We thank C.C.R. laboratory members for comments and S. Moskowitz for figure preparation. This work was supported by National Institutes of Health Grants F32GM101761 (A.J.H.) and GM54397 (C.C.R.).

注：このような手袋、安全メガネ、白衣、および適切なアクリルの盾として、を含むがこれらに限定されない、個人用保護具の使用を放射性物質の安全な使用、廃棄に関するすべての機関の規制に従ってください。 注：標準緩衝液は、40mMのHEPES-KOH、pHは7.5、50 mMのグルタミン酸カリウム、5mMのDTT、0.1mMのEDTA（このバッファは5倍の濃度で予備製）との各dNTP 0.3 mMの構成されています。 8、9、10に記載されるようにT7複製タンパク質が精製されます。単一T7プライマーゼ認識部位（5&#39;-GGGTC-3 &#39;、5&#39;-GTGTC-3&#39;、5&#39;-TGGTC-3 &#39;）を含む一本鎖DNAは、DNA合成会社の様々な（長さから購入することができます一本鎖DNAは、T7プライマーゼのために、選択した酵素に依存し得る、ペンタマーは、全長プライマーを合成するための最小テンプレートの長さである1潜在Cが必須であるように、プライマーは、ポリメラーゼによって伸長される場合に1が、しかし、追加のヌクレオチドが鋳型の3 &#39;末端に存在しなければなりません。反応を10mMのMgCl 2の最終濃度の添加によって開始し、25℃でインキュベートします。マニュアルサンプルは、5秒以上の時間点に適しています。それよりも短い時間ポイントが必要な場合には、正確なデータを得るために、急速クエンチフロー機器を使用することが推奨されます。 マニュアルサンプリング1.マルチターンオーバープライマー合成反応<ol><li>実験を開始する前に、ホルムアミド色素緩衝液のアリコート2μL（93％（v / v）のホルムアミド、50mMのEDTA、0.01％キシレンシアノール、および0.01％ブロモフェノールブルー）8 1.5 mLのポリプロピレンチューブに。一般に、管の数は、分析時点の数に等しいです。 </li><li>バッファー（1x）からなる20μLの混合物、0.1 mMのATPとCTP、0.25 mCiの/ mLの[α-32 P] CTP、0.1μMSSDを準備（六量濃度として表現 - 0.6μMモノマー）NAテンプレート、および0.1μMGP4。 </li><li> 5分間、室温で混合物をインキュベートします。 </li><li>ピペットを用いて混合物の2μLを削除し、無反応制御（時間ゼロ）のためのステップ1.1で調製した1.5 mLチューブに2μLのホルムアミド色素バッファーと混合。 </li><li> （10mMの最終濃度）を反応混合物に0.1 MのMgCl 2の2μLを追加します。 </li><li>手動で10秒間隔でピペットを用いて反応混合物の2μLのサンプルを撤回し、ステップ1.1で調製した1.5 mLチューブに予め分配ホルムアミド染料と混合します。 </li><li>ヒートブロックで5分間95℃で熱サンプル。 </li><li>変性ゲル上にサンプルのアリコートをロードします。ビスアクリルアミド（19：1）、3 M尿素、1×TBE（100mMトリス - ホウ酸、1mMのEDTA）T7プライマーゼによって合成された小さなtetraribonucleotideプライマー製品は、0.4ミリメートルの厚さの25％アクリルアミドでうまく解決されます。 </li><li> chromatograにゲル全体を置きますプラスチック製のラップでPHY紙とカバー。ゲル乾燥機を使用して乾燥ゲル。 </li><li>サンプルの4μLをロードした場合、反応混合物の残りの希釈系列を準備し、クロマトグラフィー紙上にゲル上にロードされた同じボリュームを発見、 すなわち 、希釈のスポット4μL。 注：これは、反応の間に形成された生成物の濃度を決定するための標準曲線となります。 （5 2 -5 6）15,625が、希釈物べきたとえば、TE緩衝液（10mMトリス-HCl、pH8.0の、1mMのEDTA）を用いて5倍希釈を1に1:25の範囲にわたる、うまく機能します活動のレベルに応じて調整します。 </li><li>ホスホイメージャ画面を使用して乾燥ゲルと標準を公開します。希釈系列で放射能を定量化し、8が記載されているように、標準曲線を作成、12 注：反応混合物のT7 DNAポリメラーゼを含めることは、一つのEXAすることができこの酵素による鉱山tetraribonucleotideプライマーの使用を。最適には、ポリメラーゼ濃度は、データの解釈を簡素化するために飽和されるべきです。 0.4μM以上のポリメラーゼ濃度は、良好な結果を与えます。さらに、そのような一本鎖DNA結合タンパク質などの他のタンパク質の効果は、プライマー合成またはラギング鎖開始のいずれかで、このようにして調べることができます。 </li></ol>ラピッドクエンチ機器の使用2.マルチターンオーバープライマー合成反応<ol><li> 反応混合物の調製 <ol><li> 0.5 mCiの/ mLの[α-32 P] CTPを含むバッファー（1x）、0.2μMGP4六、0.2μMssDNA鋳型、0.6 mMのdNTPを、0.2 mMのATPとCTPを（含む、A液の400μLを準備します。 </li><li>バッファー（1x）および20mMのMgCl 2を含む、溶液Bの400μLを準備します。 </li></ol></li><li> 急速クエンチフロー機器の操作 <ol><li>ラップをオンにしますID-クエンチフロー機器;メインメニューが表示された後、楽器キーボードのタイプ7はホームポジションにシリンジポンプを移動します。 </li><li> 「LOAD」にオープンバッファシリンジ位置。 </li></ol></li><li> ローディングバッファーシリンジ <ol><li>ドライブシリンジポートにバッファを含む10 mLシリンジを取り付けます。 「LOAD」にシリンジノブの位置を変更します。 </li><li> 10 mLのシリンジを用いて、10 mMトリス、pHは7.5、1 mMのEDTAを用いて器具バッファリザーバA及びBを充填し、クエンチ液（250mMのEDTA、および0.2％SDS）を用いて注射器Cを満たします。 inとoutプランジャーを押すことにより気泡を除去。 </li><li> 「FIRE」にノブの位置を変更します。シリンジポンプバーの位置を調整するタイプ2。プレスバッファが出口ループから出てくるまで、注射器を下げるためにボタンを「DOWN ADJUST」：（継続的にダウン7は-進み、8-大きなステップダウン; 9-小さなステップダウン）。メインメニューに戻るには「ESC」と入力します。 </li></ol></li><li> ウォッシュチューブ <ol><li> ATT真空へのACHの出口ライン。サンプルのノブに「FLUSH」に変更します。水平位置にノブを設定して閉じるバッファ用シリンジ。真空をオンにして、10秒間のH 2 Oで2フラッシュループを浸し、その後10秒間MeOHに浸し。 〜15秒間、または乾燥するまで空気を吸引することにより、ドライループ。 </li></ol></li><li> 読み込んサンプル <ol><li>サンプルノブの位置は、「LOAD」に変更します。 1 mLのシリンジに溶液Aを配置します。サンプルロードポートのいずれかに注射器を差し込みます。溶液Bのために繰り返し、反対側のサンプルのロードポートに配置します。 </li></ol></li><li> 時点のコレクション <ol><li>メインメニューで、クエンチフロー実行のタイプ1。反応時間（秒）を入力し、Enterキーを押し、「ENTER」。使用する反応ループ回数が表示されます。必要な反応ループに切り替えます。ステップ2.2.4で洗浄手順を繰り返します。 </li><li> 「LOAD」にサンプルのノブを回します。負荷反応は、ちょうど中央混合室の外側まで、サンプルループをミックス。 FIR」にすべてのノブを回してE &quot;は。すべてのツマミが正しい位置にあることを確認します。 </li><li>出口ループの最後に1.5 mLのチューブを置きます。押して反応を実行するために「GO」。ステップ2.2.4で洗浄手順を繰り返します。彼らはドライバーを打つまで、バッファの注射器のAとBをリロードします。 </li><li>所望の各時点での手順を繰り返し2.2.6.2-2.2.6.3。例外：開始試薬ゼロ時点のコントロールを急冷（ すなわち 、この場合のMgCl 2）を含む溶液をロードしないでください。 </li><li>サンプルを収集が終了したら、メインメニューに戻るには「ESC」を入力します。押して「7」は、そのホームポジションにバッファシリンジポンプを返します。 </li></ol></li><li> インストゥルメントのクリーンアップ <ol><li>反応混合物の注射器を取り外します。 「LOAD」の位置にサンプルローディングノブを回します。真空下、10 mLの0.3 NH 3 PO 4および10mLのMeOH、続いて10 mLの0.2 N NaOHで各サンプルループを、洗います。 </li><li> 「LOAD」の位置に注射器のつまみを回します。すべての3 SYRを押し下げますインゲプランジャは、反応やクエンチバッファーを取得します。ウォッシュは、少なくとも2倍の5mLのH 2 Oで注射器。 </li><li> 5mLのH 2 Oで再びシリンジを記入し、「FIRE」の位置にノブを回します。ノブの位置を変更し、ステップ2.2.4のようにフラッシュのH 2 Oを除去するために、真空をオンにします。楽器の電源をオフにします。 注：手順1.7から1.12に記載されているように製品を分析しています。また、T7 DNAポリメラーゼおよび他の複製タンパク質は、プライマー合成または伸長に対する効果を分析するために反応混合物に添加することができます。 </li></ol></li></ol> 3.シングルターンオーバープライマー合成反応 注：シングルターンオーバープライマー合成/伸長アッセイは、いくつかの主要な違いは、複数のターンオーバー反応と同様に実施されています。これらのアッセイは、プライマーまたは拡張製品に放射性標識されたATPの変換に従う、しかし基質の濃度およびタンパク質はconsideraありますBLY高いです。また、プライマー合成反応の分析を可能にするために、ミリ秒の分解能を達成するために、一方が急速クエンチフロー・マシンを利用しなければなりません。 <ol><li> 反応混合物を調製します。 <ol><li> 1×緩衝液を含む、A液の400μLを準備し、3μMGP4量体、6μMssDNA鋳型、0.6 mMのdNTPを、1 mMのCTP、および2 nMの[γ-32 P] ATP。バッファー（1x）および20mMのMgCl 2を含む、溶液Bの400μLを準備します。 </li></ol></li><li> 急速クエンチフロー操作 <ol><li>ステップ2.2で説明したように反応を行います。必要であれば、それぞれ、15μMおよび20μMの濃度で、T7 DNAポリメラーゼまたはT7一本鎖DNA結合タンパク質を追加します。この場合には、伸長生成物は、反応の手動サンプリングを可能にする時間体制で蓄積します。 </li></ol></li></ol> 4.データ解析<ol><li>非線形least-にフィット製品プログレス曲線最小二乗フィットおよび/または数値積分することのできる市販のソフトウェアを使用して正方形モデル。動作の詳細は、使用するソフトウェアによって変化しますが、以下のデータをフィッティングするために使用される方程式の一般形であるだろう。 </li><li>線形方程式にカーブを進行するために適合させることによって、複数の代謝回転プライマー合成反応の生成物形​​成の速度を決定します。かなりの曲率がある場合、単一指数関数にデータを当てはめることにより初速度法13、14を使用する ：Y = A（E - Tを K）yは、生成物濃度であり、Aは、反応の振幅であり、kは観察された速度定数、tは時間（秒）です。時間= 0における接線の傾きは、初速度です。 注： - k個 府線形方程式にまたは前定常状態バースト方程式y = A（Eへ前定常状態のプライマー合成反応をフィットAは反応振幅で第1のT）+レートSS tは、k個の バーストは、前定常状態のバーストのために観察された速度定数であり、レートssは定常状態速度SS = の k cat [酵素]）であり、tは時間であります、 すぐに。シングルターンオーバープライマーの合成反応は、シングル指数関数y = A（ - トンを K E）に進行曲線フィット。 GP4の場合には、市販のソフトウェアを使用して、各中間体は、酵素と平衡状態に。3つのNTP縮合段階でモデルに、数値積分15によってデータをフィット。 </li></ol>

