私たちは、財政支援のための工学・物理科学研究会議（EPSRC）（HLB）をお願いいたします。また、この手順の撮影中に彼女の援助のためSridéviMaalika Ramanoudjameに感謝します。

ペプトイドの1固相合成注：ペプトイドを手動固相ペプトイド合成のサブモノマーの手順を用いて合成されます。この方法は、高い結合効率と優れた最終製品収率を可能にします。固相上での合成はまた、過剰な反応物は、各ステップの終わりに容易に除去することができ、この方法は、異なる官能カチオン性モノマー（ すなわち、アルギニン型及びリジン型残基）は、同じ内に含まれることを可能にするためにここで変更されていますシーケンス。1,2 <ol><li> リニアペプトイドの合成 注意：合成を開始する前に、安全性評価を実施します。ヒュームフード内のすべての反応を実施し、適切な（ すなわち 、使い捨てニトリル手袋、安全メガネと白衣）として適切な個人用保護具を着用します。以下に示す試薬、溶媒を使用する際に特に注意してください。ジメチルホルムアミド（DMF）が疑われる催奇形物質およびdですichloromethane（DCM）が発がん性物質。N、N N&#39;-ジイソプロピルカルボジイミド（DIC）およびピペリジンである呼吸吸入を介して、皮膚、目に有害であり、皮膚感作を引き起こすことがあります。ヒドラジンは吸入すると、致命的な疑いのある発癌物質であり、皮膚や目に重度のやけどを引き起こします。ブロモ酢酸はまた、皮膚、眼、気道に有害であるとの接触時にやけどを引き起こす可能性があります。トリフルオロ酢酸（TFA）は、揮発性の液体であり、重度の火傷は非常に注意して扱う引き起こす可能性があります。ヘビーデューティー手袋を推奨します。 <ol><li> 2フリットでキャップ20ミリリットルポリプロピレン反応容器に0.12グラムFmoc-保護リンクアミド樹脂（0.1ミリモル、典型的なロード0.7ミリモル/ g）を追加します。樹脂を膨潤させ、室温で少なくとも60分間放置し、血管を残すために5ミリリットルのジメチルホルムアミド（DMF）を追加します。固相抽出真空プラットフォームを使用してDMFをドレイン。 </li><li>膨潤した樹脂のFmoc基を脱保護するために、（DMF v / vで20％）2mLのピペリジンの溶液を加えます。上の容器を置きます室温（450 rpm）でシェーカープラットフォームと5分間振とうします。真空ステーションを経由してソリューションを削除します。 <ol><li> 2mLのピペリジン溶液でFmoc脱保護を繰り返し、室温で15分間振とうします。以前のように解決策を排出します。 </li></ol></li><li> 2ミリリットルのDMFを添加し、30秒間樹脂を混合して樹脂を洗浄。 DMFを排出し、さらに3回繰り返します。 </li><li>アセチル化のために、ブロモ酢酸溶液（DMF中0.6 M）を1 mlを加え0.2 mlのN、N N&#39;-ジイソプロピルカルボジイミド溶液（DIC、50％DMF中のv / v）でした。室温で20分間振って反応容器のままにしておきます。解決策を排出し、2ミリリットルのDMF 3回樹脂を洗浄。 </li><li>変位のために、アミン溶液1ml（DMF中1.5 M）を加えます。室温で60分間樹脂を振ります。解決策を排出し、2ミリリットルのDMF 3回樹脂を洗浄。 <ol><li>アルギニン型モノマーを追加するには、ステップ1.7に従ってください。希望ペプトイドの配列に応じて、異なるアミン追加されます。 </li></ol></li><li>繰り返しは、1.1.4と1.1.5を繰り返します。 </li><li>グアニジン官能モノマー（ すなわち 、NのArg）を含めるには、樹脂に保護されていないジアミン溶液（DMF中1.5 M）の1ミリリットルを追加し、室温で60分間振とうします。 <ol><li>解決策を排出し、2ミリリットルのDMF 3回樹脂を洗浄。 </li><li>無料の第一級アミンへのDDEグループを追加し、室温で60分間振とうする2-acetyldimedone（0.2グラム、0.5ミリリットルのDMF中の1ミリモル、10当量）を追加します。解決策を排出し、2ミリリットルのDMF 3回樹脂を洗浄。 </li></ol></li><li>所望の配列がなされるまで、1.1.7に1.1.4のようにサブモノマー合成を続けます。樹脂を洗浄し、3回繰り返して2ミリリットルのDMFを追加します。 </li><li>樹脂上のDDE基を脱保護するために、（DMFのV IN / V）4を2mlの％ヒドラジン溶液を加え、室温で3分間振とうします。解決策を排出し、3回繰り返します。 </li><li>解決策を排出し、2ミリリットルのDMF 3トンで樹脂を洗浄IME。 </li><li> （DMFの最小体積で、NのArgモノマーあたりの遊離アミンあたり6当量、 すなわち 、）ピラゾール-1-カルボキサミジンを追加して、N、N-ジイソプロピルエチルアミンまたはDIPEA（遊離アミンあたり6当量）と60分間室温で振ります。 </li><li>解決策を排出し、2ミリリットルのジクロロメタン3回樹脂を洗浄。その後、樹脂を切断（セクション2）まで保存することができる10分間空気中で乾燥する樹脂を残します。 </li><li>合成を一時停止するには、2ミリリットルのDMF 3回樹脂を洗浄。 2ミリリットルのDMFを追加し、合成容器の栓とヒュームフード中で室温で残します。 注：合成（ジケトピペラジンのような第2変位ステップが形成されていてもよい除く）任意の変位ステップの後に一時停止することができます。 </li></ol></li><li> 側鎖脱保護および樹脂からの切断 <ol><li> displa後、合成中の任意の時点で合成（純度および質量）の進行状況を確認するためのテストを切断を行いますセメント工程、付加またはDDE保護基のまたは最後の配列がなされた後に除去します。 <ol><li>新しい8ミリリットルのポリプロピレンのフリットカートリッジに反応容器から約10樹脂ビーズを転送します。 </li><li>トリフルオロ酢酸の切断カクテルを1ml加える（95％TFA、2.5％H 2 O、2.5％のトリイソプロピルシランを含有する）を、室温で90分間振とうします。 </li><li>丸底フラスコ10ミリリットルにフリットの反応容器を用いて樹脂からTFA切断カクテルをフィルタリングします。 </li><li>ロータリーエバポレーターを用いて切断カクテルを蒸発させ、LC-MSまたはHPLC分析に提出1mlのアセトニトリル/水で得られた油状物を再溶解。 </li></ol></li><li>最終的な切断のために：合成に用いたのと同じフリット化ポリプロピレンの反応カートリッジに、TFA開裂カクテル（95％TFA、2.5％H 2 O、2.5％トリイソプロピルシラン）4 mlを加え、容器を覆います。室温で90分間振とうします。 </li><li>フィルターの目丸底フラスコ50 mlの中にフリットの反応容器を用いて樹脂から電子TFA切断カクテル。 </li><li>ロータリーエバポレーターを用いて切断カクテルを蒸発させます。 TFAを除去した後、生成物を油状物として得られるべきです。この原油からTFAの除去を支援するために、2ミリリットルの無水ジエチルエーテルを追加し、ペプトイドが沈殿する必要があります。 <ol><li>いずれかのピペットを用いて、ジエチルエーテルを除去し、廃棄するか、ロータリーエバポレーターを用いて蒸発させます。反復ジエチルエーテル沈殿三回。 </li></ol></li><li> （V / Vの水、50％アセトニトリル、0.1％TFA）アセトニトリル10ml /酸性水溶液中の粗ペプトイドを溶かします。 、予め秤量した容器に移し、20℃で凍結乾燥粉末に凍結乾燥。 </li></ol></li></ol> 2.キャラクタリゼーションおよび精製注：ペプトイド合成をモニターすることができ、最終的なペプトイドは、C18カラム及びELを用いた分析用逆相HPLCによって評価しますectrospray液体クロマトグラフィー質量分析（LC-MS）。 LC-MSのための溶媒のすべてのHPLC溶媒を新たに準備する必要があります。 <ol><li> 分析HPLC <ol><li>小さなガラスバイアルにペプトイド1mgを秤量します。溶解し、水で1mlに希釈し、アセトニトリルの最小容量を追加します。ペプトイドが完全に溶解していることを確認してください。 </li><li>分析用HPLCに10μLを注入する（推奨傾斜0 - 溶媒A = 95％水、5％アセトニトリル、0.05％TFAおよび溶媒B = 95％アセトニトリル、5％水、0.03％TFA、30分にわたって100％の溶媒B）当たり製造元の指示として。 </li><li> 220 nmのUVスペクトルを可視化します。 </li></ol></li><li> ESI LC-MS <ol><li>ステップ2.1.1のように1mg / mlのペプトイドソリューションとなります。 </li><li>製造者の指示に従って使用して、ターゲットペプトイドの分子量が存在するかどうかを決定するためにLC-MSをエレクトロために1μLを注入します。 </li><li> PEPTを使用して、ペプトイド配列の標的質量をチェック電卓上の指示に従ってOID電卓、。26このWebユーティリティはまた、質量スペクトルに見られる任意の削除/追加の製品の割り当てを可能にする。26 </li></ol></li><li> 分取逆相HPLC <ol><li>酸性水2ml /アセトニトリル（95％水、5％のMeCN、0.1％TFA）中の粗ペプトイドを溶解し、製造業者のプロトコルを使用して分取RP-HPLCにより精製します。分析用HPLCおよびカラムの寸法に依存する注入量から得られた溶出時間によって勾配を決定します。 </li><li> 220 nmに設定し、検出器を使用して視覚化します。 </li><li> 15mlの遠心管中で画分を収集し、20℃および凍結乾燥で凍結。 </li><li>製造業者のプロトコルに従ってLC-MSおよび分析用HPLCを用いて分画を再分析します。精製画分を再結合します。 </li></ol></li></ol> リーシュマニアメキシカーナ寄生虫に対する3.生物学的試験コーン：。安全性の評価は、合成を開始する前に行わなければならないメキシコリーシュマニアは、英国と適切な対策で危険グループ2病原体が所定の位置にテストを開始する前でなければならない分類されています。すべての作業は、クラス2微生物学的安全キャビネットと適切な（ すなわち、ニトリル手袋、安全メガネと白衣）として着用適切な個人用保護具で行わなければなりません。 <ol><li> 寄生虫のサブカルチャー <ol><li> 30秒間37℃の水浴中にバイアルを配置することによって、1ミリリットル-150°C凍結ストックリーシュマニアメキシカーナ M379を解凍。 </li><li>非通気キャップ25 cm 3の細胞培養フラスコ（15％熱不活化ウシ胎児血清および1％ペニシリン/ストレプトマイシンを補充したpH7.0で）を10 mlのシュナイダー昆虫培地にストック溶液を移します。 </li><li> 72時間26℃でインキュベートします。 </li><li>状態を確認するために顕微鏡下で寄生虫（400X倍率）を調べます。目EYは、昆虫ステージプロマスチゴート、多くの分裂細胞で対数期のprocyclic形でなければなりません。 </li><li> 5×10 5寄生虫/ mlの3日ごとの濃度に継代培養寄生虫によってprocyclicプロマスチゴートを維持します。ノイバウアー改善された血球計数器を用いて細胞数を計測します。 </li></ol></li><li> L.の形質転換哺乳動物のステージへmexicanaの昆虫段階無菌無鞭毛フォーム27 <ol><li> 0日25 cm 3の細胞（15％熱不活化ウシ胎児血清および1％ペニシリン/ストレプトマイシンを補充したpH7.0で）シュナイダー昆虫培地中で5×10 5寄生虫/ mlで対数期寄生虫10mlの培養物を調製します非通気型キャップ付き培養フラスコ。 </li><li> 48時間26℃でインキュベートします。 </li><li> 3日目：5分間447×gで50ミリリットルの遠心分離管と遠心分離機に移し10ミリリットル文化。 </li><li>古い培地を捨て、10mlのシュナイダーの昆虫培地を追加（pH5.5で20％の時間を補っ食べる不活化ウシ胎児血清および1％ペニシリン/ストレプトマイシン）。静かにピペットを使用して、新しい培地中で寄生虫のペレットを再懸濁します。 </li><li>ノイバウアー改善された血球計数器を用いて、寄生虫の数をカウントします。 pH5.5の培地及び25 cm 3の細胞培養フラスコに移し、5×10 5寄生虫/ mlの濃度に希釈します。 </li><li>約6日間、26℃でインキュベートします。 </li><li> 9日目：顕微鏡（400X）の下で寄生虫を調べます。彼らは、非複製、感染metacyclic前鞭毛の段階であるべきです。 </li><li>ノイバウアー改善された血球計数器を用いて、寄生虫の数をカウントします。 pH5.5の培地で5×10 5寄生虫/ mlの濃度に希釈します。 </li><li>細胞培養液の10ミリリットルを削除して、細胞培養フラスコに移します。 5日間32℃でインキュベートします。 </li><li> 14日目：顕微鏡（400X）の下で寄生虫の外観を確認してください。彼らは、鞭毛の文字を欠いている、病原性の無鞭毛の段階であるべきです前鞭毛期のISTIC、およびアッセイのための準備ができました。 </li></ol></li><li> L.上の細胞毒性アッセイメキシカーナ無菌無鞭毛型。 注：ペプトイドの生物学的試験は、96ウェルプレート中で行わハイスループットアッセイを使用します。このプロトコルは、Lのテストを記述しますメキシカーナ無菌無鞭毛型が、同一のアッセイは、適切な培地中で前鞭毛期寄生虫に行うことができます。 60分間100μM、その後10倍希釈後24時間インキュベート - 化合物3の濃度で寄生虫とインキュベートします。結果は、レサズリンベースの細胞生存溶液（ 例えば 、アラマーブルー）とのインキュベーション後、ウェルの蛍光を測定することにより得ています。 <ol><li>化合物のストック溶液を準備します。化学天秤を使用して、最終的な精製されたペプトイド製品1mgを秤量。 5 mMの濃度に分子生物学グレードのジメチルスルホキシド（DMSO）の適切な量を追加します。 6μlのアリコートを作成し、-20℃で凍結します。 </li><li> 100から3μMに三連で96ウェルプレート（推奨プレートレイアウトは、結果セクションに見ることができる。図6）の化合物の溶液を調製します。一番上の行（ すなわち、A）中の各化合物の5 mMのストック溶液2μLを加えます。マルチチャンネルピペットを使用して、一番上の行に48μlの新鮮なシュナイダー昆虫培地（pH5.5で、20％ウシ胎児血清（FBS）、1％ペニシリン/ストレプトマイシン（P / S））を加えます。他のすべての行（ - F B）に25μlのシュナイダーの昆虫培地を追加します。 <ol><li>一番上の行からの25μlの液をピペットで連続希釈を行います。下の行に加え、混合します。最後の25μlの溶液は廃棄すべき最後の行までの希釈を行います。 </li><li>三重での陰性対照として、陽性対照及びDMSO（2％溶液）としてアムホテリシンB（5 mMのストック）を使用します。 </li></ol></li><li>転送50ミリリットルの遠心分離管に文化や遠心分離機で：寄生虫液を調製5分間、447×gで。古い培地を捨て、10mlのシュナイダーの昆虫培地（pHは5.5と20％でFBS、1％P / S）を追加します。 </li><li>静かにピペットを使用して、新しい培地中の寄生虫のペレットを溶解し、ノイバウアー改善された血球計数器を使用してカウントされます。 8×10 6寄生虫/ mlに文化を希釈します。 </li><li> 25μlのL.を追加各ウェルにmexicanaの文化 。 32℃で60分間プレートをインキュベートします。 </li><li>インキュベーターからプレートを取り外し、各ウェルから40μlの溶液を除去。 </li><li> 90μlの新鮮な培地を加え、32℃で24時間インキュベートします。 </li><li>各ウェルに10μlのレサズリンベースの細胞生存率溶液を加えます。 32℃で4時間インキュベートします。 </li><li>製造元の指示に従って、（λEMが 600nmのを=、λの元 = 540 nm）をプレートリーダーを用いて蛍光を測定します。 （媒体からのみのウェル）の平均バックグラウンドを除去し、tに対する正規化した後、ウェルの蛍光を比較することによりデータを分析彼はコントロールをDMSO。 </li></ol></li></ol>

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P., Parandoosh, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+the+Alamar+Blue+assay+for+cellular+growth+and+viability+in+vitro.">Assessment of the Alamar Blue assay for cellular growth and viability in vitro.</a> J Immunol Methods. 204, 205-208 (1997).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

