Wir danken der Engineering and Physical Sciences Research Council (EPSRC) für die finanzielle Unterstützung (HLB). Wir danken auch Sridevi Maalika Ramanoudjame für ihre Unterstützung während der Dreharbeiten zu diesem Verfahren.

1. Festphasensynthese von Peptoide HINWEIS: Peptoide werden manuell mit dem submonomeren Verfahren der Festphasen-Peptoid-Synthese synthetisiert. Dieses Verfahren ermöglicht eine hohe Kopplungseffizienz und gute Endprodukt Ausbeuten. Synthese an fester Phase ermöglicht auch überschüssigen Reaktanden am Ende jeder Stufe und das Verfahren modifiziert wurde hier leicht entfernt zu werden , um verschiedene funktionalisierte kationische Monomere (dh Arginin-Typ und Lysin-Typ - Reste) ermöglichen innerhalb desselben aufgenommen werden Sequenz. 1,2 <ol><li> Synthese eines linearen Peptoid Achtung: Führen Sie die Sicherheitsbeurteilungen vor der Synthese zu starten. Führen Sie alle Reaktionen in einem Abzug und tragen eine angemessene persönliche Schutzausrüstung geeignete (dh Einweg - Handschuhe, Schutzbrille und einen Laborkittel). Seien Sie besonders vorsichtig, wenn Sie die folgenden Reagenzien und Lösungsmittel. Dimethylformamid (DMF) ist ein Verdacht teratogen und dichloromethane (DCM) ist krebserregend. N, N &#39;-diisopropylcarbodiimide (DIC) und Piperidin sind gefährlich für die Augen, die Haut, über den Atem Einatmen und kann zu Hautsensibilisierung führen. Hydrazin ist ein Verdacht, karzinogen, tödlich beim Einatmen und verursacht schwere Verbrennungen der Haut oder Augen. Bromessigsäure ist auch gefährlich für die Haut, die Augen und die Atemwege und kann zu Verbrennungen bei Kontakt verursachen. Trifluoressigsäure (TFA) ist eine flüchtige Flüssigkeit und verursachen schwere Verbrennungen so mit Sorgfalt zu behandeln. Schwerlast-Handschuhe empfohlen. <ol><li> Hinzufügen, 0,12 g Fmoc-geschütztem Rink-Amid-Harz (0,1 mmol, typische Beladung 0,7 mmol / g) zu einem verkappten 20 ml Polypropylen-Reaktionsgefäß mit zwei Fritten. 5 ml Dimethylformamid (DMF), um das Harz zu quellen und das Gefäß verlassen für mindestens 60 Minuten bei Raumtemperatur stehen. Lassen Sie das DMF eine Festphasenextraktion Vakuum-Plattform. </li><li> Um die Fmoc-Gruppe auf die geschwollene Harz entschützen, 2 ml Piperidin-Lösung (20% in DMF v / v). Das Gefäß wird aufeine Schütteltablar bei Raumtemperatur (450 Umdrehungen pro Minute) und 5 min schütteln. Entfernen Sie die Lösung über Vakuumstation. <ol><li> Wiederholen Fmoc-Abspaltung mit 2 ml Piperidin-Lösung und schütteln für 15 Minuten bei Raumtemperatur. Lassen Sie nach wie vor die Lösung. </li></ol></li><li> Das Harz wird durch Zugabe von 2 ml DMF und Mischen des Harzes für 30 sec. Lassen Sie das DMF und wiederholen Sie drei weitere Male. </li><li> Für die Acetylierung 1 ml Bromessigsäure - Lösung (0,6 M in DMF) und 0,2 ml N, N &#39;-diisopropylcarbodiimide Lösung (DIC, 50% in DMF v / v). Verlassen Reaktionsgefäß für 20 Minuten bei Raumtemperatur schütteln. Die Lösung ablaufen und wäscht das Harz mit 2 ml DMF dreimal. </li><li> Für die Verschiebung, 1 ml Aminlösung (1,5 M in DMF). Schütteln, um das Harz für 60 min bei Raumtemperatur. Die Lösung ablaufen und wäscht das Harz mit 2 ml DMF dreimal. <ol><li> Um einen Arginin-Monomer hinzuzufügen, folgen Schritt 1.7. Je nach der gewünschten Peptoid-Sequenz, verschiedene Aminewird hinzugefügt werden. </li></ol></li><li> Wiederholen Sie die Schritte 1.1.4 und 1.1.5. </li><li> Um ein Guanidin funktionalisierten Monomer umfassen (dh, N Arg), 1 ml ungeschützter Diamin - Lösung (1,5 M in DMF) zu dem Harz und schütteln für 60 min bei Raumtemperatur. <ol><li> Die Lösung ablaufen und wäscht das Harz mit 2 ml DMF dreimal. </li><li> In 2-acetyldimedone (0,2 g, 1 mmol in 0,5 ml DMF, 10 Äquivalente) die Dde-Gruppe an das freie primäre Amin zu addieren und für 60 Minuten bei Raumtemperatur schütteln. Die Lösung ablaufen und wäscht das Harz mit 2 ml DMF dreimal. </li></ol></li><li> Weiterhin Submonomer-Synthese, wie in 1.1.4 bis 1.1.7, bis die gewünschte Sequenz