The authors thank the Canadian Blood Services for a Graduate Fellowship Program Award to T.N.T. This research received financial support from the Canadian Blood Services' Centre for Innovation, funded by the federal government (Health Canada) and the provincial and territorial ministries of health. The views herein do not reflect the views of the federal, provincial, or territorial governments in Canada.

研究倫理委員会/機関審査委員会によるヒト試料の使用の承認を取得し、すべてのヒトのドナーから署名された同意を得ます。 MMAは、動物用倫理承認以下、人間のアッセイと同様に、マウスのPBMCを使用して行うことができます。 MMAは、無菌の組織培養技術を利用します。 メモ： 図1を参照してください。 注：我々は方法が唯一の「短期」とは、培養法であるとして、無菌技術を維持するために、アッセイ中にレベル2生物学的封じ込めのキャビネットを使用することをお勧めしますが、細菌がアッセイを汚染するため、実際に十分な時間がありません。したがって、レベル2の生物学的封じ込めキャビネットが存在するだけではなく、このアッセイのためにいずれかを購入していない場合、アッセイはオープンベンチに、生物学的封じ込めキャビネットの外で行うことができました。 5％CO 2で37℃のインキュベーターの使用は、しかしながら、オプションではなく、使用しなければなりません最適な結果を得ます。 1.末梢血単核細胞の単離<ol><li>健康なドナーまたは酸 - クエン酸 - デキストロース（ACD）抗凝固剤（黄色のトップチューブ）を含むバキュテナーを使用して静脈穿刺を介して患者からのヒト全血を取得します。 注記：全血を、次のステップ11に進む前に、最大36時間、室温（18~22℃）でACDに格納することができます。通常は、全血の1-2 10-mLの真空採血管は、アッセイのために十分です。 </li><li>暖かい完全RPMI培地中で1 V / V（RPMI-1640は、10％ウシ胎児血清、20mMのHEPES、0.01ミリグラム/ mlのゲンタマイシンを補充した）全血1に希釈します。 </li><li>製造業者によって推奨されるように（材料のリストを参照）、密度勾配遠心分離を用いて希釈した全血から末梢血単核細胞（PBMC）を単離します。 （室温に加温し、18-22℃）で密度勾配上で非常にゆっくりと希釈した血液をレイヤ。 注：ミクシィの量を最小限に抑えます慎重に滴下様式で血液混合物を積層することによってまたはピペットを用いて、血液の最適分離するためのインタフェースでngの。 <ol><li>血液混合物をゆっくりと密度勾配の近くにピペットチップを配置することにより、非常にゆっくりとチューブの側面を下に実行するために血液混合物を可能にすることによって、密度勾配の上部を上に層を許可します。 </li><li>実験の規模に応じて、50ミリリットルの濃度勾配の15ミリリットルの上に密度勾配の3ミリリットル（15 mLチューブ内）または血液混合物の層を35mLの上に血液混合物の層を10mL（チューブ）。一般的に、全血10mLのは、いくつかのドナーへのドナーの変動で、千万のPBMCをもたらします。 注：これは、密度勾配と血液混合物のない混合が存在しないことが非常に重要です。血液混合物は、密度勾配を超える層と、すべての血液が密度勾配の上になるまでゆっくりと上昇する必要があります。 </li><li>ブレーキなしで30分間、700×gで層状混合物を遠心分離します。 CENTR血漿、バフィーコート（のPBMCを含む）、密度勾配材料、顆粒球、および赤血球：ifuged混合物は、（上から下へ）5層に分離する必要があります。 </li><li>削除し、プラズマの大部分を破棄し、慎重にパスツールピペットと吸引バルブを使用して、新しい15 mLチューブにバフィーコート（PBMC）コンテンツを取得します。 注：バフィーコート層の除去を効果的に層の外側の周りの円運動を行いながら、チューブに対するピペットの先端で、パスツールピペットで吸引を適用することによって行われます。 </li></ol></li><li>洗浄の間に（フルブレーキで）10分間、350×gで遠心分離することによって単離されたPBMCをpH7.3のリン酸緩衝生理食塩水（PBS）で3回洗浄します。完全RPMI培地中でPBMCペレットを再構成します。ペレットの大きさに応じて、メディアの3-7 mLで十分です。 </li><li>トリパンブルーおよび血球計数器を使用してPBMCを数えます。トリパンブルーで染色されていないこれらの細胞のみをカウントします。 Reconstitut完全RPMI培地中1,750,000細胞/ mLに電子のPBMC。 </li><li> 8チャンバースライドの各ウェルにシード400μL（70万細胞）。 37℃で、完全に加湿した組織培養インキュベーター中でスライドをインキュベート単球/マクロファージが付着できるようにするために1時間（5％CO 2を補充しました）。 </li></ol> 2.付着した単球の前処理注：食作用を阻害または増強する方法を模索している場合、このステップが必要なだけです。 <ol><li>前処理は、関心のある任意の薬剤（複数可）または化合物（複数可）で単球を接着しました。完全RPMI培地を用いて、所望の濃度の薬剤（単数または複数）または他の試験材料を再構成します。 注：例えば、IVIG200μgの/ mLのは、典型的には、ヒト単球を使用した場合、食作用の95％〜100％阻害を得るために使用されます。 </li><li>吸引は（ステップ1.6の後に）1時間のインキュベーションの後、8チャンバースライドから任意の非付着細胞を含む上清を廃棄し。 400と交換してください薬物または他の治療のμL、37℃で1時間インキュベートします。 <ol><li> 8チャンバースライド中の溶液を吸引し、交換するときは、弱く付着した細胞は持ち上げないように、流体の流れを制御するようにしてください。また、一度に2-3空のウェルと協力し、ウェルを乾燥させないようにしてください。 注：典型的には、各処理は、技術的な三連で実施されます。 </li></ol></li></ol> 3. R 2 R 2赤血球のオプソニン化を注：ここで使用されるR 2、R 2は、採血センター（カナダ血液サービス）から取得されますが、彼らはまた、市販されています。オプソニンR 2 R 2 RBCをのFcγR媒介性食作用の陽性対照として使用されています。ナイーブR 2、R 2は、1ヶ月まで4℃で（貯蔵寿命を延ばすために）Alseverの溶液中に保存されるべきです。 Alseverのソリューションは、社内で作られ、0.8で構成されています％/ vのクエン酸三ナトリウム（二水和物）、1.9％W / Vのデキストロース、W 0.42％/ vの塩化ナトリウム、および0.05％W / Vクエン酸（一水和物）wです。 R 2 R 2セルが利用可能でない場合、例えば、R 1、R 2、R 1、R 1、R 1、R、またはR 2、Rのような他のRh表現型細胞を使用することができます。 <ol><li> PBSで洗浄R 2 R 2（CDE / CDE）赤血球5分間、350×gの遠心分離を用いて3回の合計。 注：必要なRBCの量は実験的なサイズに依存し、逆算することができます。赤血球が原因で溶解または上清を除去する際に、各洗浄中に失われているので、常に、RBCの過剰量を洗います。たとえば、5トリートメント、2コントロール、技術的な三重で行われ、すべてを用いた実験では、21ウェルの合計があります。 400μL/ウェルの1.25％RBC混合物との21ウェルは、パックの105μLは、RBCが必要とされるオプソニン化することを示しています。 200 RBCのμLが最初に洗浄する必要がありますし、150＆＃181; Lは、食作用のステップのためのRBCのに十分な量があることを確認するためにオプソニン化する必要があります。 </li><li>ヒト血清から1 V / Vポリクローナル抗D抗体と断続的に混合して、37℃で1時間インキュベートする：1で洗浄し、R 2 R 2ペレットをオプソニン化。 注：ポリクローナル抗D抗体が利用できない場合、市販されているモノクローナル抗D抗体、または血液銀行または輸血から得ることができ、通常のRh免疫予防のために使用された抗Dを使用することが可能ですサービスを提供しています。アッセイを設定するとき、および未力価ポリクローナル抗体の多くを切り替えるたびに、またはモノクローナル抗体への切り替えを最適化試験は、初めに行われるべきです。これは、抗グロブリン試験3+間4+とカウント100単球あたり70から90の間の貪食RBCの食作用の結果の（IAT）結果のために必要な最適濃度または抗Dのボリュームを識別することです。 </li><li>オプソニン化を洗いますDのR 2、R 2、5分ごとに350×gで遠心分離を用いてPBS中で3回の合計。 注：R 2 R 2の成功オプソニン間接IATを実行することによって確認することができます。簡単に言えば、二次ポリクローナル抗ヒト抗体はRBCの表面上の主要なオプソニン抗体を結合するために添加され、増幅された信号は、血球凝集の形で観察することができます。詳細な製造業者のプロトコルは、補足資料ファイルに記載されています。 </li><li> 1.25％v / vの完全RPMI培地を使用する洗浄R 2 R 2ペレットを再構成します。 注：過剰オプソニンR 2、R 2は、一週間まで4℃でAlseverの溶液中で保存することができます。 </li></ol> 4.のFc受容体媒介食作用<ol><li> 8チャンバースライドからの薬物または中上清を吸引除去し、1.25％v / vのR 2 R 2混合物の400μLを追加します。 2時間37℃でインキュベートします。 </li><li>アフトえーインキュベーションの2時間、メーカーのアダプタを使用してチャンバを削除します。ペーパータオルで余分なR 2 R 2をオフに軽くたたきます。スライドが乾燥しないことを確認してください。 </li><li> PBSで100 mLビーカーを埋めます。水没し、ゆっくりと未貪食R 2 R 2の大部分を除去するために、前後（30-40ストローク付近）スライドを移動させることにより、スライドを洗います。 </li><li> PBSからスライドを削除してください。ペーパータオルやティッシュ、空気乾燥スライドを使用して過剰のPBSをオフに軽くたたきます。 </li><li> 45秒間、100％メタノール中で空気乾燥したスライドを修正しました。次に、固定されたスライドを空気乾燥させます。 注：スライドは、グリュンワルド・ギムザ染色21またはライト・ギムザ染色22として、下流の染色のためのより多くの互換性のある別の方法を使用して固定することができます。 </li><li>インハウスメイドELVANOLマウンティング培地（または他の市販の封入剤）を使用してスライドをマウントし、カバースリップを追加します。 注：エルバノール封入剤は経口w / vの15％で構成されていますlyvinylアルコール樹脂、PBS中30％（v / v）のグリセリン。すべての樹脂が溶解するまで混合物を加熱し、グリセリンを均質に混合します。これは、他の市販のマウンティング培地と交換することができます。 </li><li>マウントは定量化する前に一晩乾燥することができます。 </li></ol>貪食の5定量<ol><li>位相差顕微鏡および40Xの対物レンズを使用して、手動で少なくとも200単球およびそれらの単球内の貪食R 2 R 2の数をカウントすることによって食イベントの量を定量化します。同時に、単球の数と貪食R 2 R 2の数を定量化するためにそれぞれの手で1カウンターを持っています。 </li><li>単球数によって貪食R 2 R 2の数を割り、100 Expressの平均（SEM）の平均±標準誤差としてデータ（平均貪食指数）を乗じて平均貪食インデックスを取得します。 </li&gt; </ol>

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</ol>

The authors have nothing to disclose.