<html>ペプトイドはますます、このような新規治療薬3-5、細胞送達剤としての用途における化学生物学および医薬品化学の分野内で検討されている18,20および診断ツール29は一般的に、これらの配列はオーバー病原体に対する選択性の程度を提供するためにカチオン性であります哺乳動物の細胞、細胞膜を貫通し、また水性系における溶解性を補助する能力。文献にのみリジンまたはアルギニン模倣残基を含むカチオン性ペプトイドの多数の例があります。しかし、現在までに、同じ順序でこれらのカチオン性残基の両方を含有するペプトイドの合成は、適切な合成手順の欠如によって妨げられてきました。ここで説明するプロトコルは、混合カチオン性ペプトイドを効率的に合成することができ、それは両親媒性ペプトイドの生物学的および化学的特性を調節するための経路を提供するように非常に望ましいです。 NT &quot;&gt;我々の方法は、一般的に使用されるサブモノマーペプトイド合成への適応を使用して、同一の配列内のリジンおよびアルギニン型モノマーの両方の付加を可能にする。それを室温カップリングを使用して、この方法が予想されるように、保護基化学確立しました研究グループの大半のために有用であろう。アルギニン型残基のための直交保護を追加するには、保護されていないジアミンは、標準的な変位条件下で添加した後、DDE-OHと60分間のカップリングで保護されています。ジアミンの様々なことができます保護DDE-OHをDMFで十分に溶解し、あるそれぞれ1,6-ジアミノヘキサンにインストールすることが長い6個の炭素を2個の炭素原子、 すなわち、1,2-ジアミノエタンから側鎖を可能にする。使用される非常に効率的かつ選択的な保護基のための第一級アミン。DDE-保護グループが影響を受けない第二級アミンを残し、 例えば 、ペプトイド鎖の保護されていないN末端。30 1つの制限は、シンのすべてです論文は、手動で行われました。しかし、開発のカップリング条件は、自動化ペプチド/ペプトイド合成機で使用するための方法が適して作ることが予想されます。 DDE基の樹脂の脱保護ピラゾール-1-カルボキサミジンを使用して樹脂上guanidinylatedできる遊離アミンを残してDMF中2％ヒドラジン溶液を用いて行われます。ピラゾール-1-カルボキサミジンの六同等物およびDIPEAの6同等物は、樹脂上の遊離アミンごとに使用されている（ すなわち 、各NのArg型モノマーのための6つの等価物がインストールされます）。再び、この反応はまた、効率的であり、ピラゾール-1-カルボキサミジン試薬は、DMF中で良好な溶解性を有しています。反応の完了は、典型的には、室温で60分後、LC-MSを介して見られます。 サブモノマー法、第一級アミンの広範囲の多様性に起因する条件がEFFIを連結増加させるために最適化される必要があるかもしれないので、変位工程で使用することができますciencyと全体的な生成物の収率や純度。上述の配列については31、特別な条件が成功したカップリングのために必要ではなかったです。しかし、より長い変位倍以上のアミンの濃度は、問題の変位（ すなわち 、不十分な求核または立体的に嵩高いアミンなど）を使用することができます。いくつかのアミンは、その場合には、代わりにサブモノマー合成のための前の包括的な方法のようにNメチル-2-ピロリドン（NMP）、又は固相反応のための他の適切な溶媒中でこれらを溶解することを推奨し、DMFで完全に可溶性ではないかもしれません側鎖中に保護されていないヘテロ原子を含有するモノマーを組み込むことペプトイド32で、クロロ酢酸を用いてアセチル化は、他のグループによって有効であることが示されている。33また、他の樹脂は異なるC末端官能でペプトイドを生成するために、この方法で使用することができます。ワング樹脂、2-クロロトリチルクロリド樹脂は日常的に使用されていますペプトイドのサブモノマー合成。例えば、この方法はうまく我々のグループに2-クロロトリチルクロリド樹脂で使用されてきた。2異なる固体支持体のRinkアミドに異なる負荷手順を必要とする（使用される特定の樹脂に依存して）ここで説明これは文献で確認する必要があります合成の前に。 ペプチド合成に類似し、ペプトイドオフ樹脂の最終的な切断のための条件は、特定の配列のために最適化することができます。このプロトコルでは、TFA切断カクテル（スカベンジャーとしてトリイソプロピルシラン及び水）を用いました。ここで提示ペプトイドは、合理的に酸不安定基であるのみBoc保護を含んでいました。保護された残基以下、酸に不安定な保護基の大部分を有する配列の完全な脱保護を確実にするために、より長い切断時間が必要な場合があります（ すなわち 、2時間を超える切断時間ははPbfまたは第三-BUを含有する配列のために推奨されていますティルエステル保護されたグループ）。 （例えば、エタンジチオール、または2-メルカプトエタノールは、多くの場合、システイン又はメチオニンなどの硫黄含有側鎖を有するペプチドで使用されるために）代わりのスカベンジャーはまた、特殊な側鎖のために使用することができます。 提示された生物学的アッセイは、異なる細胞株に適合するように変更することができる標準的な細胞毒性試験です。各96ウェルプレートは、得られた結果の信頼性を可能にするのに十分なコントロールを含むべきであることに留意することが重要です。それは、病気を治療するために使用される公知の薬剤であり、これはアッセイのため、化合物ストックを作製するために使用される溶媒であるようにDMSOを陰性対照として使用され、この場合には、アムホテリシンBを正の対照として使用します。他の細胞株が使用されている場合、代替の、適切なコントロールが得られ、使用前に検証されるべきである。L.メキシカーナ1時間100と2μMの濃度でペプトイドとインキュベートされ、次いで、寄生虫/ペプトイド溶液が希釈されます（ すなわち、ウェルは、最初は100μMペプトイドストックで10μMに希釈された）一晩のインキュベーションのための10の要因。 細胞生存率の試薬は、アッセイの終わりに、各ウェル（総ウェル容積の10％）に添加します。目に見える色の変化はありません実行可能な寄生虫（青）、生存寄生虫の中間数との間のスペクトルを有する生存可能な寄生虫（ピンク）、対照ウェルとウェルの間に見られています。蛍光は、生細胞の数に比例し、細胞の代謝活性に対応します。レサズリン色素（非蛍光）、代謝的に活性な細胞における還元反応により蛍光レゾルフィンに変換される。このアッセイでは34、細胞生存率の試薬とのインキュベーション時間は、Lのために最適化されていますメキシカーナ 。プレートは、（例えば、この方法を使用することもできる異なる細胞濃度で、または異なる細胞株を播種するために生存性試薬とのインキュベーション時間は変化するであろう）は、哺乳動物細胞を用いました。使用される正確なプレートリーダーに依存し、考慮事項は、蛍光測定が行われる前に行う必要があります。ウェル内の気泡は、正確な測定値を取ることができることを確認するために除去されるべきです。いくつかのプレートリーダーは、平底96ウェルプレートが使用される場合には、プレートの底部から読み出します。他のマシンは、プレートの上部から読み取ることができるので、プレートの蓋は、測定前に除去されるべきです。 最後に、将来的には、このプロトコルは、並列に多数の配列を作ることが可能な自動合成と適合性であってもよいです。さらに、環状ペプトイドの合成は、この方法を用いても可能です。このプロトコルは、材料または医薬品の分野を含む多くの用途において有用であり得るリジンおよびアルギニン系モノマーの両方を有する新規なペプトイド骨格にアクセスするために使用することができる実用的な合成法で研究者に提供すべきです。