hergestellt wird. 2 ml DMF, das Harz zu waschen und dreimal wiederholen. </li><li> Um die Dde-Gruppe auf Harz entschützen, 4 ml 2% Hydrazin-Lösung (in DMF v / v) und schütteln Sie für 3 Minuten bei Raumtemperatur. Lassen Sie die Lösung und dreimal wiederholen. </li><li> Die Lösung ablaufen und wäscht das Harz mit 2 ml DMF drei times. </li><li> Hinzufügen , Pyrazol-1-carboxamidin (6 Äquivalente pro freie Amin, das heißt pro N Arg Monomeren, in dem minimalen Volumen an DMF) und N, N - Diisopropylethylamin oder DIPEA (6 Äquivalente pro freies Amin) und schüttle bei Raumtemperatur für 60 min . </li><li> Die Lösung ablaufen und wäscht das Harz mit 2 ml Dichlormethan dreimal. Lassen Sie das Harz in Luft für 10 Minuten, um zu trocknen, dann kann das Harz bis Spaltung (Abschnitt 2) gespeichert werden. </li><li> Um die Synthese pausieren, waschen Sie das Harz mit 2 ml DMF dreimal. 2 ml DMF, Stopfen der Synthesebehälter und lassen bei Raumtemperatur in einem Abzug. HINWEIS: Die Synthese angehalten werden kann, nachdem eine Verschiebung Schritt (mit Ausnahme des zweiten Verschiebungsschritt als Diketopiperazinen gebildet werden). </li></ol></li><li> Sidechain - Entschützung und Abspaltung vom Harz <ol><li> Verpflichten einen Test spalten den Fortschritt der Synthese (Reinheit und Masse) an jedem beliebigen Punkt während der Synthese nach dem displa zu überprüfenZement Schritte, Addition oder Entfernung von Dde-Schutzgruppe oder nach der letzten Sequenz gemacht wurden. <ol><li> Übertragen etwa 10 Harzperlen aus dem Reaktionsgefäß in eine neue 8 ml Polypropylen-Fritte Patrone. </li><li> 1 ml Trifluoressigsäure Spaltung Cocktail (mit 95% TFA, 2,5% H 2 O, 2,5% Triisopropylsilan) und schütteln Sie für 90 Minuten bei Raumtemperatur. </li><li> Filtriere den TFA Spaltungscocktail aus dem Harz unter Verwendung des Frittenreaktionsgefäß in einen 10 ml-Rundkolben. </li><li> Man dampft die Spaltung Cocktail am Rotationsverdampfer abgeblasen, und der sich ergebende Öl in 1 ml Acetonitril / Wasser zur Vorlage bei LC-MS oder analytische HPLC. </li></ol></li><li> Für die endgültige Spaltung: in der gleichen Fritten Polypropylen - Reaktionspatrone für die Synthese verwendet, 4 ml TFA - Spaltung Cocktail (95% TFA, 2,5% H 2 O, 2,5% Triisopropylsilan) und das Gefäß bedecken. Schütteln für 90 min bei Raumtemperatur. </li><li> Filter the TFA Spaltungscocktail aus dem Harz, das das Frittenreaktionsgefäß in einen 50 ml Rundkolben werden. </li><li> Dampfe das Spaltungscocktail mit einem Rotationsverdampfer. Nachdem die TFA entfernt wurde, sollte das Produkt als Öl erhalten werden. Zur Unterstützung der TFA Entfernung aus diesem Rohöl, 2 ml wasserfreiem Diethylether und die Peptoid sollte auszufällen. <ol><li> Entweder die Diethylether über eine Pipette entfernen und zu entsorgen oder einem Rotationsverdampfer verdampft werden. Wiederholen Diethylether Fällung dreimal. </li></ol></li><li> Man löst das rohe Peptoid in 10 ml Acetonitril / Wasser-Lösung angesäuert (50% Acetonitril, 0,1% TFA in Wasser v / v). In Behälter vorgewogen, bei 20 ° C einfrieren und lyophilisieren zu einem trockenen Pulver. </li></ol></li></ol> 2. Charakterisierung und Aufreinigung HINWEIS: Die Peptoid-Synthese kann überwacht werden und die endgültige Peptoid über analytische Umkehrphasen-HPLC beurteilt unter Verwendung einer C18-Säule und electrospray Flüssig-Chromatographie-Massenspektrometrie (LC-MS). Alle HPLC-Lösungsmittel von Lösungsmitteln für die LC-MS sollte frisch zubereitet werden. <ol><li> analytische HPLC <ol><li> Wiegen 1 mg Peptoid in einem kleinen Glasfläschchen. Fügen Sie das Mindestvolumen von Acetonitril zu lösen und auf 1 ml mit Wasser verdünnen. Stellen Sie sicher, dass die Peptoid vollständig gelöst hat. </li><li> Einzuspritzen 10 ul einer analytischen HPLC (vorgeschlagen Gradient 0 bis 100% Lösungsmittel B über 30 min, wobei Lösungsmittel A = 95% Wasser, 5% Acetonitril, 0,05% TFA und Lösungsmittel B = 95% Acetonitril, 5% Wasser, 0,03% TFA) , gemäß den Anweisungen des Herstellers. </li><li> Visualisieren bei 220 nm UV-Spektrum. </li></ol></li><li> ESI LC-MS <ol><li> Auffüllen auf 1 mg / ml Peptoid-Lösung, wie in Schritt 2.1.1. </li><li> Injizieren 1 ul LC-MS Elektrosprühverfahren wenn das Molekulargewicht des Ziel Peptoid zu bestimmen, vorhanden ist, den Anweisungen des Herstellers verwendet wird. </li><li> Überprüfen Sie die Zielmasse der Peptoid-Sequenz eine Pept mitoid Rechner, gemäß den Anweisungen auf dem Rechner. 