEI、およびMNP信号は全て核周辺領域（ 図3C）において細胞質で検出されました。 さらに、トランスフェクションベクターの安全性の詳細な検討は、miR / PEI / MNP-HUVECを（ 図4A、得られたネットワークは陽性対照として用い、未処理細胞のものに匹敵する適切な基底膜マトリックス上で、その管を形成することができることが証明されています）。 3D-FRAP実験は、明らかにされるようにさらに、トランスフェクトされた細胞は、GJICを維持しました。特に、細胞は蛍光GJ-permeaがロードされBLE染料及びそれらの一方が漂白され、その蛍光が原因隣接セルと通信し、得られた染料転写（ 図4B）に復帰します。 重要なことに、起因する超常磁性化合物40（ 図5A）の存在のために、PEI / MNPのアプリケーションだけでなく、細胞トランスフェクションだけでなく、同時に磁化可能にします。細胞内の鉄の結果として得られる量を最適範囲内のすべての適用MNP濃度についてMPS（ 図5B）を用いて測定した（2.5ピコモル/ cm 2でのmiR; NP 25は、5~25 / mlのMNPで補完）：0.37±0.079 0.7±へ鉄/セル17 PG 0.150。磁気分離カラムの使用が実証されるように、これらすべてのMNP濃度のために、トランスフェクトされた細胞の総容積で磁気応答性細胞の量は〜70％（ 図5C）です。また、HをトランスフェクトUVECsマウス組織感受性を模倣し、in vitroでのアガロースファントムの内部MRI（ 図5D）と表示されています。さらに、 インビトロでシミュレート動的条件下でトランスフェクトされたHUVECの磁性標的は、効率的な（ 図6）であることが証明されました。この実験では、培養液のにも一定の積極的な動きは、磁石のアプリケーションに近い領域での有力な細胞増殖を防ぐことはできませんでした。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/55567/55567fig1.jpg" /> 図1.磁化のmiR-修正のHUVECとその分析の生産の概略図。 PEI / MNP（ポリエチレンイミン/超常磁性ナノ粒子に基づくベクター）は、ヒト臍帯静脈内皮細胞（HUVEC）にマイクロRNA（MIR）を送達するために適用されます。細胞生存率を含む安全性（機能性：得られた細胞生成物は、以下のパラメータによって特徴付けられますITY、および細胞間通信のための容量）トランスフェクション効率（ すなわち、のmiR取り込み効率およびその後の機能）。静的およびシミュレートされた動的条件下、in vitroで標的磁性。磁気共鳴画像（MRI）検出。 <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55567/55567fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/55567/55567fig2.jpg" /> 孤立HUVECの特徴付け図。内皮CD31マーカーで染色し、単離され、培養HUVECのA.代表的な画像。核はDAPI（青）で対比されます。スケールバーは20μmです。単離されたHUVEC上で実行管形成アッセイのB.代表的な結果。画像は、レーザー走査共焦点顕微鏡を用いて記録した（差動インターフェレンスコントラスト）基底膜マトリックス上の細胞播種後18時間。スケールバーは100μmです。 <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55567/55567fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/55567/55567fig3.jpg" /> PEI / MNPを利用したHUVECに 図3 のmiR配達。 A.タグ付けされた（赤のCy3）のmiRの24時間後、トランスフェクション（Cy3でタグ付けされたmiR、NP 25とMNPを25μg/ mLと2.5ピコモル/ cm 2）で、正常細胞の外観の維持の取り込みが示されています。画像は、514 nmの励起レーザー（Cy3の、赤色）および微分干渉コントラストを用いて共焦点レーザー顕微鏡により撮影しました。スケールバーは50μmです。 B.細胞生存率を24時間トランスフェクション後、フローサイトメトリーによって評価しました。プロットは、HUVECについて得られた結果を表します。以下の複合組成物で処理された（S）のCy3-MIRの2.5ピコモル/ cm 2で、 NP比25のMNPの5〜25μgの/ mLで補完します。バーは、生存細胞の平均数と全細胞集団（;：SEMエラーバーN = 6）の間の比を示しています。 3色のC.構造化照明顕微鏡（SIM）イメージングは、HUVECをによって取り込まれたmiR / PEI / MNP複合体を標識しました。細胞を上記のように、トランスフェクトインキュベートし、24時間後に処置を固定しました。核はDAPIで対比染色しました。生SIMデータは、zスタックに記録され、処理されました。代表画像は、最大値投影の結果です。次の励起レーザを適用した：405nmで（DAPI、青）、488nmの（Atto488-PEI、オレンジ）、565 NM（Atto565-MNP、シアン）、及び633nmの（赤色のCy5-MIRを、）。スケールバーは5μmです。 <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55567/55567fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/55567/55567fig4.jpg" /> 図4のmiR / PEI / MNPでのHUVEC変更の安全性。 48時間後処理; A.チューブ形成アッセイは、トランスフェクトされた細胞（NP 25とMNPを25μg/ mLのSCR-MIRの2.5ピコモル/ cm 2）を用いて行きました。画像は、レーザ走査型共焦点顕微鏡を用いて取得した（ すなわち、微分干渉コントラスト）18時間基底膜マトリックス上の細胞播種後。 miR / PEIでトランスフェクトされたHUVECを毒性コントロールおよびポジティブコントロールとして未処理細胞として使用しました。スケールバーは100μmです。管の長さ、分岐の数、及び接合部（N = 3、エラーバー：SEM）のプロットは、いくつかのパラメータを使用してトランスフェクトしたHUVECと未処理細胞との間の比率を反映しています。 B.のmiR / PEI / MNP変性HUVECのギャップ結合媒介性の間の通信を評価した24時間後transfecション。この目的のために、細胞をGJ透過性色素カルセイン（オレンジ）を負荷しました。 （FRAP）を光退色後蛍光回復は、Zスタック内の試験セルを走査することによって3次元で調べました。代表的な漂白前にカルセインを負荷した細胞の画像を、直接漂白後、及び（回復した蛍光を有する）を15分後に漂白が示されています。スケールバーは20μmです。 <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55567/55567fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図5" src="/files/ftp_upload/55567/55567fig5.jpg" /> PEI / MNPとその応用でのトランスフェクションに起因図5.セルの磁化。それらのクラスタ化された形態を示すTEMで撮影された濾過のMNPのA.代表画像、、。小型 - （超常磁性を生じる）の単一酸化鉄粒子（5〜15 nm）は、それによってあります確認しました。スケールバーは100nmです。 B.トランスフェクトされた細胞の細胞内負荷が磁性粒子分光法（MPS）24時間後にトランスフェクションすることにより評価しました。代表的なパネルは、検査試料のMPSスペクトルを示します。具体的には、純粋なMNP懸濁液（50μL）を参照（青い四角）を務めました。グレーの三角形は、任意のサンプルなしで測定して得られた検出された背景スペクトルを示しているが、：、：丸は、二つのトランスフェクトされた細胞サンプル（MNP5μg/ mlの緑色の円MNPを25μg/ mLの赤丸）のMPSスペクトルです。振幅（A）の対数スケールに注意してください。磁気的に、トリプシン処理後24時間処理することによって回収し、磁気的に改変された細胞の量は、トランスフェクトされたHUVEC（NP 25は、MNPの5-25μgの/ mLで補完2.5ピコモル/ cm 2でのmiR）を適用することにより定量化したC.細胞分離カラム。得られた磁気陽性画分（ すなわち、カラムに残っています）計数し、そしてトランスフェクトされた細胞の全体量のうち、その割合は、各MNP濃度（赤三角）についてのプロットに反映されます。細胞生存率は、続いてトリパンブルー排除アッセイ（灰色菱形）によって調べました。データは平均±SEMとして提示されている（N = 3）。トランスフェクトされたHUVECのD.アン例示的なMRI画像（30万細胞; 2.5ピコモル/ cm 2でのmiR; NP 25＆25μgのMNPの/ mL）をアガロースファントムに埋め込ま7.1 T動物MRIシステムで記録しました。 <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55567/55567fig5large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図6" src="/files/ftp_upload/55567/55567fig6.jpg" /> 模擬動的条件におけるmiR / PEI / MNP-HUVECの インビトロ 磁気ターゲティング で 図6。 HUVECを24時間後にトランスフェクションを収集しましたイオン（2.5ピコモル/ cmでのCy3-MIRの2; NP 25＆MNPを25μg/ mL）および再播種局所側壁に取り付けられた小さな磁石を、ウェル中の新鮮な培地中に。次に、この培養プレートを150rpmで回転振とう器に固定しました。 （; 514 nmでのCy3、オレンジ405nmで、DAPI、青色励起レーザ）細胞の付着および成長は、PFAで細胞を固定し、DAPIでそれらの核を染色し、レーザー走査型共焦点顕微鏡観察を行うことにより、12時間後に評価しました。代表的な画像は、磁石のアプリケーションでエリア内の細胞の成長を示しています。磁石のアプリケーションなし。ウェル培養の中心に、ここで液体の流れは、細胞を濃縮しました。スケールバーは50μmです。 <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55567/55567fig6large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a>

