Madison Grant, Steven Foltz, Halie Zastre and Junna Luan provided technical assistance. Research reported in this publication was supported by the National Institute of Arthritis and Musculoskeletal and Skin Diseases of the National Institutes of Health under award number AR065077. The content is solely the responsibility of the author and does not necessarily represent the official views of the National Institutes of Health.

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	<li>Foltz, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abnormal+skeletal+muscle+regeneration+plus+mild+alterations+in+mature+fiber+type+specification+in+Fktn-Deficient+Dystroglycanopathy+Muscular+Dystrophy+Mice.">Abnormal skeletal muscle regeneration plus mild alterations in mature fiber type specification in Fktn-Deficient Dystroglycanopathy Muscular Dystrophy Mice.</a> PLoS One. 11 (1), 0147049 (2016).</li><li>Bartoli, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+monitoring+of+therapeutic+gene+transfer+in+animal+models+of+muscular+dystrophies.">Noninvasive monitoring of therapeutic gene transfer in animal models of muscular dystrophies.</a> Gene Ther. 13, 20-28 (2006).</li><li>Ip, W. T., Huggins, C. E., Pepe, S., Delbridge, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluating+RNA+preparation+options+for+archived+myocardial+biopsies.">Evaluating RNA preparation options for archived myocardial biopsies.</a> Heart Lung Circ. 20 (5), 329-331 (2011).</li><li>Beedle, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+fukutin+deletion+impairs+dystroglycan+processing+and+recapitulates+muscular+dystrophy.">Mouse fukutin deletion impairs dystroglycan processing and recapitulates muscular dystrophy.</a> J. Clin. Invest. 122 (9), 3330-3342 (2012).</li><li>Foltz, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Four-week+rapamycin+treatment+improves+muscular+dystrophy+in+a+fukutin-deficient+mouse+model+of+dystroglycanopathy.">Four-week rapamycin treatment improves muscular dystrophy in a fukutin-deficient mouse model of dystroglycanopathy.</a> Skeletal Muscle. 6, 20 (2016).</li><li>Liu, L., Cheung, T. H., Charville, G. W., Rando, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+skeletal+muscle+stem+cells+by+fluorescence-activated+cell+sorting.">Isolation of skeletal muscle stem cells by fluorescence-activated cell sorting.</a> Nat. Protoc. 10, 1612-1624 (2015).</li><li>Rump, L. V., Asamoah, B., Gonzalez-Escalona, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+commercial+RNA+extraction+kits+for+preparation+of+DNA-free+total+RNA+from+Salmonella+cells.">Comparison of commercial RNA extraction kits for preparation of DNA-free total RNA from Salmonella cells.</a> BMC Res. Notes. 3, 211 (2010).</li><li>Desjardins, P., Conklin, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NanoDrop+microvolume+quantitation+of+nucleic+acids.">NanoDrop microvolume quantitation of nucleic acids.</a> J. Vis. Exp. (45), e2565 (2010).</li><li>Valdez, M. R., Richardson, J. A., Klein, W. H., Olson, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Failure+of+Myf5+to+support+myogenic+differentiation+without+myogenin,+MyoD,+and+MRF4.">Failure of Myf5 to support myogenic differentiation without myogenin, MyoD, and MRF4.</a> Dev Biol. 219 (2), 287-298 (2000).</li><li>Pavlath, G. K., Dominov, J. A., Kegley, K. M., Miller, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+of+transgenic+skeletal+muscles+with+altered+timing+of+expression+of+the+basic+helix-loop-helix+muscle+regulatory+factor+MRF4.">Regeneration of transgenic skeletal muscles with altered timing of expression of the basic helix-loop-helix muscle regulatory factor MRF4.</a> Am. J. Pathol. 162 (5), 1685-1691 (2003).</li><li>Chomczynski, P., Mackey, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Substitution+of+chloroform+by+bromo-chloropropane+in+the+single-step+method+of+RNA+isolation.">Substitution of chloroform by bromo-chloropropane in the single-step method of RNA isolation.</a> Anal. Biochem. 225 (1), 163-164 (1995).</li><li>Lee, J. T. Y., Cheung, K. M. C., Leung, V. Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extraction+of+RNA+from+tough+tissues+with+high+proteoglycan+content+by+cryosection,+second+phase+separation+and+high+salt+precipitation.">Extraction of RNA from tough tissues with high proteoglycan content by cryosection, second phase separation and high salt precipitation.</a> J. Biol. Methods. 2 (2), 20 (2015).</li><li>Guo, D., Catchpoole, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+intact+RNA+following+cryosections+of+archived+frozen+tissue.">Isolation of intact RNA following cryosections of archived frozen tissue.</a> BioTechniques. 34, 48-50 (2003).</li><li>Goodpaster, T., Randolph-Habecker, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+flexible+mouse-on-mouse+immunohistochemical+staining+technique+adaptable+to+biotin-free+reagents,+immunofluorescence,+and+multiple+antibody+staining.">A flexible mouse-on-mouse immunohistochemical staining technique adaptable to biotin-free reagents, immunofluorescence, and multiple antibody staining.</a> J. Histochem. Cytochem. 62 (3), 197-204 (2014).</li><li>Ikezawa, M., Minami, N., Takahashi, M., Goto, Y., Miike, T., Nonaka, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dystrophin+gene+analysis+of+130+patients+with+Duchenne+muscular+dystrophy+with+a+special+reference+to+muscle+mRNA+analysis.">Dystrophin gene analysis of 130 patients with Duchenne muscular dystrophy with a special reference to muscle mRNA analysis.</a> Brain Dev. 20 (3), 165-168 (1998).</li><li>Majumdar, G., Vera, S., Elam, M. B., Raghow, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+streamlined+protocol+for+extracting+RNA+and+genomic+DNA+from+archived+human+blood+and+muscle.">A streamlined protocol for extracting RNA and genomic DNA from archived human blood and muscle.</a> Anal. Biochem. 474, 25-27 (2015).</li><li>Espina, V., Heiby, M., Pieroban, M., Liotta, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+capture+microdissection+technology.">Laser capture microdissection technology.</a> Expert Rev Mol Diagnostics. 7 (5), 647-657 (2007).</li></ol>

The author declares that she has no competing financial interests.