<ol>
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C., Ellenberger, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modular+architecture+of+the+bacteriophage+T7+primase+couples+RNA+primer+synthesis+to+DNA+synthesis.">Modular architecture of the bacteriophage T7 primase couples RNA primer synthesis to DNA synthesis.</a> Mol Cell. 11 (5), 1349-1360 (2003).</li><li>Kusakabe, T., Richardson, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+4+DNA+primase+of+bacteriophage+T7+mediates+the+annealing+and+extension+of+ribo-oligonucleotides+at+primase+recognition+sites.">Gene 4 DNA primase of bacteriophage T7 mediates the annealing and extension of ribo-oligonucleotides at primase recognition sites.</a> J Biol Chem. 272 (19), 12446-12453 (1997).</li><li>Lee, S. J., Zhu, B., Hamdan, S. M., Richardson, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+sequence-specific+template+binding+by+the+DNA+primase+of+bacteriophage+T7.">Mechanism of sequence-specific template binding by the DNA primase of bacteriophage T7.</a> Nucleic Acids Res. 38 (13), 4372-4383 (2010).</li><li>Hernandez, A. J., Lee, S. J., Richardson, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primer+release+is+the+rate-limiting+event+in+lagging-strand+synthesis+mediated+by+the+T7+replisome.">Primer release is the rate-limiting event in lagging-strand synthesis mediated by the T7 replisome.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (21), 5916-5921 (2016).</li><li>Tabor, S., Richardson, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single+residue+in+DNA+polymerases+of+the+Escherichia+coli+DNA+polymerase+I+family+is+critical+for+distinguishing+between+deoxy-+and+dideoxyribonucleotides.">A single residue in DNA polymerases of the Escherichia coli DNA polymerase I family is critical for distinguishing between deoxy- and dideoxyribonucleotides.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 92 (14), 6339-6343 (1995).</li><li>Kim, Y. T., Tabor, S., Bortner, C., Griffith, J. D., Richardson, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+characterization+of+the+bacteriophage+T7+gene+2.5+protein.+A+single-stranded+DNA-binding+protein.">Purification and characterization of the bacteriophage T7 gene 2.5 protein. A single-stranded DNA-binding protein.</a> J Biol Chem. 267 (21), 15022-15031 (1992).</li><li>Frick, D. N., Richardson, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+primases.">DNA primases.</a> Annu Rev Biochem. 70, 39-80 (2001).</li><li>Lee, S. J., Richardson, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Essential+lysine+residues+in+the+RNA+polymerase+domain+of+the+gene+4+primase-helicase+of+bacteriophage+T7.">Essential lysine residues in the RNA polymerase domain of the gene 4 primase-helicase of bacteriophage T7.</a> J Biol Chem. 276 (52), 49419-49426 (2001).</li><li>Cao, W., De La Cruz, E. 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A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fitting+enzyme+kinetic+data+with+KinTek+Global+Kinetic+Explorer.">Fitting enzyme kinetic data with KinTek Global Kinetic Explorer.</a> Methods Enzymol. 467, 601-626 (2009).</li><li>Johnson, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+century+of+enzyme+kinetic+analysis,+1913.">A century of enzyme kinetic analysis, 1913.</a> FEBS Lett. 587 (17), 2753-2766 (2013).</li><li>Biswas, T., Resto-Roldan, E., Sawyer, S. K., Artsimovitch, I., Tsodikov, O. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+non-radioactive+primase-pyrophosphatase+activity+assay+and+its+application+to+the+discovery+of+inhibitors+of+Mycobacterium+tuberculosis+primase+DnaG.">A novel non-radioactive primase-pyrophosphatase activity assay and its application to the discovery of inhibitors of Mycobacterium tuberculosis primase DnaG.</a> Nucleic Acids Res. 41 (4), e56 (2013).</li><li>Sanyal, G., Doig, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+DNA+replication+enzymes+as+targets+for+antibacterial+drug+discovery.">Bacterial DNA replication enzymes as targets for antibacterial drug discovery.</a> Expert Opin Drug Discov. 7 (4), 327-339 (2012).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

これらの実験を行う際に最も重要な要因は、高活性精製された酵素の利用です。 GP4との作業中に、例えば、我々は、-20℃で50％グリセロールを含むそのバッファ中の精製酵素の貯蔵（20 mMリン酸カリウム、pH7.4中、0.1mMのEDTA、1mMのDTT）に見出さはの減少をもたらします数ヶ月にわたる準備の具体的な活動。したがって、我々は今、精製25mMトリス - 塩酸、pH7.5の、50mMのNaCl、0.1mMのEDTA、1mMのTCEPで...