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Preparation and In Vitro Characterization of Magnetized miR-modified Endothelial Cells

この原稿は、PEI / MNPベクター及びその磁化により内皮細胞へのmiRの効率的な、非ウイルス送達を記載しています。このように、遺伝的改変に加えて、このアプローチは、磁気細胞ガイダンスやMRIの検出能が可能になります。技術は、治療用細胞製品の特性を改善するために使用することができます。

準備と<em&gt;インビトロ</em磁化のmiR修飾内皮細胞の&gt;キャラクタリゼーション

To date, the available surgical and pharmacological treatments for cardiovascular diseases (CVD) are limited and often palliative. At the same time, gene ...

preparation-vitro-characterization-magnetized-mir-modified

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Medicine

Preparation and In Vitro Characterization of Magnetized miR-modified Endothelial Cells

7.6K ビュー.  University of Rostock. この原稿は、PEI / MNPベクター及びその磁化により内皮細胞へのmiRの効率的な、非ウイルス送達を記載しています。このように、遺伝的改変に加えて、このアプローチは、磁気細胞ガイダンスやMRIの検出能が可能になります。技術は、治療用細胞製品の特性を改善するために使用することができます。 

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Corneal Donor Tissue Preparation for Endothelial Keratoplasty

Over the past ten years, corneal transplantation surgical techniques have undergone revolutionary changes1,2. Since its inception, traditional full thickness corneal transplantation has been the treatment to restore sight in those limited by corneal disease. Some disadvantages to this approach include a high degree of post-operative astigmatism, lack of predictable refractive outcome, and disturbance to the ocular surface. The development of Descemet's stripping endothelial keratoplasty (DSEK), transplanting only the posterior corneal stroma, Descemet's membrane, and endothelium, has dramatically changed treatment of corneal endothelial disease. DSEK is performed through a smaller incision; this technique avoids 'open sky' surgery with its risk of hemorrhage or expulsion, decreases the incidence of postoperative wound dehiscence, reduces unpredictable refractive outcomes, and may decrease the rate of transplant rejection3-6.
Initially, cornea donor posterior lamellar dissection for DSEK was performed manually1 resulting in variable graft thickness and damage to the delicate corneal endothelial tissue during tissue processing. Automated lamellar dissection (Descemet's stripping automated endothelial keratoplasty, DSAEK) was developed to address these issues. Automated dissection utilizes the same technology as LASIK corneal flap creation with a mechanical microkeratome blade that helps to create uniform and thin tissue grafts for DSAEK surgery with minimal corneal endothelial cell loss in tissue processing.
Eye banks have been providing full thickness corneas for surgical transplantation for many years. In 2006, eye banks began to develop methodologies for supplying precut corneal tissue for endothelial keratoplasty. With the input of corneal surgeons, eye banks have developed thorough protocols to safely and effectively prepare posterior lamellar tissue for DSAEK surgery. This can be performed preoperatively at the eye bank. Research shows no significant difference in terms of the quality of the tissue7 or patient outcomes8,9 using eye bank precut tissue versus surgeon-prepared tissue for DSAEK surgery. For most corneal surgeons, the availability of precut DSAEK corneal tissue saves time and money10, and reduces the stress of performing the donor corneal dissection in the operating room. In part because of the ability of the eye banks to provide high quality posterior lamellar corneal in a timely manner, DSAEK has become the standard of care for surgical management of corneal endothelial disease.
The procedure that we are describing is the preparation of the posterior lamellar cornea at the eye bank for transplantation in DSAEK surgery (Figure 1).

Endothelial corneal transplantation is a surgical technique for treatment of posterior corneal diseases. Mechanical microkeratome dissection to prepare tissue results in thinner, more symmetric grafts with less endothelial cell loss and improved outcomes. Dissections can be performed at the eye bank prior to corneal transplantation surgery.

内皮角膜移植のために角膜ドナー組織の準備

Over the past ten years, corneal transplantation surgical techniques have undergone revolutionary changes1,2. Since its inception, traditional full ...