26 Dieses Web - Dienstprogramm ermöglicht auch die Zuordnung einer Streichung / Zusatzprodukte im Massenspektrum zu sehen. 26 </li></ol></li><li> Präparative Umkehrphasen - HPLC <ol><li> Auflösen rohe Peptoide in 2 ml angesäuertem Wasser / Acetonitril (95% Wasser, 5% MeCN, 0,1% TFA) und Reinigung durch präparative RP-HPLC unter Verwendung des Protokolls Herstellers. Bestimmen Sie die Steigung durch die Elutionszeit von analytischen HPLC und die erhaltene Menge injiziert wird von den Säulendimensionen ab. </li><li> Visualisieren Sie einen Detektor eingestellt bei 220 nm verwendet wird. </li><li> Sammle Fraktionen in 15 ml-Zentrifugenröhrchen bei 20 ° C und lyophilisiere einzufrieren. </li><li> Re-Analyse von Fraktionen mittels LC-MS und analytische HPLC nach dem Protokoll des Herstellers. Rekombinieren gereinigten Fraktionen. </li></ol></li></ol> 3. Biologische Testung gegen Leishmania mexicana Parasites Caution. Die Sicherheitsbewertungen vor Beginn der Synthese durchgeführt werden muss Leishmania mexicana ist eine Gefahr für die Gruppe 2 Erreger in Großbritannien und angemessene Kontrollmaßnahmen klassifiziert vor vorhanden sein müssen Tests beginnen. Alle Arbeiten müssen entsprechend getragen in einer Klasse 2 MSW und angemessene persönliche Schutzausrüstung durchgeführt werden (dh, Nitril Handschuhe, Schutzbrille und einen Laborkittel). <ol><li> Subculture von Parasiten <ol><li> Defrost 1 ml -150 ° C eingefroren Lager Leishmania mexicana M379 von Fläschchen in einem 37 ° C Wasserbad für 30 Sekunden platzieren. </li><li> Übertragung der Stammlösung zu 10 ml Schneider-Insektenmedium (bei pH 7,0 , supplementiert mit 15% hitzeinaktiviertem fötalem Rinderserum und 1% Penicillin / Streptomycin) in einem 25 cm 3 Zellkulturkolben , der mit einem nicht belüftete Kappe. </li><li> 72 h bei 26 ° C inkubieren. </li><li> Untersuchen Sie Parasiten unter dem Mikroskop (400-facher Vergrößerung) Zustand zu überprüfen. they sollte mit vielen teilender Zellen in der log-Phase Insektenstadium Promastigoten, prozyklischen Formen sein. </li><li> Pflegen procyclischen Promastigoten durch Subkultivierung Parasiten zu einer Konzentration von 5 x 10 5 Parasiten / ml alle drei Tage. Zählen von Zellen eine Neubauer verbesserten Zählkammer. </li></ol></li><li> Die Transformation von L. mexicana Insekten Stadium in Säuger Stadium axenic amastigote Form 27 <ol><li> Tag 0: Vorbereiten 10 ml Kultur von log Stadium - Parasiten bei 5 x 10 5 Parasiten / ml in Schneider-Insektenmedium (bei pH 7,0 , supplementiert mit 15% hitzeinaktiviertem fötalem Rinderserum und 1% Penicillin / Streptomycin) in einem 25 cm 3 Zell Kulturflasche mit einem nicht-Filtrierkappe. </li><li> für 48 Stunden bei 26 ° C inkubieren. </li><li> Tag 3: Transfer 10 ml Kultur in einen 50 ml-Zentrifugenröhrchen und Zentrifugieren bei 447 xg für 5 min. </li><li> Gießen alte Medium ab und gibt 10 ml Schneider-Insektenmedium (bei pH 5,5, ergänzt mit 20% hessen-inaktiviertem fötalem Rinderserum und 1% Penicillin / Streptomycin). Vorsichtig das Pellet von Parasiten in dem neuen Medium mit einer Pipette. </li><li> Zählen Sie die Anzahl der Parasiten eine Neubauer verbesserten Zählkammer. Verdünnt auf eine Konzentration von 5 x 10 5 Parasiten / ml mit pH 5,5 Medium und in einen 25 cm 3 Zellkulturflasche. </li><li> für etwa 6 Tage bei 26 ° C inkubieren. </li><li> Tag 9: Untersuchen Parasiten unter dem Mikroskop (400X). Sie sollten in der nicht-replizierenden, infektiöse metazyklisch promastigote Bühne. </li><li> Zählen Sie die Anzahl der Parasiten eine Neubauer verbesserten Zählkammer. Verdünnt auf eine Konzentration von 5 x 10 5 Parasiten / ml mit pH 5,5 Medium. </li><li> Entfernen 10 ml der Zellkultur und Transfer in Zellkulturflasche. 