The authors thank B. Gruchmann for the mechanical drawings of the flow chamber. Further, we want to express our gratitude to Max Beckers and Florian Drechsler for insightful comments and discussions regarding NPS and the underlying sampling engine.

<ol>
	<li>Cheng, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Particle+Cryo-EM+at+Crystallographic+Resolution.">Single-Particle Cryo-EM at Crystallographic Resolution.</a> Cell. 161, 450-457 (2015).</li><li>Garman, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developments+in+X-ray+Crystallographic+Structure+Determination+of+Biological+Macromolecules.">Developments in X-ray Crystallographic Structure Determination of Biological Macromolecules.</a> Science. 343 (6175), 1102-1108 (2014).</li><li>Sali, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Outcome+of+the+First+wwPDB+Hybrid/Integrative+Methods+Task+Force+Workshop.">Outcome of the First wwPDB Hybrid/Integrative Methods Task Force Workshop.</a> Structure. 23, 1156-1167 (2015).</li><li>Hopfner, K. P., Michaelis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+nucleic+acid+translocases:+lessons+from+structural+biology+and+single-molecule+biophysics.">Mechanisms of nucleic acid translocases: lessons from structural biology and single-molecule biophysics.</a> Curr Opin Struct Biol. 17, 87-95 (2007).</li><li>Ando, T., Uchihashi, T., Kodera, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-speed+AFM+and+applications+to+biomolecular+systems.">High-speed AFM and applications to biomolecular systems.</a> Annu Rev Biophys. 42, 393-414 (2013).</li><li>Neuman, K. K. C., Nagy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+force+spectroscopy:+optical+tweezers,+magnetic+tweezers+and+atomic+force+microscopy.">Single-molecule force spectroscopy: optical tweezers, magnetic tweezers and atomic force microscopy.</a> Nat Methods. 5, 491-505 (2008).</li><li>Yildiz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myosin+V+walks+hand-over-hand:+single+fluorophore+imaging+with+1.5-nm+localization.">Myosin V walks hand-over-hand: single fluorophore imaging with 1.5-nm localization.</a> Science. 300 (5628), 2061-2065 (2003).</li><li>Joo, C., Balci, H., Ishitsuka, Y., Buranachai, C., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+Single-Molecule+Fluorescence+Methods+for+Molecular+Biology.">Advances in Single-Molecule Fluorescence Methods for Molecular Biology.</a> Annu Rev Biochem. 77 (1), 51-76 (2008).</li><li>Hohlbein, J., Craggs, T. D., Cordes, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternating-laser+excitation:+single-molecule+FRET+and+beyond.">Alternating-laser excitation: single-molecule FRET and beyond.</a> Chem Soc Rev. 43 (4), 1156-1171 (2014).</li><li>Stryer, L., Haugland, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Energy+transfer:+a+spectroscopic+ruler.">Energy transfer: a spectroscopic ruler.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 58 (2), 719-726 (1967).</li><li>Rasnik, I., Myong, S., Cheng, W., Lohman, T. M., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA-binding+Orientation+and+Domain+Conformation+of+the+E.+coli+Rep+Helicase+Monomer+Bound+to+a+Partial+Duplex+Junction:+Single-molecule+Studies+of+Fluorescently+Labeled+Enzymes.">DNA-binding Orientation and Domain Conformation of the E. coli Rep Helicase Monomer Bound to a Partial Duplex Junction: Single-molecule Studies of Fluorescently Labeled Enzymes.</a> J Mol Biol. 336 (2), 395-408 (2004).</li><li>Andrecka, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+tracking+of+mRNA+exiting+from+RNA+polymerase+II.">Single-molecule tracking of mRNA exiting from RNA polymerase II.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (1), 135-140 (2008).</li><li>Schr&#246;der, G. F., Grubm&#252;ller, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FRETsg:+Biomolecular+structure+model+building+from+multiple+FRET+experiments.">FRETsg: Biomolecular structure model building from multiple FRET experiments.</a> Comput Phys Commun. 158 (3), 150-157 (2004).</li><li>Margittai, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+fluorescence+resonance+energy+transfer+reveals+a+dynamic+equilibrium+between+closed+and+open+conformations+of+syntaxin+1.">Single-molecule fluorescence resonance energy transfer reveals a dynamic equilibrium between closed and open conformations of syntaxin 1.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (26), 15516-15521 (2003).</li><li>Kalinin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+toolkit+and+benchmark+study+for+FRET-restrained+high-precision+structural+modeling.">A toolkit and benchmark study for FRET-restrained high-precision structural modeling.</a> Nat Methods. 9 (12), 1218-1227 (2012).</li><li>Choi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N6-methyladenosine+in+mRNA+disrupts+tRNA+selection+and+translation-elongation+dynamics.">N6-methyladenosine in mRNA disrupts tRNA selection and translation-elongation dynamics.</a> Nat Struct Mol Biol. 23 (August 2015), 110-115 (2015).</li><li>Svensson, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FRET-based+trilateration+of+probes+bound+within+functional+ryanodine+receptors.">FRET-based trilateration of probes bound within functional ryanodine receptors.</a> Biophys J. 107 (9), 2037-2048 (2014).</li><li>Stephenson, J. D., Kenyon, J. C., Symmons, M. F., Lever, A. M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+3D+RNA+structure+by+single+molecule+FRET.">Characterizing 3D RNA structure by single molecule FRET.</a> Methods. (2016), 1-11 (2016).</li><li>Lee, N. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate+FRET+measurements+within+single+diffusing+biomolecules+using+alternating-laser+excitation.">Accurate FRET measurements within single diffusing biomolecules using alternating-laser excitation.</a> Biophys J. 88 (4), 2939-2953 (2005).</li><li>McCann, J. J., Choi, U. B., Zheng, L., Weninger, K., Bowen, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimizing+methods+to+recover+absolute+FRET+efficiency+from+immobilized+single+molecules.">Optimizing methods to recover absolute FRET efficiency from immobilized single molecules.</a> Biophys J. 99 (3), 961-970 (2010).</li><li>Brunger, A. T., Strop, P., Vrljic, M., Chu, S., Weninger, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+molecular+modeling+with+single+molecule+FRET.">Three-dimensional molecular modeling with single molecule FRET.</a> J Struct Biol. 173, 497-505 (2011).</li><li>Schuler, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+FRET+of+protein+structure+and+dynamics+-+a+primer.">Single-molecule FRET of protein structure and dynamics - a primer.</a> J nanoboitechnology. 11, 1-17 (2013).</li><li>Choi, U. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+FRET-derived+model+of+the+synaptotagmin+1-SNARE+fusion+complex.">Single-molecule FRET-derived model of the synaptotagmin 1-SNARE fusion complex.</a> Nat Struct Mol Biol. 17 (3), 318-324 (2010).</li><li>Dale, R. E., Eisinger, J., Blumberg, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+orientational+freedom+of+molecular+probes.+The+orientation+factor+in+intramolecular+energy+transfer.">The orientational freedom of molecular probes. The orientation factor in intramolecular energy transfer.</a> Biophys J. 26 (2), 161-193 (1979).</li><li>Kapanidis, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternating-laser+excitation+of+single+molecules.">Alternating-laser excitation of single molecules.</a> Acc Chem Res. 38 (7), 523-533 (2005).</li><li>Muschielok, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+nano-positioning+system+for+macromolecular+structural+analysis.">A nano-positioning system for macromolecular structural analysis.</a> Nat Methods. 5 (11), 965-971 (2008).</li><li>Muschielok, A., Michaelis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+the+nano-positioning+system+to+the+analysis+of+fluorescence+resonance+energy+transfer+networks.">Application of the nano-positioning system to the analysis of fluorescence resonance energy transfer networks.</a> J Phys Chem B. 115 (41), 11927-11937 (2011).</li><li>Andrecka, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nano+positioning+system+reveals+the+course+of+upstream+and+nontemplate+DNA+within+the+RNA+polymerase+ii+elongation+complex.">Nano positioning system reveals the course of upstream and nontemplate DNA within the RNA polymerase ii elongation complex.</a> Nucleic Acids Res. 37 (17), 5803-5809 (2009).</li><li>Treutlein, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+Architecture+of+a+Minimal+RNA+Polymerase+II+Open+Promoter+Complex.">Dynamic Architecture of a Minimal RNA Polymerase II Open Promoter Complex.</a> Mol Cell. 46 (2), 136-146 (2012).</li><li>Nagy, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complete+architecture+of+the+archaeal+RNA+polymerase+open+complex+from+single-molecule.">Complete architecture of the archaeal RNA polymerase open complex from single-molecule.</a> FRET and NPS. Nat Commun. 6, 6161 (2015).</li><li>Grohmann, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Initiation+Factor+TFE+and+the+Elongation+Factor+Spt4/5+Compete+for+the+RNAP+Clamp+during+Transcription+Initiation+and+Elongation.">The Initiation Factor TFE and the Elongation Factor Spt4/5 Compete for the RNAP Clamp during Transcription Initiation and Elongation.</a> Mol Cell. 43 (2), 263-274 (2011).</li><li>Beckers, M., Drechsler, F., Eilert, T., Nagy, J., Michaelis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+structural+information+from+single-molecule+FRET.">Quantitative structural information from single-molecule FRET.</a> Faraday Discuss. 184, 117-129 (2015).</li><li>Bennink, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unfolding+individual+nucleosomes+by+stretching+single+chromatin+fibers+with+optical+tweezers.">Unfolding individual nucleosomes by stretching single chromatin fibers with optical tweezers.</a> Nat Struct Biol. 8 (7), 606-610 (2001).</li><li>Chandradoss, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+passivation+for+single-molecule+protein+studies.">Surface passivation for single-molecule protein studies.</a> J Vis Exp. (86), e50549 (2014).</li><li>W&#252;rth, C., Grabolle, M., Pauli, J., Spieles, M., Resch-Genger, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relative+and+absolute+determination+of+fluorescence+quantum+yields+of+transparent+samples.">Relative and absolute determination of fluorescence quantum yields of transparent samples.</a> Nat Protoc. 8 (8), 1535-1550 (2013).</li><li>Lakowicz, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Principles of Fluorescence Spectroscopy. , (2006).</li><li>Korkhin, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+complex+RNA+polymerases:+The+complete+archaeal+RNA+polymerase+structure.">Evolution of complex RNA polymerases: The complete archaeal RNA polymerase structure.</a> PLoS Biol. 7 (5), (2009).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

