This research was supported by the research programs of the National Research Foundation of Korea (NRF) (NRF-2015R1A1A1A05001548 and NRF-2015R1A5A1037668).

血液サンプルを用いた実験では、関連する法律や制度のガイドラインに準拠して行きました。サンプルを取得し、教育機関での臨床試験で処理されていた残留血液サンプルでした。 1. PT-AS光のセットアップ注：一つは初期PT-ASのセットアップのための空のマイクロキャピラリーチューブを使用することができます。 <ol><li>それぞれ、200および330ミクロンの内径と外径と空のマイクロキャピラリーチューブをマウントし、毛細管器具に大きな5〜cm以上の長さ。市販のファイバ固定具は、チューブ固定具として使用することができます。 </li><li>しっかりと650 nmのレーザーポインターを固定、 すなわち 、プローブ光源、毛細管を照明します。プローブビームは、毛細管よりも大きくする必要があります。角度の周期パターンを観察するために毛細管の背後にある画面（ 例えば 、ホワイトペーパー）を配置します。 </li><li>検出部は、直接scattをキャプチャするウェブカメラのいずれかのレンズをはずしてパターンをering。プローブビーム方向に対して25から35°の角度で毛細管の背後にあるウェブカメラを置きます。毛細管によって生成される角度の周期パターンが検出器（ 図1）を用いて測定することができることを確認してください。イメージセンサが適切に配置されたときに、イメージセンサの途中で角度周期パターンを観察します。 </li><li>毛細管を照明する位置532nmのPTの励起光源。限りPT励起光が毛細管のプローブビームと重複し、直接検出器に到達しないように任意の角度で位置PT光源を、。それはRIより大きな変化をもたらすように、通常、高い光パワーを用いて、血液サンプルのPTの励起は、PT-AS感度を向上させます。 <ol><li>採用PT励起光源の最も高い光パワーを使用してください。また、PTの励起光はキャピラリチューブにプローブ光と重なることを確認してください。 PT励起光のビームサイズを使用少なくとも2倍、そのプローブ光の全プローブ体積を加熱します。 </li></ol></li><li> 532 nmの光を遮断し、唯一650 nmのプローブ光を測定する検出器の前にロングパスフィルタを置きます。 </li><li>毛細管を照射する前に、PTの励起光の経路内に光チョッパをインストールします。光チョッパは、PTの励起光強度を変調するために使用されます。 </li></ol> 2.血液サンプルの調製<ol><li>エチレンジアミン四酢酸採血管に貧血状態で、新鮮な全血の6ミリリットルを描き、よくサンプルを混ぜます。他の処理は必要ありません。 </li><li>凝固を防ぐために、抽出の24時間以内にPT-ASセンサを用いて血液試料を測定します。 </li></ol> 3. PT-AS測定プロトコル<ol><li>測定するために血液サンプルを用いて、マイクロキャピラリーチューブをロードします。血液の中にチューブを配置することにより、毛細管現象を介して血液と毛細管を埋めます十分な。測定に必要な最小試料容量は、毛細管の内径及びプローブビームサイズによって決定されます。 <ol><li> 200μmの内径を有する管を採用しています。プローブビームのサイズは、測定が&gt; 63ナノリットルの試料容量を用いて行うことができることを示唆している、代表的な結果は2mmでした。 </li></ol></li><li>フィクスチャ内の指定位置に毛細管をマウントします。 </li><li>血液ロードされたマイクロキャピラリーチューブを照明するために650 nmのプローブレーザをオンにします。角度の周期パターンは、ウェブカメラで観察する必要があります。 </li><li>チューブを照らすために532-nmのPTの励起レーザーをオンにします。 </li><li> 2 HzでPTの励起光の強度を変調する光チョッパを実行します。 注：この動作条件の選択のための理論的根拠は、ディスカッションおよびKim らに記載されています。 12。 <ol><li>光チョッパのモーターヘッドアセンブリにチョッパーホイールを装着システム。 </li><li>チョッパ制御ボックスをオンにして、変調周波数を設定するために、コンソールにコントロールノブを使用します。 </li><li>コントロールノブを使用してチョッパーを実行します。 </li></ol></li><li> MPEG-4（MP4）形式で5秒間のウェブカメラを経由して変動する散乱パターンを記録します。 </li></ol> 4.信号処理注：PT-AS信号処理は、実験室開発MATLABコードを使用して行きました。 <ol><li>画像を抽出するために、ビデオファイルをロードします。各画像について、垂直方向[ 図2（B、C）]に沿った画素値の平均を計算することによって平均散乱パターンを得た[ 図2（a）は代表的な画像を参照]。 </li><li>フーリエ変換を平均散乱パターンの変換を評価し、ピーク空間周波数で位相を計算します。すべての記録画像のすべてのフレームのためにこれらの操作を実行します。 </li><li>すべての画像から得られた位相値を用いて、時間的な位相をプロット変動〔 図2（D）]。位相がPTの変調周波数で変動することに注意してください。時間領域における位相変動の変換、および変調周波数での大きさを得るフーリエ変換を取ります。この信号は、PT-AS信号〔 図2（E）]と呼ばれます。 </li><li>プロトコル5で得られた検量線を用いて、[Hbの】対応にそのPT-AS信号を変換して、血液サンプルの[ヘモグロビン]を測定します。 </li></ol> 5. PT-ASキャリブレーション<ol><li> （ - 18グラム/デシリットル例えば 、0）を均一PT-ASセンサの検出範囲に分布している[ヘモグロビン]の値を持つ、血液サンプルを準備します。 </li><li>キャリブレーションの前に、参照血液分析器を使用して、サンプルの[Hbの]の値を定量化します。サンプルのPT-AS信号を測定します。 </li><li>線形最小二乗を行うことにより、PT-AS信号に[Hbの]に関する校正曲線を導出エクスペリの、B + [ヘモグロビン] = A [PT-AS信号]、フィットLが得られます。動作条件は[ヘモグロビン]との関係は 、 表1に指定され、PT-AS信号は、[ヘモグロビン] = 5.13 [PT-AS信号]であることがわかった- 0.09。線形フィットを実行するためにMATLABコードを使用してください。 </li></ol>