DNAの複製は、すべての細胞の生命の保存機能です。アイデンティティおよびレプリケーション・コンポーネントの数は広く変化するが、一般的なメカニズムが進化1間で共有されています。ここで、我々は、T7レプリソームのコンポーネントによってインビトロでラギング鎖DNA合成の動態を理解することを目的とした放射性基質を使用して、ゲルに基づく、不連続動態実験を記載します。バクテリオファージT7の複製機構は、4つのタンパク質（DNAポリメラーゼ、GP5、そのプロセッシング因子、 大腸菌チオレドキシン、二官能性プライマーゼ、ヘリカーゼGP4、及び一本鎖DNA結合タンパク質、GP2からなる非常に簡単です。 5）2。この機能は、DNA複製に関与する保存された生化学的機構を研究するための魅力的なモデルシステムになります。 特別重点は、プライマーゼT7 DNA、criticaによりリボヌクレオチドプライマーの形成に配置されていますDNA合成の開始におけるL段階。また、一つは、反応混合物に含めることにより、T7 DNAポリメラーゼ、または他の複製タンパク質によって、これらのプライマーの使用を調べることができます。 T7プライマーゼ、ヘリカーゼ、GP4は、プライマーゼ認識部位、またはPRS（5&#39;-GTC-3 &#39;）と呼ばれる特定のDNA配列においてDNA合成のためのプライマーの形成を触媒します。 PRS中のシトシンは、サイトの認識のために不可欠であり、不可解ですが、それが製品3にコピーされていません。 GP4によるプライマー合成の最初のステップは、その後トリマーに、そして最終的にpppACCC、pppACCA、またはpppACACは、テンプレート4の配列に依存し、機能テトラヌクレオチドプライマーに拡張されたジヌクレオチドpppAC、の形成を含みます。これらのプライマーは、その後もGP4支援プロセス5,6でDNA合成を開始するために、T7 DNAポリメラーゼによって使用することができます。この点において、プライマーゼドメインは、それらの解離を防止する、テンプレートを使用して非常に短いtetraribonucleotidesを安定させるポリメラーゼ活性部位7にプライマー/鋳型の確保に資する方法でDNAポリメラーゼに係合します。これらの手順（RNAプライマー合成、ポリメラーゼへのプライマーのハンドオフ、および拡張子）はラギング鎖を複製するために複数のサイクルで繰り返され、リーディング鎖の複製と調整する必要があります。 ここに記載のアッセイは、高感度であり、適度な時間内に行うことができます。しかし、それらは比較的低いスループットと細心の注意が放射性物質の使用・廃棄に注意が必要です。で反応が進行する速度に応じて、1は、定常または前定常状態のいずれかで反応時間のコースの意味の分析のために適した時間スケールでサンプルを達成するために迅速な急冷装置を採用することがあります。最近、我々はevidencを提供するために、ここに記載のアッセイを使用しました岡崎フラグメントの開始におけるGP4のプライマーゼドメインからのプライマーのリリースの重要性の電子。さらに、当社は、効率的なプライマーの形成と利用8を促進する上で、タンパク質、gp2.5を結合T7一本鎖DNAのための調節的役割の証拠を発見しました。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="584">
	<tbody>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;"> 
			Tris pre-set crystals 
			pH 7.5</td>
			<td style="width:83px;">SIGMA</td>
			<td style="width:119px;">T4128&#160;</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Tris base</td>
			<td style="width:83px;">&#160;SIGMA</td>
			<td align="right" style="width:119px;">93362</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">L-Glutamic acid potassium salt monohydrate</td>
			<td style="width:83px;">SIGMA</td>
			<td style="width:119px;">G1501&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Magnesium chloride hexahydrate</td>
			<td style="width:83px;">Mallinckrodt Chemicals</td>
			<td style="width:119px;">5958-04</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">1,4-Dithiothreitol</td>
			<td style="width:83px;">J.T. Baker</td>
			<td style="width:119px;">F780-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Sodium Dodecyl Sulfate</td>
			<td style="width:83px;">MP Biomedicals</td>
			<td align="right" style="width:119px;">811030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">(Ethylenedinitrilo) Tetraacetic acid, disodium salt, dihydrate</td>
			<td style="width:83px;">Mallinckrodt Chemicals</td>
			<td style="width:119px;">4931-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">[&#945;-32P] CTP</td>
			<td style="width:83px;">PerkinElmer</td>
			<td style="width:119px;">BLU508H</td>
			<td>radioactive, take protective measures</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">[&#947;-32P] ATP</td>
			<td style="width:83px;">PerkinElmer</td>
			<td style="width:119px;">BLU502A</td>
			<td>radioactive, take protective measures</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">100 mM dATP, dCTP, dGTP, dTTP&#160;</td>
			<td style="width:83px;">Affymetrix</td>
			<td align="right" style="width:119px;">77100</td>
			<td>four dNTPs part of set</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">100 mM ATP and CTP</td>
			<td style="width:83px;">Epicentre</td>
			<td style="width:119px;">RN02825</td>
			<td>part of NTP set</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">ssDNA constructs</td>
			<td style="width:83px;">Integrated DNA Technologies</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td>custom sequences&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">methanol&#160;</td>
			<td style="width:83px;">Macron Fine Chemicals</td>
			<td style="width:119px;">3017-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">formamide</td>
			<td style="width:83px;">Thermo Scientific</td>
			<td align="right" style="width:119px;">17899</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">bromophenol blue</td>
			<td style="width:83px;">SIGMA</td>
			<td style="width:119px;">B8026&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">cylene xyanol&#160;</td>
			<td style="width:83px;">SIGMA</td>
			<td style="width:119px;">X4126&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">acrylamide</td>
			<td style="width:83px;">SIGMA</td>
			<td style="width:119px;">A9099</td>
			<td>Toxic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">N,N&#8242;-Methylenebisacrylamide</td>
			<td style="width:83px;">SIGMA</td>
			<td style="width:119px;">M7279&#160;</td>
			<td>Toxic</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Urea</td>
			<td style="width:83px;">Boston Bioproducts</td>
			<td style="width:119px;">P-940</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Boric acid</td>
			<td style="width:83px;">Mallinckrodt Chemicals</td>
			<td align="right" style="width:119px;">2549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Rapid Quench-Flow Instrument&#160;</td>
			<td style="width:83px;">Kintek Corp.</td>
			<td style="width:119px;">RQF-3&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Kintek Explorer</td>
			<td style="width:83px;">Kintek Corp.</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Kaleidagraph&#160;</td>
			<td style="width:83px;">Synergy Software</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