MMAは、組織培養および顕微鏡の両方の専門知識を必要とする面倒な手法です。成功を確実にするには、いくつかの重要なステップがあります：単球、単層の1）の生成は、 RBCの2）オプソニン化、および3）マニュアル定量化。単球の単層は、チャンバースライドに非常に強く付着しないので、生理的pHは、アッセイ11を通じて維持されなければならないとPBMCの十分な数が播種されるべきです。接着した細胞を乱す可能性があり、激しいピペッティングは、避けるべきです。一つのアプローチは常に削除して、チャンバーの同じコーナーからソリューションを追加し、動きがゆっくりと着実であることを保証することです。同様に、過剰な赤血球を除去するための最後の洗浄工程の間に、動きがゆっくりと着実にする必要があります。まだ未貪食RBCの大部分を除去しながらこれは、単層に最小限の妨害を保証します。不十分な洗浄は、手動の資格を行い、混入RBCの高いバックグラウンド、につながりますntification難しいです。第二に、R 2、R 2 RBCが十分に貪食制御のための80から120までの平均貪食インデックスを取得するためにオプソニン化する必要があります。この目的の食作用範囲はカウントのしやすさとのバランスを打つと統計分析のための食作用の十分な量を維持する（ 例えば、5つ以上の単球は、赤血球を正確に定量化することは困難である貪食しました）。オプソニン作用の程度は、IATによって確認することができ、4+ 3+との間の読み取りが必要です。 R 2、R洗浄の間の過剰な溶解があるとき上清は暗赤色に変わったら、または食作用の有意な減少は、ストレージ内の細胞の老化に起因する実験で観察されたときに2個のRBCは、破棄されるべきです。最後に、顕微鏡を使用して手動定量は、実験室の担当者の間や実験間でカウントを比較する場合は特に、注意が必要です。各ウェルに同じフィールドを調べることによって、または単により多くの細胞を計数することによってより一貫性のある数を得ることができます。経験豊富な技術とトレーニング用スライドの指定されたセットを使用したサイド・バイ・サイドのトレーニングが推奨されます。 MMAの主要な批判は、手動の定量化ステップの主観です。しかし、適切な訓練で、一貫性が異なるカウンタ渡って得ることができます。別の制限は、ヒト試料を扱うデータ変動の源である2 R 2表面抗原の発現レベルを、単球食作用能力およびRにおいて内因性のドナーからドナーの違いです。 他の代替技術は、FcγRを媒介食作用を調べるために利用可能です。市販のキットの大部分は、食作用をモニターするための蛍光出力を利用して（ 例えば、生体粒子、pH感受性蛍光タンパク質、またはIgG標識蛍光ラテックスビーズ）。蛍光出力の使用は、より客観的な定量化を提供しますが、1はまた、コンする必要があります可用性、コスト、および蛍光顕微鏡やフローサイトメーターと同様に、市販のキットの際に後続依存の使用に関連するトレーニングサイダー。 最後に、このアッセイは、研究の質問に応じて変更することができます。食作用の薬物阻害をテストする場合、例えば、単球を前処理することができるいずれかまたは薬物およびオプソニン化赤血球（ すなわち、競合アッセイ）の両方と共培養しました。異なるサブタイプ、キメラ抗体、または組換え構築物の抗体の下流のシグナル伝達も試験することができます。普遍的抗原ヌル血液24の開発における最近のブレークスルーでは、MMAは、食作用を誘発における低下効果が実際に存在するかどうかを評価するために様々な抗体を用いたこれらの抗原ヌルRBCの初期画面で利用することができます。