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No conflict of interest is declared.

PT-ASセンサは、未処理の血液サンプルの直接【のHb]測定可能な全光学的方法を表します。この方法は、赤血球中のヘモグロビン分子の固有のPT応答を使用して、血液中の[Hbを]定量化します。 532 nmの光による照明下で、ヘモグロビン分子が光エネルギーを吸収して熱を発生します。得られた温度上昇は、血液試料のRIを変更します。 BSIの高RI感度は、血液中のこのRIの変化を測定するために利用しました。以前、我々はPT-ASセンサーは、市場で商業【ヘモグロビン]センサーに匹敵する0.35〜17.9グラム/ dlで、範囲にわたって0.12グラム/ dlでの検出限界で[ヘモグロビン]の測定を可能にすることを実証しました。 PT-ASセンサの注目すべき特徴は、血液試料または化学物質の任意の前処理を必要としないことです。したがって、センサは、直接、迅速な（&lt;5秒）、および環境に配慮した測定を可能にします。サンプル続きとしてガラス系マイクロキャピラリーチューブを使用ainerは、低運転コストで[ヘモグロビン]アッセイを可能にしました。 PT-ASセンサの最小試料容量は、毛細管の内径及び毛細管の測定ビームのサイズによって決定されます。代表的な結果で〜63 NLと推定されます。市販の装置（ 例えば 、参照血液分析器のための50から200マイクロリットル）に必要なサンプル量との比較では、PT-ASセンサが大幅に減少したサンプル・ボリュームに[Hbの]測定を可能にします。いくつかの迅速かつ低コスト[ヘモグロビン]検出技術は11,17,18を報告したが、それでも動作のために2-10μlにサンプル容量を必要とされてきました。 PT-ASセンサーの実装のいくつかの機能が注目されるべきです。一つは、PTの励起光のサイズは、その毛細管のプローブ光ビームの少なくとも2倍であることを確認すべきです。二つの光ビームが目に2つの光ビームの無いまたは部分的にオーバーラップとして、毛細管に重複しなければなりません電子管はないか、または小さいPT-AS応答になります。 1つはまた、角度散乱パターンが検出器に飽和していないことを確認する必要があります。水平または垂直方向に散乱パターンの向きの調整が必要であってもよいです。そうでない場合は、取得された画像は、信号処理段階に回転されるべきです。管により532 nmのPT励起光の散乱はまた、検出器上の角度散乱パターンを生成することに注意してください。したがって、ロングパスフィルタ532 nmの光を遮断する必要があります。より大きなイメージセンサは、より角度の周期的なパターンをキャプチャします。フーリエ変換は、より高い精度で位相測定を可能にする対応する空間周波数で高いシグナルを生成することになる角度パターンの変換します。それは一時的な位相変動の多くのサンプリングを可能にするようにまた、より高いフレームレートは、典型的には、改善されたSNRとPT-ASの測定をもたらします。このため、高画素dの大きな高速画像センサの使用ensityが有利です。 いくつかのコメントはまた、測定時間とPTの変調周波数でなされるべきです。 Kim らに記載されるように。 12、PT-AS信号は、PTの変調周波数で測定された角度散乱パターンの位相変動のフーリエ変換の大きさを指します。ノイズは、PT励振12前の位相測定のフーリエ変換のピーク振幅として定義されます。 PT-AS信号のSNRは、ノイズによってPT-AS信号の大きさを分割することによって評価されます。長い測定時間は、通常、より高いSNRを用いた測定をもたらすが、合計[ヘモグロビン]アッセイ時間が増加します。測定時間は、偶数[ヘモグロビン] &lt;1グラム/デシリットルの血液サンプルについて3より高いSNRを達成するために、5秒としました。最適なPTの変調周波数は、PT変調周波数の関数として、PT-ASセンサのSNRを検査することによって求めることができます。担当者のための最適な変調周波数resentative結果は2ヘルツであることが見出されました。 PTの変調周波数未満2ヘルツでの動作は、光チョッパや振動の激しい動きのような低周波ノイズに起因する高いSNRを生じませんでした。 このデモでは、PT-ASセンサーは、市販のレーザーポインタとウェブカメラを使用して、ベンチトップ構成で実証されました。光学セットアップには、化学物質が関与していないため、測定手順は簡単です、簡単です、と。一方、センサは、潜在的に、コンパクトなハンドヘルド装置に包装することができることを強調すべきです。プローブおよびPT励起用光源は、低コストのレーザダイオードまたは発光ダイオードで置き換えることができます。内蔵の計算能力と小型化相補型金属酸化物半導体イメージセンサはまた、検出器として利用することができます。小さなフォームファクタでこれらのコンポーネントを統合することにより、[ヘモグロビン]アッセイのための新しいポータブル、無農薬、かつ安価なプラットフォームを生成するであろう。私N [ヘモグロビン]アッセイに加えは、PT-ASセンサの検出原理は、PTの応答を示す種々のバイオマーカーおよび化学物質の検出に拡張することができます。例えば、有機リン農薬のPTアッセイはまた、19を示しており、容易にPT-AS方式で実現することができます。