余分な樹脂は、プールされた凍結切片のコレクションが遅くなりますし、RNA単離に樹脂汚染を埋め込む増加させることができるので、この方法で最良の結果を達成するために、組織の凍結保存中に筋肉の下3分の1または半分に制限された樹脂を埋め込む保ちます。また、針の均質化中細心の注意は、収量を最大化し、針を目詰まりの可能性を最小限にすることが重要です。プロトコルは、針がブロックされ、目詰まりを取り除くために高圧が必要になった場合、サンプルの損失から保護するために、ルアーロックシリンジを使用して変更することができます。 25または26ゲージ針を有する付加的な針の均質化ステップは、さらにRNAの収量を増強するために、より微細な組織懸濁液を製造するために添加することができます。クロロホルムは、BCPの代わりに用いることができるが、これは、BCPとして推奨されていないRNA 12の有機抽出の際、水相中のゲノムDNA汚染の低いレベルで毒性が低く、その結果です。増加均質化はあまり効率的であるように、30ミクロン以上のプールされた凍結切片のセクション厚さも推奨されません。 RNA収量が所望のレベル以下である場合に、様々な戦略は、次のような回収増大させるために使用することができる：i）が可能な収率を増加させるために出発物質のミリグラム量を増加します。 ⅱ）組織の機械的均質化を改善するために、30ミクロン以下のセクションの厚さを減らします。 iii）の機械的および化学的な組織破壊を改善するために、有機抽出試薬のサンプルのインキュベーション及び針均質化の持続時間を増加させます。組織塊が残っている場合およびiv）、より厳密なニードル均質化第二抽出工程を行います。あるいは、そのような高いプロテオグリカン含量13のサンプルのための付加的な相分離及び沈殿工程のような組織特異的な考慮事項が存在し得ます。 RNAカラム精製の間に、より大きな溶出ボリュームを使用し、2回目の溶出を実施することができ、MAトータルRNA回収をximizeが、RNA濃度を犠牲に。ポストカラムアルコール沈殿は、低濃度のこの変更に懸念がある場合は、RNAを濃縮するために使用することができます。 RNAの分解は低温室、凍結切片14のRNase阻害剤を添加し、そして頻繁なニードル均質化工程を行い、切開、RNアーゼ暴露を最小限にするクライオスタット表面とツールのより厳密な洗浄中に凍結保存する時間を短縮する、という問題である場合RNaseを含まない溶液の交換は、それぞれ予防またはRNアーゼへの曝露を最小限にし、切断活性を低減するのを助けることができます。簡単に切開した後、RNase阻害剤で組織を浸すことが可能であるが、凍結保存の前に、さらなるサンプルの劣化を低減することができます。しかし、予備実験は、どのような治療は、凍結保存中に氷の結晶や他のアーティファクトを増加させないことを確実にするために実行する必要があります。 胚一方、ミオシン重鎖/コラーゲンVI間接免疫蛍光法は、損傷の筋肉分析のための一例として、ここで使用される、薄凍結切片を顕微鏡に取り付けられた後で免疫蛍光技術を含む凍結切片上で実施することができる任意の関連する組織学的染色のために使用することができ、これらの実験からスライド-fixationおよびヘマトキシリン/エオシン染色。確かに、ここで提供される単純な免疫プロトコルへの適応が必要になることがあります。例えば、マウス一次抗体（ 例えば、eMHC）を検出するために使用した抗マウス二次抗体は、標的組織における内因性のマウス免疫グロブリンを検出することができます。このような内因性抗体は、典型的には、バックグラウンドの免疫蛍光染色を引き起こして負傷したか、ジストロフィー筋損傷や壊死性筋線維に蓄積されます。 （省略一次抗体との）二次制御スライドは常に染色の特異性を評価するために検討すべきです。内因性抗体の背景に問題がある場合は、事前にブロックのステップがあるべきです内因性マウス免疫グロブリン15の検出を防止または最小限にするためのプロトコルに加えました。 この方法の主な制限は、クライオスタットを必要とすることであり、それは比較的低いスループットを行い、時間がかかり、あります。例えば、技術の専門家は、約9〜10時間でプールされた凍結切片および顕微鏡スライドのための16の筋肉（全16組織の重複部分を有する8スライド）まで処理することができました。凍結切片にする初心者のために、2〜4サンプルからプールされた凍結切片の回収が合理的にクライオスタット訓練し、1つまたは2つのプラクティスセッションの後に習得することができ、その代わりに、組織学のために品質の凍結切片を得ることはより多くの経験をしました。したがって、機器、時間、または訓練の要因は、手動乳棒ホモジナイザーで十分に均質化することができますより柔らかい組織のため、この方法はあまり有用で行うことができます。 非クライオスタット均質化法と比較して、横紋筋のRNAの調製sが筋肉16と、より最近では0.27筋17の1mg当たり1.08μgのRNAへの0.05〜0.7μgのRNAを事前ミリグラムのRNAの収量と筋肉生検から報告されています。したがって、ここで説明する手法は、対になった組織を可能にする追加の利点と同じくらい良いか非クライオスタットの方法よりも優れたRNA収量を提供するのと同じサンプルの連続した領域から分析します。特に、以前の研究では、椎体組織中で均質化するために凍結切片に使用され、同様に凍結切片の組織は、RNA単離の13のための均質化の効率を増強することを見出しました。この技術は、ウシ骨格筋サンプルで試験したときに、試料調製当たりの平均RNA収量は、ここで報告された13の正常範囲の低い端で、4.09±0.36μgのありました。レーザーキャプチャーマイクロダイセクションは、凍結切片からのRNA抽出のための組織の収集のための別の代替です。レーザーキャプチャは、このプールされた凍結切片法におけるよりも優れていますそれは特異性が部分から細胞の必要なサブセットのみを収集することができますし、それは、厚さ50μmの18までの単一の組織切片上で行うことができます。しかし、微小解剖サンプルの回収困難と適切な機器であることができるが、研究者にプールされた凍結切片の均質化がよりアクセスしやすく、広く利用可能ではありません。両方の方法が利用可能である場合にサブ領域分析はそれほど重要であり、RNAの高い量が必要な場合にプールされた凍結切片の均質化が最良であるが、唯一の小さなRNAの量を必要とするアプリケーションのための組織のサブ領域を分析するための設定は、レーザーキャプチャーマイクロダイセクションを好むだろう。 組織およびRNA単離方法は、ここでの焦点であるが、プールされた凍結切片法を容易にウェスタンブロット分析、または酵素活性の測定のためにタンパク質溶解物を調製するために適合されています。例えば、心臓からのプールされた凍結切片は、ウェスタンブロットのために可溶化した4 Aを分析ND TAからプールされた凍結切片は、ミトコンドリア機能5のコハク酸脱水素酵素活性アッセイのために均質化しました。あるいは、ゲノムDNAおよびタンパク質画分を、単一のクライオスタットセッションの後、単一の組織からのゲノムDNA、タンパク質、RNA、および組織学的測定値を導出する可能性を提供し、RNA単離の後、有機抽出中に他の相から分離することができます。 全体として、この方法の主な利点は、単一の組織から別の試料調製を必要とする複数の分析手法を可能にすることによって、実験的な柔軟性を高めることです。この方法は、筋肉と乳棒ベースの組織の均質化の効率を低下させる大規模な細胞内又は細胞外構造を持つ他の組織に最も適切です。