The monocyte monolayer assay (MMA) is an in vitro assay originally developed to better predict blood transfusion outcomes in patients with auto- or alloantibodies to red blood cells (RBCs)1-5. By assessing the effect of anti-RBC antibodies in mediating Fc&#947; receptor (Fc&#947;R)-mediated phagocytosis using this in vitro assay, it is possible to predict the clinical outcome in vivo. Indeed, the MMA has been used successfully to avoid immune destruction of antibody-bound RBCs, despite the transfusion of serologically incompatible blood5. The typical pre-transfusion procedure for compatibility testing, also termed crossmatching, involves serological methods that include typing the patient's blood for ABO and Rh antigens and screening for the presence of anti-RBC antibodies in the patient6. Blood matched for ABO/Rh is selected, and if antibodies are present, an attempt to identify them is made so that blood for transfusion can be further selected to avoid these antigens. An ideal crossmatch result occurs when all donor blood is serologically compatible with the patient's blood, which reduces the risk of post-transfusion hemolysis7. However, this system falls short for the small group of patients who have become alloimmunized upon repeated transfusion or pregnancy. These patients produce alloantibodies against specific RBC antigens. Some produce antibodies to antigens of very high frequency in the general population, and thus become progressively more difficult to crossmatch8,9. Adding to the complexity, not all alloantibodies are clinically significant; in other words, the binding of an alloantibody to RBCs detected by a serology test does not necessarily result in hemolysis when antigen-positive, incompatible blood is transfused. The MMA was originally developed to assess the potential clinical significance of serologically incompatible blood in a transfusion setting1-5.
Since extravascular hemolysis of antibody-bound RBCs is known to be mediated by the mononuclear phagocyte system, primary monocytes/macrophages are utilized in the development of diagnostic assays. The first assay to study the interaction of monocytes, RBCs, and antibodies was published in 1975, but the sub-optimal conditions used led only to rosette formation (the binding of RBCs to the periphery of the monocyte), and no phagocytosis was observed10. Significant modifications to the assay were made by several groups, leading to an assay for which the level of phagocytosis of alloantibody-bound RBCs could be correlated to the clinical outcome of hemolysis1-5. Recently, the optimal storage conditions of clinical samples and further optimization of assay conditions were examined to enhance the utility of a clinical MMA crossmatch using autologous patient samples11.
Three other diagnostic techniques have been employed in addition to the MMA in predicting transfusion outcomes: the 51Cr release test, the rosette test, and the chemiluminescence test (CLT). In the 51Cr release test, the patient is injected with 51Cr-labeled donor RBCs, and the half-life of the labeled RBCs is monitored and is predictive of post-transfusion survival or clearance12,13. As this method uses radioactive materials, it is rarely performed anymore. The rosette test involves mixing and incubating monocytes with RBCs and quantifying the level of rosette formation (with no phagocytosis)14. The clinical significance of antibodies in vivo involves active phagocytosis by macrophages found in the spleen and/or the liver; thus, this method does not provide a relevant readout of phagocytosis. The CLT uses luminol to monitor the oxidative burst during monocyte phagocytosis of RBC, since luminol fluoresces blue when oxidized in the phagosome15. This method is good, but contamination by neutrophils can confound the readout. Parallel comparisons have been made to evaluate the sensitivity, practicality, and reproducibility of the four available methods, and both the CLT and MMA were ranked superior16. However, the CLT has been mainly utilized in assessing hemolytic disease of the fetus and newborn (HDFN), and the assay's optimal pH of 8.0 might compromise the level of phagocytosis11.
In addition to its diagnostic and clinical utility, the MMA has been modified for other research purposes. Indeed, the MMA can not only serve as a functional assay to address discrepancies between serology and biology, it has also been used to retrospectively investigate the cause of hemolysis after intravenous immunoglobulin (IVIG) therapy17. It has also been used to examine the structure-function of chemical inhibitors of Fc&#947;R-mediated phagocytosis18-20 and to study the downstream signaling of Fc&#947;R-mediated phagocytosis21. In our laboratory, in addition to using a human MMA, we are developing a murine MMA using primary mouse peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) and autologous RBCs. The rationale is to screen antibodies that can induce Fc&#947;R-mediated phagocytosis as an intermediate to developing an in vivo autoimmune hemolytic anemia (AIHA) mouse model (unpublished data). The various modifications focus on different aspects of the IgG antibody and Fc&#947;R interaction that induce phagocytosis.

<table><tbody><tr><td>Acid citrate dextrose (ACD) vacutainers</td><td>BD</td><td>REF364606</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Sigma</td><td>R8758</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Bioshop</td><td>HEP003.100</td><td></td></tr><tr><td>Fetal bovine serum</td><td>Multicell&amp;nbsp;</td><td>080150</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicin</td><td>Gibco</td><td>15710-64</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll-Paque PLUS</td><td>GE</td><td>17-1440-03</td><td>https://www.gelifesciences.com/</td></tr><tr><td>Phosphate buffered saline</td><td>Sigma</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>8-chamber slides</td><td>Lab-Tek-ll</td><td>154534</td><td></td></tr><tr><td>R&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;R&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; (cDE/cDE) red blood cells</td><td>Canadian Blood Services</td><td></td><td>Commercially available (&lt;em&gt;e.g.&lt;/em&gt;, http://www.bio-rad.com/en-ca/product/reagent-red-blood-cells)</td></tr><tr><td>Polyclonal anti-D from human serum</td><td>Gamma Biologics</td><td>DIN 02247724</td><td>Can be substituted with commercially available monoclonal anti-D or with Rh immune globulin</td></tr><tr><td>100% methanol</td><td>Caledon</td><td>6700-1-42</td><td></td></tr><tr><td>Polyvinyl alcohol resin</td><td>Sigma</td><td>P8136</td><td>Can be substituted with commercially available mount</td></tr><tr><td>UltraPure glycerine</td><td>Invitrogen</td><td>15514-011</td><td></td></tr><tr><td>Cover slips</td><td>VWR</td><td>48366 067</td><td></td></tr><tr><td>Novaclone anti-IgG</td><td>Immucorgamma</td><td>5461023</td><td>Optional for IAT (http://www.fda.gov/downloads/biologicsbloodvaccines/.../ucm081743.pdf)</td></tr></tbody></table>

use of a monocyte monolayer assay to evaluate fc&#947; receptor-mediated phagocytosis