私たちは、正確に生体高分子に柔軟なリンカーを介して結合している染料、 すなわち 、核酸および/またはタンパク質間のFRET効率を決定するためのセットアップおよび実験手順を提示します。 精密smFRET測定（セクション3）を確保するためには、測定中の任意の時点でフローチャンバーから空気を排除することが重要です。さらに、蛍光体でフローチャンバーに過負荷をかけないようにしてください。フルオロフォアは明らかに正しい分析を確実にするために分離されなければなりません。ドナーの漂白を示さないsmFRETペアは、分析から除外されなければならないように、視野内の分子の&gt; 80％は映画の終わりに漂白されていることを確認してください。サンプルβ-因子およびγ-ファクタの不均一性を考慮するために、ドナーとアクセプターチャネルのクロストークと相対検出効率を補正し、それぞれ、個別に各FRET対に対して計算されています。 <p class= &quot;jove_content&quot;&gt;カメラ設定（セクション3.9で説明積分時間、電子増倍ゲイン、プリアンプゲインと読み出し速度）は、信号対雑音比、ダイナミックレンジ及び時間分解能信号との間の最良のトレードオフを与える値に設定されるべきです。これらは、異なる実験のために、または異なるハードウェアを使用する場合、再調整する必要があります。フレームの数は、ドナーの大部分は観測時間内漂白分子ことを保証するのに十分に高いことが必要です。 蛍光分光計（セクション7〜9）の測定のための信号強度と記録されたデータのスペクトル分解能との間の良好な妥協点を見つける必要があります。この目的のために蛍光分光計の励起および発光経路のスリットを用いる機器、サンプル濃度に依存するように適合されなければなりません。 さらに、我々は、一過性または動的MACROMの構造情報を得るために高速NPS分析法を提示しますolecular複合体。 NPSは、非鋳型DNA鎖と古細菌RNAポリメラーゼオープン複合体における転写開始因子の位置の経路を明らかにするために適用されています。 60以上の異なる距離測定のネットワークを使用して、我々はその新しく実装されたサンプリング・エンジン（準備中Eilert、T.、ベッカー、M.、・ドレクスラー、F.、＆ミカエリス、J）を装備した高速NPS、示しました元のグローバルNPS法27に比べて、大きさの≈2オーダーすることによって、この複雑なsmFRETネットワークの解析に必要な時間を短縮します。アルゴリズムの堅牢性は、レプリカ交換法のスキームと組み合わせメトロポリス-内-ギブスサンプラーに根ざしています。高速NPSは、ネットワークの結果の正確な再現性を示し、30以前公開された結果と一致しています。 いくつかの異なる方法がsmFRET測定11から構造情報を推測することを目指して公開されています</sアップ&gt;、12、13、14、15、16、17、18。これらのアプローチの全ては、1つの特定の色素のモデルを提供します。このように、それぞれのモデルによって作られた仮定を満たしていない染料は、使用されるか、または虚偽の構造情報に導くことはできません。高速NPSは、逆に、各色素分子のための別のモデルを選択することができます。これは、異なるコンホメーションの両方の行動、色素分子自体、ならびにその結合のために使用されるリンカーを説明するために役立ちます。色素分子の局所分子周囲だけでなく、その物理的性質が最も適切であるモデルを決定します。 古細菌の開始複合体の分析smFRETネットワークでは、すべての色素分子のための等方性の仮定は大幅な減少の私につながりますnは信頼できるボリュームのサイズ古典的なモデルと比較して。すべての色素のための平均動的位置との組み合わせで（95％で）すべての信頼できるボリュームサイズの中央値が0.5nm未満3に減少する分子。しかし、これらの色素分子の事後は仮定が偽構造情報とリードを作っていることを示す、そのsmFRET測定値ともはや一致していません。これとは対照的に、古典的なモデルで決定された事後が決定smFRET効率と一致しています。 等方性および/または全ての染料のための平均動的位置の仮定が矛盾につながるように、高速NPSは、各色素が5モデルのいずれかを割り当てることが可能な色素分子の事前確率を可能にします。各モデルは、同じアクセス可能なボリュームを使用しています。色素のAVを計算するためのアルゴリズムは、いくつかの仮定を行います。最初は、フルオロフォアの空間的形状は球で近似されます。このように、直径が考慮フォアのWIDを取ります番目、高さと厚さは、（第12節）を使用する必要があります。また、リンカの形状は、柔軟なロッドで近似されます。第12節で提示値は12-Cリンカーを介して結合した色素アレクサ647用に計算しました。今日まで、実験のジオメトリを考慮すると、正確なモデルが最も適している事前に決定することは不可能であり、したがって、すべてのモデルは、試験されるべきです。静止画データと一致しながら、一般的に、人は、可能な最小後方サイズを与えるモデルを選択します。モデルの選択はsmFRETデータと一致しているかどうかをテストするために、我々は事後尤度の両方を計算します。一貫性は、後方から採取した試料の90％以上は、可能性の95％信頼区間内にあることを意味します。 それが真である間、色素分子のsmFRETネットワークにおいて、距離不確定小さく、異方性低い幾何学的配置も考慮しなければならないこと。したがって、R一方典型的な最初の選択肢は、ISOモデルと低蛍光異方性と染料分子をさepresenting、一貫性のテストは、正しい染料モデルを選択するためのより直接的な手段を提供します。染料モデルの最適な選択は、ローカリゼーション精度の大幅な増加をもたらすと同時に、そのFRETのデータとネットワークの整合性を保持することができます。 要約すると、高速NPSは、大きな高分子複合体の構造や動的な情報を得ることができます。例えば、X線結晶学または低温電子顕微鏡法などの一般的な構造的方法とは対照的に、これは大幅に複雑な生物学的プロセスの我々のメカニズムの理解を広げ、非常に柔軟なまたは一過性の複合体をモニターすることを可能にします。