この技術の目的は、単一の小さな骨格筋ソース組織からアクセスでき、そのような組織学および遺伝子発現など異なるモダリティ、ことで、複数の実験的な分析を行うことです。顕微鏡アプリケーションを注意深く凍結保存中に氷晶アーチファクトの形成を制限するように制御されなければならないサンプルの保存方法に最も敏感です。したがって、この方法の開発は、部分的に免疫蛍光顕微鏡法および遺伝子発現の両方のための原料物質分析として-140℃の液体窒素冷却2-メチルブタン浴中で樹脂を埋め込んで被覆された凍結前脛骨（TA）筋に基づいています。 多様な技術的アプローチのために同一の原料物質を使用する必要性は、左右の筋肉が異なる条件、実験の1つずつの制御を表す筋肉内注射に基づく実験のために特に重要です。例えば、筋肉再生の研究で一μSCLEは反対側の筋肉がビヒクル注射対照1として機能する広範な組織の損傷を引き起こす毒素を注射します。同様に、筋疾患の遺伝子治療研究は、典型的には、反対側2の空ベクター、無関係ベクターまたはビヒクル対照と比較する筋肉内注射による遺伝子治療ベクターの検証で始まります。したがって、別のアプリケーションに各TA筋を供給することは不可能です。 この問題に対処するための一般的な戦略は次のとおりです。私は）ii）の追加のマウスを使用すること、またはiii）は、各アプリケーションのための筋肉の一部を遮断するために、アプリケーションごとに異なる筋肉群を使用します。しかし、筋群の間に実質的な差異は、それが困難な別個のアプリケーションからのデータを比較することを可能にする、追加の動物は費用を増加させ、他の選択肢が存在する場合、不十分正当化されます。異なるアプリケーションを調達するために解剖した後に筋肉を割ると、最良の選択肢の私ですnは多くの場合。しかし、筋肉片は、しばしば均質2-5のために液体窒素または機械的な粉砕技術の下で粉砕を使用するには小さすぎます。筋肉は、細胞外マトリックス及び収縮タンパク質を充填した高度に構造組織であるため、不十分な機械的な均質化は、その後のDNA、RNAまたはタンパク質の低い収率をもたらします。ここでの詳細な方法は、複数のアプリケーションで使用するための1つのソース筋からの組織の少量を可能にし、凍結切片と針粉砕を含めることは、より良好なRNAの収量のための機械的均質化を向上させます。