5 Tage bei 32 ° C inkubieren. </li><li> Tag 14: Überprüfen Auftreten von Parasiten unter dem Mikroskop (400X). Sie sollten in der pathogenen amastigote Stufe sein, die Geissel Charakter fehltistisch von Promastigoten und bereit für den Test. </li></ol></li><li> Zytotoxizitätstest auf L. mexicana axenic Amastigoten. HINWEIS: Die biologische Prüfung der Peptoide verwendet Hochdurchsatz-Assays in 96-Well-Platten durchgeführt. Dieses Protokoll beschreibt das Testen von L. mexicana axenic Amastigoten, aber identische Assays können auch auf die Promastigoten Stadium - Parasiten in geeigneten Medien durchgeführt werden. 60 min 100 uM und anschließend 24 Stunden nach einer 10-fachen Verdünnung inkubiert - Verbindungen werden mit Parasiten in Konzentrationen von 3 inkubiert. Die Ergebnisse werden durch Messen der Fluoreszenz der Vertiefungen nach der Inkubation mit Resazurin-basierte Zellebensfähigkeit Lösung (zB alamarBlue) gewonnen. <ol><li> Bereiten Verbindung Stammlösungen. Abwiegen 1 mg des endgültigen gereinigten Peptoid Produkt einer Analysenwaage verwenden. Fügen Sie den entsprechenden Volumen der Molekularbiologie Dimethylsulfoxid (DMSO) in einer Konzentration von 5 mM. Machen Sie 6 ul Aliquots undeinfrieren bei -20 ° C. </li><li> Herstellung der Verbindung Lösungen auf 96 - Well - Platten (eine empfohlene Plattenlayout in den Ergebnisteil zu sehen ist, Figur 6) in dreifacher Ausfertigung 100-3 uM. In 2 ul 5 mM Stammlösung jeder Verbindung in der oberen Reihe (dh A). In 48 ul frisch Schneiders Insektenmedium (bei pH 5,5 und 20% fötalem Rinderserum (FBS), 1% Penicillin / Streptomycin (P / S)) nach oben Reihe einen Mehrkanal-Pipette. In 25 ul Schneider-Insektenmedium für alle anderen Reihen (B - F). <ol><li> Führen Sie eine serielle Verdünnung durch Pipettieren von 25 ul Lösung aus der oberen Reihe. In der Zeile unterhalb und mischen. Führen Sie Verdünnungen bis zur letzten Zeile, wo die letzten 25 ul-Lösung verworfen werden sollte. </li><li> Verwenden Amphotericin B (5 mM Bestände) als positive Kontrolle und DMSO (2% ige Lösung) als negative Kontrolle in dreifacher Ausführung. </li></ol></li><li> Bereiten Parasiten Lösung: Kultur in ein 50 ml Zentrifugenröhrchen und zentrifugiere bei447 × g für 5 min. Gießen Sie alte Medium und 10 ml Schneider-Insektenmedium (bei pH 5,5 und 20% FBS, 1% P / S). </li><li> Vorsichtig lösen sich die Pellets von Parasiten in dem neuen Medium mit einer Pipette und rechnen mit einem Neubauer verbesserten Zählkammer. Verdünnte Kultur bis 8 x 10 &amp; sup6 ; Parasiten / ml. </li><li> In 25 ul L. mexicana Kultur in jede Kammer . Inkubieren Platten für 60 min bei 32 ° C. </li><li> Entfernen Platte aus dem Inkubator und entfernen Sie aus jeder Vertiefung 40 ul-Lösung. </li><li> In 90 ul frisches Medium und Inkubation für 24 Stunden bei 32 ° C. </li><li> In 10 ul Resazurin-basierte Lösung die Lebensfähigkeit der Zellen zu jeder Vertiefung. bei 32 ° C für 4 Stunden inkubiert. </li><li> Messen Sie die Fluoreszenz einen Plattenleser (λ ex = 540 nm, λ em = 600 nm), als den Anweisungen des Herstellers. Analysieren von Daten durch die durchschnittliche Entfernung Hintergrund (von Medium nur Wells) und Vergleichen der Fluoreszenz von Brunnen nach der Normalisierung in Bezug auf ter DMSO-Kontrollen. </li></ol></li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