生体分子の構造を決定することは、その機能を理解するための重要な前提条件です。構造決意ための2つのよく確立された方法は、低温電子顕微鏡法およびX線結晶1、2です。今日では、両方の方法は、オングストロームレベルまで解像度を持つ高解像度の構造情報を提供します。これらの2つの方法は、タンパク質複合体のような大きな生体分子の構造を解明するために広く使用されています。既存の方法は、常に最後の数十年を通じて改善されているが、大規模な動的および過渡複合体は3を検討する際に、生物学的構造の複雑さは、まだ具体的には、構造生物学に大きな課題を提起します。 巨大分子複合体の力学、特に構造 - 機能の関係を研究するために、単一分子方法はPROVを有しますIDED有用な情報4。いくつかの新しい戦略は、構造的および動的な情報を取得するに直交するアプローチを提供する開発されました。例としては、高速AFM 5、機械的操作6、蛍光局在顕微鏡7と同様に、単一分子蛍光共鳴エネルギー移動（smFRET）8、9です。かなり早い段階FRET上ので生体高分子10の長さスケールでの距離依存性に起因する分子定規を 、と呼ばれています。 smFRETの特に興味深い適用は、構造情報11、12、13、14を推測するsmFRET測定から得られた距離情報を使用することで、15 </sup&gt;、16、17、18、19、20、21、22、23。 smFRETの高時間分解能を、タンパク質構造の可動部の位置を局在化することができます。しかし、smFRETデータから定量的情報を抽出するために色素分子に関する重要な補正パラメータは、測定24中に決定される必要があります。これらの補正係数を用いて、FRET効率E FRET式を用いて計算することができます<img alt="式（1）" src="/files/ftp_upload/54782/54782eq1.jpg" /> 、 ここで、I AとI D </sUB&gt;（ 図2参照 ）は、それぞれ、ドナー及びアクセプター分子の蛍光強度です。 βファクタは、アクセプターチャネルに、クロストークのためのドナー発光の漏れを占め、によって計算されます<img alt="式（2）" src="/files/ftp_upload/54782/54782eq2.jpg" /> I &#39;AとI D&#39;は、アクセプター分子の光退色後のドナーとアクセプター分子の蛍光強度どこにいます。 γ-要因は、2チャンネルの相対的な検出効率の違いだけでなく、ドナーの蛍光量子収率とアクセプター色素の違いを補正します。それはによってすべての個々の時間トレースから計算されますこの説明は、時には重要になり、同様のために修正する必要があるアクセプター分子の直接励起を無視することを、注意してください。これらの補正係数を決定するためには、光物理的変化と構造力学を区別するために、交互スキーム25にドナーならびにアクセプターの両方を励起するのに便利です。 定量的smFRET効率だけでなく、定量的な構造情報を取得するだけでなく、ためには、ナノポジショニングシステム（NPS）は、2008年26で導入されました。名前は、衛星ベースの全地球測位システム（GPS）との類似性に基づいて選択しました。 NPSは、生体高分子複合体中の未知の色素位置の局在化smFRETとX線結晶学データを組み合わせたハイブリッド技術です。 C言語rystal構造は、参照フレームとして機能し、smFRET結果が不明フルオロフォアの位置（ アンテナ ）と結晶構造（ 衛星 ）からの既知の位置との間の距離情報を取得するために使用されます。連続実験では、アンテナと複数の衛星との間の距離が測定され、アンテナの位置がベイズパラメータ推定に基づいて、統計的に厳密な分析手法によって決定されます。その結果、アンテナの有力位置だけではなく計算されますが、その完全な3Dの不確実性分布、いわゆる後方には、信頼できるボリュームによって可視化しました。また、NPSは完全smFRETネットワーク27の分析を可能にするために拡張されました。 NPSは、真核生物の転写において重要な質問の数、すなわち上流のDNAもちろん、非鋳型DNAとRNAポリメラーゼII伸長共内新生のmRNAを解決するために使用されていますまた、転写開始の効果を実証mplex 12、28は 、26因子と29を開放プロモーターの動的なアーキテクチャが複雑。また、NPSは、転写伸長因子Spt4 / 5 31と同一部位に競合的に結合する転写開始因子TFEのオープン複雑30、特に位置古細菌RNAポリメラーゼの構造を解明するために使用されました。 それ以来、smFRET基づく構造のアプローチの数は15、18、21、23を発表されています。異なるsmFRET基づく構造の方法を比較すると、それは、この方法の明らかな精度は、染料モデルの特定の選択に大きく依存することが明らかとなります。一つは、あることに注意する必要があります色素分子は、それらの局所環境に応じて異なる空間および配向挙動を示すことができます。 このため、高速NPSは32を導入しました。高速NPSは大幅に計算時間を削減する高度なサンプリングアルゴリズムを使用しています。また、高速NPSは1つが構造解析を実行することを可能にし、ユーザが次に説明する5異なる色素モデルのセットから選択することができ、各色素分子のため。 古典と呼ばれる最も保守的なモデルは、染料が一つだけが、未知の、位置を占めていることを前提としています。この位置では、フルオロフォアは、そのサイズがそのそれぞれの（時間依存性）蛍光異方性から決定される円錐内で自由に回転することができます。円錐の向きは、距離に測定smFRET効率を変換する際に大きな不確実性をもたらす、知られていません。それは他の染料のモードに比べて最小精度につながるので、この点で、このモデルは、保守的ですlsの。ごく短い距離のための前提条件が著しく不正確な位置決意に古典的なモデルのリードによって作らなければなりません。典型的なsmFRET値については、正確な位置は常に比較的大きな信頼できるボリュームで囲まれています。 より高い精度が望まれるので、開発および精度を改善するために役立つ可能性が代替染料モデルをテストすることが重要です。染料は、その固有の蛍光寿命よりもはるかに高速に回転する場合、いわゆるISOモデルを適用することができます。ここでは、2κ配向係数は（特性の等方性のフェルスター半径を計算するために必要な<img alt="式（1）" src="/files/ftp_upload/54782/54782eq4.jpg" /> ）2/3に設定されています。その結果、計算された信頼性の高いボリュームは、古典的なモデル32におけるものと比較してほぼ2桁小さいです。フルオロフォアは、高速reoriだけでなく、できる環境で発見された場合にはすべてのアクセス可能な容量を超えるentationが、さらに速い動きは、meanposイソモデルを使用する必要があります。このモデルでは、染料は、効果的に空間平均は多項式距離変換15によって占められて唯一の平均位置を占めます。 （例えば、一般的に疎水性）色素が親水性領域、 例えば、DNAに取り付けられている場合、このモデルは適用されます。 meanposイソモデルの適用は、約2倍信頼ボリュームのサイズをさらに低減することができます。しかし、タンパク質に連結された色素は、その立体的にアクセス可能なボリューム（AV）のいくつかの疎水性パッチに可逆的に結合する可能性があります。瞬時にこれらの領域の間にスイッチが、1領域内の自由な回転を受け、高速なローカライズされた動きがVAR-meanpos -イソモデルによって最良に記載されている。フォア似たような状況のためにした染料は、モデルが適用されるVAR-meanposを自由に回転することではありません。以上のD<html>これらのモデルについてetailsは、私たちの最近の刊行物32に記載されています。 これらのモデルは、具体的には色素が発生する可能性のある様々な環境を考慮し、それらを適用することは賢明にその局在化の精度を最適化する広範なレパートリーを提供します。高速NPSで特定の位置に取り付けられたすべての色素分子は、FRET-パートナーは異なるモデルを持つことが許可されているように、個々のモデルに割り当てることができます。これは無限にあり、近隣ツー自然モデリングを可能にします。しかし、1つが最終的なモデルの組み合わせによって得られた結果は実験データと一致したままであることを保証するために厳密な統計的検定を行うことが重要です。これらのテストは、高速NPSソフトウェアに含まれています。 実験データに高速NPSを適用するために（のみ）3つの入力パラメータの測定が必要とされます。まず、色素ペア固有の等方性のフェルスター半径（/54782/54782eq5.jpg &quot;/&gt;）を決定する必要がドナー色素のあるので、量子収率（QY）、ドナーの蛍光発光スペクトルとアクセプターの吸収スペクトルを測定する必要がある。これらの測定値は、で行うことができますバルクは、標準的な分光計及び標準的な蛍光分光計を用いて、それぞれのペアについて、R 0は、その後フリーPhotochemCADを使用して計算され、NPS分析に使用することができる。また、色素分子の（時間分解）蛍光異方性が必要偏光（及び時間）に敏感な蛍光分光計を用いて得ることができる。しかし、高速NPSのための最も重要な入力パラメータは、全内部反射蛍光顕微鏡（TIRFM）などの単一分子蛍光顕微鏡の設定で測定smFRET効率であります。 ここでは、smFRETデータを取得し、高速NPS（ 図1）を適用するためのステップバイステップのプロトコルを提示します。