血液検査は、一般的に全体的な人間の健康を評価し、特定の疾患に関連するバイオマーカーを検出するために行われます。例えば、血液中のコレステロール濃度は、密接に、心血管疾患および膵炎に関連する高脂血症のための基準として機能します。グルコースレベルは、糖尿病性ケトアシドーシス及び高血糖高浸透圧症候群などの合併症に関連付けられているように、血糖の内容は、頻繁に測定すべきです。例えばマラリア、ヒト免疫不全ウイルスおよび後天性免疫不全症候群などの深刻な病気は、血液検査によって診断され、赤血球、血小板、および白血球を含む血液成分の定量化は、膵臓及び腎臓疾患のスクリーニングを可能にしています。 ヘモグロビン（Hb）は、血液の重要な成分は、赤血球の約96％を占め、そして人間の臓器に酸素を輸送します。その質量濃度（[ヘモグロビン]）の有意な変化は、私を指示することができますtabolic変化、肝胆道疾患、および神経、心血管および内分泌疾患1。 【ヘモグロビン従って日常の血液検査で測定されます。特に、貧血患者、透析患者、および妊娠中の女性は強く重要なタスク2として[ヘモグロビン]を監視することをお勧めします。 様々な[ヘモグロビン]の検出方法は、このように開発されています。ヘモグロビンシアン化方法、[ヘモグロビン]定量化のための最も一般的な技術の一つは、赤血球3の脂質二重層を破壊するためにシアン化カリウム（KCN）を用います。 540 nmの周りの化学展示高い吸収によって生成されるシアン化ヘモグロビン;従って、[ヘモグロビン]測定は、比色分析を介して行うことができます。この方法は、広くそのシンプルさのため採用したが、採用化学物質（ 例えば 、KCNおよびジメチルラウリルアミンオキシド）は、ヒトや環境への毒性がありますさ。ヘマトクリットスキームは、全血の体積に比べて赤血球の体積比を測定します梅の遠心分離を介して、しかし、それは比較的大きな血液量（50-100μl）を4が必要です。分光測光法は、[ヘモグロビン]正確に任意の化学物質なしで測定したが、複数の波長と大きな血液量で測定が5,6を必要としています。同様に、[ヘモグロビン]測定するためのいくつかの光学的方法は、光散乱に基づく検出方法を含む提案されてきたが、その測定精度は、理論的な血液モデルの精度に強く依存します。 光熱（PT）に基づいて、これらの制限を克服するために、[ヘモグロビン]検出方法Hbの効果は、最近7に提案されています。主に酸化鉄から構成さHbは、532 nmの光を吸収し熱8-10に光エネルギーに変換します。このPTの温度上昇は、血液サンプルの屈折率（RI）の変化を測定することによって光学的に検出することができます。イムら。就業スペクトルドメイン光コヒーレンスreflectometryは血液収容室11内のPT光路長の変化を測定します。この方法は、無農薬やダイレクト[Hbの]測定を可能にしているが、分光計および干渉計構成の使用は、その小型化の妨げとなる場合があります。我々は最近、代替[ヘモグロビン]検出方法を提示し、デバイスの微細化12に適している光熱角度光散乱（PT-AS）センサーを、と呼ばれます。 PT-ASセンサは、毛細管内部の血液試料のRIにおけるPTの変化を測定するために後方散乱干渉（BSI）の高RI感度を利用します。 BSIは、様々なソリューション13-15のRIを測定し、自由溶液16中の生化学的相互作用をモニターするために利用されてきました。 PT-ASセンサはBSIと同様の光学配置を採用したが、血液試料中のRIのPTの上昇を測定する光熱励起設定を組み合わせます。 BSIおよびPT-ASセンサの動作原理は、他の場所で詳細に記載されています<sup&gt; 12,15。 PT-ASセンサは、広い検出範囲（0.35から17.9までグラム/デシリットル）で高感度[ヘモグロビン]測定値を示し、&lt;100nlのサンプル容量で動作することができます。血液サンプルのないプレコンディショニングを必要とせず、測定時間は、約5秒です。ここでは、実験と詳細な測定手順について説明します。代表的なPT-ASの結果は、貧血患者から血液サンプルを使用して提供され、その結果は、PT-ASセンサの精度を評価するための血液分析器からのものと比較されます。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>650nm laser pointer</td>
			<td>LASMAC</td>
			<td>LED-1</td>
			<td>Probe light</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hollow round glass capillaries</td>
			<td>Cm Scientific</td>
			<td>CV2033</td>
			<td>Blood sample container</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Webcam</td>
			<td>Logitech</td>
			<td>C525</td>
			<td>CMOS optical sensor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>532-nm DPSS laser</td>
			<td>CNI Laser</td>
			<td>MGL-&#8546;-532</td>
			<td>Photothermal light source</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical chopper system</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>MC2000-EC</td>
			<td>Optical chopper</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic long-pass filter</td>
			<td>Edmund Optics</td>
			<td>#43-942</td>
			<td>To reject 532-nm PT excitation light</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiber clamp</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>SM1F1-250</td>
			<td>Capillary tube fixture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA coated blood sampling tube</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>VACUETTE 454217</td>
			<td>Blood sampling &#38; anticoagulating</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematology analyzer</td>
			<td>Siemens AG</td>
			<td>ADVIA 2120i</td>
			<td>Reference hematology analyzer</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a rapid and chemical-free hemoglobin assay with photothermal angular light scattering

