Name: generation of human monocyte-derived dendritic cells from whole blood
Uploaded: 2016-12-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 35 s
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We would like to thank our technician Karolin Thurnes, Divison of Hygiene and Medical Microbiology, and Dr. Annelies M&#252;hlbacher and Dr. Paul H&#246;rtnagl, Central Institute for Blood Transfusion and Immunological Department, for their valuable help and support regarding this manuscript. We thank the Austrian Science Fund for supporting this work (P24598 to DW, P25389 to WP).

倫理の声明：書面によるインフォームドコンセントは、輸血＆免疫学専攻、インスブルック、オーストリア中央研究所によってすべての参加血液ドナーから得ました。科学的な目的のために匿名残りの標本の使用はインスブルック医科大学の倫理委員会によって承認されました。 末梢血単核細胞（PBMC）の1濃縮<ol><li> 遠心分離によるPBMCの濃度。 <ol><li>受け取った血液の量に応じて滅菌50ミリリットルの遠心分離管に血液パックとスプリット血液を開きます。 </li><li>必要に応じて、無菌のダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水（D-PBS）で各チューブのために50ミリリットルにボリュームを調整します。 </li><li>遠心分離にチューブを配置し、ブレーキなしで室温（RT）で15分間400×gでそれらをスピン。 </li><li> boundarを残し、滅菌10ミリリットルの血清学的ピペットを用いて血漿および血小板を含む上層をオフに描きますy層を乱さ。 注：代わりに、FCSの自己血漿を培養培地を補充するために使用される場合、血漿を回収しなければならず、この段階で熱不活性化。 </li><li> 2 50mlの遠心管から単核細胞（境界層）を収集し、滅菌した10ミリリットルの血清学的ピペットを使用して、1つの無菌50mlチューブに移します。 </li><li>滅菌D-PBSを用いて各チューブのための50ミリリットルにボリュームを調整します。 </li><li>遠心分離にチューブを配置し、ブレーキなしでRTで15分間、400×gでそれらをスピン。 </li><li>邪魔されずに境界層を残し、滅菌10ミリリットルの血清学的ピペットを用いて血漿および血小板を含む上層をオフに描画します。 </li><li> 50mlの遠心分離管から単核細胞（境界層）を収集し、滅菌した10ミリリットルの血清学的ピペットを使用して、2つの滅菌50ミリリットルのコレクションチューブに移します。 </li><li>滅菌D-PBSで各チューブのための50ミリリットルにボリュームを調整します。 </li></ol></li><li> 分離密度勾配遠心分離によりPBMCの（図1）。 <ol><li>各チューブに密度勾配媒体の4 50mlチューブおよびピペット15ミリリットルを準備します。 </li><li>コレクションチューブ（ステップ1.1.10）からプールした細胞/血液の25ミリリットルを取り、慎重に密度勾配媒体を重ねます。 </li><li>遠心分離にチューブを配置し、ブレーキなしでRTで30分間、700×gでそれらをスピン。 </li></ol></li><li> PBMCの回収および精製。 <ol><li>滅菌10ミリリットルの血清学的ピペットを用いて、血漿および血小板、乱されていないPBMC層を残すことを含む上層をオフに描画します。 </li><li>すべての管からのPBMCの間期を収集し、滅菌した25ミリリットルの血清学的ピペットを使用して、2つの無菌50mlチューブに細胞をプール。 </li><li>滅菌D-PBSで各チューブのための50ミリリットルにボリュームを調整します。遠心分離にチューブを配置し、ブレーキを4℃で15分間400×gでそれらをスピン。 </li><li>上清を吸引除去し、再懸濁滅菌D-PBSで細胞。両方の管からの細胞をプールし、滅菌D-PBSで50ミリリットルにボリュームを調整します。 </li><li>遠心分離にチューブを配置し、ブレーキを4℃で10分間400×gでそれらをスピン。 </li><li>上清を吸引除去し、滅菌D-PBSで細胞を再懸濁。 D-PBS450μlのを含む1.5 mlチューブに滅菌D-PBSで50mlピペットを50μlにボリュームを調整します。 </li><li>渦1.5mlチューブ激しくノイバウアー室または他の細胞計数器で細胞を数えます。 </li><li>遠心分離機に50ミリリットルチューブを配置し、ブレーキを4℃で10分間400×gでそれらをスピン。 </li></ol></li></ol>抗ヒトCD14磁性粒子による単球の2の単離<ol><li> 磁性粒子とのPBMCの標識。 <ol><li>分離緩衝液を使用して8×10 7細胞/ mlのPBMCの濃度を調整します。 </li><li>渦抗ヒトCD14磁性粒子thoroughlyおよびすべての1×10 7のPBMCのために、粒子の50μlを添加します。 </li><li>徹底的細胞粒子懸濁液を混合し、室温で30分間静置します。 </li></ol></li><li> 正と負の分画の分離。 <ol><li>分離バッファを使用して12ミリリットルにボリュームを最大に調整します。 </li><li>各チューブに細胞粒子懸濁液の6滅菌丸底チューブ、ピペット2ミリリットルを準備します。 </li><li>すぐに磁石上にチューブを置きます。 RTで10分間それをインキュベートします。 </li><li>磁石上にチューブを保持し、上清を注意深く取り除きます。上清は陰性画分が含まれています。 </li><li>磁石からチューブを外し、分離バッファの2ミリリットルを追加します。 </li><li>静かにピペッティングにより細胞を再懸濁します。 </li><li>背面磁石にチューブを入れます。 RTで5分間インキュベートします。 </li><li>磁石上にチューブを保持し、上清を注意深く取り除きます。上清は陰性画分が含まれています。 </li><li>磁石からチューブを取り外し、各チューブに分離バッファの2ミリリットルを追加します。静かにピペッティングにより細胞を再懸濁します。 </li><li>滅菌50mlチューブに陽性画分を移し、滅菌D-PBSを用いて50ミリリットルにボリュームを調整します。 </li></ol></li></ol> IL-4およびGM-CSFと分離された単球の3刺激<ol><li>遠心分離機の中にチューブを配置し、ブレーキを4℃で10分間400×gで、それをスピン。 </li><li>吸引した上清とD-PBS 50ml中で細胞を再懸濁します。 </li><li> D-PBS450μlのを含む1.5 mlチューブにピペットを50μl。渦1.5mlチューブ激しくノイバウアー室または他の細胞計数器で細胞を数えます。 </li><li>遠心分離機に50ミリリットルチューブを配置し、ブレーキを4℃で10分間400×gで、それをスピン。 注：末梢血リンパ球（PBLの）を含む陰性画分は、また、必要な場合は、洗浄を行い、カウントは、Tと同様の工程陽性画分のホース（3.1から3.5ステップ）。 </li><li>予め温めた培地（RPMI 1640、10％熱不活性化FBSおよび1％L-グルタミン溶液を添加した培地）およびピペット3ミリリットル/ウェル、6ウェルプレートに1×10 6個 / mlに細胞濃度を調整します。 注：熱不活化自己血漿を使用している場合は、実験のセットアップに応じて1〜5％の自己血漿と10％のFCSを交換してください。 </li><li>培養培地中に直接サイトカインをピペッティングすることによって、組換えヒトIL-4（250 U / ml）および組換えヒトGM-CSF（千U / ml）を用いて単球を刺激します。 37℃で培養し、5％CO 2。 </li><li>培養培地中に直接サイトカインをピペッティングすることにより48時間後のIL-4（250 U / ml）およびGM-CSF（1,000 U / ml）で細胞を再刺激します。 注：培地中のpH指示薬により示される酸性化の兆候がある場合は、予め温めた培地で培地の半分を交換してください。 </li><li>収穫はのために5日目に、樹状細胞を未成熟しました最大数回上下培地をピペッティングした後、6ウェルプレートのうち、50mlの遠心管に培養細胞をピペッティングすることにより、ダウンストリーム実験。 </li><li>細胞をカウントし、一緒に細胞生存率色素で、のCD11b、CD11cの、およびDC-SIGN / CD209に対する抗ヒト抗体を用いて、単離された単球のサンプルを染色。表面染色時の抗体の非特異的結合を回避するために、試薬またはウシ血清アルブミン（BSA）のバッファをブロックするFc受容体の使用を強くお勧めします。 </li><li>生成されたiDCの純度および生存率を評価するためにフローサイトメトリーを行うことにより、製造業者のプロトコルに従って、細胞生存色素を使用してサンプルを分析します。 </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