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Flowchamber preparation&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Customized metall sample holder</td><td>self-built</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>quartz-glass slides, 76&amp;nbsp;mm x 26&amp;nbsp;mm</td><td>Technical Glass Products</td><td>26007</td><td></td></tr><tr><td>coverslips, 60 mm x 24&amp;nbsp;mm</td><td>Marienfeld</td><td>101242</td><td></td></tr><tr><td>detergent, Hellmanex II</td><td>Hellma</td><td>320.001</td><td></td></tr><tr><td>ultra-pure water from Synergy UV</td><td>Millipore</td><td>2512600</td><td></td></tr><tr><td>Zepto plasma cleaner</td><td>Diener</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>(3-aminopropyl)-triethoxysilane, p.a.</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3648</td><td></td></tr><tr><td>methoxy PEG-succinimidyl valerate, 5 kDa</td><td>Laysan Bio Inc.</td><td>MPEG-SVA-5000-1g</td><td></td></tr><tr><td>biotinylated PEG-succinimidyl valerate, 5 kDa</td><td>Laysan Bio Inc.</td><td>BIOTIN-PEG-SVA-5000</td><td></td></tr><tr><td>Sodium biocarbonate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761 Sigma&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Sodium carbonate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2127 Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>sealing film (Nescofilm)</td><td>Fisher Scientific</td><td>12981805</td><td></td></tr><tr><td>Tygon Flexible Silicone Tubing, 0.8&amp;nbsp;mm ID, 2.4&amp;nbsp;mm OD</td><td>Saint-Gobain Performance Plastics</td><td>720958</td><td></td></tr><tr><td>Fine-Bore Polyethylene Tubing, 0.58 mm ID, 0.96 mm OD (Smiths Medical)</td><td>Fisher Scientific</td><td>12665497</td><td></td></tr><tr><td>Neutravidin</td><td>Life Technologies</td><td>A2666</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Total internal reflection fluorescence microscope&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Nd:YAG Laser, 532 nm</td><td>Newport Spectra-Physics</td><td>EXLSR-532-100-CDRH</td><td></td></tr><tr><td>diode-pumped solid-state laser, 491 nm, Calypso</td><td>Cobolt</td><td>904010050</td><td></td></tr><tr><td>diode laser 643 nm, iBeam smart</td><td>Toptica</td><td>iBEAM-SMART-640-S</td><td></td></tr><tr><td>dichroic mirror, 532 RDC</td><td>Chroma</td><td>F33-540</td><td></td></tr><tr><td>dichroic mirror, 476 RDC</td><td>Chroma</td><td>F33-476z</td><td></td></tr><tr><td>acousto-optic tunable filter</td><td>AA Opto-Electronic</td><td>AOTFnC-VIS</td><td></td></tr><tr><td>plano-convex cylindrical lens, f = 75 mm</td><td>Thorlabs</td><td>LJ1703L1-A</td><td></td></tr><tr><td>plano-concave cylindrical, f = -300&amp;nbsp;mm</td><td>Thorlabs</td><td></td><td></td></tr><tr><td>prism, PS 991</td><td>Thorlabs</td><td>PS991</td><td></td></tr><tr><td>focusing lens, f = 75&amp;nbsp;mm</td><td>Thorlabs</td><td>LA1608-B</td><td></td></tr><tr><td>syringe pump, PHD 2000</td><td>Harvard Apparatus</td><td>70-2002</td><td></td></tr><tr><td>2 stepper motors, Z812B</td><td>Thorlabs</td><td>Z812B</td><td></td></tr><tr><td>piezoelectric actuator, PE4</td><td>Thorlabs</td><td>PE4</td><td></td></tr><tr><td>IR diode laser</td><td>Edmund Optics</td><td>CPS808</td><td>part of the autofocus system</td></tr><tr><td>dichroic mirror, 775 DCXR</td><td>Chroma</td><td>775 DCXR</td><td></td></tr><tr><td>position-sensing detector (PSD), PDP90A</td><td>Thorlabs</td><td>PDP90A</td><td>part of the autofocus system</td></tr><tr><td>water-immersion objective, Plan Apo 60X WI, NA 1.2</td><td>Nikon</td><td></td><td>MRD07601</td></tr><tr><td>dichroic mirror, 645 DCXR</td><td>Chroma</td><td>645 DCXR</td><td>part of the emission pathway</td></tr><tr><td>emission filter, 3RD550-510</td><td>Omega Optical</td><td>3RD550-510</td><td>green channel in the emission pathway</td></tr><tr><td>emission filter, 3RD660-760</td><td>Omega Optical</td><td>3RD660-760</td><td>red channel in the emission pathway</td></tr><tr><td>EMCCD camera, iXon+ DU897EBV</td><td>Andor</td><td>AND-20-00032</td><td></td></tr><tr><td>EMCCD camera, iXon3 DU897D-BV</td><td>Andor</td><td>AND-20-000141</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Miscellaneous&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Varian 50</td><td>Cary</td><td></td><td>UV-VIS spectrometer</td></tr><tr><td>Fluorolog2</td><td>SPEX</td><td></td><td>fluorescence spectrometer</td></tr><tr><td>Solis (V4.15)</td><td>Andor</td><td></td><td>control software for the EM-CCD camera</td></tr><tr><td>Apt user utility&amp;nbsp; (V1.022)</td><td>Thorlabs</td><td></td><td>control software for the piezo-motors</td></tr><tr><td>Norland Optical Adhesive 68</td><td>Thorlabs</td><td></td><td>adhesive</td></tr><tr><td>PC-AFN-0.8 Nile red</td><td>Kisker Biotech</td><td></td><td>avidin-coated fluorescent multispec beads&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Matlab</td><td>Mathworks</td><td></td><td>technical computing language for custon written software</td></tr><tr><td>Origin (V9.0)</td><td>Originlab</td><td></td><td>scientific graphing and data analysis software</td></tr><tr><td>Hellma 105-202-15-40</td><td>Hellma</td><td>105-202-15-40</td><td>absorption cuvette of 1&amp;nbsp;cm path length</td></tr><tr><td>Hellma 105-251-15-40</td><td>Hellma</td><td>105-251-15-40</td><td>fluorescence cuvette with 3 mm path length</td></tr></tbody></table>