Although originally developed for predicting transfusion outcomes of serologically incompatible blood, the monocyte monolayer assay (MMA) is a highly versatile in vitro assay that can be modified to examine different aspects of antibody and Fc&#947; receptor (Fc&#947;R)-mediated phagocytosis in both research and clinical settings. The assay utilizes adherent monocytes from peripheral blood mononuclear cells isolated from mammalian whole blood. MMA has been described for use in both human and murine investigations. These monocytes express Fc&#947;Rs (e.g., Fc&#947;RI, Fc&#947;RIIA, Fc&#947;RIIB, and Fc&#947;RIIIA) that are involved in immune responses. The MMA exploits the mechanism of Fc&#947;R-mediated interactions, phagocytosis in particular, where antibody-sensitized red blood cells (RBCs) adhere to and/or activate Fc&#947;Rs and are subsequently phagocytosed by the monocytes. In vivo, primarily tissue macrophages found in the spleen and liver carry out Fc&#947;R-mediated phagocytosis of antibody-opsonized RBCs, causing extravascular hemolysis. By evaluating the level of phagocytosis using the MMA, different aspects of the in vivo Fc&#947;R-mediated process can be investigated. Some applications of the MMA include predicting the clinical relevance of allo- or autoantibodies in a transfusion setting, assessing candidate drugs that promote or inhibit phagocytosis, and combining the assay with fluorescent microscopy or traditional Western immunoblotting to investigate the downstream signaling effects of Fc&#947;R-engaging drugs or antibodies. Some limitations include the laboriousness of this technique, which takes a full day from start to finish, and the requirement of research ethics approval in order to work with mammalian blood. However, with diligence and adequate training, the MMA results can be obtained within a 24-h turnover time.

図1において非常に重要なステップと上記で概説した手順に従うことで、MMAは再現可能に行うことができます。 IVIGは、 図2の食作用の阻害のための例として使用しました。 IVIGは、このように食作用の下流の結果を阻害し、結合し、Fc受容体をブロックすることが知られています。使用IVIGの量を滴定することにより、用量依存的阻害とは、/ mLの全て（ 図2A）で阻害しなかった/ mLの0.5μgの下の100％に近い抑制および濃度をもたらした200μg以上の濃度、観察されます。食作用指数は、形質転換し、0％阻害、/ mLで決定することができるの3μgのIC 50（ 図2B）での阻害曲線としてR 2 R 2陽性対照に対して標準化されている場合。 一貫してアッセイを実施することに加えて、quantificaアッセイの化は、時には困難な場合があります。 図3は 、様々なMMAスライドの位相差顕微鏡画像のコレクションです。顕微鏡の経験では、1は、混入RBC（ 図3D）、または貪食RBC（ 図3B）からの液胞から単球を区別することができます。細胞および/または破片の密なクラスターは、定量化（ 図3EおよびF）の間に避けるべきです。また、1はオーバーオプソニン化単球の内部をovercrowdsし、正確な定量（ 図3C）に干渉する高め食作用につながるR 2 R 2 RBCを、避けるべきです。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/55039/55039fig1.jpg" /> MMAの1模式図を図。 MMAにおける重要なステップのステップバイステップの描写：全血からPBMCを単離し、付着しmonocytを供給オプソニン化R 2、R 2、およびチャンバースライドを洗浄とエス。 <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55039/55039fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/55039/55039fig2.jpg" /> 図2静脈内のIgG（IVIG）は、MMAを用いてインビトロで食作用を阻害します。 IVIGは、食作用を阻害することが知られており、人間のMMAにおける阻害対照として使用します。 （A）IVIGの滴定は、未処理のR 2 R 2、対照と比較食作用の用量依存的阻害をもたらしました。結果は、n = 3回の実験の平均（SEM）の平均±標準誤差を示しています。統計分析は、 スチューデントt検定を用いて行った：**P≤0.01及び***P≤0.001。 IC 50 OでIVIGの（B）阻害曲線F 3 / mlの（点線）。結果は、未処理のR 2 R 2（0％阻害）に対して正規化したデータを示します。 n = 3の実験の平均±SEM。 <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55039/55039fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/55039/55039fig3.jpg" /> 40X倍率下サンプルスライドの図3の位相差顕微鏡画像。 （A）単球が背景（白矢印）で非常に少数の汚染、非貪食R 2 R 2で、平均（独特のハロー輝きと黒の矢印）に1-2、R 2、R 2を貪食した完璧なスライド。貪食R 2、R 2と間違われることができ、このスライドに示すように、（B）、単球が時々拡大してきた空胞（白矢印）、。 （C &lt;R 2、R 2は、上でオプソニン化されている場合には/）&gt;強い、以上の4-5は、単球あたりR 2 R 2（黒矢印を貪食）R 2、R 2は、単球および別個の細胞内で混雑しているので、難しいカウント正確なレンダリング境界は区別することはできません。 （D）スライドの不十分な洗浄は、付着したRBCと間違われる可能性が豊富で、R 2、R 2汚染（白矢印）、につながります。 （E）場合によっては、単球および夾雑赤血球のクラスターを形成してもよいです。クラスタはまた避けるべきである細菌汚染を示しています。 （F）単球は、定量化の際に避けるべきであるより大きな凝集体を形成することができます。表示するために、フィールドのランダムな選択を使用して、パネルAは、MMAが適正に行われている場合に通常観察されるものです。スケールバーは20μmです。 <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55039/55039fig3large.jpg" target="_blank">こちらをクリックしてください</a>この図の拡大版を表示します。

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Use of a Monocyte Monolayer Assay to Evaluate Fc&#947; Receptor-mediated Phagocytosis

The monocyte monolayer assay (MMA) is an in vitro assay that utilizes isolated primary monocytes obtained from mammalian peripheral whole blood to evaluate Fc&#947; receptor (Fc&#947;R)-mediated phagocytosis.