<table><tbody><tr><td>Cork</td><td>VWR Scientific</td><td>23420-708</td><td>Cut into small squares with a sharp blade.</td></tr><tr><td>Plastic coverslip</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-547</td><td>Used to orient the muscle during freezing.</td></tr><tr><td>Low temperature thermometer</td><td>VWR Scientific</td><td>89370-158</td><td></td></tr><tr><td>2-methylbutane</td><td>Sigma</td><td>M32631-4L</td><td>Caution: hazardous chemical. Store in flammable cabinet.</td></tr><tr><td>Embedding resin: &quot;cryomatrix&quot;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>6769006</td><td>Other embedding resins can be substituted for cryomatrix.</td></tr><tr><td>Cryostat</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>microm HM550 with disposable blade carrier</td><td>Any working cryostat should be sufficient for the protocol.</td></tr><tr><td>Disposable cryostat blade</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>3052835</td><td>Use an appropriate blade or knife for the cryostat to be used.</td></tr><tr><td>RNAse decontamination solution: &quot;RNase Zap&quot;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM9780</td><td></td></tr><tr><td>Analytical balance</td><td>Mettler Toledo</td><td>XS64</td><td></td></tr><tr><td>Paint brush</td><td>Daler Rowney</td><td>214900920</td><td>Use to handle cryosections. Can be found with in stores with simple art supplies.</td></tr><tr><td>Razor blade</td><td>VWR Scientific</td><td>55411-050</td><td></td></tr><tr><td>Microscope slide</td><td>VWR Scientific</td><td>48311600</td><td></td></tr><tr><td>RNA organic extraction reagent: TRIzol</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15596026</td><td>Caution: TRIzol is a hazardous chemical. Note: Only organic extraction reagents are recommended for RNA extraction from skeletal muscle.</td></tr><tr><td>18 gauge needle</td><td>VWR Scientific</td><td>BD305185</td><td></td></tr><tr><td>22 gauge needle</td><td>VWR Scientific</td><td>BD305155</td><td></td></tr><tr><td>26 gauge needle</td><td>VWR Scientific</td><td>BD305115</td><td>Optional. Can be used for a third round of sample trituration in the RNA extraction protocol.</td></tr><tr><td>1 ml syringe</td><td>VWR Scientific</td><td>BD309659</td><td>For very high value samples, a Luer-Lok syringe is recommended (&lt;i&gt;e.g.&lt;/i&gt;, VWR BD309628).</td></tr><tr><td>1-bromo-3-chloropentane (BCP)</td><td>Sigma</td><td>B9673</td><td></td></tr><tr><td>For 70% ethanol in DEPC water: 200 proof alcohol</td><td>Decon Laboratories, Inc.</td><td>+M18027161M</td><td>Mix 35 ml 200 proof alcohol + 15 ml DEPC water.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>For 70% ethanol in DEPC water: DEPC-treated water</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM9922</td><td>Mix 35 ml 200 proof alcohol + 15 ml DEPC water.</td></tr><tr><td>RNA purification kit: PureLink RNA minikit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12183018A</td><td>Final steps of RNA preparation.</td></tr><tr><td>DNase/Rnase-free water&amp;nbsp;</td><td>Gibco</td><td>10977</td><td>DEPC-treated water can also be used.</td></tr><tr><td>Spectrophotometer: Nanodrop 2000</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>NanoDrop 2000</td><td></td></tr><tr><td>Dnase I</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM2222</td><td>Treat purified RNA to remove any DNA contamination before downstream appications.</td></tr><tr><td>Hydrophobic pen</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>8899</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&#039;s PBS</td><td>Gibco</td><td>14190</td><td>PBS for immunofluorescence protocol.</td></tr><tr><td>Donkey serum</td><td>Jackson ImmunoResearch Laoratories, Inc</td><td>017-000-121</td><td>Rehydrate normal donkey serum stock according to the manufacturer&#039;s instructions, then dilute an aliquot to 5% for immunofluorescence.&amp;nbsp; Normal goat serum can also be used.</td></tr><tr><td>eMHC antibody</td><td>University of Iowa Developmental Studies Hybridoma Bank</td><td>F1.652</td><td></td></tr><tr><td>Collagen VI antibody</td><td>Fitzgerald Industries</td><td>#70R-CR009x</td><td></td></tr><tr><td>Donkey anti-rabbit AlexaFluor488</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A21206</td><td></td></tr><tr><td>Goat anti-mouse IgG1 AlexaFluor546</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A21123</td><td></td></tr><tr><td>DAPI (4&#039;,6-diamidino-2-phenylindole)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>Aqueous mounting media: Permafluor</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>TA-030-FM</td><td>Only use mounting media designed for fluorescent applications with anti-fade properties.</td></tr><tr><td>Glass coverslip</td><td>VWR Scientific</td><td>16004-314</td><td>Use for mounting slides at the end of immunofluorescence protocl</td></tr><tr><td>Image analysis software: ImageProExpress</td><td>Media Cybernetics, Inc.</td><td>Image-Pro Express, or more advanced products</td><td>Freeware ImageJ should also work for manual counting. More advanced software with segmentation abiities may allow partial automation of the process; &lt;em&gt;e.g.&lt;/em&gt;, ImageProPremier.</td></tr><tr><td>Merge and map section images: Photoshop</td><td>Adobe</td><td>Photoshop</td><td></td></tr><tr><td>Cardiotoxin</td><td>Sigma</td><td>C9659</td><td>Sigma C9659 has been discontinued. Other options for cardiotoxin are EMD Millipore #217503; American Custom Chemicals Corp. # BIO0000618; or Ge Script # RP17303; but these have not been validated.</td></tr><tr><td>reverse transcription kit: Superscript III First-strand synthesis system</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>18080051</td><td>Any validated, high quality reverse transcription reagents can be used.</td></tr><tr><td>Standard PCR: GoTaq Flexi polymerase system</td><td>Promega</td><td>M8298</td><td>Any validated, high quality Taq polymerase system can be used. If DNA sequencing is to be used for any application downstream of the PCR, then a high fidelity PCR system should be used instead.</td></tr><tr><td>SYBR green</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>S7585</td><td>For use in qPCR when not using a dedicated qPCR master mix. Use with SuperROX (for Applied Biosystems instruments) and GoTaq Flexi polymerase and buffers.</td></tr><tr><td>ROX: SuperROX, 15 mM</td><td>BioResearch Technologies, Inc. Novato CA</td><td>SR-1000-10</td><td>SuperROX is more stable in the PCR reaction, so it is preferred for use as a qPCR passive reference dye over ROX (carboxy-X-rhodamine). For qPCR with Applied Biosystems instruments</td></tr><tr><td>Real-time PCR</td><td>Applied Biosystems</td><td>7900HT</td><td></td></tr></tbody></table>

cryosectioning of contiguous regions of a single mouse skeletal muscle for gene expression and histological analyses

この方法では、連続した凍結切片は、単一のマウス骨格筋からの隣接領域を用いて、遺伝子発現のための組織の組織学とRNAの濃縮のための両方の顕微鏡アプリケーションを可能にするために収集されます。典型的には、それがバッファボリュームは、効率的な研削用途には低すぎるかもしれないので、まだ十分な機械的破壊することなく、小さな骨格筋サンプルの適切な均質化を達成するために挑戦され、緩衝剤の筋限界浸透の密集組織構造は、最終的に低いRNA収量を引き起こします。ここで報告されたプロトコルに従うことにより、30μmのセクションでは、収集され、バッファへの浸透のために露出表面積を増加させ、凍結切片およびその後の針均質化が筋肉を混乱させる機械的にできるようにプールしました。技術の主要な制限は、クライオスタットを必要とすることであり、それは比較的低いスループットです。しかし、高品質のRNAをプールし、Mの小さなサンプルから得られますuscle凍結切片は、多くの異なる骨格筋および他の組織のために、この方法は、アクセス可能にします。測定は直接実験的不確実性を低減し、のための小さな組織を供給するのに必要な複製の動物実験を低減するためにアプリケーション間で比較することができるように、また、この技術は、単一の骨格筋の隣接領域からの一致分析（ 例えば、組織の組織病理学および遺伝子発現）を可能にします複数のアプリケーション。