光熱角度光散乱（PT-AS）は、血液サンプルのヘモグロビン濃度（[Hbの]）を測定するための新規な光学的方法です。ヘモグロビン分子の固有光熱応答に基づいて、センサは高感度、[Hbの]の無農薬の測定を可能にします。 [ヘモグロビン] 0.35の範囲にわたって0.12グラム/ dlでの限界と検出能力 - 17.9グラム/ dlが以前に実証されています。この方法は、容易に、レーザポインタやウェブカメラなどの安価な消費者電子デバイスを使用して実施することができます。血液容器としてのマイクロキャピラリーチューブの使用はまた、ナノリットルスケールの血液量と低運転コストでヘモグロビン分析を可能にします。ここで、PT-AS光学装置と信号処理手順の詳細については、提示されています。実験プロトコルおよび貧血状態の血液サンプルについての代表的な結果（[ヘモグロビン] = 5.3、7.5、9.9グラム/デシリットル）も提供され、そして測定があちこちと比較しますミリアンペアの血液分析装置。実装と運用におけるそのシンプルさは、臨床検査室やリソースが制限された設定で、広い採用を有効にする必要があります。

ヘモグロビンアッセイは、PT-ASセンサを用いて行い、その測定値は、血液分析器からのものと比較しました。実験は2ヘルツの1.4 W / cm 2で、PTの変調周波数、及び5秒の測定時間のPTの励起光強度で行いました。 表1に実験条件をまとめたものです。プローブおよびPT励起光のビームサイズは、それぞれ、5.5および2mMでした。ウェブカメラは、30fpsのフレームレートで画像を記録しました。測定のために、三つの異なるヘモグロビン濃度を有する貧血血液試料を使用しました。 PT-ASを測定する前に、サンプルの[Hbの]値は、最初に5.3、7.5、および9.9グラム/血液分析器によってdlのように測定しました。 図3（a）は、変調されたPT光照射下での角度散乱パターンの代表的なタイムラプス位相変動を示しています。目情報は、フーリエ角度散乱パターンの変換をとり、ピークの空間周波数で時間的な位相変動を測定することにより得られたれます。その血液サンプルは、より高い[ヘモグロビン]展示で注意大きな位相シフト。対応するPT-AS信号を評価し、[ヘモグロビン]の値に変換しました。イレブン測定は、各試料について行い、平均[ヘモグロビン]の値は、それぞれ5.46、7.23、および9.85グラム/ dlであることが見出されました。結果は、血液分析装置[ 図3（B）]を使用して得られたものとよく一致しました。 PT-ASセンサの[ヘモグロビン】測定精度が&lt;こと0.89グラム/デシリットルを見出しました。この変動は、部分的には、プローブの量およ​​び使用される光源の強度変動に赤血球数の変動によって説明することができます。 表2は、血液分析装置からのものに対するPT-ASの測定値の詳細な比較を提示します。 &gt; <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/55006/55006fig1.jpg" /> 図1：PT-ASセンサの概略図。レーザポインタから650 nmのプローブ光は、血液ロード毛細管に向けられています。次に、光はウェブカメラ上で定期的なパターンを生成する、血液を含む管によって散乱されます。ヘモグロビン分子が高い吸収を示すれる532 nmの光で照明すると、ヘモグロビン分子が光エネルギーを吸収して熱に変換します。結果として得られる温度上昇は、血液のRIを変更します。角度の周期的なパターンがRIとチューブの物理的な大きさによって変化するので、[Hbの血液における角度周期パターンにおけるこのPTシフトを測定することによって定量化されます。光チョッパは、高い信号対雑音比を有する[ヘモグロビン]測定値を得るために使用されます。低コストのプラスチックロングパスフィルタのみ、プローブ光を検出するためのウェブカメラの正面に配置されています。K &quot;&gt; この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/55006/55006fig2.jpg" /> 図2：PT-AS 信号処理手順。 （a）は、オンとオフのPT励起光を代表ウェブカメラの画像を。角度散乱パターンが原因のHb分子のPT応答のシフト。 （b）は、各画像は、平均化パターンを得るために、垂直（Y）方向に沿って平均化されます。 （c）の代表は、オンとオフPT励起で周期的なパターンを平均しました。 （D）平均周期パターンは、その後フーリエ変換され、ピークの空間周波数の位相を時間の関数として検討されています。変調されたPT光照明の下で、周期的パターンの位相は、変調周波数で変動します。 （e）の測定された位相インフルエンザctuationは、フーリエ変換され、変調周波数で評価し、その大きさは、PT-AS信号と呼ばれる、[ヘモグロビン]に変換されます。 <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55006/55006fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/55006/55006fig3.jpg" /> 図3： 貧血の血液サンプルのPT-AS測定。 （a）は 3血液貧血状態のサンプル（[ヘモグロビン] = 5.3、7.5、および9.9グラム/デシリットル）のために測定された角度散乱パターンの代表的な位相変動。より高い[ヘモグロビン]値を有する血液試料は、より大きな位相変化を生じさせます。 （B）のHb]の値の比較は、基準血液分析器のものとPT-ASセンサを用いて測定しました。イレブンPT-AS測定は、各サンプルについて実施しました。誤りますまたはバーは標準偏差を表します。 <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55006/55006fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td colspan="2"> 実験条件 </td></tr><tr><td> PTの変調周波数 </td><td> 2 Hzの</td></tr><tr><td> PT光強度 </td><td> 1.4 W / cm 2の</td></tr><tr><td> PTのビームサイズ </td><td> 5ミリメートル</td></tr><tr><td> プローブビームサイズ </td><td> 2ミリメートル</td></tr><tr><td> 測定時間 </td><td> 5秒</td></tr><tr><td> フレーム取得率 </td><td> 30 fpsの</td></tr></tbody></table> 表1：ExperimeNTAL条件。 <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td rowspan="2"> 血液分析器（グラム/デシリットル） </td><td colspan="2"> PT-ASセンサー </td></tr><tr><td> 平均（G / DL） </td><td> SD（G / DL） </td></tr><tr><td> 5.3 </td><td> 5.46 </td><td> 0.72 </td></tr><tr><td> 7.5 </td><td> 7.23 </td><td> 0.89 </td></tr><tr><td> 9.9 </td><td> 9.85 </td><td> 0.84 </td></tr></tbody></table> 表2：血液分析装置によってものとPT-ASセンサによる計測[ヘモグロビン]の比較。