ペプトイド（またはポリNは、グリシン-置換）ペプチドに類似の特性を提供し、そのようなものとして、ますます医薬品や材料の用途のために検討されているペプチド模倣物のクラスです。ペプチドにおいて、各アミノ酸の側鎖は、アミド主鎖のα炭素に接続されています。ペプトイド、側鎖は、主鎖の窒素原子上にシフトされます。重要なことは、これは、ペプトイドをタンパク質分解に対してより高い耐性を提供します。 ペプトイドは、一般的に1。Zuckermann ら、ペプトイドモノマーが固体支持体と第一級アミンを用いて、ハロゲンのその後の変位に取り付けられたアミン官能の連続ハロアセチルによって構築することができますによって開拓サブモノマー法を用いて合成される当社グループは、最近開発されましたリジンとアルギニン型ペプトイド残基をfに同じペプトイドの配列内に含まれることができるようにするには、このサブモノマー法への適応IRST時間は2ペプトイド合成にこの手動の固相アプローチは、研究室の大多数のため、それがアクセスできるように、市販の試薬および共通実験装置を使用しています。ペプトイドは、グラム陰性菌、多くの公知の抗菌性ペプチドに匹敵するグラム陽性細菌および真菌種の広い範囲に対して有望な活性を有することが示されている。3-9 私たちの仕事では、ペプトイドは顧みられない熱帯病のリーシュマニア症の治療のための新規抗感染化合物として使用されてきた。5,10リーシュマニア症は、世界80カ国以上で流行している、1200万人が世界的に感染していると推定されている。11この疾患は、サシチョウバエの咬傷によって送信される寄生原虫によって引き起こされる。 リーシュマニア種は皮膚リーシュマニア症、粘膜に瘢痕および損傷につながる条件、または生命を脅かす内臓レイを引き起こす可能性があります致命的な臓器損傷を引き起こすhmaniasis。いいえワクチンは、この病気のために現在利用可能ではないと既存の治療は、重篤な副作用を有する薬物の小さな数に依存しています。また、既存薬に対する耐性は治療が必死に効果的に将来的にリーシュマニア症を治療するのに必要とされているので、新たに出現し、深刻な問題である。12-16 これらの抗菌剤の用途では、ペプトイドは、多くの場合、カチオン性および疎水性モノマーの混合物と両親媒性であるように設計されている。3,4これは、ペプトイドを細菌細胞への選択性の程度を与える哺乳動物細胞への毒性を減少させる、および分子輸送体としてのそれらの活性を向上させることができ。17-20文献における抗感染ペプトイドの大部分は、専らアミノ官能リジン型モノマーまたはアルギニン型残基のいずれかで構成されているカチオン性側鎖を含みます。カチオン性鎖がAで構成されているペプチド - ペプトイドのキメラ、美濃酸リシンまたはアルギニンは、また活動や毒性に対するカチオン性基の効果を調べるために合成されている。21-25 ポリリジンペプトイドを容易に商業的に入手可能なBoc-保護アミンを用いて合成することができます。ポリアルギニンペプトイドはグアニジニル剤としてピラゾール-1-カルボキサミジンを使用する方法を用いて作製することができると報告した。ペプトイドは樹脂から切断された側鎖のBoc保護を除去した後、18しかし、これが唯一よう、行うことができます配列内のすべてのリジン型残基がアルギニン残基に変換されます。微調整に努力化学物質および化合物の生物学的特性では、二重のカチオン性機能（ 例えば 、N LysおよびNのArg）が初めて任意のペプトイドのシーケンスに含まれることを可能にする方法を開発した。2 ここで、我々はTWの合成、精製及び特徴を説明します同じ順序で両方のリジンおよびアルギニン型残基を含む小説ペプトイドO。この方法は、グアニジニル試薬としてピラゾール-1-カルボキサミジンと樹脂上の直交N -BocとN -Dde保護を使用しています。これらのペプトイドの生物学的評価はまた、リーシュマニア・メキシカーナ 、皮膚リーシュマニア症の病原体に対する細胞毒性アッセイに記載されています。これは、二重のカチオン性官能基を有するペプトイドにアクセスするために、それらの生物学的活性を評価するための実用的な方法を提供します。この方法は、将来的にペプトイドコミュニティによって両親媒性ペプトイドの合成を促進することが期待されます。

<table><tbody><tr><td>Polypropylene solid phase extraction cartridges with two frits</td><td>Crawford Scientific</td><td>12131017 and 12131015</td><td>20 ml and 6 ml cartridges used in this preparation</td></tr><tr><td>Trifluoroacetic acid</td><td>Tokyo Chemical Industry (Europe)</td><td>T0431-100g</td><td>&gt;98%; CAUTION: can cause severe burns and respiratory irritation</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;N,N&#039;&lt;/em&gt;-diisopropylcarbodiimide</td><td>Sigma Aldrich</td><td>38370-100ML</td><td>&gt;98%; CAUTION: hazardous to eyes, skin and via respiratory inhalation, may also cause sensitisation</td></tr><tr><td>Dimethylformamide</td><td>Fischer Scientific</td><td>10346180</td><td>HPLC grade; CAUTION: suspected teratogen</td></tr><tr><td>Acetonitrile</td><td>Fischer Scientific</td><td>10407440</td><td>HPLC grade</td></tr><tr><td>Dichloromethane</td><td>Fischer Scientific</td><td>10354263</td><td>99.8%; CAUTION: suspected carcinogen</td></tr><tr><td>Bromacetic acid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>17000-100G</td><td>&gt;99%; CAUTION: causes burns and hazardous to skin, eyes and respiratory tract</td></tr><tr><td>(&lt;em&gt;S&lt;/em&gt;)-(-)-alpha methylbenzylamine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>115568-100G</td><td>98%; CAUTION: harmful if swallowed, toxic in contact with skin, causes severe skin burns and eye damage, used to synthesise the Nspe monomer</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;N&lt;/em&gt;-Boc 1,4-diaminobutane</td><td>Tokyo Chemical Industry (Europe)</td><td>A1373-25g</td><td>&gt;98%; CAUTION: causes severe skin burns and eye damage, used to synthesise the NLys monomer</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;N&lt;/em&gt;-Boc 1,2-diaminoethane</td><td>Tokyo Chemical Industry (Europe)</td><td>A1371-25g</td><td>&gt;97%; CAUTION: causes severe skin burns and eye damage, used to synthesise the Nae monomer</td></tr><tr><td>1,2-diaminobutane</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D13208-100G</td><td>99%; CAUTION: flammable liquid and vapour, harmful if swallowed or inhaled, toxic in contact with skin, causes severe skin burns and eye damage, used in the synthesis of the NhArg monomer</td></tr><tr><td>1,4-diaminoethane</td><td>Sigma Aldrich</td><td>03550-250ML</td><td>&gt;99.5%; CAUTION: flammable liquid and vapour, harmful if swallowed or inhaled, toxic in contact with skin, causes severe skin burns and eye damage, used in the synthesis of the NnArg monomer&lt;br /&gt;&amp;nbsp;&lt;br /&gt;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>1H-pyrazole-1-carboxamidine HCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>402516-10G</td><td>as HCl salt; CAUTION: harmful if swallowed and may cause an allergic skin reaction, causes serious eye damage</td></tr><tr><td>Hydrazine monohydrate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>207942-5G</td><td>reagent grade; CAUTION: suspected carcinogen, fatal if inhaled and causes severe burns to skin and eyes</td></tr><tr><td>2-acetyl dimedone</td><td>Novabiochem</td><td>8510150005</td><td>Dde-OH</td></tr><tr><td>Rink Amide resin</td><td>Novabiochem</td><td>8551190005</td><td>100-200 mesh, high loading</td></tr><tr><td>Piperidine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>411027-1L</td><td>&gt;99.5%, a controlled substance, so adequate permission must be obtained before purchase; CAUTION: highly flammable liquid and vapour, harmful if swallowed and toxic in contact with skin or if inhaled, causes severe skin burns and eye damage, harmful to aquatic life with long lasting effects</td></tr><tr><td>Triisopropylsilane</td><td>Sigma Aldrich</td><td>233781-50G</td><td>98%; CAUTION: flammable liquid and vapour, causes skin irritation and serious eye irritation</td></tr><tr><td>alamarBlue</td><td>ThermoFischer&amp;nbsp;</td><td>DAL1025</td><td>Not classified as hazardous</td></tr><tr><td>Schneider&#039;s Insect Medium</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S9895-1L</td><td>Powdered, medium must be made prior to use following manafacturers instructions; allow to warm to room temperature before use in biological assays</td></tr><tr><td>96 well plates</td><td>VWR</td><td>734-1793</td><td>Flat bottom (to allow fluorescence measurement from the bottom), tissue-culture treated</td></tr><tr><td>Solvent reservoirs</td><td>VWR</td><td>613-1182</td><td>Used with multi channel pipette</td></tr><tr><td>Multi channel pipette</td><td>Eppendorf</td><td>3122000043</td><td></td></tr><tr><td>Pipette tips</td><td>Starlab Group</td><td>S1111-3810, S1113-1810, S1111-6810</td><td>Volume of tip dependent on pipette used. 10&amp;nbsp;&amp;micro;l, 10 - 200&amp;nbsp;&amp;micro;l and 1,000&amp;nbsp;&amp;micro;l recommended for assays</td></tr><tr><td>25 cm&lt;sup&gt;3&lt;/sup&gt; cell culture flasks</td><td>VWR</td><td>734-2312</td><td></td></tr><tr><td>50 ml centrifuge tubes</td><td>VWR</td><td>525-0791</td><td></td></tr><tr><td>dimethylsulphoxide (molecular biology grade)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D8418-50ML</td><td>Not classified as hazardous</td></tr><tr><td>Heat Inactivated Fetal Bovine Serum</td><td>ThermoFischer&amp;nbsp;</td><td>10082139-100mL</td><td>Gibco</td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>ThermoFischer&amp;nbsp;</td><td>15140148-20mL</td><td>Abbreviation: P/S</td></tr><tr><td>Amphotericin B</td><td>Sigma Aldrich</td><td>46006-100mg</td><td>Amphotericin B trihydrate, VetranalTM analytical standard</td></tr></tbody></table>

an efficient method for the synthesis of peptoids with mixed lysine-type/arginine-type monomers and evaluation of their anti-leishmanial activity