このプロトコルは、磁性ナノ粒子ベースのアッセイを用いて抗凝固血液からヒト単球の単離を通して単球由来樹状細胞（MDDCs）の生成を説明しています。このプロトコルでは、遠心分離工程は、PBMC画分の濃縮につながる細胞単離手順、上流で行われます。細胞を遠心分離中に失われているが、密度勾配媒体200〜300ミリリットル必要とする密度勾配媒体の全血パックの内容をオーバーレイし、したがって、コスト効率的と考えることができません。また、積極的分離プロセス中に抗ヒトCD14磁性粒子の付着に影響クリーナー細胞集団における遠心分離結果のPBMCの濃縮。さらに、様々なDCサブセットまたはマクロファージのインビトロ分化のために使用することができる生存可能な単球集団における単球結果、磁性ナノ粒子の分離。 <p class= &quot;jove_content&quot;&gt;組織培養またはゼラチンコーティングしたプラスチック皿上遵守媒介精製のような過去に使用され、他のプロトコルに比べてこの技術の利点は、高純度で単離された細胞集団の均質性だけでなく、利便性がありますそして、スピード。細胞を操作するとき、一般的には、非生理的条件への長期暴露を避けるために迅速が、十分に機能することが重要です。このプロトコルで使用される抗ヒトCD14磁性粒子が正の選択またはCD14保有白血球の枯渇のために最適化されています。そのため、磁性ナノ粒子は、目的の細胞に直接結合して、手順の後に削除されません。これは、特定の実験や分析が実行される前に、結果に影響を与えたり、細胞に結合した磁性ナノ粒子によって変更される可能性があるので、研究者は、対処しなければならない問題である可能性があります。代替的に、ネガティブ選択アッセイは、不要な細胞を枯渇させるために、Kのように設計され、利用可能です手付かずの目的の細胞をEEP。 MDDCsの世代のために、単球を単離するために使用される抗ヒトCD14磁性ナノ粒子はMDDCs、ダウンレギュレートCD14受容体をサイトカインで刺激した単球への分化の間に、ので、何の合併症を提示していません。したがって、磁性ナノ粒子は、さらに、溶出または脱着手順なしに除去され、そしてMDDCsは、フローサイトメトリーによるCD14受容体の発現について陰性で試験されます。 FCSを含む培養培地は、このプロトコルにおける分化の間に使用されているので、ここで得られたMDDCsは、研究用途のためのものです。臨床現場でMDDCsのために、血清を必要とせず、特別なメディアが開発されています。また、自己血漿を最初に遠心分離工程（ステップ1.1.4）後に回収することができ、熱不活性化、および培地に使用されます。自己血漿に加え、市販のヒト血漿はまた、Xenogen社に長期アッセイにおける可能なバックグラウンド反応性を回避するために、培地に添加することができますFCSでEICタンパク質。 あるいは、樹状細胞は、直接、皮膚または粘膜生検から単離することができ、またはex子宮を得た臍帯血サンプルから単離されたCD34 +造血前駆細胞から開発することができます。 生検からのDCの直接単離が実行するより複雑であるので、それにもかかわらず、MDDCsは、樹状細胞のために最も広く使用されているモデルです。それはまた、多くの場合、ドナーの品質の違いによる変化する非効率的な細胞数をもたらすことができます。 DCは、臍帯血から単離されたCD34 +幹細胞から生成された場合にも同様の問題が発生することができます。 将来のアプリケーションのために、誘導多能性幹細胞（iPS細胞）は、代わりに、血液からの単球のCD14磁気ビーズ分離を使用することができます。 iPS細胞を使用する利点は、DCサブセットが、関心のあるすべての造血細胞だけでなく、一人のドナー（T細胞、B細胞、およびNK Cから生成することができることですells）その患者特有の性IPSCは、パーソナライズされた方法で自己免疫細胞の相互作用を特徴付けるために使用することができます。 遠心分離機のブレーキをオフにすると、赤と白の血液細胞の正確な分離のみ達成されるので、単球の単離の間に最も重要なステップは、密度勾配遠心分離工程です。これは、ダウンストリームの分離効率の結果を決定します。 結論として、このプロトコルは、抗凝固血液からヒト単球の単離を通じて実行可能で均質な単球由来樹状細胞集団を生成するために、非常に、高速で効率的、かつ費用対効果の高い方法です。