structural information from single-molecule fret experiments using the fast nano-positioning system

Single-molecule F&#246;rster Resonance Energy Transfer (smFRET) can be used to obtain structural information on biomolecular complexes in real-time. Thereby, multiple smFRET measurements are used to localize an unknown dye position inside a protein complex by means of trilateration. In order to obtain quantitative information, the Nano-Positioning System (NPS) uses probabilistic data analysis to combine structural information from X-ray crystallography with single-molecule fluorescence data to calculate not only the most probable position but the complete three-dimensional probability distribution, termed posterior, which indicates the experimental uncertainty. The concept was generalized for the analysis of smFRET networks containing numerous dye molecules. The latest version of NPS, Fast-NPS, features a new algorithm using Bayesian parameter estimation based on Markov Chain Monte Carlo sampling and parallel tempering that allows for the analysis of large smFRET networks in a comparably short time. Moreover, Fast-NPS allows the calculation of the posterior by choosing one of five different models for each dye, that account for the different spatial and orientational behavior exhibited by the dye molecules due to their local environment.
Here we present a detailed protocol for obtaining smFRET data and applying the Fast-NPS. We provide detailed instructions for the acquisition of the three input parameters of Fast-NPS: the smFRET values, as well as the quantum yield and anisotropy of the dye molecules. Recently, the NPS has been used to elucidate the architecture of an archaeal open promotor complex. This data is used to demonstrate the influence of the five different dye models on the posterior distribution.