Fcγ受容体媒介食作用を評価するために、単球単層アッセイの使用

Although originally developed for predicting transfusion outcomes of serologically incompatible blood, the monocyte monolayer assay (MMA) is a highly ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

18.0K ビュー.  University of Toronto. The monocyte monolayer assay (MMA) is an in vitro assay that utilizes isolated primary monocytes obtained from mammalian peripheral whole blood to evaluate Fcγ receptor (FcγR)-mediated phagocytosis.

ビデオ: Use of a Monocyte Monolayer Assay to Evaluate Fcγ Receptor-mediated Phagocytosis

Determining the Phagocytic Activity of Clinical Antibody Samples

Antibody-driven phagocytosis is induced via the engagement of Fc receptors on professional phagocytes, and can contribute to both clearance as well as pathology of disease. While the properties of the variable domains of antibodies have long been considered critical to in vivo function, the ability of antibodies to recruit innate immune cells via their Fc domains has become increasingly appreciated as a major factor in their efficacy, both in the setting of recombinant monoclonal antibody therapy, as well as in the course of natural infection or vaccination1-3.
Importantly, despite its nomenclature as a constant domain, the antibody Fc domain does not have constant function, and is strongly modulated by IgG subclass (IgG1-4) and glycosylation at Asparagine 2974-6. Thus, this method to study functional differences of antigen-specific antibodies in clinical samples will facilitate correlation of the phagocytic potential of antibodies to disease state, susceptibility to infection, progression, or clinical outcome.
Furthermore, this effector function is particularly important in light of the documented ability of antibodies to enhance infection by providing pathogens access into host cells via Fc receptor-driven phagocytosis7. Additionally, there is some evidence that phagocytic uptake of immune complexes can impact the Th1/Th2 polarization of the immune response8.
Here, we describe an assay designed to detect differences in antibody-induced phagocytosis, which may be caused by differential IgG subclass, glycan structure at Asn297, as well as the ability to form immune complexes of antigen-specific antibodies in a high-throughput fashion. To this end, 1 &mu;m fluorescent beads are coated with antigen, then incubated with clinical antibody samples, generating fluorescent antigen specific immune complexes. These antibody-opsonized beads are then incubated with a monocytic cell line expressing multiple Fc&gamma;Rs, including both inhibitory and activating. Assay output can include phagocytic activity, cytokine secretion, and patterns of Fc&gamma;Rs usage, and are determined in a standardized manner, making this a highly useful system for parsing differences in this antibody-dependent effector function in both infection and vaccine-mediated protection9.

We present a high-throughput flow cytometric assay to determine the phagocytic activity of antigen-specific antibodies from clinical samples, utilizing fluorescent antigen-coated beads and a monocytic cell line expressing multiple Fc receptors&#x2014;providing receptor usage and phagocytic activity determinations in a standardized and reproducible fashion for any antigen of interest.

臨床抗体サンプルの貪食活性を決定する

Antibody-driven phagocytosis is induced via the engagement of Fc receptors on professional phagocytes, and can contribute to both clearance as well as ...

免疫・感染学

High Throughput Fluorometric Technique for Assessment of Macrophage Phagocytosis and Actin Polymerization

The goal of fluorometric analysis is to serve as an efficient, cost effective, high throughput method of analyzing phagocytosis and other cellular processes. This technique can be used on a variety of cell types, both adherent and non-adherent, to examine a variety of cellular properties. When studying phagocytosis, fluorometric technique utilizes phagocytic cell types such as macrophages, and fluorescently labeled opsonized particles whose fluorescence can be extinguished in the presence of trypan blue. Following plating of adherent macrophages in 96-well plates, fluorescent particles (green or red) are administered and cells are allowed to phagocytose for varied amounts of time. Following internalization of fluorescent particles, cells are washed with trypan blue, which facilitates extinction of fluorescent signal from bacteria which are not internalized, or are merely adhering to the cell surface. Following the trypan wash, cells are washed with PBS, fixed, and stained with DAPI (nuclear blue fluorescent label), which serves to label nuclei of cells. By a simple fluorometric quantification through plate reading of nuclear (blue) or particle (red/green) fluorescence we can examine the ratio of relative fluorescence units of green:blue and determine a phagocytic index indicative of amount of fluorescent bacteria internalized per cell. The duration of assay using a 96-well method and multichannel pipettes for washing, from end of phagocytosis to end of data acquisition, is less than 45 min. Flow cytometry could be used in a similar manner but the advantage of fluorometry is its high throughput, rapid method of assessment with minimal manipulation of samples and quick quantification of fluorescent intensity per cell. Similar strategies can be applied to non adherent cells, live labeled bacteria, actin polymerization, and essentially any process utilizing fluorescence. Therefore, fluorometry is a promising method for its low cost, high throughput capabilities in the study of cellular processes.

Here we present a protocol to quantify phagocytosis of fluorescent particles by adherent macrophage cell line using a fluorometric method. This method facilitates a high throughput quantification of particle internalization as well as the resulting actin polymerization.

マクロファージ食作用およびアクチン重合の評価のためのハイスループット蛍光技術

The goal of fluorometric analysis is to serve as an efficient, cost effective, high throughput method of analyzing phagocytosis and other cellular ...