kinetics of lagging-strand dna synthesis in vitro by the bacteriophage t7 replication proteins

Here we provide protocols for the kinetic examination of lagging-strand DNA synthesis in vitro by the replication proteins of bacteriophage T7. The T7 replisome is one of the simplest replication systems known, composed of only four proteins, which is an attractive feature for biochemical experiments. Special emphasis is placed on the synthesis of ribonucleotide primers by the T7 primase-helicase, which are used by DNA polymerase to initiate DNA synthesis. Because the mechanisms of DNA replication are conserved across evolution, these protocols should be applicable, or useful as a conceptual springboard, to investigators using other model systems. The protocols described here are highly sensitive and an experienced investigator can perform these experiments and obtain data for analysis in about a day. The only specialized piece of equipment required is a rapid-quench flow instrument, but this piece of equipment is relatively common and available from various commercial sources. The major drawbacks of these assays, however, include the use of radioactivity and the relative low throughput.

手動多代謝回転条件下GP4によって触媒されるプライマーの合成反応をサンプリングすることによって、 すなわち 、プロトコルのステップ1に記載したように、図1Aに示した結果が得られました。ここで、ゲル電気泳動後の製品の範囲は、プライマー合成反応（ 図1A）内のα位の32 Pで標識されたCTPを用いて観察するこ...

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Kinetics of Lagging-strand DNA Synthesis In Vitro by the Bacteriophage T7 Replication Proteins

We describe sensitive, gel-based discontinuous assays to examine the kinetics of lagging-strand initiation using the replication proteins of bacteriophage T7.

遅行本鎖DNA合成の動態<em&gt;インビトロ</em&gt;バクテリオファージT7複製タンパク質によって

Here we provide protocols for the kinetic examination of lagging-strand DNA synthesis in vitro by the replication proteins of bacteriophage T7. The T7 ...

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Kinetics of Lagging-strand DNA Synthesis In Vitro by the Bacteriophage T7 Replication Proteins

DNA Replication

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7.3K ビュー.  Harvard Medical School. We describe sensitive, gel-based discontinuous assays to examine the kinetics of lagging-strand initiation using the replication proteins of bacteriophage T7. 

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In Vitro Transcription Assays and Their Application in Drug Discovery

In vitro transcription assays have been developed and widely used for many years to study the molecular mechanisms involved in transcription. This process requires multi-subunit DNA-dependent RNA polymerase (RNAP) and a series of transcription factors that act to modulate the activity of RNAP during gene expression. Sequencing gel electrophoresis of radiolabeled transcripts is used to provide detailed mechanistic information on how transcription proceeds and what parameters can affect it. In this paper we describe the protocol to study how the essential elongation factor NusA regulates transcriptional pausing, as well as a method to identify an antibacterial agent targeting transcription initiation through inhibition of RNAP holoenzyme formation. These methods can be used a as platform for the development of additional approaches to explore the mechanism of action of the transcription factors which still remain unclear, as well as new antibacterial agents targeting transcription which is an underutilized drug target in antibiotic research and development.

In Vitro Transcription Assays and Their Application in Drug Discovery

In this manuscript, we describe a protocol to functionally examine transcription and the inhibitory activity of antibacterial agents targeting bacterial transcription.

in vitro転写アッセイおよび創薬への応用

In vitro transcription assays have been developed and widely used for many years to study the molecular mechanisms involved in transcription. This process ...