This protocol describes the manual solid-phase synthesis of linear peptoids that contain two differently functionalized cationic monomers. In this procedure amino functionalized 'lysine' and guanido functionalized 'arginine' peptoid monomers can be included within the same peptoid sequence. This procedure uses on-resin (N-(1-(4,4-dimethyl-2,6-dioxocyclohexylidene)ethyl) or Dde protection, orthogonal conditions to the Boc protection of lysine monomers. Subsequent deprotection allows an efficient on-resin guanidinylation reaction to form the arginine residues. The procedure is compatible with the commonly used submonomer method of peptoid synthesis, allowing simple peptoids to be made using common laboratory equipment and commercially available reagents. The representative synthesis, purification and characterization of two mixed peptoids is described. The evaluation of these compounds as potential anti-infectives in screening assays against Leishmania mexicana is also described. The protozoan parasite L. mexicana is a causative agent of cutaneous leishmaniasis, a neglected tropical disease that affects up to 12 million people worldwide.

代表的な結果として、2つのリシン型モノマーと二アルギニン型モノマーをそれぞれ含む二12残基のペプトイドの合成および特徴付けを説明します。細胞毒性アッセイの後続の結果も示されています。 二つペプトイドは[（N第narg Nの SPE N SPE）（N AE N SPE N SPE）] 2（a）および[（N HARG Nの SPE N SPE）（N LysのN個の SPE N SPE）] 2（B）を用いて合成しました。 120 mgのリンクアミド各（ロード= 0.79ミリモル/ g）を樹脂。上記のように、すべてのアセチル化と変位ステップは、商業的に購入したすべての試薬を用いて、実施しました。これらの残基は、以下のアミンは、置換工程において使用した：N SPE（S） - （ - ） - α -メチルベンジルアミン、N AE N - （tert-ブチルブトキシカルボニル）-1,2- DIAMinoethane、N Lysの N - （tert-ブチルブトキシカルボニル）-1,4-ジアミノブタン。アルギニン誘導体残基については、以下の保護されていないジアミンを結合させた：N HARG 1,4-ジアミノブタンまたはN 第narg 1,2-ジアミノエタン、2-acetyldimedone（DDE-OH）との上に樹脂の保護が続きます。全配列が合成された後、DDEのヒドラジンの脱保護は、guanidinylateする遊離アミンが得られます。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/54750/54750fig1.jpg" /> 図1ペプトイド構造（A）（N第narg N SPE N個の SPE）（N AE N SPE N個の SPE）] 2及び（b）（N HARG N SPE N個の SPE）（N <stro<html> NG&gt; LysのN個の SPE N SPE）] 2。 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54750/54750fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/54750/54750fig2.jpg" /> 図2.。私を混合アルギニン/リシンペプトイドを合成するために使用される方法 。ジアミンとサブモノマー法における標準的な変位ステップ; II。遊離アミンを保護するためのDDE-OH、90分間の添加; III。さらなる追加はサブモノマー法を用いて、ペプトイド鎖を延長します。 IV。 DDEは、DMF中2％ヒドラジンを用いた脱保護。 。DMF中のピラゾール-1-カルボキサミジン及びDIPEAと樹脂上の遊離アミンのVグアニジニル。 viの。 Boc基を樹脂及び脱保護から酸性の切断。large.jpg &quot;ターゲット=&quot; _空白 &quot;&gt;この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 （a）は154 mgであり、（b）の163ミリグラム：樹脂および凍結乾燥から切断後、粗生成物を白色粉末として得ました。分析カラムでのUV-VIS検出器（λ= 250 nm）を、×10 250mmの、5ミクロンを有するLCポンプを使用して、最大50 mgの注射を用いて説明したように生成物をRP-HPLCによって精製しました。速度= 2ml /分を流します。目標質量に対応する画分を合わせ、白色の粉末として得られた：（A）54mgの（B）65 mgの、90％の純粋な画分&gt;のための約30％の最終収率。 精製後の最終化合物のアイデンティティは、UPLCフォトダイオードアレイ検出器を備えた三連四重極質量分析計を用いたLC-MS（ 図3参照）により確認しました。正確な質量分析法は、トンでも同じ分光計を用いて行きました<html>彼[M + 2H] 2+イオン。計算された以下と観察された質量は、近く合意（ 図4）で発見された：（a）は、計算された= 896.0026 amuで、観察= 896.0038 AMU。 （b）は計算された= 952.0691 amuで、観察= 952.0730 AMU。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/54750/54750fig3.jpg" /> 精製されたペプトイドのための図3のLC-MS（A） の m / z = 1,792および（b） の m / z = 1,903。どこトップはTIC、ミドルLC-MSスペクトル、220 nmでの底UVクロマトグラムである。 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54750/54750fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/54750/54750fig4.jpg" /> ペプトイド（a）及び（b）は図4の正確な質量分析データ。「https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54750/54750fig4large.jpg &quot;ターゲット=&quot; _空白 &quot;&gt;この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 、220 nmで可視化し、吸光度、生成物の純度は、分析RP-HPLC（流速= 1ml /分分析カラム4.6ミリメートル×100ミリメートル、3.5ミクロンのUV-VIS検出器を備えたLCポンプ）を用いて評価しました。アミド骨格。 図5aおよび5bの化合物が均一であることを示しています。 <img alt="図5" src="/files/ftp_upload/54750/54750fig5.jpg" /> 図5.分析精製ペプトイド用HPLC（a）および（b）30分間にわたる勾配0-100％Bであり、40°C（A = 95％H 2 O、5％のMeCN、0.05でカラムオーブン％TFA; B = 95％のMeCN、5％H 2 O、0.03％TFA） <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54750/54750fig5large.jpg" target="_blank">をクリアしてください。</a>この図の拡大版を表示するには、こちらICK。 精製されたペプトイド（a）及び（b）はL.に対する細胞傷害性アッセイにおいて試験しました。 メキシカーナ無菌無鞭毛型。 L.の凍結ストックメキシカーナを解凍し、アッセイのための準備ができて無鞭毛ステージに形質転換しました。 72時間解凍後、寄生虫は多くの分裂細胞のログ期で、そのprocyclic形で昆虫ステージ前鞭でなければなりません。この段階で寄生虫を説明pHおよび温度シフトを用いて、無鞭毛期に変換することができます。27変態の9日目では、寄生虫は、非複製感染性metacyclic前鞭毛の段階になります。最後に、14日目に、寄生虫は寄生虫がプロマスチゴートの特性鞭毛を欠く病原性無鞭毛の段階であるべきである。28 化合物の5mMのストック溶液は、細胞培養グレードのDMSOで作製上に三連で試験しました。堅牢なデータセットを確保するために2つの機会を最小に収集しました。代表的な96ウェルプレート計画が図6に示されている。このアッセイの終了時、細胞生存度試薬を各ウェルに添加し、試験した各濃度で寄生虫の生存率を計算するために記載したように蛍光を測定した（ 図7参照 ）。 ED 50値は、ペプトイド（A）&gt; 100μMおよび37μMそれぞれペプトイド（B）として算出しました。エラーバーは、標準偏差などのウェル間の変動を示し、プロットし、これらは、ほとんどのバーのための合理的であることがわかります。 <img alt="図6" src="/files/ftp_upload/54750/54750fig6.jpg" /> 図6.代表96（正および負の対照を含む）2ペプトイドソリューションの細胞毒性アッセイ用のウェルプレート計画。+ =中（シュナイダー昆虫培地、pH5.5の、20％FBS、1％P / S）のmed。L. MEX。 =MED + 8×10 6 / mlの寄生虫の文化。 AmphoB = DMSO中の5mM。 DMSO中のペプトイド= 5 mMのストック溶液。空のウェルは、滅菌水を含むべきである。 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54750/54750fig6large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図7" src="/files/ftp_upload/54750/54750fig7.jpg" /> 図L.に対する細胞傷害性アッセイからの7の結果ペプトイドを使用メキシカーナ無菌無鞭毛寄生虫は（a）と（b）。ペプトイド（b）は（a）の両方の化合物は、用量依存的効果を有する、生存可能な寄生虫の割合を減少させるのにペプトイドよりも効果的であることがわかります。プロットエラーバーは、標準偏差など、ウェル間の変動を示す。 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54750/54750fig7large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a>