Measuring Granulocyte and Monocyte Phagocytosis and Oxidative Burst Activity in Human Blood

The granulocyte and monocyte phagocytosis and oxidative burst (OB) activity assay can be used to study the innate immune system. This manuscript provides the necessary methodology to add this assay to an exercise immunology arsenal. The first step in this assay is to prepare two aliquots ("H" and "F") of whole blood (heparin). Then, dihydroethidium is added to the H aliquot, and both aliquots are incubated in a warm water bath followed by a cold water bath. Next, Staphylococcus aureus (S. aureus) is added to the H aliquot and fluorescein isothiocyanate-labeled S. aureus is added to the F aliquot (bacteria:phagocyte = 8:1), and both aliquots are incubated in a warm water bath followed by a cold water bath. Then, trypan blue is added to each aliquot to quench extracellular fluorescence, and the cells are washed with phosphate-buffered saline. Next, the red blood cells are lysed, and the white blood cells are fixed. Finally, a flow cytometer and appropriate analysis software are used to measure granulocyte and monocyte phagocytosis and OB activity. This assay has been used for over 20 years. After heavy and prolonged exertion, athletes experience a significant but transient increase in phagocytosis and an extended decrease in OB activity. The post-exercise increase in phagocytosis is correlated with inflammation. In contrast to normal weight individuals, granulocyte and monocyte phagocytosis is chronically elevated in overweight and obese participants, and is modestly correlated with C-reactive protein. In summary, this flow cytometry-based assay measures the phagocytosis and OB activity of phagocytes and can be used as an additional measure of exercise- and obesity-induced inflammation.

The purpose of this manuscript is to present a method for measuring monocyte and granulocyte phagocytosis and oxidative burst activity in human blood samples.

ヒト血液中の測定顆粒球と単球食作用および酸化バースト活動

The granulocyte and monocyte phagocytosis and oxidative burst (OB) activity assay can be used to study the innate immune system. This manuscript provides ...

Time-lapse 3D Imaging of Phagocytosis by Mouse Macrophages

Phagocytosis plays a key role in host defense, as well as in tissue development and maintenance, and involves rapid, receptor-mediated rearrangements of the actin cytoskeleton to capture, envelop and engulf large particles. Although phagocytic receptors, downstream signaling pathways, and effectors, such as Rho GTPases, have been identified, the dynamic cytoskeletal remodeling of specific receptor-mediated phagocytic events remain unclear. Four decades ago, two distinct mechanisms of phagocytosis, exemplified by Fc&#947; receptor (Fc&#947;R)- and complement receptor (CR)-mediated phagocytosis, were identified using scanning electron microscopy. Binding of immunoglobulin G (IgG)-opsonized particles to Fc&#947;Rs triggers the protrusion of thin membrane extensions, which initially form a so-called phagocytic cup around the particle before it becomes completely enclosed and retracted into the cell. In contrast, complement opsonized particles appear to sink into the phagocyte following binding to complement receptors. These two modes of phagocytosis, phagocytic cup formation and sinking in, have become well established in the literature. However, the distinctions between the two modes have become blurred by reports that complement receptor-mediated phagocytosis may induce various membrane protrusions. With the availability of high resolution imaging techniques, phagocytosis assays are required that allow real-time 3D (three dimensional) visualization of how specific phagocytic receptors mediate the uptake of individual particles. More commonly used approaches for the study of phagocytosis, such as end-point assays, miss the opportunity to understand what is happening at the interface of particles and phagocytes. Here we describe phagocytic assays, using time-lapse spinning disk confocal microscopy, that allow 3D imaging of single phagocytic events. In addition, we describe assays to unambiguously image Fc&#947; receptor- or complement receptor-mediated phagocytosis.

Here we describe methods using spinning disk confocal microscopy to image single phagocytic events by mouse resident peritoneal macrophages. The protocols can be extended to other phagocytic cells.

マウスのマクロファージによる貪食のコマ撮りの 3 D イメージング

Phagocytosis plays a key role in host defense, as well as in tissue development and maintenance, and involves rapid, receptor-mediated rearrangements of ...

Prediction of Red Blood Cell Antibody Significance Using the Monocyte-Macrophage Assay

Derived from monocytes in the bone marrow, macrophages are large, innate immune cells that play a major role in clearing dead cells, debris, tumor cells, and foreign pathogens. The phagocytic capacity of monocytes versus macrophages is a concept that is not well understood. Here, we aim to examine a difference in the phagocytosis of monocytes versus macrophages, specifically M1/M2 macrophages, against various opsonized red cells using a modified and updated version of the established monocyte monolayer assay (MMA). Peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) were isolated from donor buffy coats. Using purified monocytes, inflammatory M1 and anti-inflammatory M2 macrophages were produced by in vitro culture and polarization. M1/M2 cells were harvested and used in an MMA-like assay, which we refer to as the M-MA, to decipher clinically significant phagocytosis of various red cell antibodies. A phagocytic index (PI) &#62; 5 was deemed clinically significant phagocytosis with the use of monocytes. A phagocytic index (PI) &#62; 12 was deemed clinically significant phagocytosis with the use of M1/M2 macrophages. M2 macrophages demonstrate an increased ability to phagocytose opsonized RBCs compared to monocytes and M1s. The same weak antibody (anti-S) yields significant phagocytosis with only M2 macrophages (PI=43) but not M1s (PI=2) or monocytes (PI=0), and this was demonstrated repeatedly using various antibodies. The use of M2 macrophages instead of monocytes may allow for more accurate results as these cells are more phagocytic, offering further clinical relevance to the assay. Further studies with different antibodies to red blood cells, including validation of the monocyte-macrophage assay (M-MA) with antibodies having known clinical significance, may show the M-MA&#160;more useful to help predict clinically significant red cell alloantibodies and transfusion reactions. This method will advance the field of transfusion medicine and immunology.