遺伝学

Novel RNA-Binding Proteins Isolation by the RaPID Methodology

RNA-binding proteins (RBPs) play important roles in every aspect of RNA metabolism and regulation. Their identification is a major challenge in modern biology. Only a few in vitro and in vivo methods enable the identification of RBPs associated with a particular target mRNA. However, their main limitations are the identification of RBPs in a non-cellular environment (in vitro) or the low efficiency isolation of RNA of interest (in vivo). An RNA-binding protein purification and identification (RaPID) methodology was designed to overcome these limitations in yeast and enable efficient isolation of proteins that are associated in vivo. To achieve this, the RNA of interest is tagged with MS2 loops, and co-expressed with a fusion protein of an MS2-binding protein and a streptavidin-binding protein (SBP). Cells are then subjected to crosslinking and lysed, and complexes are isolated through streptavidin beads. The proteins that co-purify with the tagged RNA can then be determined by mass spectrometry. We recently used this protocol to identify novel proteins associated with the ER-associated PMP1 mRNA. Here, we provide a detailed protocol of RaPID, and discuss some of its limitations and advantages.

RNA-protein interactions lie at the heart of many cellular processes. Here, we describe an in vivo method to isolate specific RNA and identify novel proteins that are associated with it. This could shed new light on how RNAs are regulated in the cell.

急速な手法による新規RNA結合タンパク質の単離

RNA-binding proteins (RBPs) play important roles in every aspect of RNA metabolism and regulation. Their identification is a major challenge in modern ...

In Situ Labeling of Mitochondrial DNA Replication in Drosophila Adult Ovaries by EdU Staining

The mitochondrial genome is inherited exclusively through the maternal line. Understanding of how the mitochondrion and its genome are proliferated and transmitted from one generation to the next through the female oocyte is of fundamental importance. Because of the genetic tractability, and the elegant, ordered simplicity by which oocyte development proceeds, Drosophila oogenesis has become an invaluable system for mitochondrial study. An EdU (5-ethynyl-2&#180;-deoxyuridine) labeling method was utilized to detect mitochondrial DNA (mtDNA) replication in Drosophila ovaries. This method is superior to the BrdU (5-bromo-2'-deoxyuridine) labeling method in that it allows for good structural preservation and efficient fluorescent dye penetration of whole-mount tissues.
Here we describe a detailed protocol for labeling replicating mitochondrial DNA in Drosophila adult ovaries with EdU. Some technical solutions are offered to improve the viability of the ovaries, maintain their health during preparation, and ensure high-quality imaging. Visualization of newly synthesized mtDNA in the ovaries not only reveals the striking temporal and spatial pattern of mtDNA replication through oogenesis, but also allows for simple quantification of mtDNA replication under various genetic and pharmacological perturbations.

In Situ Labeling of Mitochondrial DNA Replication in Drosophila Adult Ovaries by EdU Staining

Drosophila oogenesis continues to be exceptionally useful in the study of mitochondrial proliferation and inheritance. This manuscript describes a detailed protocol used to label the replicating mitochondrial DNA (mtDNA) in Drosophila adult ovaries with 5-ethynyl-2&#180;-deoxyuridine (EdU), which facilitates uncovering mechanisms associated with mitochondrial inheritance that were previously debatable.

EDU染色によりショウジョウバエアダルト卵巣内のミトコンドリアDNA複製のその場の標識で

The mitochondrial genome is inherited exclusively through the maternal line. Understanding of how the mitochondrion and its genome are proliferated and ...

Genome-wide Determination of Mammalian Replication Timing by DNA Content Measurement

Replication of the genome occurs during S phase of the cell cycle in a highly regulated process that ensures the fidelity of DNA duplication. Each genomic region is replicated at a distinct time during S phase through the simultaneous activation of multiple origins of replication. Time of replication (ToR) correlates with many genomic and epigenetic features and is linked to mutation rates and cancer. Comprehending the full genomic view of the replication program, in health and disease is a major future goal and challenge.
This article describes in detail the &#34;Copy Number Ratio of S/G1 for mapping genomic Time of Replication&#34; method (herein called: CNR-ToR), a simple approach to map the genome wide ToR of mammalian cells. The method is based on the copy number differences between S phase cells and G1 phase cells. The CNR-ToR method is performed in 6 steps: 1. Preparation of cells and staining with propidium iodide (PI); 2. Sorting G1 and S phase cells using fluorescence-activated cell sorting (FACS); 3. DNA purification; 4. Sonication; 5. Library preparation and sequencing; and 6. Bioinformatic analysis. The CNR-ToR method is a fast and easy approach that results in detailed replication maps.

We describe here a relatively fast and simple approach for mapping genome-wide mammalian replication timing, from cell isolation to the basic analysis of the sequencing results. A genomic map of a representative replication program will be provided following the protocol.

DNA含有量測定法による哺乳類の複製タイミングのゲノムワイドな決意

Replication of the genome occurs during S phase of the cell cycle in a highly regulated process that ensures the fidelity of DNA duplication. Each genomic ...