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An Efficient Method for the Synthesis of Peptoids with Mixed Lysine-type/Arginine-type Monomers and Evaluation of Their Anti-leishmanial Activity

A protocol to synthesize peptoids with mixed cationic functionality in the same sequence is presented (lysine- and arginine-type monomers). Subsequent testing of these compounds against Leishmania mexicana, the protozoan parasites that cause cutaneous leishmaniasis, is also described.

混合リジン型/アルギニン型モノマーおよびそれらの抗リーシュマニア活性の評価とペプトイドの合成のための効率的な方法

This protocol describes the manual solid-phase synthesis of linear peptoids that contain two differently functionalized cationic monomers. In this ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biochemistry

12.0K ビュー.  Durham University. A protocol to synthesize peptoids with mixed cationic functionality in the same sequence is presented (lysine- and arginine-type monomers). Subsequent testing of these compounds against Leishmania mexicana, the protozoan parasites that cause cutaneous leishmaniasis, is also described.

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Split-and-pool Synthesis and Characterization of Peptide Tertiary Amide Library

Peptidomimetics are great sources of protein ligands. The oligomeric nature of these compounds enables us to access large synthetic libraries on solid phase by using combinatorial chemistry. One of the most well studied classes of peptidomimetics is peptoids. Peptoids are easy to synthesize and have been shown to be proteolysis-resistant and cell-permeable. Over the past decade, many useful protein ligands have been identified through screening of peptoid libraries. However, most of the ligands identified from peptoid libraries do not display high affinity, with rare exceptions. This may be due, in part, to the lack of chiral centers and conformational constraints in peptoid molecules. Recently, we described a new synthetic route to access peptide tertiary amides (PTAs). PTAs are a superfamily of peptidomimetics that include but are not limited to peptides, peptoids and N-methylated peptides. With side chains on both &#945;-carbon and main chain nitrogen atoms, the conformation of these molecules are greatly constrained by sterical hindrance and allylic 1,3 strain. (Figure 1) Our study suggests that these PTA molecules are highly structured in solution and can be used to identify protein ligands. We believe that these molecules can be a future source of high-affinity protein ligands. Here we describe the synthetic method combining the power of both split-and-pool and sub-monomer strategies to synthesize a sample one-bead one-compound (OBOC) library of PTAs.

Peptide tertiary amides (PTAs) are a superfamily of peptidomimetics that include but are not limited to peptides, peptoids and N-methylated peptides. Here we describe a synthetic method which combines&#160;both split-and-pool and sub-monomer strategies to synthesize a one-bead one-compound library of PTAs.

ペプチド第三級アミドライブラリのスプリット·アンド·プールの合成とキャラクタリゼーション

Peptidomimetics are great sources of protein ligands. The oligomeric nature of these compounds enables us to access large synthetic libraries on solid ...

化学

Solid-phase Submonomer Synthesis of Peptoid Polymers and their Self-Assembly into Highly-Ordered Nanosheets

Peptoids are a novel class of biomimetic, non-natural, sequence-specific heteropolymers that resist proteolysis, exhibit potent biological activity, and fold into higher order nanostructures. Structurally similar to peptides, peptoids are poly N-substituted glycines, where the side chains are attached to the nitrogen rather than the alpha-carbon. Their ease of synthesis and structural diversity allows testing of basic design principles to drive de novo design and engineering of new biologically-active and nanostructured materials.
Here, a simple manual peptoid synthesis protocol is presented that allows the synthesis of long chain polypeptoids ( up to 50mers) in excellent yields. Only basic equipment, simple techniques (e.g. liquid transfer, filtration), and commercially available reagents are required, making peptoids an accessible addition to many researchers' toolkits. The peptoid backbone is grown one monomer at a time via the submonomer method which consists of a two-step monomer addition cycle: acylation and displacement. First, bromoacetic acid activated in situ with N,N'-diisopropylcarbodiimide acylates a resin-bound secondary amine. Second, nucleophilic displacement of the bromide by a primary amine follows to introduce the side chain. The two-step cycle is iterated until the desired chain length is reached. The coupling efficiency of this two-step cycle routinely exceeds 98% and enables the synthesis of peptoids as long as 50 residues. Highly tunable, precise and chemically diverse sequences are achievable with the submonomer method as hundreds of readily available primary amines can be directly incorporated.
 
Peptoids are emerging as a versatile biomimetic material for nanobioscience research because of their synthetic flexibility, robustness, and ordering at the atomic level. The folding of a single-chain, amphiphilic, information-rich polypeptoid into a highly-ordered nanosheet was recently demonstrated. This peptoid is a 36-mer that consists of only three different commercially available monomers: hydrophobic, cationic and anionic. The hydrophobic phenylethyl side chains are buried in the nanosheet core whereas the ionic amine and carboxyl side chains align on the hydrophilic faces. The peptoid nanosheets serve as a potential platform for membrane mimetics, protein mimetics, device fabrication, and sensors. Methods for peptoid synthesis, sheet formation, and microscopy imaging are described and provide a simple method to enable future peptoid nanosheet designs.

A simple and general manual peptoid synthesis method involving basic equipment and commercially available reagents is outlined, enabling peptoids to be easily synthesized in most laboratories. The synthesis, purification and characterization of an amphiphilic peptoid 36mer is described, as well as its self-assembly into highly-ordered nanosheets.

高秩序のナノシートにペプトイドポリマーおよびそれらの自己組織化の固相Submonomer合成

Peptoids are a novel class of biomimetic, non-natural, sequence-specific heteropolymers that resist proteolysis, exhibit potent biological activity, and ...

生物工学

Development of a Backbone Cyclic Peptide Library as Potential Antiparasitic Therapeutics Using Microwave Irradiation

Protein-protein interactions (PPIs) are intimately involved in almost all biological processes and are linked to many human diseases. Therefore, there is a major effort to target PPIs in basic research and in the pharmaceutical industry. Protein-protein interfaces are usually large, flat, and often lack pockets, complicating the discovery of small molecules that target such sites. Alternative targeting approaches using antibodies have limitations due to poor oral bioavailability, low cell-permeability, and production inefficiency.
Using peptides to target PPI interfaces has several advantages. Peptides have higher conformational flexibility, increased selectivity, and are generally inexpensive. However, peptides have their own limitations including poor stability and inefficiency crossing cell membranes. To overcome such limitations, peptide cyclization can be performed. Cyclization has been demonstrated to improve peptide selectivity, metabolic stability, and bioavailability. However, predicting the bioactive conformation of a cyclic peptide is not trivial. To overcome this challenge, one attractive approach it to screen a focused library to screen in which all backbone cyclic peptides have the same primary sequence, but differ in parameters that influence their conformation, such as ring size and position.
We describe a detailed protocol for synthesizing a library of backbone cyclic peptides targeting specific parasite PPIs. Using a rational design approach, we developed peptides derived from the scaffold protein Leishmania receptor for activated C-kinase (LACK). We hypothesized that sequences in LACK that are conserved in parasites, but not in the mammalian host homolog, may represent interaction sites for proteins that are critical for the parasites&#39; viability. The cyclic peptides were synthesized using microwave irradiation to reduce reaction times and increase efficiency. Developing a library of backbone cyclic peptides with different ring sizes facilitates a systematic screen for the most biological active conformation. This method provides a general, fast, and facile way to synthesize cyclic peptides.