樹状細胞（DC）は、我々の免疫系の最も重要な特殊な抗原提示細胞です。未成熟DC（iDCを）は、皮膚または粘膜組織に存在し、侵入する病原体と対話するための最初の免疫細胞の間で、したがってあります。彼らは病原体検出、次のTおよびB細胞応答を活性化することができますので、DCは、先天性および適応免疫系1との間のブリッジを表します。さらに、それらは、IL-1β、IL-6、およびIL-12などのためのサイトカインの多量の分泌の前炎症性免疫応答に寄与する。 DCはまた、NK細胞を活性化および走化性によって感染部位に他の免疫細胞を引き付けます。 DCは、未成熟樹状細胞（iDCを）とその形態および機能に基づいて、成熟樹状細胞（mDCの）2に分けることができます。多くのパターン認識受容体（ 例えば、Toll様受容体、C型の1による外来抗原の認識後レクチン、または豊富に細胞表面に発現）受容体を補完する、iDCをは大きな変化を受け、成熟し始めます。この成熟過程の間に、抗原捕獲のための受容体はダウンレギュレートされ、抗原提示に必須の分子がアップレギュレートされている一方、3。成熟DCアップレギュレート主要組織適合遺伝子複合体の抗原提示およびTリンパ球の活性化に必須であるCD80およびCD86のようなIおよびII（MHC I及びII）、共刺激分子、。さらに、細胞表面上のケモカイン受容体CCR7の発現は、リンパ節への末梢組織からのDCの移動を可能にする、誘導されます。移行は、リンパ節4-6のケモカインリガンド19（CCL19 / MIP-3B）およびケモカインリガンド21（CCL21 / SLC）の勾配に沿ってDCの「ローリング」によって促進されます。 移行後、mDCのは、このように、INI、CD4 +およびCD8 + T細胞をナイーブために処理抗原を提示します侵入病原体7に対する適応免疫応答をtiating。リンパ節におけるT細胞とのこの相互作用は、ウイルス8の広がりに関連しています。他のインビトロの研究では、DCが効率的に捕捉し、活発な感染9-12にこの送信結果T細胞へとすることをHIVを移すことを明らかにしました。これらの実験は、リンパ節への周囲からのシャトルバスとしてそのin vivoでの HIVの悪用のDCを強調表示します。抗原提示の間、DCは、エフェクターTヘルパー細胞の分化を形成し、したがって、微生物に対する全免疫応答の結果は、この非常に相互作用で決定されたキーのインターロイキンを分泌します。別にタイプ1（のTh1）および2型（Th2の）エフェクターT細胞、CD4 + Tヘルパー細胞の他のサブセット（ 例えば、タイプ17（Th17細胞）およびタイプ22（TH22）T細胞）が記載されており、それらの誘導から、および機能は徹底的に研究されてきました。 DCはさらに、に関与しています制御性T細胞（Treg）13,14の世代。これらの細胞は免疫抑制性であり、停止または誘導またはエフェクターT細胞の増殖をダウンレギュレートし、従って免疫寛容を開発するために重要であることができます。 人間従来のDC（のCDC）は、骨髄起源（ すなわち、ランゲルハンス細胞（LCS）と皮膚との間質のDC）またはリンパ系起源（ すなわち、形質のDC（pDCに））を用いた細胞のいくつかのサブセットを含みます。 インビトロ実験またはDCワクチン接種戦略は、単球由来のDCは、日常的に、皮膚のDCのモデルとして使用されています。これらの細胞は、従来の骨髄樹状細胞への生理、形態学、および機能の類似性を示します。これらは、健康なドナー12,15-18から単離された単球のインターロイキン4（IL-4）および顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）を添加することによって生成されます。樹状細胞は、直接、皮膚または粘膜生検から単離することができる、またはできても、Beは子宮外を得た臍帯血サンプルから単離したCD34 +造血前駆細胞から開発します。ここでは、単球を単離し、密度勾配遠心分離により末梢血単核細胞（PBMC）、濃縮した後、抗凝固処理ヒト血液から刺激される方法を示しています。 5日間インキュベートした後、特定の条件下でヒト単球は、iDCをに分化され、非臨床設定において実験手順の準備ができています。