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A Rapid and Chemical-free Hemoglobin Assay with Photothermal Angular Light Scattering

A photo-thermal angular light scattering (PT-AS) sensor enables the rapid and chemical-free hemoglobin assay of nanoliter-scale blood samples. Here, details of the PT-AS setup and a measurement protocol for the hemoglobin concentration in blood are provided. Representative results for anemic blood samples are also presented.

光熱角度光散乱ラピッド・化学・フリーヘモグロビンアッセイ

Photo-thermal angular light scattering (PT-AS) is a novel optical method for measuring the hemoglobin concentration ([Hb]) of blood samples. On the basis ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Bioengineering

9.6K ビュー.  Yonsei University. A photo-thermal angular light scattering (PT-AS) sensor enables the rapid and chemical-free hemoglobin assay of nanoliter-scale blood samples. Here, details of the PT-AS setup and a measurement protocol for the hemoglobin concentration in blood are provided. Representative results for anemic blood samples are also presented.

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Rapid Subtractive Patterning of Live Cell Layers with a Microfluidic Probe

The microfluidic probe (MFP) facilitates performing local chemistry on biological substrates by confining nanoliter volumes of liquids. Using one particular implementation of the MFP, the hierarchical hydrodynamic flow confinement (hHFC), multiple liquids are simultaneously brought in contact with a substrate. Local chemical action and liquid shaping using the hHFC, is exploited to create cell patterns by locally lysing and removing cells. By utilizing the scanning ability of the MFP, user-defined patterns of cell monolayers are created. This protocol enables rapid, real-time and spatially controlled cell patterning, which can allow selective cell-cell and cell-matrix interaction studies.

We present a protocol to perform subtractive patterning of live cell monolayers on a surface. This is achieved by local and selective lysis of adherent cells using a microfluidic probe (MFP). The cell lysate retrieved from local regions can be used for downstream analysis, enabling molecular profiling studies.

マイクロ流体プローブとのライブの細胞層の急速なサブトラクティブパターニング

The microfluidic probe (MFP) facilitates performing local chemistry on biological substrates by confining nanoliter volumes of liquids. Using one ...