医学

Isolation, Characterization and Comparative Differentiation of Human Dental Pulp Stem Cells Derived from Permanent Teeth by Using Two Different Methods

Developing wisdom teeth are easy-accessible source of stem cells during the adulthood which could be obtained by routine orthodontic treatments. Human pulp-derived stem cells (hDPSCs) possess high proliferation potential with multi-lineage differentiation capacity compare to the ordinary source of adult stem cells1-8; therefore, hDPSCs could be the good candidates for autologous transplantation in tissue engineering and regenerative medicine. Along with these benefits, possessing the mesenchymal stem cells (MSC) features, such as immunolodulatory effect, make hDPSCs more valuable, even in the case of allograft transplantation6,9,10. Therefore, the primary step for using this source of stem cells is to select the best protocol for isolating hDPSCs from pulp tissue. In order to achieve this goal, it is crucial to investigate the effect of various isolation conditions on different cellular behaviors, such as their common surface markers &amp; also their differentiation capacity.
Thus, here we separate human pulp tissue from impacted third molar teeth, and then used both existing protocols based on literature, for isolating hDPSCs,11-13 i.e. enzymatic dissociation of pulp tissue (DPSC-ED) or outgrowth from tissue explants (DPSC-OG). In this regards, we tried to facilitate the isolation methods by using dental diamond disk. Then, these cells characterized in terms of stromal-associated Markers (CD73, CD90, CD105 &amp; CD44), hematopoietic/endothelial Markers (CD34, CD45 &amp; CD11b), perivascular marker, like CD146 and also STRO-1. Afterwards, these two protocols were compared based on the differentiation potency into odontoblasts by both quantitative polymerase chain reaction (QPCR) &amp; Alizarin Red Staining. QPCR were used for the assessment of the expression of the mineralization-related genes (alkaline phosphatase; ALP, matrix extracellular phosphoglycoprotein; MEPE &amp; dentin sialophosphoprotein; DSPP).14

The method described isolation and characterization of human Dental Pulp Stem Cells (hDPSCs) by using either enzymatic dissociation of pulp (DPSC-ED) or direct outgrowth of stem cells from pulp tissue explants (DPSC-OG). Then followed by in vitro comparative differentiation of both types of hDPSCs into odontoblasts.

単離、特徴付けと二つの異なる方法を使用して永久歯に由来するヒト歯髄幹細胞の分化の比較

Developing wisdom teeth are easy-accessible source of stem cells during the adulthood which could be obtained by routine orthodontic treatments. Human ...

Stretch in Brain Microvascular Endothelial Cells (cEND) as an In Vitro Traumatic Brain Injury Model of the Blood Brain Barrier

Due to the high mortality incident brought about by traumatic brain injury (TBI), methods that would enable one to better understand the underlying mechanisms involved in it are useful for treatment. There are both in vivo and in vitro methods available for this purpose. In vivo models can mimic actual head injury as it occurs during TBI. However, in vivo techniques may not be exploited for studies at the cell physiology level. Hence, in vitro methods are more advantageous for this purpose since they provide easier access to the cells and the extracellular environment for manipulation.
Our protocol presents an in vitro model of TBI using stretch injury in brain microvascular endothelial cells. It utilizes pressure applied to the cells cultured in flexible-bottomed wells. The pressure applied may easily be controlled and can produce injury that ranges from low to severe. The murine brain microvascular endothelial cells (cEND) generated in our laboratory is a well-suited model for the blood brain barrier (BBB) thus providing an advantage to other systems that employ a similar technique. In addition, due to the simplicity of the method, experimental set-ups are easily duplicated. Thus, this model can be used in studying the cellular and molecular mechanisms involved in TBI at the BBB.

Stretch in Brain Microvascular Endothelial Cells cEND as an In Vitro Traumatic Brain Injury Model of the Blood Brain Barrier

In vitro traumatic brain injury models are being developed to reproduce in vivo brain deformation. Stretch-induced injury has been employed for astrocytes, neurons, glial cells, aortic, and brain endothelial cells. However, our system uses a blood brain barrier (BBB) model that possesses properties constituting a legitimate model of the BBB to establish an in vitro&#160;TBI model.

として脳微小血管内皮細胞（CEND）でストレッチ<em&gt;インビトロ</em血液脳関門の&gt;外傷性脳損傷モデル

Due to the high mortality incident brought about by traumatic brain injury (TBI), methods that would enable one to better understand the underlying ...