<table><tbody><tr><td>APC Mouse Anti-Human CD19 Clone HIB19</td><td>BD Biosciences</td><td>555415</td><td></td></tr><tr><td>APC Mouse Anti-Human CD83 Clone HB15e</td><td>BD Biosciences</td><td>551073</td><td></td></tr><tr><td>BD Imag Anti-Human CD14 Magnetic Particles</td><td>BD Biosciences</td><td>557769</td><td></td></tr><tr><td>BD Imagnet</td><td>BD Biosciences</td><td>552311</td><td></td></tr><tr><td>BSA (Albumin Fraction V)</td><td>Carl Roth</td><td>EG-Nr 2923225</td><td></td></tr><tr><td>Costar 6 Well Clear TC-Treated Multiple Well Plates</td><td>Costar</td><td>3506</td><td></td></tr><tr><td>Density gradient media: Ficoll-Paque Premium</td><td>GE Healthcare Bio-Sciences</td><td>17-5442-03</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s Phosphate Buffered Saline (D-PBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 10&amp;nbsp;ml Serological Pipet</td><td>Corning</td><td>357551</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 25&amp;nbsp;ml Serological Pipet</td><td>Corning</td><td>357525</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 50&amp;nbsp;ml High Clarity PP Centrifuge Tube</td><td>Corning</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Round-Bottom Tubes</td><td>Corning</td><td>352054</td><td></td></tr><tr><td>FITC Mouse Anti-Human CD3 Clone HIT3a</td><td>BD Biosciences</td><td>555339</td><td></td></tr><tr><td>Ghost Dye Violet 510 (Cell Viability Reagent)</td><td>Tonbo biosciences</td><td>13-0870</td><td></td></tr><tr><td>GM-CSF</td><td>MACS Miltenyi Biotec</td><td>130-093-862</td><td></td></tr><tr><td>Heat Inactivated FBS (Fetal Bovine Serum), EU Approved Origin (South America)</td><td>Gibco</td><td>10500-064</td><td></td></tr><tr><td>Hettich Rotanta 460R</td><td>Hettich</td><td>---</td><td></td></tr><tr><td>IL-4 CC</td><td>PromoKine</td><td>C-61401</td><td></td></tr><tr><td>Isolation buffer: BD IMag Buffer (10x)</td><td>BD Biosciences</td><td>552362</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine solution</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7513</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifuge tubes, 1.5 ml, SuperSpin</td><td>VWR</td><td>211-0015</td><td></td></tr><tr><td>PE Mouse Anti-Human CD14 Clone M5E2</td><td>BD Biosciences</td><td>555398</td><td></td></tr><tr><td>PE Mouse Anti-Human CD209 Clone DCN46</td><td>BD Biosciences</td><td>551265</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640 medium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R0883</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0</td><td>Invitrogen</td><td>15575020</td><td></td></tr></tbody></table>

generation of human monocyte-derived dendritic cells from whole blood

Dendritic cells (DCs) recognize foreign structures of different pathogens, such as viruses, bacteria, and fungi, via a variety of pattern recognition receptors (PRRs) expressed on their cell surface and thereby activate and regulate immunity. 
The major function of DCs is the induction of adaptive immunity in the lymph nodes by presenting antigens via MHC I and MHC II molecules to na&#239;ve T lymphocytes. Therefore, DCs have to migrate from the periphery to the lymph nodes after the recognition of pathogens at the sites of infection. For in vitro experiments or DC vaccination strategies, monocyte-derived DCs are routinely used. These cells show similarities in physiology, morphology, and function to conventional myeloid dendritic cells. They are generated by interleukin 4 (IL-4) and granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) stimulation of monocytes isolated from healthy donors. Here, we demonstrate how monocytes are isolated and stimulated from anti-coagulated human blood after peripheral blood mononuclear cell (PBMC) enrichment by density gradient centrifugation. Human monocytes are differentiated into immature DCs and are ready for experimental procedures in a non-clinical setting after 5 days of incubation.