生物工学

Light-mediated Formation and Patterning of Hydrogels for Cell Culture Applications

Click chemistries have been investigated for use in numerous biomaterials applications, including drug delivery, tissue engineering, and cell culture. In particular, light-mediated click reactions, such as photoinitiated thiol&#8722;ene and thiol&#8722;yne reactions, afford spatiotemporal control over material properties and allow the design of systems with a high degree of user-directed property control. Fabrication and modification of hydrogel-based biomaterials using the precision afforded by light and the versatility offered by these thiol&#8722;X photoclick chemistries are of growing interest, particularly for the culture of cells within well-defined, biomimetic microenvironments. Here, we describe methods for the photoencapsulation of cells and subsequent photopatterning of biochemical cues within hydrogel matrices using versatile and modular building blocks polymerized by a thiol&#8722;ene photoclick reaction. Specifically, an approach is presented for constructing hydrogels from allyloxycarbonyl (Alloc)-functionalized peptide crosslinks and pendant peptide moieties and thiol-functionalized poly(ethylene glycol) (PEG) that rapidly polymerize in the presence of lithium acylphosphinate photoinitiator and cytocompatible doses of long wavelength ultraviolet (UV) light. Facile techniques to visualize photopatterning and quantify the concentration of peptides added are described. Additionally, methods are established for encapsulating cells, specifically human mesenchymal stem cells, and determining their viability and activity. While the formation and initial patterning of thiol-alloc hydrogels are shown here, these techniques broadly may be applied to a number of other light and radical-initiated material systems (e.g., thiol-norbornene, thiol-acrylate) to generate patterned substrates.

We describe a sequential process for light-mediated formation and subsequent biochemical patterning of synthetic hydrogel matrices for three-dimensional cell culture applications. The construction and modification of hydrogels with cytocompatible photoclick chemistry is demonstrated. Additionally, facile techniques to quantify and observe patterns and determine cell viability within these hydrogels are presented.

細胞培養アプリケーションのためのヒドロゲルの光媒介形成とパターニング

Click chemistries have been investigated for use in numerous biomaterials applications, including drug delivery, tissue engineering, and cell culture. In ...

Rapid Mix Preparation of Bioinspired Nanoscale Hydroxyapatite for Biomedical Applications

Hydroxyapatite (HA) has been widely used as a medical ceramic due to its good biocompatibility and osteoconductivity. Recently there has been interest regarding the use of bioinspired nanoscale hydroxyapatite (nHA). However, biological apatite is known to be calcium-deficient and carbonate-substituted with a nanoscale platelet-like morphology. Bioinspired nHA has the potential to stimulate optimal bone tissue regeneration due to its similarity to bone and tooth enamel mineral. Many of the methods currently used to fabricate nHA both in the laboratory and commercially, involve lengthy processes and complex equipment. Therefore, the aim of this study was to develop a rapid and reliable method to prepare high quality bioinspired nHA. The rapid mixing method developed was based upon an acid-base reaction involving calcium hydroxide and phosphoric acid. Briefly, a phosphoric acid solution was poured into a calcium hydroxide solution followed by stirring, washing and drying stages. Part of the batch was sintered at 1,000 &#176;C for 2 h in order to investigate the products&#39; high temperature stability. X-ray diffraction analysis showed the successful formation of HA, which showed thermal decomposition to &#946;-tricalcium phosphate after high temperature processing, which is typical for calcium-deficient HA. Fourier transform infrared spectroscopy showed the presence of carbonate groups in the precipitated product. The nHA particles had a low aspect ratio with approximate dimensions of 50 x 30 nm, close to the dimensions of biological apatite. The material was also calcium deficient with a Ca:P molar ratio of 1.63, which like biological apatite is lower than the stoichiometric HA ratio of 1.67. This new method is therefore a reliable and far more convenient process for the manufacture of bioinspired nHA, overcoming the need for lengthy titrations and complex equipment. The resulting bioinspired HA product is suitable for use in a wide variety of medical and consumer health applications.

This paper describes a novel method for the rapid manufacture of high quality bioinspired nanoscale hydroxyapatite. This biomaterial is of great significance in the manufacture of a wide range of innovative medical devices for clinical applications in orthopedics, craniofacial surgery and dentistry.

バイオメディカル応用のためのバイオインスパイアードナノハイドロキシアパタイトの急速なミックス準備

Hydroxyapatite (HA) has been widely used as a medical ceramic due to its good biocompatibility and osteoconductivity. Recently there has been interest ...

Construction and Setup of a Bench-scale Algal Photosynthetic Bioreactor with Temperature, Light, and pH Monitoring for Kinetic Growth Tests

The optimal design and operation of photosynthetic bioreactors (PBRs) for microalgal cultivation is essential for improving the environmental and economic performance of microalgae-based biofuel production. Models that estimate microalgal growth under different conditions can help to optimize PBR design and operation. To be effective, the growth parameters used in these models must be accurately determined. Algal growth experiments are often constrained by the dynamic nature of the culture environment, and control systems are needed to accurately determine the kinetic parameters. The first step in setting up a controlled batch experiment is live data acquisition and monitoring. This protocol outlines a process for the assembly and operation of a bench-scale photosynthetic bioreactor that can be used to conduct microalgal growth experiments. This protocol describes how to size and assemble a flat-plate, bench-scale PBR from acrylic. It also details how to configure a PBR with continuous pH, light, and temperature monitoring using a data acquisition and control unit, analog sensors, and open-source data acquisition software.

This paper describes the assembly process and operation of a bench-scale photosynthetic bioreactor that can be used, in conjunction with other methods, to estimate pertinent kinetic growth parameters. This system continuously monitors the pH, light, and temperature using sensors, a data acquisition and control unit, and open-source data acquisition software.