A simple and general method for the synthesis of cyclic peptides using microwave irradiation is outlined. This procedure enables the synthesis of backbone cyclic peptides with a collection of different conformations while retaining the side chains and the pharmacophoric moieties., and therefore, allows to screen for the bioactive conformation.

マイクロ波照射を用いて潜在的な抗寄生虫治療薬としてのバックボーン環状ペプチドライブラリの開発

Protein-protein interactions (PPIs) are intimately involved in almost all biological processes and are linked to many human diseases. Therefore, there is ...

Analysis of the Solvent Accessibility of Cysteine Residues on Maize rayado fino virus Virus-like Particles Produced in Nicotiana benthamiana Plants and Cross-linking of Peptides to VLPs

Mimicking and exploiting virus properties and physicochemical and physical characteristics holds promise to provide solutions to some of the world's most pressing challenges. The sheer range and types of viruses coupled with their intriguing properties potentially give endless opportunities for applications in virus-based technologies. Viruses have the ability to self- assemble into particles with discrete shape and size, specificity of symmetry, polyvalence, and stable properties under a wide range of temperature and pH conditions. Not surprisingly, with such a remarkable range of properties, viruses are proposed for use in biomaterials 9, vaccines 14, 15, electronic materials, chemical tools, and molecular electronic containers4, 5, 10, 11, 16, 18, 12.
In order to utilize viruses in nanotechnology, they must be modified from their natural forms to impart new functions. This challenging process can be performed through several mechanisms including genetic modification of the viral genome and chemically attaching foreign or desired molecules to the virus particle reactive groups 8. The ability to modify a virus primarily depends upon the physiochemical and physical properties of the virus. In addition, the genetic or physiochemical modifications need to be performed without adversely affecting the virus native structure and virus function. Maize rayado fino virus (MRFV) coat proteins self-assemble in Escherichia coli producing stable and empty VLPs that are stabilized by protein-protein interactions and that can be used in virus-based technologies applications 8. VLPs produced in tobacco plants were examined as a scaffold on which a variety of peptides can be covalently displayed 13. Here, we describe the steps to 1) determine which of the solvent-accessible cysteines in a virus capsid are available for modification, and 2) bioconjugate peptides to the modified capsids. By using native or mutationally-inserted amino acid residues and standard coupling technologies, a wide variety of materials have been displayed on the surface of plant viruses such as, Brome mosaic virus 3, Carnation mottle virus 12, Cowpea chlorotic mottle virus 6, Tobacco mosaic virus 17, Turnip yellow mosaic virus 1, and MRFV 13.

Analysis of the Solvent Accessibility of Cysteine Residues on Maize rayado fino virus Virus-like Particles Produced in Nicotiana benthamiana Plants and Cross-linking of Peptides to VLPs

A method to analyze the solvent accessibility of the thiol group of cysteine residues of Maize rayado fino virus (MRFV)-virus-like particles (VLPs) followed by a peptide cross-linking reaction is described. The method takes advantage of the availability of several chemical groups on the surface of the VLPs that can be targets for specific reactions.

上のシステイン残基の溶媒アクセシビリティの分析<em&gt;トウモロコシrayadoフィノウイルス</emで生産&gt;ウイルス様粒子<em&gt; Nicotiana benthamianaの</emVLPは、ペプチドの&gt;植物と架橋

Mimicking  and exploiting virus properties and physicochemical and physical  characteristics holds promise to provide solutions to some of  the world's ...

免疫・感染学

Synthesis and Mass Spectrometry Analysis of Oligo-peptoids

Peptoids are sequence-controlled peptide-mimicking oligomers consisting of N-alkylated glycine units. Among many potential applications, peptoids have been thought of as a type of molecular information storage. Mass spectrometry analysis has been considered the method of choice for sequencing peptoids. Peptoids can be synthesized via solid phase chemistry using a repeating two-step reaction cycle. Here we present a method to manually synthesize oligo-peptoids and to analyze the sequence of the peptoids using tandem mass spectrometry (MS/MS) techniques. The sample peptoid is a nonamer consisting of alternating N-(2-methyloxyethyl)glycine (Nme) and N-(2-phenylethyl)glycine (Npe), as well as an N-(2-aminoethyl)glycine (Nae) at the N-terminus. The sequence formula of the peptoid is Ac-Nae-(Npe-Nme)4-NH2, where Ac is the acetyl group. The synthesis takes place in a commercially available solid-phase reaction vessel. The rink amide resin is used as the solid support to yield the peptoid with an amide group at the C-terminus. The resulting peptoid product is subjected to sequence analysis using a triple-quadrupole mass spectrometer coupled to an electrospray ionization source. The MS/MS measurement produces a spectrum of fragment ions resulting from the dissociation of charged peptoid. The fragment ions are sorted out based on the values of their mass-to-charge ratio (m/z). The m/z values of the fragment ions are compared against the nominal masses of theoretically predicted fragment ions, according to the scheme of peptoid fragmentation. The analysis generates a fragmentation pattern of the charged peptoid. The fragmentation pattern is correlated to the monomer sequence of the neutral peptoid. In this regard, MS analysis reads out the sequence information of the peptoids.

A protocol is described for the manual synthesis of oligo-peptoids followed by sequence analysis by mass spectrometry.

合成とオリゴ ペプチドの質量分析

Peptoids are sequence-controlled peptide-mimicking oligomers consisting of N-alkylated glycine units. Among many potential applications, peptoids have ...

Facile Protocol for the Synthesis of Self-assembling Polyamine-based Peptide Amphiphiles (PPAs) and Related Biomaterials

Polyamine-based Peptide Amphiphiles (PPAs) are a new class of self-assembling amphiphilic biomaterials-related to the peptide amphiphiles (PAs). Traditional PAs possess charged amino acids as solubilizing groups (lysine, arginine), which are directly connected to a lipid segment or can contain a linker region made of neutral amino acids. Tuning the peptide sequence of PAs can yield diverse morphologies. Similarly, PPAs possess a hydrophobic segment and neutral amino acids, but also contain polyamine molecules as water solubilizing (hydrophilic) groups. As is the case with PAs, PPAs can also self-assemble into diverse morphologies, including small rods, twisted nano-ribbons, and fused nano-sheets, when dissolved in water. However, the presence of both primary and secondary amines on a single polyamine molecule poses a significant challenge when synthesizing PPAs. In this paper, we show a simple protocol, based on literature precedents, to achieve a facile synthesis of PPAs using solid phase peptide synthesis (SPPS). This protocol can be extended to the synthesis of PAs and other similar systems. We also illustrate the steps that are needed for cleavage from the resin, identification, and purification.

Facile Protocol for the Synthesis of Self-assembling Polyamine-based Peptide Amphiphiles PPAs and Related Biomaterials

The synthesis of polyamine-based peptide amphiphiles (PPAs) is a significant challenge due to the presence of multiple amine nitrogens, which requires judicious use of protecting groups to mask these reactive functionalities. In this paper, we describe a facile method for the preparation of these new class of self-assembling molecules.

自己組織化ペプチドのポリアミンによる両親媒性物質 (Ppa の) と関連生体材料の合成のための安易なプロトコル

Polyamine-based Peptide Amphiphiles (PPAs) are a new class of self-assembling amphiphilic biomaterials-related to the peptide amphiphiles (PAs). ...

Synthesis of Information-bearing Peptoids and their Sequence-directed Dynamic Covalent Self-assembly

This protocol presents the use of Lewis acidic multi-role reagents to circumvent kinetic trapping observed during the self-assembly of information-encoded oligomeric strands mediated by paired dynamic covalent interactions in a manner mimicking the thermal cycling commonly employed for the self-assembly of complementary nucleic acid sequences. Primary amine monomers bearing aldehyde and amine pendant moieties are functionalized with orthogonal protecting groups for use as dynamic covalent reactant pairs. Using a modified automated peptide synthesizer, the primary amine monomers are encoded into oligo(peptoid) strands through solid-phase submonomer synthesis. Upon purification by high-performance liquid chromatography (HPLC) and characterization by electrospray ionization mass spectrometry (ESI-MS), sequence-specific oligomers are subjected to high-loading of a Lewis acidic rare-earth metal triflate which both deprotects the aldehyde moieties and affects the reactant pair equilibrium such that strands completely dissociate. Subsequently, a fraction of the Lewis acid is extracted, enabling annealing of complementary sequence-specific strands to form information-encoded molecular ladders characterized by matrix assisted laser desorption/ionization mass spectrometry (MALDI-MS). The simple procedure outlined in this report circumvents kinetic traps commonly experienced in the field of dynamic covalent assembly and serves as a platform for the future design of robust, complex architectures.