スクロースクッションを用いて抗凝固処理血液の遠心分離後、末梢血単核細胞（PBMC）は、密度勾配媒体（ 図1）の上に中間相が富化されています。 PBMCを引き出された後、FACS分析は、（Bリンパ球のために、例えば、Tリンパ球のためのCD3、単球のためのCD14、およびCD19）系列マーカーを用いたPBMC内の異なる細胞集団を特徴付けるために行われます。 図2Aは、密度勾配遠心分離後に回収し、染色したPBMCの代表的なFACS分析の結果を示します。ゲートされた人口（ 図2A、上のプロット）のうち、我々は、4.03パーセントのBリンパ球、28.20パーセントの単球、および43.62パーセントは、Tリンパ球（ 図2A、下のプロットそのうち67.62パーセント、他の細胞（ 図2A、中央のプロット）を、検出されました）。 PBMCは、次にwをインキュベートします磁石のインキュベーション後のi番目のCD14磁性粒子は、末梢血リンパ球（PBLの）を含む陰性画分は、上記の系統マーカーの選択を使用してFACSにより分析します。 6.59パーセント、 図2BをしたPBMCと比較すると、我々は、Bリンパ球（4.65パーセント、 図2B、中段プロット）、他の細胞（88.61パーセント、 図2B、中段プロット）のより高い割合の同様の割合を測定し、単球の強力減少割合（ 、中央のプロット）。陽性画分（ 図3）の特徴は、単離された細胞の純度は97％（ 図3、左のプロット）、これは99.56％で（ 図3、右のプロット）であるため、高い分離効率を実証したCD14を高レベルで発現し細胞表面上。 5日間単球のIL4およびGM-CSF刺激は、単球由来樹状細胞への分化をもたらします匹敵するのは、形態学、行動、および受容体の発現19における樹状細胞を真皮します。 5日目の単球由来樹状細胞のFACS分析は、のCD11b、CD11cの（図示せず）、およびC型レクチンDC-SIGNを高レベルで発現する相同な集団（ 図4、左のプロット）を示しています。 DC成熟マーカーCD83の発現は（ 図4、右のプロット）が検出されず、細胞は、単球マーカーCD14（図示せず）を失います。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/54968/54968fig1.jpg" /> 図1：密度勾配遠心分離により血液成分の分離。 PBMCを密度勾配遠心分離により分離媒体の上に相間に富んでいます。 （左）と後（右）遠心分離前の層が示されています。 <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54968/54968fig1large.jpg" target="_blank">お願いします</a>この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/54968/54968fig2.jpg" /> 図2：フローサイトメトリーは、PBMCを（A）とのPBL（B）の分析します。 （A）PBMCを回収系統マーカー（マウス抗ヒトCD3、CD14、およびCD19抗体）について染色し、そしてフローサイトメトリーにより分析します。代表的な結果のドットプロットが示されています。 （B）のPBLを含む陰性画分は系統マーカー（マウス抗ヒトCD3、CD14、およびCD19抗体）を特徴とし、フローサイトメトリーにより分析します。代表的な結果のドットプロットが示されています。 <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54968/54968fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/54968/54968fig3.jpg" /> <strong&gt;図3：フローサイトメトリーは、単球の分析します。単離された単球（陽性画分）は、系列マーカー（マウス抗ヒトCD3、CD14、およびCD19抗体）を用いて特徴付けし、フローサイトメトリーにより分析します。代表的な結果のドットプロットが示されています。 <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/54968/54968fig4.jpg" /> 図4： フローサイトメトリーは、単球由来樹状細胞の解析します。単球は、IL4およびGM-CSFで5日間刺激し、特性のCD11b、CD11cの（図示せず）のようなDCマーカー、C型レクチンDC-SIGN、および成熟マーカーCD83について染色されています。代表的な結果のドットプロットが示されています。

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Generation of Human Monocyte-derived Dendritic Cells from Whole Blood

Here, we demonstrate how monocytes are isolated by magnetic bead separation from peripheral blood mononuclear cells after density gradient centrifugation of human anti-coagulated blood. Following incubation for 5 days, human monocytes are differentiated into immature dendritic cells and are ready for experimental procedures in a non-clinical setting.

全血からのヒト単球由来樹状細胞の生成

Dendritic cells (DCs) recognize foreign structures of different pathogens, such as viruses, bacteria, and fungi, via a variety of pattern recognition ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

20.1K ビュー.  Medical University of Innsbruck. Here, we demonstrate how monocytes are isolated by magnetic bead separation from peripheral blood mononuclear cells after density gradient centrifugation of human anti-coagulated blood. Following incubation for 5 days, human monocytes are differentiated into immature dendritic cells and are ready for experimental procedures in a non-clinical setting.