<html> Peptoide werden zunehmend in der chemischen Biologie und der medizinischen Chemie Felder in Anwendungen wie neuartige Therapeutika untersucht 3-5, Zellabgabemittel 18,20 und Diagnose - Tools. 29 Typischerweise sind diese Sequenzen sind kationische eine gewisse Selektivität für den Krankheitserreger zu schaffen über Säugetierzellen, die Fähigkeit, durch Zellmembranen zu durchdringen und auch die Löslichkeit in wässrigen Systemen unterstützen. Es gibt zahlreiche Beispiele von kationischen Peptoide, die ausschließlich Lysin- oder Arginin-mimetische Reste in der Literatur enthalten. Jedoch bisher die Synthese von Peptoiden, die beide dieser kationischen Reste in der gleichen Sequenz enthalten wurde durch den Mangel eines geeigneten Syntheseverfahren behindert. Das hier beschriebene Protokoll ermöglicht gemischte kationische Peptoide in einer effizienten Weise zu synthetisierenden und ist sehr wünschenswert, da sie einen Weg bietet, die biologischen und chemischen Eigenschaften der amphipathischen Peptoide zu modulieren. nt &quot;&gt; Unser Verfahren verwendet eine Anpassung an die Submonomer Peptoid-Synthese allgemein verwendet und ermöglicht die Zugabe beider Lysin- und Arginin-Monomeren innerhalb der gleichen Sequenz. Es verwendet Kopplungen Raumtemperatur und etablierten Schutzgruppenchemie so ist es, dass dieses Verfahren zu erwarten ist eine Vielzahl von Diaminen kann, wird für die meisten Forschungsgruppen nützlich sein. Um orthogonale Schutz für die Arginin-Typ-Rest hinzufügen, wird ein ungeschützter Diamin unter Standardverdrängungsbedingungen gegeben und dann in einem 60-Minuten-Kupplung mit Dde-OH geschützt. sein verwendet , die jeweils Seitenketten von 2 Kohlenstoffatomen bis 6 Kohlenstoffe lang installiert werden, das heißt, 1,2-Diaminoethan zu 1,6-Diaminohexan werden können. Die Schutz Dde-OH löst sich gut in DMF und ist eine sehr effiziente und selektive Schutzgruppe für primäre Amine. die Dde-Schutzgruppe verlässt sekundären Aminen nicht betroffen, zum Beispiel die ungeschützten N - Terminus von Peptoid - Kette. 30 Eine Einschränkung besteht darin , dass die syn alleArbeit wurde manuell durchgeführt werden; jedoch wird erwartet, daß die Kopplungsbedingungen entwickelt das Verfahren zugänglich für die Verwendung mit automatisierten Peptid / Peptoid Synthesizern machen. Die auf Harz Entschützung der Dde-Gruppen wird mit einer 2% Hydrazin-Lösung in DMF durchgeführt, um freie Amine lassen, die auf Harz unter Verwendung von Pyrazol-1-carboxamidine guanidinylated werden kann. Sechs Äquivalente des Pyrazol-1-carboxamidine und sechs Äquivalenten DIPEA pro freie Amin auf dem Harz verwendet werden (dh sechs Äquivalente für jedes N Arg Monomer installiert werden). Wiederum ist diese Reaktion auch effizient und die Pyrazol-1-carboxamidin Reagenz eine gute Löslichkeit in DMF hat. Beendigung der Reaktion wird in der Regel über LC-MS nach 60 Minuten bei Raumtemperatur angesehen. Aufgrund der Vielseitigkeit der Submonomer-Verfahren kann eine Vielzahl von primären Aminen in der Verdrängungsstufe verwendet werden, so können die Bedingungen benötigen, zu erhöhen Kupplungs effi optimiert werdenzienz und die allgemeine Produktausbeuten oder Reinheit. 31 für die Sequenzen oben diskutiert wurde , waren keine besonderen Voraussetzungen für eine erfolgreiche Kupplungen. Allerdings könnten längere Verschiebung Zeiten oder höhere Aminkonzentrationen für problematische Verschiebungen verwendet werden (dh für schlecht nukleophilen oder sperriger Amine). Manche Amine können nicht vollständig löslich in DMF, in diesem Fall ist es empfehlenswert, diese in N - Methyl-2-pyrrolidon (NMP) oder einem anderen geeigneten Lösungsmittel für Festphasenreaktionen statt , wie in einem vorhergehenden umfassende Methode zur Synthese Submonomer aufzulösen von Peptoiden. 32 einzuarbeiten Monomere , die ungeschützte Heteroatome in den Seitenketten, Acetylierung unter Verwendung von Chloressigsäure enthalten , wurde von anderen Gruppen als wirksam erwiesen. 33 Zusätzlich können andere Harze , die mit diesem Verfahren verwendet werden können Peptoide mit unterschiedlichen C - terminalen Funktionalisierung zu ergeben. Wang-Harze und 2-Chlortritylchlorid-Harze werden in die routinemäßig verwendetsubmonomeren Synthese von Peptoide. Beispielsweise wurde dieses Verfahren erfolgreich mit 2-Chlortritylchlorid - Harz , in unsere Gruppe verwendet. 