A protocol is presented for the synthesis of information-encoded peptoid oligomers and for the sequence-directed self-assembly of these peptoids into molecular ladders using amines and aldehydes as dynamic covalent reactant pairs and Lewis acidic rare-earth metal triflates as multi-role reagents.

情報を持つペプトイドの合成と、その配列指向動的共有自己集合

This protocol presents the use of Lewis acidic multi-role reagents to circumvent kinetic trapping observed during the self-assembly of information-encoded ...

Constructing Cyclic Peptides Using an On-Tether Sulfonium Center

In recent years, cyclic peptides have attracted increasing attention in the field of drug discovery due to their excellent biological activities, and, as a consequence, they are now used clinically. It is, therefore, critical to seek effective strategies for synthesizing cyclic peptides to promote their application in the field of drug discovery. This paper reports a detailed protocol for the efficient synthesis of cyclic peptides using on-resin or intramolecular (intermolecular) bisalkylation. Using this protocol, linear peptides were synthesized by taking advantage of solid-phase peptide synthesis with cysteine (Cys) and methionine (Met) coupled simultaneously on the resin. Further, cyclic peptides were synthesized via bisalkylation between Met and Cys using a tunable tether and an on-tether sulfonium center. The whole synthetic route can be divided into three major processes: the deprotection of Cys on the resin, the coupling of the linker, and the cyclization between Cys and Met in a trifluoroacetic acid (TFA) cleavage solution. Furthermore, inspired by the reactivity of the sulfonium center, a propargyl group was attached to the Met to trigger thiol-yne addition and form a cyclic peptide. After that, the crude peptides were dried and dissolved in acetonitrile, separated, and then purified by high-performance liquid chromatography (HPLC). The molecular weight of the cyclic peptide was confirmed by liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS), and the stability of the cyclic peptide combination with the reductant was further confirmed using HPLC. In addition, the chemical shift in the cyclic peptide was analyzed by 1H nuclear magnetic resonance (1H NMR) spectra. Overall, this protocol aimed to establish an effective strategy for synthesizing cyclic peptides.

This protocol presents the synthesis of cyclic peptides via bisalkylation between cysteine and methionine and the facile thiol-yne reaction triggered by the propargyl sulfonium center.

オンテザースルホニウム中心を用いた環状ペプチドの構築

In recent years, cyclic peptides have attracted increasing attention in the field of drug discovery due to their excellent biological activities, and, as ...

Solid Phase Synthesis of a Functionalized Bis-Peptide Using "Safety Catch" Methodology

In 1962, R.B. Merrifield published the first procedure using solid-phase peptide synthesis as a novel route to efficiently synthesize peptides. This technique quickly proved advantageous over its solution-phase predecessor in both time and labor. Improvements concerning the nature of solid support, the protecting groups employed and the coupling methods employed over the last five decades have only increased the usefulness of Merrifield's original system. Today, use of a Boc-based protection and base/nucleophile cleavable resin strategy or Fmoc-based protection and acidic cleavable resin strategy, pioneered by R.C. Sheppard, are most commonly used for the synthesis of peptides1.
Inspired by Merrifield's solid supported strategy, we have developed a Boc/tert-butyl solid-phase synthesis strategy for the assembly of functionalized bis-peptides2, which is described herein. The use of solid-phase synthesis compared to solution-phase methodology is not only advantageous in both time and labor as described by Merrifield1, but also allows greater ease in the synthesis of bis-peptide libraries. The synthesis that we demonstrate here incorporates a final cleavage stage that uses a two-step "safety catch" mechanism to release the functionalized bis-peptide from the resin by diketopiperazine formation.
Bis-peptides are rigid, spiro-ladder oligomers of bis-amino acids that are able to position functionality in a predictable and designable way, controlled by the type and stereochemistry of the monomeric units and the connectivity between each monomer. Each bis-amino acid is a stereochemically pure, cyclic scaffold that contains two amino acids (a carboxylic acid with an &alpha;-amine)3,4. Our laboratory is currently investigating the potential of functional bis-peptides across a wide variety of fields including catalysis, protein-protein interactions and nanomaterials.

The efficient solid-phase peptide synthesis of a functionalized bis-peptide trimer utilizing a "safety catch" cleavage procedure from HMBA resin is described.

官能ビス - ペプチドの固相合成方法を &quot;安全キャッチ&quot;を使用して

In 1962, R.B. Merrifield published the first procedure using solid-phase peptide synthesis as a novel route to efficiently synthesize peptides. This ...

生物学

Specificity Analysis of Protein Lysine Methyltransferases Using SPOT Peptide Arrays

Lysine methylation is an emerging post-translation modification and it has been identified on several histone and non-histone proteins, where it plays crucial roles in cell development and many diseases. Approximately 5,000 lysine methylation sites were identified on different proteins, which are set by few dozens of protein lysine methyltransferases. This suggests that each PKMT methylates multiple proteins, however till now only one or two substrates have been identified for several of these enzymes. To approach this problem, we have introduced peptide array based substrate specificity analyses of PKMTs. Peptide arrays are powerful tools to characterize the specificity of PKMTs because methylation of several substrates with different sequences can be tested on one array. We synthesized peptide arrays on cellulose membrane using an Intavis SPOT synthesizer and analyzed the specificity of various PKMTs. Based on the results, for several of these enzymes, novel substrates could be identified. For example, for NSD1 by employing peptide arrays, we showed that it methylates K44 of H4 instead of the reported H4K20 and in addition H1.5K168 is the highly preferred substrate over the previously known H3K36. Hence, peptide arrays are powerful tools to biochemically characterize the PKMTs.

Peptide arrays synthesized by the SPOT method can be used to analyze the substrate specificity of Protein lysine methyltransferases (PKMTs) and to define the substrate spectrum of PKMTs to understand their biological role. This protocol describes how to synthesize peptide arrays, methylate them with PKMTs, and analyze the results.

SPOTペプチド配列を用いてタンパク質リジンメチルトランスフェラーゼの特異性の解析

Lysine methylation is an emerging post-translation modification and it has been identified on several histone and non-histone proteins, where it plays ...

混合リジン型/アルギニン型モノマーおよびそれらの抗リーシュマニア活性の評価とペプトイドの合成のための効率的な方法

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高秩序のナノシートにペプトイドポリマーおよびそれらの自己組織化の固相Submonomer合成

マイクロ波照射を用いて潜在的な抗寄生虫治療薬としてのバックボーン環状ペプチドライブラリの開発

上のシステイン残基の溶媒アクセシビリティの分析

合成とオリゴペプチドの質量分析

自己組織化ペプチドのポリアミンによる両親媒性物質 (Ppa の) と関連生体材料の合成のための安易なプロトコル

情報を持つペプトイドの合成と、その配列指向動的共有自己集合

オンテザースルホニウム中心を用いた環状ペプチドの構築

官能ビス - ペプチドの固相合成方法を "安全キャッチ"を使用して

SPOTペプチド配列を用いてタンパク質リジンメチルトランスフェラーゼの特異性の解析

混合リジン型/アルギニン型モノマーおよびそれらの抗リーシュマニア活性の評価とペプトイドの合成のための効率的な方法

要約

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ペプチド第三級アミドライブラリのスプリット·アンド·プールの合成とキャラクタリゼーション

高秩序のナノシートにペプトイドポリマーおよびそれらの自己組織化の固相Submonomer合成

マイクロ波照射を用いて潜在的な抗寄生虫治療薬としてのバックボーン環状ペプチドライブラリの開発

上のシステイン残基の溶媒アクセシビリティの分析

合成とオリゴ ペプチドの質量分析

自己組織化ペプチドのポリアミンによる両親媒性物質 (Ppa の) と関連生体材料の合成のための安易なプロトコル

情報を持つペプトイドの合成と、その配列指向動的共有自己集合

オンテザースルホニウム中心を用いた環状ペプチドの構築

官能ビス - ペプチドの固相合成方法を "安全キャッチ"を使用して

SPOTペプチド配列を用いてタンパク質リジンメチルトランスフェラーゼの特異性の解析

合成とオリゴペプチドの質量分析