筋肉凍結切片のRNAは、品質が高く、ほとんどのアプリケーションのための十分な収量を提供します分析は、16骨格筋のRNA調製物を、8匹の対照マウスからプールした前脛骨（TA）筋の19.4〜41ミリグラムを用いて、 表1に示します。どちらの左（L）と右（R）TAの筋肉がメソッドを使用して、筋肉の損傷を引き起こすことが3日、生理食塩水または10μMのカルジオトキシンの25μlに縦筋肉内注射後に採取した筋肉で再生実験で調製したが、以前に1を報告しました 。 表1に示すように 、筋肉凍結切片のRNAのためのA260 / 280比は、典型的には、これらの代表的なサンプル中の2以上の近くにあります。 「純粋な」RNAは2.2 2.0〜A260 / 280 1.8のA260 / 280を有すると考えられているように、凍結切片のRNAサンプルの純度は9優れています。全RNAの回収は、一般的にオベました最下流のアプリケーションのために十分な材料を提供し、組織を開始1mg当たりの総RNAのμgの1を超えると0.18の収率でサンプルあたりrの10μgの。特に、RNA濃度、抽出した全RNA、および3日後に毒素傷害TA筋から始まる組織1mg当たりのRNA収量は、生理食塩水を注射したTAからよりも有意に高かったです。これは、筋肉の構造が広範囲の損傷によって、および/または筋再生3日に遺伝子の転写および/またはRNA安定性の増加があることが破壊されたときに改善された均質化が存在することを示唆しています。試料は18ヶ月間-20℃で保存した後のRNAの質の持続性は、単純な1×TAE /筋肉凍結切片のRNAの1マイクロリットルの1.5％アガロースゲル電気泳動によって評価しました。著名な18Sおよび28S rRNAバンドはあっても、次善の貯蔵条件（ 図1A）の下で、依然として高いRNAの品質を実証するサンプルで明らかです。 筋肉凍結切片のRNA下流のアプリケーションをサポートしていますプールされた凍結切片サンプルあたり1μgのRNAは、DNA分解酵素で処理し、オリゴdTプライマーから逆転写しました。 RNase処理の後、cDNAを逆転写の総容量は30μlでした。過剰増幅したシンプルな非定量的PCRは、cDNAの生存能力を確認するために実行されました。筋原性制御因子4（MRF4）、筋分化にアップレギュレートする転写因子は、標準的なPCRを用いて鋳型を2μlから、5&#39;-CTACATTGAGCGTCTACAGGACCおよびアンチセンス5&#39;-CTGAAGACTGCTGGAGGCTG 10を感知する 、以前に報告されたマウスのプライマーを用いて増幅しました。 RTのddH 2 O（なしRNA鋳型と逆転写）、またはのddH、（RNAが含まれていますが、無逆転写酵素）が左と右のTA cDNAサンプルの両方から234 bpのMRF4フラグメントの堅牢、特定の増幅があったが、RT-ありません2 O PCRコントロール（ 図1B）。同じ試料は、相対的な増幅およびリアルタイムPCRシステム上の受動蛍光リファレンスを使用してMRF4とmOaz1基準制御4定量化のために3回行いました。 MRF4はΔΔCT法4により算出し、生理食塩水を注射した左TA、と比較して毒素を注射した右TAで0.097倍で発現されました。これは3日、成熟した筋肉繊維11の損失による毒素損傷後の低MRF4式の以前の報告と同様です。定量的PCRのために凍結切片のRNAの整合性を比較するために、Ct値はmOaz1参照遺伝子について比較しました。平均Ctは36.332±3.61 RT-対照試料中のSD（N = 4）であったのに対し、6サンプルから、mOaz1転写物は、17.242±1.483 SDの平均Ctを用いて検出しました。サンプル全体のmOaz1のCt信号のタイトなグループ分けは、TA筋の凍結切片から単離されたRNAは、下流のRNA発現解析で期待どおりに実行することを示唆しています。 同腹仔対照マウスから7μmの前脛骨筋切片の間接的免疫蛍光染色の例には、3日間毒素注入後の再生繊維（ 図2）を検出することが示されています。両方のセクションは、より少ない近位筋の表面から4.5 4.6ミリメートルの深さのRNA分析のために使用される領域から150ミクロンよりも筋から収集しました。胚性ミオシン重鎖（eMHC、赤）の再生繊維、コラーゲンVIを検出する（、緑ColVI）は筋線維の概要を説明し、DAPIの汚れが濃縮された核浸潤（青信号）4.領域は毒素損傷の部位を示すプロトコルに従って、青色の核、eMHC正新たに再生筋細胞の活性化によって明らかなように。この例のようなセクション全体マップはembryoniの割合を計算することにより、再生の定量のために使用されています以前に1報告されているように、Cミオシン重鎖を発現する繊維（赤、新たに再生）または集中有核繊維。特に、 図2AのTA筋で驚くほど小さなダメージがあります。注射の間に変化があるが、図2（b）に示すように 、代表的な毒素の注射は、筋区画1のはるかに大きな割合に影響を与えます。したがって、この組織学的分析は、 図2Aの毒素損傷は最小限であり、隣接する筋肉凍結切片のRNAサンプルからの遺伝子発現データを解釈するための重要なツールを提供することを示唆しています。全筋肉が標準研削方法によって、RNA調製のために使用された場合、このサンプルの予想外に小さな損傷領域は、下流分析をゆがめることになる異常値になるだろう。代わりに、同じ筋肉から組織学的定量化をペアリングすることは、隣接するセクションからの傷害の程度を直接測定することができます。これは、院生の使用を可能にシオン/除外基準は、傷害のサイズに応じて分析最小損傷閾値またはRNAの正常化を満たす分析全てのサンプルは、下流のRNAに含まれていることを確認します。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/55058/55058fig1.jpg" /> 図1：プールされた筋肉凍結切片からのRNAの品質評価。 A）18Sおよび28SリボソームRNAバンドは、RNA調製した後、プール筋肉凍結切片を18ヶ月からのRNAに顕著です。逆転写次MRF4用B）非定量的PCR。 DNAラダーの200と300 bpのバンドが示されています。 RT-は、RNAテンプレートが、無逆転写酵素で逆転写反応を。 RT-H 2 O、のddH 2 O、無RNA鋳型と逆転写。これらの実験では、H 2 O、のddH 2 Oで鋳型なしPCR制御は、毒素は、右の前脛骨（RTA）および生理食塩水WAに注入しましたSは、左（LTA）に注入しました。 <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55058/55058fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/55058/55058fig2.jpg" /> 図2：筋肉再生の研究のための組織学的マップのサンプル。 、B）の3日間、貧困層の例（A）と、通常の（B）毒素誘導傷害を示す毒素注射後、単一の前脛骨筋切片のマップを作成。各セクションマップの白い四角で囲まれた領域は、高倍率の表示、レッド、胚性ミオシン重鎖のためのはめ込み画像として表示されます。緑、コラーゲンVI、細胞外マトリックスタンパク質、ブルー、DAPI核染色。スケールバーは100μm。 <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55058/55058fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a>。 <img alt="表1" src="/files/ftp_upload/55058/55058table1.jpg" /> 表1： プール筋肉凍結切片からの代表的なRNA収量と純度の測定。十六前脛骨（TA）筋を凍結切片試料をRNAのために処理した切片とプールしました。精製されたRNA（1μl）をnanospectrophotometerで分析しました。カラム統計はスプレッドシートで行った、グループの比較は、統計ソフトウェアを用いて行きました。