2 verschiedene feste Träger wird eine andere Ladevorgang erfordern Rinkamid hier diskutiert (abhängig von der spezifischen verwendeten Harzes) , so sollte dies mit der Literatur überprüft werden , vor der Synthese. Ähnlich wie die Peptidsynthese, die Bedingungen für die abschließende Abspaltung der Peptoid-off-Harz kann auch für die spezifische Sequenz optimiert werden. In diesem Protokoll wurde ein TFA Spaltungscocktail (mit Triisopropylsilan und Wasser als Fänger) verwendet. Die Peptoide hier vorgestellten enthielt nur Boc-Schutz, die eine einigermaßen säurelabile Gruppe ist. Um eine vollständige Entfernung der Schutzgruppen von Sequenzen mit einem größeren Anteil von Schutzresten oder weniger säurelabilen Schutzgruppen, längere Spaltungszeiten erforderlich sein können (dh Spaltungszeiten von mehr als 2 Stunden werden für Sequenzen empfohlen, Pbf oder tertiär-bu enthaltentyl Ester geschützten Gruppen). Alternative Fängern kann auch für spezielle Seitenketten verwendet werden (beispielsweise Ethandithiol oder 2-Mercaptoethanol häufig in Peptiden verwendet werden, die schwefelhaltige Seitenketten wie Cystein oder Methionin). Der biologische Test vorgestellt, ist ein Standard-Zytotoxizitätstest, die verändert werden können, verschiedene Zelllinien anpassen. Es ist wichtig zu beachten, dass jeder 96-Well-Platte ausreichende Kontrollen das Vertrauen in die erzielten Ergebnisse zu ermöglichen, enthalten sollte. In diesem Fall wird Amphotericin B als positive Kontrolle verwendet, da es ein bekanntes Medikament verwendet wird, um die Krankheit zu behandeln und DMSO wird als negative Kontrolle verwendet, da dies das Lösungsmittel, um Verbindung Bestände für den Assay verwendet wird. Wenn andere Zelllinien verwendet werden, alternative, sollten geeignete Kontrollen erhalten und vor Gebrauch validiert werden. L. mexicana ist mit dem Peptoid bei Konzentrationen zwischen 100 und 2 &amp; mgr; M für eine Stunde inkubiert und dann der Parasit / Peptoid - Lösung wird verdünnt , indemein Faktor von zehn für die Inkubation über Nacht (dh Brunnen zunächst mit 100 &amp; mgr; M Peptoid Lager sind auf 10 uM verdünnt). Die Lebensfähigkeit der Zellen Reagens wird am Ende des Tests in jede Vertiefung (10% der Gesamtvertiefungsvolumen) zugegeben. Eine sichtbare Farbänderung wird zwischen Brunnen mit lebensfähigen Parasiten (pink), Kontrollvertiefungen ohne tragfähige Parasiten (blau) und einem Spektrum zwischen mit Zwischen Zahlen von lebenden Parasiten gesehen. Die Fluoreszenz ist proportional zur Anzahl der lebenden Zellen und entspricht der Stoffwechselaktivität der Zellen; Resazurin Farbstoff (nicht fluoreszierenden) mit dem fluoreszierenden Resorufin durch Reduktionsreaktionen in metabolisch aktiven Zellen umgewandelt. 34 In diesem Test wird die Inkubationszeit mit der Lebensfähigkeit der Zellen Reagenz für L. optimiert mexicana. Inkubationszeiten mit der Lebensfähigkeit Reagenz für Platten ausgesät bei verschiedenen Zellkonzentrationen oder mit verschiedenen Zelllinien variieren (beispielsweise kann dieses Verfahren auch verwendet werden,mit Säugerzellen). Abhängig von der genauen Plattenleser verwendet wird, müssen Überlegungen angestellt werden, bevor Fluoreszenzmessungen getroffen werden. Eventuell vorhandene Luftblasen in den Vertiefungen sollten genaue Messwerte entfernt werden, um sicherzustellen, ergriffen werden können. Einige Plattenleser gelesen von der Unterseite der Platten, wobei in diesem Fall flach 96-Well-Platten Boden verwendet werden. Andere Maschinen können von der Oberseite der Platte zu lesen, so dass der Deckel der Platte sollte vor der Messung entfernt werden. Schließlich wird in der Zukunft, so kann dieses Protokoll mit automatisierten Synthesizern kompatibel sein, die zur Herstellung vieler Sequenzen in der Lage sind, parallel. Zusätzlich ist die Synthese von cyclischen Peptoide diese Methode auch möglich verwenden. Dieses Protokoll sollte Forscher mit einer praktischen Syntheseverfahren bereitzustellen, das verwendet werden kann, mit neuen Peptoid Gerüste zuzugreifen sowohl Lysin- und Arginin-Monomeren, die in vielen Anwendungen nützlich sein können, einschließlich Materialien oder medizinischen Bereichen.