動力学的成長試験のための温度、光およびpHモニタリングを有するベンチスケール藻類光合成バイオリアクターの構築およびセットアップ

The optimal design and operation of photosynthetic bioreactors (PBRs) for microalgal cultivation is essential for improving the environmental and economic ...

Protocol for MicroRNA Transfer into Adult Bone Marrow-derived Hematopoietic Stem Cells to Enable Cell Engineering Combined with Magnetic Targeting

While CD133+ hematopoietic stem cells (SCs) have been proven to provide high potential in the field of regenerative medicine, their low retention rates after injection into injured tissues as well as the observed massive cell death rates lead to very restricted therapeutic effects. To overcome these limitations, we sought to establish a non-viral based protocol for suitable cell engineering prior to their administration. The modification of human CD133+ expressing SCs using microRNA (miR) loaded magnetic polyplexes was addressed with respect to uptake efficiency and safety as well as the targeting potential of the cells. Relying on our protocol, we can achieve high miR uptake rates of 80&#8211;90% while the CD133+ stem cell properties remain unaffected. Moreover, these modified cells offer the option of magnetic targeting. We describe here a safe and highly efficient procedure for the modification of CD133+ SCs. We expect this approach to provide a standard technology for optimization of therapeutic stem cell effects and for monitoring of the administered cell product via magnetic resonance imaging (MRI).

This protocol illustrates a safe and efficient procedure to modify CD133+ hematopoietic stem cells. The presented non-viral, magnetic polyplex-based approach may provide a basis for the optimization of therapeutic stem cell effects as well as for monitoring the administered cell product via magnetic resonance imaging.

成人骨髄由来造血幹細胞が細胞工学磁気ターゲッティングと結合を有効にするにマイクロ Rna の転送のためのプロトコル

While CD133+ hematopoietic stem cells (SCs) have been proven to provide high potential in the field of regenerative medicine, their low retention rates ...

A Rapid Image-based Bacterial Virulence Assay Using Amoeba

Traditional bacterial virulence assays involve prolonged exposure of bacteria over the course of several hours to host cells. During this time, bacteria can undergo changes in the physiology due to the exposure to host growth environment and the presence of the host cells. We developed an assay to rapidly measure the virulence state of bacteria that minimize the extent to which bacteria grow in the presence of host cells. Bacteria and amoebae are mixed together and immobilized on a single imaging plane using an agar pad. The procedure uses single-cell fluorescence imaging with calcein-acetoxymethyl ester (calcein-AM) as an indicator of host cell health. The fluorescence of host cells is analyzed after 1 h of exposure of host cells to bacteria using epifluorescence microscopy. Image analysis software is used to compute a host killing index. This method has been used to measure virulence within planktonic and surface-attached Pseudomonas aeruginosa sub-populations during the initial stage of biofilm formation and may be adapted to other bacteria and other stages of biofilm growth. This protocol provides a rapid and robust method of measuring virulence and avoids many of the complexities associated with the growth and maintenance of mammalian cell lines. Virulence phenotypes measured here using amoebae have also been validated using mouse macrophages. In particular, this assay was used to establish that surface attachment upregulates virulence in P. aeruginosa.

Here, we present a protocol to measure the virulence of planktonic or surface-attached bacteria using D. discoideum (amoeba) as a host. Virulence is measured over a period of 1 h and host killing is quantified using fluorescence microscopy and image analysis. We demonstrate this protocol using the bacterium P. aeruginosa.

アメーバを用いた急速なイメージに基づく細菌の病原性試験

Traditional bacterial virulence assays involve prolonged exposure of bacteria over the course of several hours to host cells. During this time, bacteria ...

Rapid Characterization of Genetic Parts with Cell-Free Systems

Characterizing and cataloging genetic parts are critical to the design of useful genetic circuits. Having well-characterized parts allows for the fine-tuning of genetic circuits, such that their function results in predictable outcomes. With the growth of synthetic biology as a field, there has been an explosion of genetic circuits that have been implemented in microbes to execute functions pertaining to sensing, metabolic alteration, and cellular computing. Here, we show a rapid and cost-effective method for characterizing genetic parts. Our method utilizes cell-free lysate, prepared in-house as a medium to evaluate parts via the expression of a reporter protein. Template DNA is prepared by PCR amplification using inexpensive primers to add variant parts to the reporter gene, and the template is added to the reaction as linear DNA without cloning. Parts that can be added in this way include promoters, operators, ribosome binding sites, insulators, and terminators. This approach, combined with the incorporation of an acoustic liquid handler and 384-well plates, allows the user to carry out high-throughput evaluations of genetic parts in a single day. By comparison, cell-based screening approaches require time-consuming cloning and have longer testing times due to overnight culture and culture density normalization steps. Further, working in cell-free lysate allows the user to exact tighter control over the expression conditions through the addition of exogenous components and DNA at precise concentrations. Results obtained from cell-free screening can be used directly in applications of cell-free systems or, in some cases, as a way to predict function in whole cells.

Well-characterized genetic parts are necessary for the design of novel genetic circuits. Here we describe a cost-effective, high-throughput method for rapidly characterizing genetic parts. Our method reduces cost and time by combining cell-free lysates, linear DNA to avoid cloning, and acoustic liquid handling to increase throughput and reduce reaction volumes.