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Cryosectioning of Contiguous Regions of a Single Mouse Skeletal Muscle for Gene Expression and Histological Analyses

連続凍結切片を、単一のマウス骨格筋からの隣接領域を用いた遺伝子発現の測定のための組織学的応用およびRNAの濃縮を可能にするために収集されます。直接アプリケーション間で比較され、プールされた凍結切片と測定30mgの - 高品質のRNAが20から得られます。

遺伝子発現と組織学的分析のためにシングルマウス骨格筋の連続領域の凍結切片化

With this method, consecutive cryosections are collected to enable both microscopy applications for tissue histology and enrichment of RNA for gene ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

15.6K ビュー.  University of Georgia. 連続凍結切片を、単一のマウス骨格筋からの隣接領域を用いた遺伝子発現の測定のための組織学的応用およびRNAの濃縮を可能にするために収集されます。直接アプリケーション間で比較され、プールされた凍結切片と測定30mgの - 高品質のRNAが20から得られます。 

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Non-Laser Capture Microscopy Approach for the Microdissection of Discrete Mouse Brain Regions for Total RNA Isolation and Downstream Next-Generation Sequencing and Gene Expression Profiling

As technological platforms, approaches such as next-generation sequencing, microarray, and qRT-PCR have great promise for expanding our understanding of the breadth of molecular regulation. Newer approaches such as high-resolution RNA sequencing (RNA-Seq)1 provides new and expansive information about tissue- or state-specific expression such as relative transcript levels, alternative splicing, and micro RNAs2-4. Prospects for employing the RNA-Seq method in comparative whole transcriptome profiling5 within discrete tissues or between phenotypically distinct groups of individuals affords new avenues for elucidating molecular mechanisms involved in both normal and abnormal physiological states. Recently, whole transcriptome profiling has been performed on human brain tissue, identifying gene expression differences associated with disease progression6. However, the use of next-generation sequencing has yet to be more widely integrated into mammalian studies.
Gene expression studies in mouse models have reported distinct profiles within various brain nuclei using laser capture microscopy (LCM) for sample excision7,8. While LCM affords sample collection with single-cell and discrete brain region precision, the relatively low total RNA yields from the LCM approach can be prohibitive to RNA-Seq and other profiling approaches in mouse brain tissues and may require sub-optimal sample amplification steps. Here, a protocol is presented for microdissection and total RNA extraction from discrete mouse brain regions. Set-diameter tissue corers are used to isolate 13 tissues from 750-&mu;m serial coronal sections of an individual mouse brain. Tissue micropunch samples are immediately frozen and archived. Total RNA is obtained from the samples using magnetic bead-enabled total RNA isolation technology. Resulting RNA samples have adequate yield and quality for use in downstream expression profiling. This microdissection strategy provides a viable option to existing sample collection strategies for obtaining total RNA from discrete brain regions, opening possibilities for new gene expression discoveries.

Non-Laser Capture Microscopy Approach for the Microdissection of Discrete Mouse Brain Regions for Total RNA Isolation and Downstream Next-Generation Sequencing and Gene Expression Profiling  |

RNA expression profiling of discrete mouse brain regions requires a precise and repeatable tissue collection strategy. A protocol that uses both coronal brain sectioning and tissue corer-assisted microdissection is described here. The yield and quality of total RNA obtained from the resulting samples confirms the utility of the outlined method.

トータルRNAの単離およびダウンストリーム次世代シーケンシングと遺伝子発現プロファイリングのための離散マウスの脳領域のマイクロダイセクションのための非レーザーキャプチャー顕微鏡のアプローチ

As technological platforms, approaches such as next-generation sequencing, microarray, and qRT-PCR have great promise for expanding our understanding of ...

神経科学

Laser Capture Microdissection of Mouse Embryonic Cartilage and Bone for Gene Expression Analysis

Laser capture microdissection (LCM) is a powerful tool to isolate specific cell types or regions of interest from heterogeneous tissues. The cellular and molecular complexity of skeletal elements increases with development. Tissue heterogeneity, such as at the interface of cartilaginous and osseous elements with each other or with surrounding tissues, is one obstacle to the study of developing cartilage and bone. Our protocol provides a rapid method of tissue processing and isolation of cartilage and bone that yields high quality RNA for gene expression analysis. Fresh frozen tissues of mouse embryos are sectioned and brief cresyl violet staining is used to visualize cartilage and bone with colors distinct from surrounding tissues. Slides are then rapidly dehydrated, and cartilage and bone are isolated subsequently by LCM. The minimization of exposure to aqueous solutions during this process maintains RNA integrity. Mouse Meckel&rsquo;s cartilage and mandibular bone at E16.5 were successfully collected and gene expression analysis showed differential expression of marker genes for osteoblasts, osteocytes, osteoclasts, and chondrocytes. High quality RNA was also isolated from a range of tissues and embryonic ages. This protocol details sample preparation for LCM including cryoembedding, sectioning, staining and dehydrating fresh frozen tissues, and precise isolation of cartilage and bone by LCM resulting in high quality RNA for transcriptomic analysis.

This protocol describes laser capture microdissection for the isolation of cartilage and bone from fresh frozen sections of the mouse embryo. Cartilage and bone can be rapidly visualized by cresyl violet staining and collected precisely to yield high quality RNA for transcriptomic analysis.

遺伝子発現解析のためのマウス胚軟骨と骨のレーザー捕捉微小分片

Laser capture microdissection (LCM) is a powerful tool to isolate specific cell types or regions of interest from heterogeneous tissues. The cellular and ...