Peptoide (oder Poly- N - substituierten Glycine) sind eine Klasse von Peptid-Mimetika , die ähnliche Eigenschaften wie Peptide und als solche bieten zunehmend für Anwendungen , medizinische und Materialien untersucht. In Peptiden ist die Seitenkette jeder Aminosäure an den α-Kohlenstoff des Amid-Rückgrat verbunden ist; in Peptoide sind die Seitenketten an das Stickstoffatom des Gerüsts verschoben. Entscheidend ist, gibt dieser Peptoide größere Resistenz gegenüber Proteolyse. Peptoide werden unter Verwendung der Submonomer - Methode von Zuckerman Pionier allgemein synthetisiert et al., Wo Peptoid Monomere können an einen festen Träger und die anschließende Verdrängung des Halogens befestigt durch sequentielle haloacetylation einer Amin - Funktionalität aufgebaut werden , um ein primäres Amin verwendet wird . 1 Unsere Gruppe hat kürzlich entwickelte eine Anpassung an dieses Verfahren Submonomer Lysin- und Arginin-Typ-Peptoid-Reste innerhalb der gleichen Peptoid-Sequenz für die f enthalten sein sollen, damitrste Zeit. 2 Dieses Handbuch Festphasen - Ansatz Synthese zu Peptoid verwendet im Handel erhältlichen Reagenzien und gemeinsame Laborausrüstung, zugänglich für die meisten Labors zu machen. Peptoide wurden Peptide gezeigt , vielversprechende Aktivität gegen ein breites Spektrum von Gram - negativen Bakterien, Gram - positive Bakterien und Pilzarten haben, die viele bekannte antimikrobielle vergleichbar sind. 3-9 In unserer Arbeit wurden als neue Antiinfektiva-Verbindungen zur Behandlung der vernachlässigten Tropenkrankheit Leishmaniose. 5,10 Leishmaniose ist endemisch in mehr als 80 Ländern weltweit und es wird geschätzt , dass mehr als 12 Millionen Menschen infiziert sind global. 11 Die Peptoide verwendet Krankheit wird durch einzellige Parasiten verursacht , die durch den Biss eines sandfly übertragen werden. Leishmanienspezies kutanen Leishmaniose verursachen kann, eine Bedingung , die zu Narben und Schäden an den Schleimhäuten führt, oder die lebensbedrohlichen viszeralen leishmaniasis, die tödlich Organschäden verursacht. Kein Impfstoff ist derzeit für diese Krankheit und bestehende Therapien stützen sich auf eine kleine Anzahl von Medikamenten, die starke Nebenwirkungen haben. Darüber hinaus Resistenz gegen bestehende Medikamente ist ein aufstrebendes und ernstes Problem so neue Therapien dringend benötigt werden , um effektiv Leishmaniose in Zukunft zu behandeln. 12-16 In dieser antimikrobiellen Anwendungen werden Peptoide oft mit einem Gemisch aus kationischen und hydrophoben Monomeren sein amphipathischen gestaltet. Diese 3,4 Peptoide einen Grad an Selektivität gegenüber Bakterienzellen geben kann, reduzieren die Toxizität für Säugerzellen, und ihre Aktivität als Molekular Transporter zu verbessern . 17-20 enthalten die Mehrheit der anti-infektiöse Peptoide in der Literatur kationischen Seitenketten , die entweder von aminofunktionalisierten Lysin-Monomeren oder Arginin-Typ - Reste ausschließlich bestehen. Peptid-Peptoid-Chimären, in denen die kationische Ketten des a bestehenmino Säuren Lysin oder Arginin, haben auch die Wirkung der kationischen Gruppen auf Aktivität und Toxizität zu untersuchen , synthetisiert. 21-25 Poly-Lysin Peptoide leicht synthetisiert werden können, im Handel erhältliche Boc-geschützten Aminen. Die Poly-Arginin Peptoide berichtet können mit einem Verfahren hergestellt werden , die Pyrazol-1-carboxamidin als Guanidinylierung Mittel verwendet. 18. Dies ist jedoch nur durchgeführt werden kann , nachdem der Peptoid wurde von dem Harz und Boc - Schutz an Seitenketten entfernt, so gespalten jedes Lysin-Typ-Rest innerhalb der Sequenz wird in einen Argininrest umgewandelt. In dem Bemühen um eine Feinabstimmung der chemischen und biologischen Eigenschaften der Verbindungen, entwickelten wir ein Verfahren , das doppelten kationischer Funktionalität (beispielsweise N Lys und Arg N) in einem gegebenen Peptoid Sequenz ermöglicht zum ersten Mal aufgenommen werden. 2 Hier beschreiben wir die Synthese, Reinigung und Charakterisierung von two neuartige Peptoide, die beide Lysin- und Arginin-Reste-Typ in der gleichen Reihenfolge enthalten. Das Verfahren verwendet orthogonal N - Boc und N -Dde Schutz auf Harz mit Pyrazol-1-carboxamidine als Guanidinylierungsreagenz. Die biologische Bewertung dieser Peptoide wird auch in Zytotoxizitätstests gegen Leishmania mexicana, dem Erreger der kutanen Leishmaniose beschrieben. Dies stellt eine praktische Methode, um Peptoide mit Dual kationischer Funktionalität zuzugreifen und ihre biologische Aktivität zu beurteilen. Es wird erwartet, dass diese Methode die Synthese von amphipathischen Peptoide durch die Peptoid Gemeinschaft in Zukunft helfen werden.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="2269">