In vitro Method to Observe E-selectin-mediated Interactions Between Prostate Circulating Tumor Cells Derived From Patients and Human Endothelial Cells

Metastasis is a process in which tumor cells shed from the primary tumor intravasate blood vascular and lymphatic system, thereby, gaining access to extravasate and form a secondary niche.&#160;The extravasation of tumor cells from the blood vascular system can be studied using endothelial cells (ECs) and tumor cells obtained from different cell lines.&#160;Initial studies were conducted using static conditions but it has been well documented that ECs behave differently under physiological flow conditions.&#160;Therefore, different flow chamber assemblies are currently being used to studying cancer cell interactions with ECs.&#160;Current flow chamber assemblies offer reproducible results using either different cell lines or fluid at different shear stress conditions.&#160;However, to observe and study interactions with rare cells such as circulating tumor cells (CTCs), certain changes are required to be made to the conventional flow chamber assembly.&#160;CTCs are a rare cell population among millions of blood cells. Consequently, it is difficult to obtain a pure population of CTCs.&#160;Contamination of CTCs with different types of cells normally found in the circulation is inevitable using present enrichment or depletion techniques.&#160;In the present report, we describe a unique method to fluorescently label circulating prostate cancer cells and study their interactions with ECs in a self-assembled flow chamber system.&#160;This technique can be further applied to observe interactions between prostate CTCs and any protein of interest.

In vitro Method to Observe E-selectin-mediated Interactions Between Prostate Circulating Tumor Cells Derived From Patients and Human Endothelial Cells

Our report describes a unique method to visualize and analyze CTC/EC interactions in prostate cancer under physiological flow conditions.

患者とヒト内皮細胞に由来する前立腺循環腫瘍細胞との間のE-セレクチン介在性の相互作用を観察するin vitro法での

Metastasis is a process in which tumor cells shed from the primary tumor intravasate blood vascular and lymphatic system, thereby, gaining access to ...

Corneal Donor Tissue Preparation for Descemet's Membrane Endothelial Keratoplasty

Descemet&#8217;s Membrane Endothelial Keratoplasty (DMEK) is a form of corneal transplantation in which only a single cell layer, the corneal endothelium, along with its basement membrane (Descemet&#39;s membrane) is introduced onto the recipient&#39;s posterior stroma3. Unlike Descemet&#8217;s Stripping Automated Endothelial Keratoplasty (DSAEK), where additional donor stroma is introduced, no unnatural stroma-to-stroma interface is created. As a result, the natural anatomy of the cornea is preserved as much as possible allowing for improved recovery time and visual acuity4. Endothelial Keratoplasty (EK) is the procedure of choice for treatment of endothelial dysfunction. The advantages of EK include rapid recovery of vision, preservation of ocular integrity and minimal refractive change due to use of a small, peripheral incision1. DSAEK utilizes donor tissue prepared with partial thickness stroma and endothelium. The rapid success and utilization of this procedure can be attributed to availability of eye-bank prepared precut tissue. The benefits of eye-bank preparation of donor tissue include elimination of need for specialized equipment in the operating room and availability of back up donor tissue in case of tissue perforation during preparation. In addition, high volume preparation of donor tissue by eye-bank technicians may provide improved quality of donor tissue. DSAEK may have limited best corrected visual acuity due to creation of a stromal interface between the donor and recipient cornea. Elimination of this interface with transplantation of only donor Descemet&#39;s membrane and endothelium in DMEK may improve visual outcomes and reduce complications after EK5. Similar to DSAEK, long term success and acceptance of DMEK is dependent on ease of availability of precut, eye-bank prepared donor tissue. Here we present a stepwise approach to donor tissue preparation which may reduce some barriers eye-banks face in providing DMEK grafts.

Endothelial keratoplasty is a surgical technique continuously evolving as advancements result in transplantation of thinner grafts with each succession1. Here we present a technique for controlled manual tissue dissection to allow safe and repeatable separation of endothelium and Descemet&#39;s membranes from donor corneoscleral buttons for transplantation2.

デスメ膜内皮角膜移植のための角膜ドナー組織の準備

Descemet&#8217;s Membrane Endothelial Keratoplasty (DMEK) is a form of corneal transplantation in which only a single cell layer, the corneal endothelium, ...