ビデオ: Generation of Human Monocyte-derived Dendritic Cells from Whole Blood

Culture of myeloid dendritic cells from bone marrow precursors

Myeloid dendritic cells (DCs) are frequently used to study the interactions between innate and adaptive immune mechanisms and the early response to infection. Because these are the most potent antigen presenting cells, DCs are being increasingly used as a vaccine vector to study the induction of antigen-specific immune responses. In this video, we demonstrate the procedure for harvesting tibias and femurs from a donor mouse, processing the bone marrow and differentiating DCs in vitro. The properties of DCs change following stimulation: immature dendritic cells are potent phagocytes, whereas mature DCs are capable of antigen presentation and interaction with CD4+ and CD8+ T cells. This change in functional activity corresponds with the upregulation of cell surface markers and cytokine production. Many agents can be used to mature DCs, including cytokines and toll-like receptor ligands. In this video, we demonstrate flow cytometric comparisons of expression of two co-stimulatory molecules, CD86 and CD40, and the cytokine, IL-12, following overnight stimulation with CpG or mock treatment. After differentiation, DCs can be further manipulated for use as a vaccine vector or to generate antigen-specific immune responses by in vitro pulsing using peptides or proteins, or transduced using recombinant viral vectors. 

This video demonstrates the procedure for differentiating myeloid dendritic cells from mouse bone marrow. Isolation of mouse tibia and femur, and processing of bone marrow are demonstrated. Pictures demonstrating cell morphology before and after differentiation, and figures depicting cell phenotype and IL-12 production following maturation using CpG are shown.

骨髄前駆細胞から骨髄樹状細胞の培養

Myeloid dendritic cells (DCs) are frequently used to study the interactions between innate and adaptive immune mechanisms and the early response to ...

生物学

Generation of Bone Marrow Derived Murine Dendritic Cells for Use in 2-photon Imaging

Several methods for the preparation of murine dendritic cells can be found in the literature. Here, we present a method that produces greater than 85% CD11c high dendritic cells in culture that home to the draining lymph node after subcutaneous injection and present antigen to antigen specific T cells (see video). Additionally, we use Essen Instruments Incucyte to track dendritic cell maturation, where, at day 10, the morphology of the cultured cells is typical of a mature dendritic cell and &lt;85% of cells are CD11chigh. The study of antigen presentation in peripheral lymph nodes by 2-photon imaging revealed that there are three distinct phases of dendritic cell and T cell interaction1, 2. Phase I consists of brief serial contacts between highly motile antigen specific T cells and antigen carrying dendritic cells1, 2. Phase two is marked by prolonged contacts between antigen-specific T cell and antigen bearing dendritic cells1, 2. Finally, phase III is characterized by T cells detaching from dendritic cells, regaining motility and beginning to divide1, 2. This is one example of the type of antigen-specific interactions that can be analyzed by two-photon imaging of antigen-loaded cell tracker dye-labeled dendritic cells.

Antigen presentation in secondary lymphoid organs by dendritic cells is crucial for the initiation of the T cell mediated adaptive immune response. Here we demonstrate the culture of bone marrow derived murine dendritic cells, activation, and labeling for 2-photon imaging.

2光子イメージングで使用するための骨髄由来マウス樹状細胞の世代

Several methods for the preparation of murine dendritic cells can be found in the literature. Here, we present a method that produces greater than 85% ...

Isolation and Intravenous Injection of Murine Bone Marrow Derived Monocytes

As a subtype of leukocytes and progenitors of macrophages, monocytes are involved in many important processes of organisms and are often the subject of various fields in biomedical science. The method described below is a simple and effective way to isolate murine monocytes from heterogeneous bone marrow.
Bone marrow from the femur and tibia of Balb/c mice is harvested by flushing with phosphate buffered saline (PBS). Cell suspension is supplemented with macrophage-colony stimulating factor (M-CSF) and cultured on ultra-low attachment surfaces to avoid adhesion-triggered differentiation of monocytes. The properties and differentiation of monocytes are characterized at various intervals. Fluorescence activated cell sorting (FACS), with markers like CD11b, CD115, and F4/80, is used for phenotyping. At the end of cultivation, the suspension consists of 45%&#177; 12% monocytes. By removing adhesive macrophages, the purity can be raised up to 86%&#177; 6%. After the isolation, monocytes can be utilized in various ways, and one of the most effective and common methods for in vivo delivery is intravenous tail vein injection. 
This technique of isolation and application is important for mouse model studies, especially in the fields of inflammation or immunology. Monocytes can also be used therapeutically in mouse disease models.

Here we present a protocol that generates large amounts of murine monocytes from heterogeneous bone marrow for translational applications. In comparison to others, this new method helps reduce the number of sacrificed animals and lowers costs by avoiding expensive methods such as high gradient magnetic cell separation (MACS).

単離とマウス骨髄由来の単球の静脈注射

As a subtype of leukocytes and progenitors of macrophages, monocytes are involved in many important processes of organisms and are often the subject of ...

免疫・感染学

Generation of Immature, Mature and Tolerogenic Dendritic Cells with Differing Metabolic Phenotypes

Immune response results from a complex interplay between the antigen non-specific innate immune system and the antigen specific adaptive immune system. The immune system is a constant balance in maintaining tolerance to self-molecules and reacting rapidly to pathogens. Dendritic cells (DCs) are powerful professional antigen presenting cells that link the innate immune system to the adaptive immune system and balance the adaptive response between self and non-self. Depending on the maturation signals, immature dendritic cells can be selectively stimulated to differentiate into immunogenic or tolerogenic DCs. Immunogenic dendritic cells provide proliferation signals to antigen-specific T cells for clonal expansion; while tolerogenic dendritic cells regulate tolerance by antigen-specific T-cell deletion or clonal expansion of regulatory T-cells. Due to this unique property, dendritic cells are highly sought after as therapeutic agents for cancer and autoimmune diseases. Dendritic cells can be loaded with specific antigens in vitro and injected into the human body to mount a specific immune response both immunogenic and tolerogenic. This work presents a means to generate in vitro from monocytes, immature monocyte derived dendritic cells (moDCs), tolerogenic and mature moDCs that differ in surface marker expression, function and metabolic phenotypes.