発生生物学

The Neuromuscular Junction: Measuring Synapse Size, Fragmentation and Changes in Synaptic Protein Density Using Confocal Fluorescence Microscopy

The neuromuscular junction (NMJ) is the large, cholinergic relay synapse through which mammalian motor neurons control voluntary muscle contraction. Structural changes at the NMJ can result in neurotransmission failure, resulting in weakness, atrophy and even death of the muscle fiber. Many studies have investigated how genetic modifications or disease can alter the structure of the mouse NMJ. Unfortunately, it can be difficult to directly compare findings from these studies because they often employed different parameters and analytical methods. Three protocols are described here. The first uses maximum intensity projection confocal images to measure the area of acetylcholine receptor (AChR)-rich postsynaptic membrane domains at the endplate and the area of synaptic vesicle staining in the overlying presynaptic nerve terminal. The second protocol compares the relative intensities of immunostaining for synaptic proteins in the postsynaptic membrane. The third protocol uses Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) to detect changes in the packing of postsynaptic AChRs at the endplate. The protocols have been developed and refined over a series of studies. Factors that influence the quality and consistency of results are discussed and normative data are provided for NMJs in healthy young adult mice.

The neuromuscular junction (NMJ) is altered in a variety of conditions that can sometimes culminate in synaptic failure. This report describes fluorescence microscope-based methods to quantify such structural changes.

神経筋接合部：測定シナプスサイズ、断片化および共焦点蛍光顕微鏡を用いてシナプスタンパク質の密度の変化

The neuromuscular junction (NMJ) is the large, cholinergic relay synapse through which mammalian motor neurons control voluntary muscle contraction. ...

Do's and Don'ts in the Preparation of Muscle Cryosections for Histological Analysis

Histological evaluation of muscle biopsies has served as an indispensable tool in the understanding of the development and progression of pathology of neuromuscular disorders. However, in order to do so, proper care needs to be taken when excising and preserving tissues to achieve optimal staining. One method of tissue preservation involves fixing tissues in formaldehyde and then embedding them with paraffin wax. This method preserves morphology well and allows for long-term storage at RT but is cumbersome and requires handling of toxic chemicals. Further, formaldehyde fixation results in antigen cross-linking, which necessitates antigen retrieval protocols for effective immunostaining. On the contrary, frozen sectioning does not require fixation and thus retains biological antigen conformation. This method also provides a distinct advantage in quick turn around time, making it especially useful in situations needing quick histological evaluation like intraoperative surgical biopsies. Here we describe the most effective method of preparing muscle biopsies for visualization with different histological and immunological stains.

Here we demonstrate the most efficient methods for freezing, embedding, cryosectioning, and staining of muscle biopsies to avoid freezing artifacts.

組織学的分析のために筋肉凍結切片の調製でのやっていいことといけないことを行います

Histological evaluation of muscle biopsies has served as an indispensable tool in the understanding of the development and progression of pathology of ...

医学

Simultaneous Cryosectioning of Multiple Rodent Brains

Histology and immunohistochemistry are routine methods of analysis to visualize microscopic anatomy and localize proteins within biological tissue. In neuroscience, as well as a plethora of other scientific fields, these techniques are used. Immunohistochemistry can be done on slide mounted tissue or free-floating sections. Preparing slide-mounted samples is a time intensive process. The following protocol for a technique, called the Megabrain, reduced the time taken to cryosection and mount brain tissue by up to 90% by combining multiple brains into a single frozen block. Furthermore, this technique reduced variability seen between staining rounds, in a large histochemical study. The current technique has been optimized for using rodent brain tissue in downstream immunohistochemical analyses; however, it can be applied to different scientific fields that use cryosectioning.

Here, we present a protocol to freeze and section brain tissue from multiple animals as a timesaving alternative to processing single brains. This reduces staining variability during immunohistochemistry and reduces time cryosectioning and imaging.

複数の齧歯動物の頭脳の同時セクショニング

Histology and immunohistochemistry are routine methods of analysis to visualize microscopic anatomy and localize proteins within biological tissue. In ...

Microdissection of Mouse Brain into Functionally and Anatomically Different Regions

The brain is the command center for the mammalian nervous system and an organ with enormous structural complexity. Protected within the skull, the brain consists of an outer covering of grey matter over the hemispheres known as the cerebral cortex. Underneath this layer reside many other specialized structures that are essential for multiple phenomenon important for existence. Acquiring samples of specific gross brain regions requires quick and precise dissection steps.&#160;It is understood that at the microscopic level, many sub-regions exist and likely cross the arbitrary regional boundaries that we impose for the purpose of this dissection.
Mouse models are routinely used to study human brain functions and diseases. Changes in gene expression patterns may be confined to specific brain areas targeting a particular phenotype depending on the diseased state. Thus, it is of great importance to study regulation of transcription with respect to its well-defined structural organization. A complete understanding of the brain requires studying distinct brain regions, defining connections, and identifying key differences in the activities of each of these brain regions. A more comprehensive understanding of each of these distinct regions may pave the way for new and improved treatments in the field of neuroscience. Herein, we discuss a step-by-step methodology for dissecting the mouse brain into sixteen distinct regions. In this procedure, we have focused on male mouse C57Bl/6J (6-8 week old) brain removal and dissection into multiple regions using neuroanatomical landmarks to identify and sample discrete functionally-relevant and behaviorally-relevant&#160;brain regions. This work will help lay a strong foundation in the field of neuroscience, leading to more focused approaches in the deeper understanding of brain function.

We present a hands-on, step-by-step, rapid protocol for mouse brain removal and dissection of discrete regions from fresh brain tissue. Obtaining brain regions for molecular analysis has become routine in many neuroscience labs. These brain regions are immediately frozen to obtain high quality transcriptomic data for system level analysis.

機能的および解剖学的に異なる領域へのマウス脳の微小解剖

The brain is the command center for the mammalian nervous system and an organ with enormous structural complexity. Protected within the skull, the brain ...

Cryosectioning Method for Microdissection of Murine Colonic Mucosa

The colonic mucosal tissue provides a vital barrier to luminal antigens. This barrier is composed of a monolayer of simple columnar epithelial cells. The colonic epithelium is dynamically turned over and epithelial cells are generated in the stem cell containing crypts of Lieberk&#252;hn. Progenitor cells produced in the crypt-bases migrate toward the luminal surface, undergoing a process of cellular differentiation before being shed into the gut lumen. In order to study these processes at the molecular level, we have developed a simple method for the microdissection of two spatially distinct regions of the colonic mucosa; the proliferative crypt zone, and the differentiated surface epithelial cells. Our objective is to isolate specific crypt and surface epithelial cell populations from mouse colonic mucosa for the isolation of RNA and protein.