転写は全ての生物における遺伝子発現の最初のステップです。古細菌では、転写は、単一のRNAポリメラーゼ（RNAP）によって行われます。単純な転写機構を有しながら、真核生物と比較して、古細菌のRNAPは彼らの真核生物のカウンターパートへの印象的な構造似ています。このように、古細菌は、RNAポリメラーゼII（ポルII）の真核生物の転写開始を研究するためのモデル系として使用することができます。最近、古細菌RNAポリメラーゼオープン複合体の完全なアーキテクチャは、単一分子FRETおよびNPSから決定されています。 NPS分析からのデータは、転写開始のメカニズムに有益な洞察を提供し、完全な古細菌オープンプロモーター複合体のモデルを構築するために使用されました。 この構造を解明するために、smFRET効率がオープンプロモーターコム内に位置する未知のアンテナ色素分子間で測定しました。プレックスとポジション結晶構造（PDB-ID：2WAQ）から知られているRNAP、の5つの参照サイトで組み込まれたいくつかの既知の衛星色素分子37。アンテナ色素は、非鋳型DNA、TFB、TBPまたはTFEの異なる位置のいずれか一方に取り付けられました。本研究で用いた完全なネットワークは、60以上の測定された距離から成っていました。 図7は、NPS分析から構築された完全な古細菌オープンプロモーター複合体のモデルを示しています。これは、二本鎖プロモーターDNA（光とダークブルー）、RNAポリメラーゼ（灰色）および転写開始は、TBP（紫）、TFB（緑）、TFE（黄色）の係数を備えます。モデルは、古典的なモデル（A）、ISOモデル（B）、meanposイソモデル（C）、VAR-meanposイソモデルを用いて計算したNPS分析の結果、信頼性の高いボリュームと重畳されます（D）とVAR-meanpos<html>モデル（E）。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/54782/54782fig1.jpg" /> 図1： ファスト-NPS計算に必要なパラメータの取得および処理のワークフロー。 <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54782/54782fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/54782/54782fig2.jpg" /> 図2：smFRET イベントの代表的な蛍光強度の時間トレース。ドナー（緑色）の蛍光強度と3つの特徴の段階、すなわちI示すアクセプター分子（赤）：smFRET、II：アクセプター光退色後のドナー蛍光、III：バックグラウンド蛍光ドナー退色後を。g2large.jpg &quot;ターゲット=&quot; _空白 &quot;&gt;この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/54782/54782fig3.jpg" /> 図3：smFRET 実験のためのフローチャンバの模式図。フローチャンバーは、アクリルガラスホルダーでカスタマイズ金属ホルダに取り付けられます。フローチャンバーのサンドイッチ設計は、石英ガラス（溶融シリカ）入口および出口チューブを取り付けるための2つの穴を有するスライド、封止膜とフローチャンバーを閉鎖カバースリップを含みます。 TIRF照明のためのプリズムは、フローチャンバの下半分に取り付けられます。中空タブねじはフローチャンバーのための入口と出口を提供します。 <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54782/54782fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img<html> ALT = &quot;図4&quot; SRC = &quot;/ファイル/ ftp_upload / 54782 / 54782fig4.jpg&quot; /&gt; 図4： 石英ガラススライドの調製及び封止膜。 （ミリメートル単位で与えられる）の穴の位置を示す石英ガラススライドの機械的な図。 <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54782/54782fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図5" src="/files/ftp_upload/54782/54782fig5.jpg" /> 図5： フローチャンバーの機械製図。アルミプリズムホルダのための対策は、アクリルガラスホルダーとアルミ取付枠の単位はmmです。 <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54782/54782fig5large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> igure 6 &quot;SRC =&quot; /ファイル/ ftp_upload / 54782 / 54782fig6.jpg &quot;/&gt; 図6：smFRET 実験に使用したプリズム型TIRFセットアップの模式図。光学部品用略語：A、開口; DM、ダイクロイックミラーと、 F、発光フィルター; L、レンズ; M、ミラー; O、客観; P、プリズム。 PSD、位置敏感型フォトダイオード。 S、サンプル; PS、位置決めステージ。 T、望遠鏡。 <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54782/54782fig6large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図7" src="/files/ftp_upload/54782/54782fig7.jpg" /> 図7： 異なるモデルの仮定のシミュレーション結果。 、（それぞれ、青、シアンでTDNAとntDNA）プロモーターとともにDNAのためのモデルとTBP（紫）、TFB（緑）、TFE（黄色）：全ての写真は古細菌RNAポリメラーゼ（2WAQ、上面図PDB-ID）を表示します古細菌に複雑な30を開きます。信頼できるボリュームは、（A）の古典的モデル、（B）は、ISOモデル（C）meanposイソモデル、（D）VAR-meanposイソモデル及び（E）のNPSのシミュレーション結果をVARのために重畳されます-meanposモデル。すべてのボリュームは68％の信頼性で示されています。クラシックとVAR-meanposネットワークはsmFRETデータと一致しています。これとは対照的に、すべての染料のISO、meanpos - イソまたはVAR-meanpos - イソモデルが選択されているネットワークは、測定したデータと矛盾しています。 <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54782/54782fig7large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a>

Watch this Scientific Journal Video about Structural Information from Single-molecule FRET Experiments Using the Fast Nano-positioning System at JoVE.com

Structural Information from Single-molecule FRET Experiments Using the Fast Nano-positioning System

We present the setup and experimental procedure to obtain smFRET data from large donor-acceptor networks with a TIRF microscope. The step-by-step analysis of these measurements with the Bayesian inference software Fast-NPS yields high-resolved structural information via the application of adapted dye models.

ファストナノ位置決めシステムを用いた単一分子FRET実験から構造情報

Single-molecule F&#246;rster Resonance Energy Transfer (smFRET) can be used to obtain structural information on biomolecular complexes in real-time. ...

structural-information-from-single-molecule-fret-experiments-using

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biochemistry

12.1K ビュー.  Ulm University. We present the setup and experimental procedure to obtain smFRET data from large donor-acceptor networks with a TIRF microscope. The step-by-step analysis of these measurements with the Bayesian inference software Fast-NPS yields high-resolved structural information via the application of adapted dye models.

ビデオ: Structural Information from Single-molecule FRET Experiments Using the Fast Nano-positioning System

High Precision FRET at Single-molecule Level for Biomolecule Structure Determination

A protocol on how to perform high-precision interdye distance measurements using F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) at the single-molecule level in multiparameter fluorescence detection (MFD) mode is presented here. MFD maximizes the usage of all &#34;dimensions&#34; of fluorescence to reduce photophysical and experimental artifacts and allows for the measurement of interdye distance with an accuracy up to ~1 &#197; in rigid biomolecules. This method was used to identify three conformational states of the ligand-binding domain of the N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptor to explain the activation of the receptor upon ligand binding. When comparing the known crystallographic structures with experimental measurements, they agreed within less than 3 &#197; for more dynamic biomolecules. Gathering a set of distance restraints that covers the entire dimensionality of the biomolecules would make it possible to provide a structural model of dynamic biomolecules.

A protocol for high-precision FRET experiments at the single molecule level is presented here. Additionally, this methodology can be used to identify three conformational states in the ligand-binding domain of the N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptor. Determining precise distances is the first step towards building structural models based on FRET experiments.

生体分子構造決定のための単分子レベルでの高精度FRET

A protocol on how to perform high-precision interdye distance measurements using F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) at the single-molecule ...

生化学

Atomic Force Microscopy of Red-Light Photoreceptors Using PeakForce Quantitative Nanomechanical Property Mapping

Atomic force microscopy (AFM) uses a pyramidal tip attached to a cantilever to probe the force response of a surface. The deflections of the tip can be measured to ~10 pN by a laser and sectored detector, which can be converted to image topography. Amplitude modulation or &#8220;tapping mode&#8221; AFM involves the probe making intermittent contact with the surface while oscillating at its resonant frequency to produce an image. Used in conjunction with a fluid cell, tapping-mode AFM enables the imaging of biological macromolecules such as proteins in physiologically relevant conditions. Tapping-mode AFM requires manual tuning of the probe and frequent adjustments of a multitude of scanning parameters which can be challenging for inexperienced users. To obtain high-quality images, these adjustments are the most time consuming.
PeakForce Quantitative Nanomechanical Property Mapping (PF-QNM) produces an image by measuring a force response curve for every point of contact with the sample. With ScanAsyst software, PF-QNM can be automated. This software adjusts the set-point, drive frequency, scan rate, gains, and other important scanning parameters automatically for a given sample. Not only does this process protect both fragile probes and samples, it significantly reduces the time required to obtain high resolution images. PF-QNM is compatible for AFM imaging in fluid; therefore, it has extensive application for imaging biologically relevant materials.
The method presented in this paper describes the application of PF-QNM to obtain images of a bacterial red-light photoreceptor, RpBphP3 (P3), from photosynthetic R. palustris in its light-adapted state. Using this method, individual protein dimers of P3 and aggregates of dimers have been observed on a mica surface in the presence of an imaging buffer. With appropriate adjustments to surface and/or solution concentration, this method may be generally applied to other biologically relevant macromolecules and soft materials.