無細胞システムによる遺伝子部分の迅速な特性評価

Characterizing and cataloging genetic parts are critical to the design of useful genetic circuits. Having well-characterized parts allows for the ...

Light-Controlled Fermentations for Microbial Chemical and Protein Production

Microbial cell factories offer a sustainable alternative for producing chemicals and recombinant proteins from renewable feedstocks. However, overburdening a microorganism with genetic modifications can reduce host fitness and productivity. This problem can be overcome by using dynamic control: inducible expression of enzymes and pathways, typically using chemical- or nutrient-based additives, to balance cellular growth and production. Optogenetics offers a non-invasive, highly tunable, and reversible method of dynamically regulating gene expression. Here, we describe how to set up light-controlled fermentations of engineered Escherichia coli and Saccharomyces cerevisiae for the production of chemicals or recombinant proteins. We discuss how to apply light at selected times and dosages to decouple microbial growth and production for improved fermentation control and productivity, as well as the key optimization considerations for best results. Additionally, we describe how to implement light controls for lab-scale bioreactor experiments. These protocols facilitate the adoption of optogenetic controls in engineered microorganisms for improved fermentation performance.

Optogenetic control of microbial metabolism offers flexible dynamic control over fermentation processes. The protocol here shows how to set up blue light-regulated fermentations for chemical and protein production at different volumetric scales.

微生物化学およびタンパク質生産のための光制御発酵

Microbial cell factories offer a sustainable alternative for producing chemicals and recombinant proteins from renewable feedstocks. However, ...

In vivo Imaging of Biological Tissues with Combined Two-Photon Fluorescence and Stimulated Raman Scattering Microscopy

Stimulated Raman scattering (SRS) microscopy enables label-free imaging of the biological tissues in its natural microenvironment based on intrinsic molecular vibration, thus providing a perfect tool for in vivo study of biological processes at subcellular resolution. By integrating two-photon excited fluorescence (TPEF) imaging into the SRS microscope, the dual-modal in vivo imaging of tissues can acquire critical biochemical and biophysical information from multiple perspectives which helps understand the dynamic processes involved in cellular metabolism, immune response and tissue remodeling, etc. In this video protocol, the setup of a TPEF-SRS microscope system as well as the in vivo imaging method of the animal spinal cord is introduced. The spinal cord, as part of the central nervous system, plays a critical role in the communication between the brain and peripheral nervous system. Myelin sheath, abundant in phospholipids, surrounds and insulates the axon to permit saltatory conduction of action potentials. In vivo imaging of myelin sheaths in the spinal cord is important to study the progression of neurodegenerative diseases and spinal cord injury. The protocol also describes animal preparation and in vivo TPEF-SRS imaging methods to acquire high-resolution biological images.

In vivo Imaging of Biological Tissues with Combined Two-Photon Fluorescence and Stimulated Raman Scattering Microscopy

Stimulated Raman scattering (SRS) microscopy allows label-free imaging of biomolecules based on their intrinsic vibration of specific chemical bonds. In this protocol, the instrumental setup of an integrated SRS and two-photon fluorescence microscope is described to visualize cellular structures in the spinal cord of live mice.

インビボ で2光子蛍光と誘導ラマン散乱顕微鏡を組み合わせた生体組織のイメージング

Stimulated Raman scattering (SRS) microscopy enables label-free imaging of the biological tissues in its natural microenvironment based on intrinsic ...

A Nonsequencing Approach for the Rapid Detection of RNA Editing

RNA editing is a process that leads to posttranscriptional sequence alterations in RNAs. Detection and quantification of RNA editing rely mainly on Sanger sequencing and RNA sequencing techniques. However, these methods can be costly and time-consuming. In this protocol, a portable microtemperature gradient gel electrophoresis (&#181;TGGE) system is used as a nonsequencing approach for the rapid detection of RNA editing. The process is based on the principle of electrophoresis, which uses high temperatures to denature nucleic acid samples as they move across a polyacrylamide gel. Across a range of temperatures, a DNA fragment forms a gradient of fully double-stranded DNA to partially separated strands and then to entirely separated single-stranded DNA. RNA-edited sites with distinct nucleotide bases produce different melting profiles in &#181;TGGE analyses. We used the &#181;TGGE-based approach to characterize the differences between the melting profiles of four edited RNA fragments and their corresponding nonedited (wild-type) fragments. Pattern Similarity Scores (PaSSs) were calculated by comparing the band patterns produced by the edited and nonedited RNAs and were used to assess the reproducibility of the method. Overall, the platform described here enables the detection of even single base mutations in RNAs in a straightforward, simple, and cost-effective manner. It is anticipated that this analysis tool will aid new molecular biology findings.

Rapid detection and reliable quantification of RNA editing events at a genomic scale remain challenging and currently rely on direct RNA sequencing methods. The protocol described here uses microtemperature gradient gel electrophoresis (&#181;TGGE) as a simple, quick, and portable method of detecting RNA editing.

RNA編集の迅速な検出のためのノンシーケンシングアプローチ

RNA editing is a process that leads to posttranscriptional sequence alterations in RNAs. Detection and quantification of RNA editing rely mainly on Sanger ...