Immature dendritic cells can be selectively differentiated into tolerogenic or mature dendritic cells to regulate the balance between immunity and tolerance. This work presents a means to generate from immature monocyte derived dendritic cells (moDCs), in vitro tolerogenic and mature moDCs that differ in metabolic phenotypes.

代謝表現型が異なる未熟、熟女と寛容原性樹状細胞の生成

Immune response results from a complex interplay between the antigen non-specific innate immune system and the antigen specific adaptive immune system. ...

Characterization of Human Monocyte-derived Dendritic Cells by Imaging Flow Cytometry: A Comparison between Two Monocyte Isolation Protocols

Dendritic cells (DCs) are antigen presenting cells of the immune system that play a crucial role in lymphocyte responses, host defense mechanisms, and pathogenesis of inflammation. Isolation and study of DCs have been important in biological research because of their distinctive features. Although they are essential key mediators of the immune system, DCs are very rare in blood, accounting for approximately 0.1 - 1% of total blood mononuclear cells. Therefore, alternatives for isolation methods rely on the differentiation of DCs from monocytes isolated from peripheral blood mononuclear cells (PBMCs). The utilization of proper isolation techniques that combine simplicity, affordability, high purity, and high yield of cells is imperative to consider. In the current study, two distinct methods for the generation of DCs will be compared. Monocytes were selected by adherence or negatively enriched using magnetic separation procedure followed by differentiation into DCs with IL-4 and GM-CSF. Monocyte and MDDC viability, proliferation, and phenotype were assessed using viability dyes, MTT assay, and CD11c/ CD14 surface marker analysis by imaging flow cytometry. Although the magnetic separation method yielded a significant higher percentage of monocytes with higher proliferative capacity when compared to the adhesion method, the findings have demonstrated the ability of both techniques to simultaneously generate monocytes that are capable of proliferating and differentiating into viable CD11c+ MDDCs after seven days in culture. Both methods yielded &gt; 70% CD11c+ MDDCs. Therefore, our results provide insights that contribute to the development of reliable methods for isolation and characterization of human DCs.

This study compares two different methods of human monocyte isolation for obtaining in vitro dendritic cells (DCs). Monocytes are selected by adherence or negatively enriched by magnetic separation. Monocyte yield and viability along with MDDC viability, proliferation and CD11c/CD14 surface marker expression will be compared between both methods.

イメージングフローサイトメトリーによるヒト単球由来樹状細胞の特徴付け：二つの単球の分離プロトコルの比較

Dendritic cells (DCs) are antigen presenting cells of the immune system that play a crucial role in lymphocyte responses, host defense mechanisms, and ...

Generation of Large Numbers of Myeloid Progenitors and Dendritic Cell Precursors from Murine Bone Marrow Using a Novel Cell Sorting Strategy

Cultures of monocyte-derived dendritic cells (moDC) generated from mouse bone marrow using Granulocyte-Macrophage Colony Stimulating Factor (GM-CSF) have recently been recognized to be more heterogeneous than previously appreciated. These cultures routinely contain moDC as well monocyte-derived macrophages (moMac), and even some less developed cells such as monocytes. The goal of this protocol is to provide a consistent method for identification and separation of the many cell types present in these cultures as they develop, so that their specific functions may be further investigated. The sorting strategy presented here separates cells first into four populations based on expression of Ly6C and CD115, both of which are expressed transiently by cells as they develop in GM-CSF-driven culture. These four populations include Common myeloid progenitors or CMP (Ly6C-, CD115-), granulocyte/macrophage progenitors or GMP (Ly6C+, CD115-), monocytes (Ly6C+, CD115+), and monocyte-derived macrophages or moMac (Ly6C-, CD115+). CD11c is also added to the sorting strategy to distinguish two populations within the Ly6C-, CD115- population: CMP (CD11c-) and moDC (CD11c+). Finally, two populations may be further distinguished within the Ly6C-, CD115+ population based on the level of MHC class II expression. MoMacs express lower levels of MHC class II, while a monocyte-derived DC precursor (moDP) expresses higher MHC class II. This method allows for the reliable isolation of several developmentally distinct populations in numbers sufficient for a variety of functional and developmental analyses. We highlight one such functional readout, the differential responses of these cell types to stimulation with Pathogen-Associated Molecular Patterns (PAMPs).

Here we provide a method for identifying and isolating large numbers of GM-CSF driven myeloid cells using high speed cell sorting. Five distinct populations (Common myeloid progenitors, granulocyte/macrophage progenitors, monocytes, monocyte-derived macrophages, and monocyte-derived DCs) can be identified based on Ly6C and CD115 expression.