We have developed enhancements and updated methods for the existing monocyte-monolayer assay (MMA), in which macrophages are used to help better predict the clinical relevance of red cell alloantibodies in transfusion medicine and immunology. This assay is named the monocyte-macrophage assay (M-MA).

単球マクロファージアッセイを用いた赤血球抗体の意義の予測

Derived from monocytes in the bone marrow, macrophages are large, innate immune cells that play a major role in clearing dead cells, debris, tumor cells, ...

Real-Time Imaging of Macrophage Phagocytosis of IgG-Opsonized Red Blood Cells

Source: Horsthemke, M., et al. <a href="https://app-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/v/57566">Time-lapse 3D Imaging of Phagocytosis by Mouse Macrophages.</a> J. Vis. Exp. (2018)
This video demonstrates an assay to monitor independent macrophage-mediated red blood cell (RBC) phagocytosis events. Mouse immunoglobulin G (IgG)-opsonized human RBCs are incubated with mouse macrophages and observed under a confocal microscope. The RBCs are engulfed by macrophages via a phagocytic cup formation and targeted for lysosomal degradation.

IgGオプソニン化赤血球のマクロファージ食作用のリアルタイムイメージング

Source: Horsthemke, M., et al. Time-lapse 3D Imaging of Phagocytosis by Mouse Macrophages. J. Vis. Exp. (2018)
This video demonstrates an assay to monitor ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

免疫学

免疫診断

特殊なアッセイ

An In Vitro Assay for Evaluating the Immunomodulatory Impact of Monocytes on Leukocyte Proliferation

Source: Hsu, P., et al. <a href="https://app-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/v/53265">Assessment of the Immunomodulatory Properties of Human Mesenchymal Stem Cells (MSCs).</a> J. Vis. Exp. (2015)
This video demonstrates an in vitro assay to explore the immunomodulatory influence of mesenchymal stem cells (MSCs) on effector T cell proliferation. The assay includes co-culturing MSCs with PBMCs to induce the monocyte population to acquire an immunomodulatory phenotype, leading to the secretion of interleukin-10 (IL-10). Following incubation with activated CD4+ T cells, the induced monocytes effectively suppress T cell proliferation.

白血球増殖に対する単球の免疫調節影響を評価するためのIn vitroアッセイ

All procedures involving sample collection have been performed in accordance with the institute&#39;s IRB guidelines.
1. Density Gradient Isolation of ...

In Vitro および In Vivo モデル

An Assay to Assess Phagocytosis and Oxidative Burst Activity In Granulocytes and Monocytes

Source: Meaney, M. P. et al., <a href="https://app-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/v/54264">Measuring Granulocyte and Monocyte Phagocytosis and Oxidative Burst Activity in Human Blood.</a> J. Vis. Exp. (2016)
This video demonstrates the assay to confirm phagocytic activity by cells in human blood via flow cytometry. The granulocytes and monocytes confirm their phagocytic activity by showing green and red fluorescence confirming the presence of engulfed bacteria and oxidative burst activity respectively.

顆粒球および単球における食作用および酸化的バースト活性を評価するためのアッセイ

All procedures involving human participants have been performed in compliance with the institutional, national, and international guidelines for human ...

An Assay for Quantifying Antibody-Mediated Phagocytosis of Parasite-Infected Erythrocytes

Source: Quintana, M. d. P. et al., <a href="https://app-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/v/61538">Measuring Naturally Acquired Phagocytosis-Inducing Antibodies to Plasmodium falciparum Parasites by a Flow Cytometry-Based Assay.</a>&#160;J. Vis. Exp.&#160;(2020)
This video demonstrates a flow cytometry-based phagocytosis assay involving labeled and opsonized Plasmodium falciparum-infected erythrocytes by monocytes. Flow cytometry identifies fluorescence in monocytes, confirming the successful identification of opsonized erythrocytes through phagocytosis.

All procedures involving sample collection have been performed in accordance with the institute&#39;s IRB guidelines.
1. Parasite culture
NOTE: Follow the ...

An In Vitro Assay to Measure Antibody-Dependent Cellular Phagocytosis by Phagocytes

Source: Powell, R. L., et al. <a href="https://app-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/v/60149">Isolation of Leukocytes from Human Breast Milk for Use in an Antibody-dependent Cellular Phagocytosis Assay of HIV Targets.</a> J. Vis. Exp. (2019).
This video demonstrates an assay to measure the antibody-dependent cellular phagocytosis (ADCP) by breast milk phagocytes. Fluorescently labeled microspheres conjugated to an antigen-antibody complex, are combined with a cell suspension isolated from breast milk to induce antibody-dependent cellular phagocytosis by the phagocytic leukocytes. Upon labeling the cells with antibodies against common leukocyte antigen (CD45), flow cytometry is used to measure the fluorescence intensity of microsphere-positive viable phagocytic leukocytes, indicating the level of ADCP activity.

食細胞による抗体依存性細胞貪食作用を測定するためのin vitroアッセイ

All procedures involving sample collection have been performed in accordance with the institute&#39;s IRB guidelines.
1. Target Microsphere preparation

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