Inducible T7 RNA Polymerase-mediated Multigene Expression System, pMGX

Co-expression of multiple proteins is increasingly essential for synthetic biology, studying protein-protein complexes, and characterizing and harnessing biosynthetic pathways. In this manuscript, the use of a highly effective system for the construction of multigene synthetic operons under the control of an inducible T7 RNA polymerase is described. This system allows many genes to be expressed simultaneously from one plasmid. Here, a set of four related vectors, pMGX-A, pMGX-hisA, pMGX-K, and pMGX-hisK, with either the ampicillin or kanamycin resistance selectable marker (A and K) and either possessing or lacking an N-terminal hexahistidine tag (his) are disclosed. Detailed protocols for the construction of synthetic operons using this vector system are provided along with the corresponding data, showing that a pMGX-based system containing five genes can be readily constructed and used to produce all five encoded proteins in Escherichia coli. This system and protocol enables researchers to routinely express complex multi-component modules and pathways in E. coli.

This study describes methods for the T7-mediated co-expression of multiple genes from a single plasmid in Escherichia coli using the pMGX plasmid system.

誘導性T7 RNAポリメラーゼ媒介マルチ遺伝子発現システム、pMGX

Co-expression of multiple proteins is increasingly essential for synthetic biology, studying protein-protein complexes, and characterizing and harnessing ...

Profiling DNA Replication Timing Using Zebrafish as an In Vivo Model System

DNA replication timing is an important cellular characteristic, exhibiting significant relationships with chromatin structure, transcription, and DNA mutation rates. Changes in replication timing occur during development and in cancer, but the role replication timing plays in development and disease is not known. Zebrafish were recently established as an in vivo model system to study replication timing. Here is detailed the protocols for using the zebrafish to determine DNA replication timing. After sorting cells from embryos and adult zebrafish, high-resolution genome-wide DNA replication timing patterns can be constructed by determining changes in DNA copy number through analysis of next generation sequencing data. The zebrafish model system allows for evaluation of the replication timing changes that occur in vivo throughout development, and can also be used to assess changes in individual cell types, disease models, or mutant lines. These methods will enable studies investigating the mechanisms and determinants of replication timing establishment and maintenance during development, the role replication timing plays in mutations and tumorigenesis, and the effects of perturbing replication timing on development and disease.

Profiling DNA Replication Timing Using Zebrafish as an In Vivo Model System

Zebrafish were recently used as an in vivo model system to study DNA replication timing during development. Here is detailed the protocols for using zebrafish embryos to profile replication timing. This protocol can be easily adapted to study replication timing in mutants, individual cell types, disease models, and other species.

In Vivoモデル システムとしてゼブラフィッシュを用いた DNA 複製タイミングのプロファイリング

DNA replication timing is an important cellular characteristic, exhibiting significant relationships with chromatin structure, transcription, and DNA ...

Methodology for Accurate Detection of Mitochondrial DNA Methylation

Quantification of DNA methylation can be achieved using bisulfite sequencing, which takes advantage of the property of sodium bisulfite to convert unmethylated cytosine into uracil, in a single-stranded DNA context. Bisulfite sequencing can be targeted (using PCR) or performed on the whole genome and provides absolute quantification of cytosine methylation at the single base-resolution. Given the distinct nature of nuclear- and mitochondrial DNA, notably in the secondary structure, adaptions of bisulfite sequencing methods for investigating cytosine methylation in mtDNA should be made. Secondary and tertiary structure of mtDNA can indeed lead to bisulfite sequencing artifacts leading to false-positives due to incomplete denaturation poor access of bisulfite to single-stranded DNA. Here, we describe a protocol using an enzymatic digestion of DNA with BamHI coupled with bioinformatic analysis pipeline to allow accurate quantification of cytosine methylation levels in mtDNA. In addition, we provide guidelines for designing the bisulfite sequencing primers specific to mtDNA, in order to avoid targeting undesirable NUclear MiTochondrial segments (NUMTs) inserted into the nuclear genome.

Here, we present a protocol to allow accurate quantification of mitochondrial DNA (mtDNA) methylation. In this protocol, we describe an enzymatic digestion of DNA with BamHI coupled with a bioinformatic analysis pipeline which can be used to avoid overestimation of mtDNA methylation levels caused by the secondary structure of mtDNA.

ミトコンドリア DNA のメチル化の正確な検出のための方法論

Quantification of DNA methylation can be achieved using bisulfite sequencing, which takes advantage of the property of sodium bisulfite to convert ...

Using In Vitro and In-cell SHAPE to Investigate Small Molecule Induced Pre-mRNA Structural Changes

In the process of drug development of RNA-targeting small molecules, elucidating the structural changes upon their interactions with target RNA sequences is desired. We herein provide a detailed in vitro and in-cell selective 2&#39;-hydroxyl acylation analyzed by primer extension (SHAPE) protocol to study the RNA structural change in the presence of an experimental drug for spinal muscular atrophy (SMA), survival of motor neuron (SMN)-C2, and in exon 7 of the pre-mRNA of the SMN2 gene. In in vitro SHAPE, an RNA sequence of 140 nucleotides containing SMN2 exon 7 is transcribed by T7 RNA polymerase, folded in the presence of SMN-C2, and subsequently modified by a mild 2&#39;-OH acylation reagent, 2-methylnicotinic acid imidazolide (NAI). This 2&#39;-OH-NAI adduct is further probed by a 32P-labeled primer extension and resolved by polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE). Conversely, 2&#39;-OH acylation in in-cell SHAPE takes place in situ with SMN-C2 bound cellular RNA in living cells. The pre-mRNA sequence of exon 7 in the SMN2 gene, along with SHAPE-induced mutations in the primer extension, was then amplified by PCR and subject to next-generation sequencing. Comparing the two methodologies, in vitro SHAPE is a more cost-effective method and does not require computational power to visualize results. However, the in vitro SHAPE-derived RNA model sometimes deviates from the secondary structure in a cellular context, likely due to the loss of all interactions with RNA-binding proteins. In-cell SHAPE does not need a radioactive material workplace and yields a more accurate RNA secondary structure in the cellular context. Furthermore, in-cell SHAPE is usually applicable for a larger range of RNA sequences (~1,000 nucleotides) by utilizing next-generation sequencing, compared to in vitro SHAPE (~200 nucleotides) that usually relies on PAGE analysis. In case of exon 7 in SMN2 pre-mRNA, the in vitro and in-cell SHAPE derived RNA models are similar to each other.