大量の骨髄前駆細胞と新規セルソーティング戦略を使用してマウスの骨髄から樹状細胞前駆体の生成

Cultures of monocyte-derived dendritic cells (moDC) generated from mouse bone marrow using Granulocyte-Macrophage Colony Stimulating Factor (GM-CSF) have ...

Determination of Vaccine Immunogenicity Using Bovine Monocyte-Derived Dendritic Cells

Dendritic cells (DCs) are the most potent antigen-presenting cells (APCs) within the immune system. They patrol the organism looking for pathogens and play a unique role within the immune system by linking the innate and adaptive immune responses. These cells can phagocytize and then present captured antigens to effector immune cells, triggering a diverse range of immune responses. This paper demonstrates a standardized method for the in vitro generation of bovine monocyte-derived dendritic cells (MoDCs) isolated from cattle peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) and their application in evaluating vaccine immunogenicity.
Magnetic-based cell sorting was used to isolate CD14+ monocytes from PBMCs, and the supplementation of complete culture medium with interleukin (IL)-4 and granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) was used to induce the differentiation of CD14+ monocytes into naive MoDCs. The generation of immature MoDCs was confirmed by detecting the expression of major histocompatibility complex II (MHC II), CD86, and CD40 cell surface markers. A commercially available rabies vaccine was used to pulse the immature MoDCs, which were subsequently co-cultured with naive lymphocytes.
The flow cytometry analysis of the antigen-pulsed MoDCs and lymphocyte co-culture revealed the stimulation of T lymphocyte proliferation through the expression of Ki-67, CD25, CD4, and CD8 markers. The analysis of the mRNA expression of IFN-&#947; and Ki-67, using quantitative PCR, showed that the MoDCs could induce the antigen-specific priming of lymphocytes in this in vitro co-culture system. Furthermore, IFN-&#947; secretion assessed using ELISA showed a significantly higher titer (**p &#60; 0.01) in the rabies vaccine-pulsed MoDC-lymphocyte co-culture than in the non-antigen-pulsed MoDC-lymphocyte co-culture. These results show the validity of this in vitro MoDC assay to measure vaccine immunogenicity, meaning this assay can be used to identify potential vaccine candidates for cattle before proceeding with in vivo trials, as well as in vaccine immunogenicity assessments of commercial vaccines.

The methodology describes the generation of bovine monocyte-derived dendritic cells (MoDCs) and their application for the in vitro evaluation of antigenic candidates during the development of potential veterinary vaccines in cattle.

ウシ単球由来樹状細胞を用いたワクチン免疫原性の決定

Dendritic cells (DCs) are the most potent antigen-presenting cells (APCs) within the immune system. They patrol the organism looking for pathogens and ...

シアリダーゼ処理を用いた単離PBMCからの脱シアル化単球誘導型DC

Generation of Monocyte-Derived Dendritic Cells with Differing Sialylated Phenotypes

Sialic acids are negatively charged monosaccharides typically found at the termini of cell surface glycans. Due to their hydrophilicity and biophysical characteristics, they are involved in numerous biological processes, such as modulation of the immune response, recognition of self and non-self antigens, carbohydrate-protein interactions, etc. The cellular content of sialic acid is regulated by sialidase, which catalyzes the removal of sialic acid residues. Several studies have shown that sialo-glycans are critical in monitoring immune surveillance by engaging with cis and trans inhibitory Siglec receptors on immune cells. Likewise, glyco-immune checkpoints in cancer are becoming crucial targets for developing immunotherapies. Additionally, dendritic cells (DCs) are envisioned as an important component in immunotherapies, especially in cancer research, due to their unique role as professional antigen-presenting cells (APC) and their capacity to trigger adaptive immune responses and generate immunologic memory. Nevertheless, the function of DCs is dependent on their full maturation. Immature DCs have an opposing function to mature DCs and a high sialic acid content, which further dampens their maturation level. This downregulates the ability of immature DCs to activate T-cells, leading to a compromised immune response. Consequently, removing sialic acid from the cell surface of human DCs induces their maturation, thus increasing the expression of MHC molecules and antigen presentation. In addition, it can restore the expression of co-stimulatory molecules and IL-12, resulting in DCs having a higher ability to polarize T-cells toward a Th1 phenotype and specifically activate cytotoxic T-cells to kill tumor cells. Therefore, sialic acid has emerged as a key modulator of DCs and is being used as a novel target to advance their therapeutic use. This study provides a unique approach to treat in vitro monocyte-derived DCs with sialidase, aimed at generating DC populations with different cell surface sialic acid phenotypes and tailored maturation and co-stimulatory profiles.

著者スポットライト:細胞表面のシアリダーゼベースの酵素処理を使用した樹状細胞の成熟 

A unique, comprehensive protocol to generate de-sialylated human monocyte-derived dendritic cells (mo-DCs) from isolated peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) using a sialidase treatment is presented. Further, methods to assess the phenotypic and functional characterization of mo-DCs and evaluate how sialidase treatment improves the maturation level of mo-DCs are described.

シアル化表現型の異なる単球由来樹状細胞の作製

Sialic acids are negatively charged monosaccharides typically found at the termini of cell surface glycans. Due to their hydrophilicity and biophysical ...

全血からのヒト単球由来樹状細胞の生成

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シアル化表現型の異なる単球由来樹状細胞の作製

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