Here we describe a simple method for the isolation of spatially distinct murine colonic epithelial surface cells from the underlying crypt-base cells.

マウス結腸粘膜の顕微解剖のための凍結切片法

The colonic mucosal tissue provides a vital barrier to luminal antigens. This barrier is composed of a monolayer of simple columnar epithelial cells. The ...

生物学

Fiber Type and Subcellular-Specific Analysis of Lipid Droplet Content in Skeletal Muscle

Skeletal muscle lipid infiltration, known as myosteatosis, increases with obesity and ageing. Myosteatosis has also recently been discovered as a negative prognostic factor for several other disorders such as cardiovascular disease and cancer. Excessive lipid infiltration decreases muscle mass and strength. It also results in lipotoxicity and insulin resistance depending on total intramyocellular lipid content, lipid droplet (LD) morphology, and subcellular distribution. Fiber type (oxidative vs glycolytic) is also important, since oxidative fibers have a greater capacity to utilize lipids. Because of their crucial implications in pathophysiology, in-depth studies on LD dynamics and function in a fiber type-specific manner are warranted.
Herein, a complete protocol is presented for the quantification of intramyocellular lipid content and analysis of LD morphology and subcellular distribution in a fiber type-specific manner. To this end, serial muscle cryosections were stained with the fluorescent dye Bodipy and antibodies against myosin heavy chain isoforms. This protocol enables the simultaneous processing of different muscles, saving time and avoiding possible artifacts and, thanks to a personalized macro created in Fiji, the automatization of LD analysis is also possible.

Increasing evidence indicates that excessive infiltration of lipids inside skeletal muscle results in lipotoxicity and diabetes. Here, we present a complete protocol, including tissue processing, staining with Bodipy, image acquisition, and analysis, to quantify the size, density, and subcellular distribution of lipid droplets in a fiber-type specific manner.

骨格筋中の脂肪滴含量の線維タイプおよび細胞下特異的分析

Skeletal muscle lipid infiltration, known as myosteatosis, increases with obesity and ageing. Myosteatosis has also recently been discovered as a negative ...

A Laser Capture Microdissection Protocol That Yields High Quality RNA from Fresh-frozen Mouse Bones

RNA yield and integrity are decisive for RNA analysis. However, it is often technically challenging to maintain RNA integrity throughout the entire laser capture microdissection (LCM) procedure. Since LCM studies work with low amounts of material, concerns about limited RNA yields are also important. Therefore, an LCM protocol was developed to obtain sufficient quantity of high-quality RNA for gene expression analysis in bone cells. The effect of staining protocol, thickness of cryosections, microdissected tissue quantity, RNA extraction kit, and LCM system used on RNA yield and integrity obtained from microdissected bone cells was evaluated. Eight-&#181;m-thick frozen bone sections were made using an adhesive film and stained using a rapid protocol for a commercial LCM stain. The sample was sandwiched between a polyethylene terephthalate (PET) membrane and the adhesive film. An LCM system that uses gravity for sample collection and a column-based RNA extraction method were used to obtain high quality RNAs of sufficient yield. The current study focusses on mouse femur sections. However, the LCM protocol reported here can be used to study in situ gene expression in cells of any hard tissue in both physiological conditions and disease processes.

A laser capture microdissection (LCM) protocol was developed to obtain sufficient quantity of high-quality RNA for gene expression analysis in bone cells. The current study focusses on mouse femur sections. However, the LCM protocol reported here can be used to study gene expression in cells of any hard tissue.

新鮮な凍結マウスの骨から高品質のRNAを得るレーザー捕捉微解剖プロトコル

RNA yield and integrity are decisive for RNA analysis. However, it is often technically challenging to maintain RNA integrity throughout the entire laser ...

可変長マウス筋線維の酵素的単離と特性評価

Intact Short, Intermediate, and Long Skeletal Muscle Fibers Obtained by Enzymatic Dissociation of Six Hindlimb Muscles of Mice: Beyond Flexor Digitorum Brevis

Skeletal muscle fibers obtained by enzymatic dissociation of mouse muscles are a useful model for physiological experiments. However, most papers deal with the short fibers of the flexor digitorum brevis (FDB), which restrains the scope of results dealing with fiber types, limits the amount of biological material available, and impedes a clear connection between cellular physiological phenomena and previous biochemical and dynamical knowledge obtained in other muscles.
This paper describes how to obtain intact fibers from six muscles with different fiber type profiles and lengths. Using C57BL/6 adult mice, we show the muscle dissection and fiber isolation protocol and demonstrate the suitability of the fibers for Ca2+ transient studies and their morphometric characterization. The fiber type composition of the muscles is also presented. When dissociated, all muscles rendered intact, living fibers that contract briskly for more than 24 h. FDB gave short (&#60;1 mm), peroneus digiti quarti (PDQA) and peroneus longus (PL) gave intermediate (1-3 mm), while extensor digitorum longus (EDL), extensor hallucis longus (EHL), and soleus muscles released long (3-6 mm) fibers.
When recorded with the fast dye Mag-Fluo-4, Ca2+ transients of PDQA, PL, and EHL fibers showed the fast, narrow kinetics reminiscent of the morphology type II (MT-II), known to correspond to type IIX and IIB fibers. This is consistent with the fact that these muscles have over 90% of type II fibers compared with FDB (~80%) and soleus (~65%). Moving beyond FDB, we demonstrate for the first time the dissociation of several muscles, which render fibers spanning a range of lengths between 1 and 6 mm. These fibers are viable and give fast Ca2+ transients, indicating that the MT-II can be generalized to IIX and IIB fast fibers, regardless of their muscle source. These results increase the availability of models for mature skeletal muscle studies.

著者スポットライト:線維タイプ間の興奮収縮結合を研究するためのマウス後肢筋からの長筋線維の分離

We describe a protocol to obtain enzymatically dissociated fibers of different lengths and types from six muscles of adult mice: three of them already described (flexor digitorum brevis, extensor digitorum longus, soleus) and three of them successfully dissociated for the first time (extensor hallucis longus, peroneus longus, peroneus digiti quarti).

マウスの6つの後肢筋の酵素的解離によって得られた無傷の短、中、および長の骨格筋線維:指屈筋を超えて

Skeletal muscle fibers obtained by enzymatic dissociation of mouse muscles are a useful model for physiological experiments. However, most papers deal ...