Detailed protocols for both in vitro and in-cell selective 2&#39;-hydroxyl acylation analyzed by primer extension (SHAPE) experiments to determine the secondary structure of pre-mRNA sequences of interest in the presence of an RNA-targeting small molecule are presented in this article.

MRNA の構造変化を誘導培養と細胞の形で使用して小分子を調査するには

In the process of drug development of RNA-targeting small molecules, elucidating the structural changes upon their interactions with target RNA sequences ...

High-Density DNA and RNA microarrays - Photolithographic Synthesis, Hybridization and Preparation of Large Nucleic Acid Libraries

Photolithography is a powerful technique for the synthesis of DNA oligonucleotides on glass slides, as it combines the efficiency of phosphoramidite coupling reactions with the precision and density of UV light reflected from micrometer-sized mirrors. Photolithography yields microarrays that can accommodate from hundreds of thousands up to several million different DNA sequences, 100-nt or longer, in only a few hours. With this very large sequence space, microarrays are ideal platforms for exploring the mechanisms of nucleic acid&#183;ligand interactions, which are particularly relevant in the case of RNA. We recently reported on the preparation of a new set of RNA phosphoramidites compatible with in situ photolithography and which were subsequently used to grow RNA oligonucleotides, homopolymers as well as mixed-base sequences. Here, we illustrate in detail the process of RNA microarray fabrication, from the experimental design, to instrumental setup, array synthesis, deprotection and final hybridization assay using a template 25mer sequence containing all four bases as an example. In parallel, we go beyond hybridization-based experiments and exploit microarray photolithography as an inexpensive gateway to complex nucleic acid libraries. To do so, high-density DNA microarrays are fabricated on a base-sensitive monomer that allows the DNA to be conveniently cleaved and retrieved after synthesis and deprotection. The fabrication protocol is optimized so as to limit the number of synthetic errors and to that effect, a layer of &#946;-carotene solution is introduced to absorb UV photons that may otherwise reflect back onto the synthesis substrates. We describe in a step-by-step manner the complete process of library preparation, from design to cleavage and quantification.

In this article, we present and discuss new developments in the synthesis and applications of nucleic acid microarrays fabricated in situ. Specifically, we show how the protocols for DNA synthesis can be extended to RNA and how microarrays can be used to create retrievable nucleic acid libraries.

高密度DNAおよびRNAマイクロアレイ - 光リソグラフィー合成、ハイブリダイゼーション、大型核酸ライブラリーの調製

Photolithography is a powerful technique for the synthesis of DNA oligonucleotides on glass slides, as it combines the efficiency of phosphoramidite ...

Use of Frozen Tissue in the Comet Assay for the Evaluation of DNA Damage

The comet assay is gaining popularity as a means to assess DNA damage in cultured cells and tissues, particularly following exposure to chemicals or other environmental stressors. Use of the comet assay in regulatory testing for genotoxic potential in rodents has been driven by adoption of an Organisation for Economic Co-operation and Development (OECD) test guideline in 2014. Comet assay slides are typically prepared from fresh tissue at the time of necropsy; however, freezing tissue samples can avoid logistical challenges associated with simultaneous preparation of slides from multiple organs per animal and from many animals per study. Freezing also enables shipping samples from the exposure facility to a different laboratory for analysis, and storage of frozen tissue facilitates deferring a decision to generate DNA damage data for a given organ. The alkaline comet assay is useful for detecting exposure-related DNA double- and single-strand breaks, alkali-labile lesions, and strand breaks associated with incomplete DNA excision repair. However, DNA damage can also result from mechanical shearing or improper sample processing procedures, confounding the results of the assay. Reproducibility in collection and processing of tissue samples during necropsies may be difficult to control due to fluctuating laboratory personnel with varying levels of experience in harvesting tissues for the comet assay. Enhancing consistency through refresher training or deployment of mobile units staffed with experienced laboratory personnel is costly and may not always be feasible. To optimize consistent generation of high quality samples for comet assay analysis, a method for homogenizing flash frozen cubes of tissue using a customized tissue mincing device was evaluated. Samples prepared for the comet assay by this method compared favorably in quality to fresh and frozen tissue samples prepared by mincing during necropsy. Moreover, low baseline DNA damage was measured in cells from frozen cubes of tissue following prolonged storage.

This protocol describes several procedures for preparing high quality frozen tissue samples at the time of necropsy for use in the comet assay to assess DNA damage: 1) minced tissue, 2) scraped epithelial cells from the gastrointestinal tract, and 3) cubed tissue samples, requiring homogenization using a tissue mincing device.

DNA損傷評価のための彗星アッセイにおける凍結組織の利用

The comet assay is gaining popularity as a means to assess DNA damage in cultured cells and tissues, particularly following exposure to chemicals or other ...