A method for investigating the structure of a protein photoreceptor using atomic force microscopy (AFM) is described in this paper. PeakForce Quantitative Nanomechanical Property Mapping (PF-QNM) reveals intact protein dimers on a mica surface.

PeakForce定量的ナノメカニカルプロパティマッピングを使用した赤色光光受容体の原子間力顕微鏡

Atomic force microscopy (AFM) uses a pyramidal tip attached to a cantilever to probe the force response of a surface. The deflections of the tip can be ...

工学

Investigating Single Molecule Adhesion by Atomic Force Spectroscopy

Atomic force spectroscopy is an ideal tool to study molecules at surfaces and interfaces. An experimental protocol to couple a large variety of single molecules covalently onto an AFM tip is presented. At the same time the AFM tip is passivated to prevent unspecific interactions between the tip and the substrate, which is a prerequisite to study single molecules attached to the AFM tip. Analyses to determine the adhesion force, the adhesion length, and the free energy of these molecules on solid surfaces and bio-interfaces are shortly presented and external references for further reading are provided. Example molecules are the poly(amino acid) polytyrosine, the graft polymer PI-g-PS and the phospholipid POPE (1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine). These molecules are desorbed from different surfaces like CH3-SAMs, hydrogen terminated diamond and supported lipid bilayers under various solvent conditions. Finally, the advantages of force spectroscopic single molecule experiments are discussed including means to decide if truly a single molecule has been studied in the experiment.

A protocol to couple a large variety of single molecules covalently onto an AFM tip is presented. Procedures and examples to determine the adhesion force and free energy of these molecules on solid supports and bio-interfaces are provided.

原子間力分光法による単一分子の接着性を調査

Atomic force spectroscopy is an ideal tool to study molecules at surfaces and interfaces. An experimental protocol to couple a large variety of single ...

Covalent Immobilization of Proteins for the Single Molecule Force Spectroscopy

In recent years, atomic force microscopy (AFM) based single molecule force spectroscopy (SMFS) extended our understanding of molecular properties and functions. It gave us the opportunity to explore a multiplicity of biophysical mechanisms, e.g., how bacterial adhesins bind to host surface receptors in more detail. Among other factors, the success of SMFS experiments depends on the functional and native immobilization of the biomolecules of interest on solid surfaces and AFM tips. Here, we describe a straightforward protocol for the covalent coupling of proteins to silicon surfaces using silane-PEG-carboxyls and the well-established N-hydroxysuccinimid/1-ethyl-3-(3-dimethyl-aminopropyl)carbodiimid (EDC/NHS) chemistry in order to explore the interaction of pilus-1 adhesin RrgA from the Gram-positive bacterium Streptococcus pneumoniae (S. pneumoniae) with the extracellular matrix protein fibronectin (Fn). Our results show that the surface functionalization leads to a homogenous distribution of Fn on the glass surface and to an appropriate concentration of RrgA on the AFM cantilever tip, apparent by the target value of up to 20% of interaction events during SMFS measurements and revealed that RrgA binds to Fn with a mean force of 52 pN. The protocol can be adjusted to couple via site specific free thiol groups. This results in a predefined protein or molecule orientation and is suitable for other biophysical applications besides the SMFS.

This protocol describes the covalent immobilization of proteins with a heterobifunctional silane coupling agent to silicon-oxide surfaces designed for the atomic force microscopy based single molecule force spectroscopy which is exemplified by the interaction of RrgA (pilus-1 tip adhesin of S. pneumoniae) with fibronectin.

力の単一分子分光法のための蛋白質の共有結合固定

In recent years, atomic force microscopy (AFM) based single molecule force spectroscopy (SMFS) extended our understanding of molecular properties and ...

Automated System for Single Molecule Fluorescence Measurements of Surface-immobilized Biomolecules

Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) microscopy has been widely used to study the structure and dynamics of molecules of biological interest, such as nucleic acids and proteins. Single molecule FRET (sm-FRET) measurements on immobilized molecules permit long observations of the system -effectively until both dyes photobleach- resulting in time-traces that report on biomolecular dynamics with a broad range of timescales from milliseconds to minutes. To facilitate the acquisition of large number of traces for statistical analyses, the process must be automated and the sample environment should be tightly controlled over the entire measurement time (~12 hours). This is accomplished using an automated scanning confocal microscope that allows the interrogation of thousands of single molecules overnight, and a microfluidic cell that permits the controlled exchange of buffer, with restricted oxygen content and maintains a constant temperature throughout the entire measuring period. Here we show how to assemble the microfluidic device and how to activate its surface for DNA immobilization. Then we explain how to prepare a buffer to maximize the photostability and lifetime of the fluorophores. Finally, we show the steps involved in preparing the setup for the automated acquisition of time-resolved single molecule FRET traces of DNA molecules.

In this article we describe how we obtain FRET traces from individual DNA molecules immobilized to a surface using an automated scanning confocal microscope.

表面固定化生体分子の単一分子蛍光測定のための自動化システム

Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) microscopy has been widely used to study the structure and dynamics of molecules of biological interest, ...

生物学

Utilizing Time-Resolved Protein-Induced Fluorescence Enhancement to Identify Stable Local Conformations One &#945;-Synuclein Monomer at a Time

Using spectroscopic rulers to track multiple conformations of single biomolecules and their dynamics have revolutionized the understanding of structural dynamics and its contributions to biology. While the FRET-based ruler reports on inter-dye distances in the 3-10 nm range, other spectroscopic techniques, such as protein-induced fluorescence enhancement (PIFE), report on the proximity between a dye and a protein surface in the shorter 0-3 nm range. Regardless of the method of choice, its use in measuring freely-diffusing biomolecules one at a time retrieves histograms of the experimental parameter yielding separate centrally-distributed sub-populations of biomolecules, where each sub-population represents either a single conformation that stayed unchanged within milliseconds, or multiple conformations that interconvert much faster than milliseconds, and hence an averaged-out sub-population. In single-molecule FRET, where the reported parameter in histograms is the inter-dye FRET efficiency, an intrinsically disordered protein, such as the &#945;-Synuclein monomer in buffer, was previously reported as exhibiting a single averaged-out sub-population of multiple conformations interconverting rapidly. While these past findings depend on the 3-10 nm range of the FRET-based ruler, we sought to put this protein to the test using single-molecule PIFE, where we track the fluorescence lifetime of site-specific sCy3-labeled &#945;-Synuclein proteins one at a time. Interestingly, using this shorter range spectroscopic proximity sensor, sCy3-labeled &#945;-Synuclein exhibits several lifetime sub-populations with distinctly different mean lifetimes that interconvert in 10-100 ms. These results show that while &#945;-Synuclein might be disordered globally, it nonetheless attains stable local structures. In summary, in this work we highlight the advantage of using different spectroscopic proximity sensors that track local or global structural changes one biomolecule at a time.