In vitro Functional Characterization of Mouse Colorectal Afferent Endings

This video demonstrates in detail an in vitro single-fiber electrophysiological recording protocol using a mouse colorectum-nerve preparation. The approach allows unbiased identification and functional characterization of individual colorectal afferents. Extracellular recordings of propagated action potentials (APs) that originate from one or a few afferent (i.e., single-fiber) receptive fields (RFs) in the colorectum are made from teased nerve fiber fascicles. The colorectum is removed with either the pelvic (PN) or lumbar splanchnic (LSN) nerve attached and opened longitudinally. The tissue is placed in a recording chamber, pinned flat and perfused with oxygenated Krebs solution. Focal electrical stimulation is used to locate the colorectal afferent endings, which are further tested by three distinct mechanical stimuli (blunt probing, mucosal stroking and circumferential stretch) to functionally categorize the afferents into five mechanosensitive classes. Endings responding to none of these mechanical stimuli are categorized as mechanically-insensitive afferents (MIAs). Both mechanosensitive and MIAs can be assessed for sensitization (i.e., enhanced response, reduced threshold, and/or acquisition of mechanosensitivity) by localized exposure of RFs to chemicals (e.g., inflammatory soup (IS), capsaicin, adenosine triphosphate (ATP)). We describe the equipment and colorectum&#8211;nerve recording preparation, harvest of colorectum with attached PN or LSN, identification of RFs in the colorectum, single-fiber recording from nerve fascicles, and localized application of chemicals to the RF. In addition, challenges of the preparation and application of standardized mechanical stimulation are also discussed.

In vitro Functional Characterization of Mouse Colorectal Afferent Endings

This video demonstrates a protocol for conducting single-fiber electrophysiological recordings on an in vitro mouse colorectum-nerve preparation.

マウス大腸求心性終末の体外機能解析では、

This video demonstrates in detail an in vitro single-fiber electrophysiological recording protocol using a mouse colorectum-nerve preparation. The ...

Studying Pancreatic Cancer Stem Cell Characteristics for Developing New Treatment Strategies

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor initiation, metastasis and resistance to radio- and chemotherapy. Here we describe a specific methodology for culturing primary human pancreatic CSCs as tumor spheres in anchorage-independent conditions. Cells are grown in serum-free, non-adherent conditions in order to enrich for CSCs while their more differentiated progenies do not survive and proliferate during the initial phase following seeding of single cells. This assay can be used to estimate the percentage of CSCs present in a population of tumor cells. Both size (which can range from 35 to 250 micrometers) and number of tumor spheres formed represents CSC activity harbored in either bulk populations of cultured cancer cells or freshly harvested and digested tumors 1,2. Using this assay, we recently found that metformin selectively ablates pancreatic CSCs; a finding that was subsequently further corroborated by demonstrating diminished expression of pluripotency-associated genes/surface markers and reduced in vivo tumorigenicity of metformin-treated cells. As the final step for preclinical development we treated mice bearing established tumors with metformin and found significantly prolonged survival. Clinical studies testing the use of metformin in patients with PDAC are currently underway (e.g., NCT01210911, NCT01167738, and NCT01488552). Mechanistically, we found that metformin induces a fatal energy crisis in CSCs by enhancing reactive oxygen species (ROS) production and reducing mitochondrial transmembrane potential. In contrast, non-CSCs were not eliminated by metformin treatment, but rather underwent reversible cell cycle arrest. Therefore, our study serves as a successful example for the potential of in vitro sphere formation as a screening tool to identify compounds that potentially target CSCs, but this technique will require further in vitro and in vivo validation to eliminate false discoveries.

Pancreatic cancer stem cells (CSCs) can be expanded in vitro using the anchorage-independent sphere culture technique, which represents a powerful tool to study CSC biology and can serve as the first step to develop novel CSC-targeting therapies. Here the methodology for expanding, analyzing and targeting of pancreatic CSCs is provided.

新しい治療戦略を開発するための膵臓癌幹細胞特性を研究

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor ...

Isolation and Culture Expansion of Tumor-specific Endothelial Cells

Freshly isolated tumor-specific endothelial cells (TEC) can be used to explore molecular mechanisms of tumor angiogenesis and serve as an in vitro model for developing new angiogenesis inhibitors for cancer. However, long-term in vitro expansion of murine endothelial cells (EC) is challenging due to phenotypic drift in culture (endothelial-to-mesenchymal transition) and contamination with non-EC. This is especially true for TEC which are readily outcompeted by co-purified fibroblasts or tumor cells in culture. Here, a high fidelity isolation method that takes advantage of immunomagnetic enrichment coupled with colony selection and in vitro expansion is described. This approach generates pure EC fractions that are entirely free of contaminating stromal or tumor cells. It is also shown that lineage-traced Cdh5cre:ZsGreenl/s/l reporter mice, used with the protocol described herein, are a valuable tool to verify cell purity as the isolated EC colonies from these mice show durable and brilliant ZsGreen fluorescence in culture.