Time-resolved single-molecule protein-induced fluorescence enhancement is a useful fluorescence spectroscopic proximity sensor sensitive to local structural changes in proteins. Here we show it can be used to uncover stable local conformations in &#945;-Synuclein, which is otherwise known as globularly unstructured and unstable when measured using the longer range FRET ruler.

時間分解タンパク質誘導蛍光強化を利用して、一度に1つのαシヌクレインモノマーの安定した局所構造を同定する

Using spectroscopic rulers to track multiple conformations of single biomolecules and their dynamics have revolutionized the understanding of structural ...

A Protocol for Using F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET)-force Biosensors to Measure Mechanical Forces across the Nuclear LINC Complex

The LINC complex has been hypothesized to be the critical structure that mediates the transfer of mechanical forces from the cytoskeleton to the nucleus. Nesprin-2G is a key component of the LINC complex that connects the actin cytoskeleton to membrane proteins (SUN domain proteins) in the perinuclear space. These membrane proteins connect to lamins inside the nucleus. Recently, a F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET)-force probe was cloned into mini-Nesprin-2G (Nesprin-TS (tension sensor)) and used to measure tension across Nesprin-2G in live NIH3T3 fibroblasts. This paper describes the process of using Nesprin-TS to measure LINC complex forces in NIH3T3 fibroblasts. To extract FRET information from Nesprin-TS, an outline of how to spectrally unmix raw spectral images into acceptor and donor fluorescent channels is also presented. Using open-source software (ImageJ), images are pre-processed and transformed into ratiometric images. Finally, FRET data of Nesprin-TS is presented, along with strategies for how to compare data across different experimental groups.

A number of FRET-based force biosensors have recently been developed, enabling the protein-specific resolution of intracellular force. In this protocol, we demonstrate how one of these sensors, designed for the linker of the nucleoskeleton-cytoskeleton (LINC) complex protein Nesprin-2G can be used to measure actomyosin forces on the nuclear LINC complex.

原子力LINCコンプレックス全体に機械的な力を測定するために、蛍光共鳴エネルギー移動（FRET）-forceのバイオセンサーを使用するためのプロトコル

The LINC complex has been hypothesized to be the critical structure that mediates the transfer of mechanical forces from the cytoskeleton to the nucleus. ...

生物工学

High-Speed Magnetic Tweezers for Nanomechanical Measurements on Force-Sensitive Elements

Single-molecule magnetic tweezers (MTs) have served as powerful tools to forcefully interrogate biomolecules, such as nucleic acids and proteins, and are therefore poised to be useful in the field of mechanobiology. Since the method commonly relies on image-based tracking of magnetic beads, the speed limit in recording and analyzing images, as well as the thermal fluctuations of the beads, has long hampered its application in observing small and fast structural changes in target molecules. This article describes detailed methods for the construction and operation of a high-resolution MT setup that can resolve nanoscale, millisecond dynamics of biomolecules and their complexes. As application examples, experiments with DNA hairpins and SNARE complexes (membrane-fusion machinery) are demonstrated, focusing on how their transient states and transitions can be detected in the presence of piconewton-scale forces. We expect that high-speed MTs will continue to enable high-precision nanomechanical measurements on molecules that sense, transmit, and generate forces in cells, and thereby deepen our molecular-level understanding of mechanobiology.

Here, we describe a high-speed magnetic tweezer setup that performs nanomechanical measurements on force-sensitive biomolecules at the maximum rate of 1.2 kHz. We introduce its application to DNA hairpins and SNARE complexes as model systems, but it will be also applicable to other molecules involved in mechanobiological events.

力に敏感な素子のナノメカニカル測定のための高速磁気ピンセット

Single-molecule magnetic tweezers (MTs) have served as powerful tools to forcefully interrogate biomolecules, such as nucleic acids and proteins, and are ...

Automated Two-dimensional Spatiotemporal Analysis of Mobile Single-molecule FRET Probes

Single-molecule F&#246;rster resonance energy transfer (smFRET) is a versatile technique reporting on distances in the sub-nanometer to nanometer range. It has been used in a wide range of biophysical and molecular biological experiments, including the measurement of molecular forces, characterization of conformational dynamics of biomolecules, observation of intracellular colocalization of proteins, and determination of receptor-ligand interaction times. In a widefield microscopy configuration, experiments are typically performed using surface-immobilized probes. Here, a method combining single-molecule tracking with alternating excitation (ALEX) smFRET experiments is presented, permitting the acquisition of smFRET time traces of surface-bound, yet mobile probes in plasma membranes or glass-supported lipid bilayers. For the analysis of recorded data, an automated, open-source software collection was developed supporting (i) the localization of fluorescent signals, (ii) single-particle tracking, (iii) determination of FRET-related quantities including correction factors, (iv) stringent verification of smFRET traces, and (v) intuitive presentation of the results. The generated data can conveniently be used as input for further exploration via specialized software, e.g., for the assessment of the diffusional behavior of probes or the investigation of FRET transitions.

This article presents a method for spatiotemporal analysis of mobile, single-molecule F&#246;rster resonance energy transfer (smFRET)-based probes using widefield fluorescence microscopy. The newly developed software toolkit allows the determination of smFRET time traces of moving probes, including the correct FRET efficiency and the molecular positions, as functions of time.

モバイル1分子フレットプローブの自動二次元時空間解析

Single-molecule F&#246;rster resonance energy transfer (smFRET) is a versatile technique reporting on distances in the sub-nanometer to nanometer range. ...

Fluorescence Imaging with One-nanometer Accuracy (FIONA)

Fluorescence imaging with one-nanometer accuracy (FIONA) is a simple but useful technique for localizing single fluorophores with nanometer precision in the x-y plane. Here a summary of the FIONA technique is reported and examples of research that have been performed using FIONA are briefly described. First, how to set up the required equipment for FIONA experiments, i.e., a total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM), with details on aligning the optics, is described. Then how to carry out a simple FIONA experiment on localizing immobilized Cy3-DNA single molecules using appropriate protocols, followed by the use of FIONA to measure the 36 nm step size of a single truncated myosin Va motor labeled with a quantum dot, is illustrated. Lastly, recent effort to extend the application of FIONA to thick samples is reported. It is shown that, using a water immersion objective and quantum dots soaked deep in sol-gels and rabbit eye corneas (&#62;200 &#181;m), localization precision of 2-3 nm can be achieved.

Fluorescence Imaging with One-nanometer Accuracy FIONA

Single fluorophores can be localized with nanometer precision using FIONA. Here a summary of the FIONA technique is reported, and how to carry out FIONA experiments is described.

ワンナノメートルの精度で蛍光イメージング（FIONA）

Fluorescence imaging with one-nanometer accuracy (FIONA) is a simple but useful technique for localizing single fluorophores with nanometer precision in ...