We report a reliable method to isolate and culture primary tumor-specific endothelial cells from genetically engineered mouse models.

腫瘍特異的内皮細胞の単離および培養拡大

Freshly isolated tumor-specific endothelial cells (TEC) can be used to explore molecular mechanisms of tumor angiogenesis and serve as an in vitro model ...

Isolation and Culture of Primary Endothelial Cells from Canine Arteries and Veins

Cardiovascular disease is studied in both human and veterinary medicine. Endothelial cells have been used extensively as an in vitro model to study vasculogenesis, (tumor) angiogenesis, and atherosclerosis. The current standard for in vitro research on human endothelial cells (ECs) is the use of Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVECs) and Human Umbilical Artery Endothelial Cells (HUAECs). For canine endothelial research, only one cell line (CnAOEC) is available, which is derived from canine aortic endothelium. Although currently not completely understood, there is a difference between ECs originating from either arteries or veins. For a more direct approach to in vitro functionality studies on ECs, we describe a new method for isolating Canine Primary Endothelial Cells (CaPECs) from a variety of vessels. This technique reduces the chance of contamination with fast-growing cells such as fibroblasts and smooth muscle cells, a problem that is common in standard isolation methods such as flushing the vessel with enzymatic solutions or mincing the vessel prior to digestion of the tissue containing all cells. The technique we describe was optimized for the canine model, but can easily be utilized in other species such as human.

Novel isolation methods of primary endothelial cells from blood vessels are needed. This protocol describes a new technique that completely inverts blood vessels of interest, exposing only the endothelial side to enzymatic digestion. The resulting pure endothelial cell culture can be used to study cardiovascular diseases, disease modelling, and angiogenesis.

犬の動脈と静脈からの初代内皮細胞の単離および培養

Cardiovascular disease is studied in both human and veterinary medicine. Endothelial cells have been used extensively as an in vitro model to study ...

Forskolin-induced Swelling in Intestinal Organoids: An In Vitro Assay for Assessing Drug Response in Cystic Fibrosis Patients

Recently-developed cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR)-modulating drugs correct surface expression and/or function of the mutant CFTR channel in subjects with cystic fibrosis (CF). Identification of subjects that may benefit from these drugs is challenging because of the extensive heterogeneity of CFTR mutations, as well as other unknown factors that contribute to individual drug efficacy. Here, we describe a simple and relatively rapid assay for measuring individual CFTR function and response to CFTR modulators in vitro. Three dimensional (3D) epithelial organoids are grown from rectal biopsies in standard organoid medium. Once established, the organoids can be bio-banked for future analysis. For the assay, 30-80 organoids are seeded in 96-well plates in basement membrane matrix and are then exposed to drugs. One day later, the organoids are stained with calcein green, and forskolin-induced swelling is monitored by confocal live cell microscopy at 37 &#176;C. Forskolin-induced swelling is fully CFTR-dependent and is sufficiently sensitive and precise to allow for discrimination between the drug responses of individuals with different and even identical CFTR mutations. In vitro swell responses correlate with the clinical response to therapy. This assay provides a cost-effective approach for the identification of drug-responsive individuals, independent of their CFTR mutations. It may also be instrumental in the development of future CFTR modulators.

Forskolin-induced Swelling in Intestinal Organoids: An In Vitro Assay for Assessing Drug Response in Cystic Fibrosis Patients

This protocol describes an assay for measuring CFTR function and CFTR modulator responses in cultured tissue from subjects with cystic fibrosis (CF). Biopsy-derived intestinal organoids swell in a cAMP-driven fashion, a response that is defective (or strongly reduced) in CF organoids and can be restored by exposure to CFTR modulators.

フォルスコリン誘発性腸オルガノイドに腫れ：<em&gt;インビトロ</em&gt;アッセイ嚢胞性線維症患者における薬物反応を評価するための

Recently-developed cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR)-modulating drugs correct surface expression and/or function of the mutant ...