	<tbody>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Polypropylene solid phase extraction cartridges with two frits</td>
			<td style="width:144px;">Crawford Scientific</td>
			<td style="width:119px;">12131017 and 12131015</td>
			<td style="width:1791px;">20 mL and 6 mL cartridges used in this preparation</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Trifluoroacetic acid</td>
			<td style="width:144px;">Tokyo Chemical Industry (Europe)</td>
			<td style="width:119px;">T0431-100g</td>
			<td>&#62;98%; CAUTION can cause severe burns and respiratory irritation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">N-N&#39;-diisopropylcarbodiimide</td>
			<td style="width:144px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>38370-100ML</td>
			<td>&#62;98%; CAUTION hazardous to eyes, skin and via respiratory inhalation, may also cause sensitisation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Dimethylformamide</td>
			<td style="width:144px;">Fischer Scientific</td>
			<td align="right" style="width:119px;">10346180</td>
			<td>HPLC grade; CAUTION suspected teratogen</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Acetonitrile</td>
			<td style="width:144px;">Fischer Scientific</td>
			<td align="right" style="width:119px;">10407440</td>
			<td>HPLC grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Dichloromethane</td>
			<td style="width:144px;">Fischer Scientific</td>
			<td align="right" style="width:119px;">10354263</td>
			<td>99.8%; CAUTION suspected carcinogen</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Bromacetic acid</td>
			<td style="width:144px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>17000-100G</td>
			<td>&#62;99%; ; CAUTION causes burns and hazardous to skin, eyes and respiratory tract</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">(S)-(-)-alpha methylbenzylamine</td>
			<td style="width:144px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>115568-100G</td>
			<td>98%; CAUTION harmful if swallowed, toxic in contact with skin, causes severe skin burns and eye damage, used to synthesise the Nspe monomer</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">N-Boc 1,4 diaminobutane</td>
			<td style="width:144px;">Tokyo Chemical Industry (Europe)</td>
			<td style="width:119px;">A1373-25g</td>
			<td>&#62;98%; CAUTION causes severe skin burns and eye damage, used to synthesise the NLys monomer</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">N-Boc 1,2 diaminoethane</td>
			<td style="width:144px;">Tokyo Chemical Industry (Europe)</td>
			<td>A1371-25g</td>
			<td>&#62;97%; CAUTION causes severe skin burns and eye damage, used to synthesise the Nae monomer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">1,2 diaminobutane</td>
			<td style="width:144px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>D13208-100G</td>
			<td>99%; CAUTION flammable liquid and vapour, harmful if swallowed or inhaled, toxic in contact with skin, causes severe skin burns and eye damage, used in the synthesis of the NhArg monomer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">1,4 diaminoethane</td>
			<td style="width:144px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>03550-250ML</td>
			<td>&#62;99.5%; CAUTION flammable liquid and vapour, harmful if swallowed or inhaled, toxic in contact with skin, causes severe skin burns and eye damage, used in the synthesis of the NnArg monomer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1H-pyrazole-1-carboxamidine HCl</td>
			<td style="width:144px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>402516-10G</td>
			<td>as HCl salt; CAUTION harmful if swallowed and may cause an allergic skin reaction, causes serious eye damage</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Hydrazine monohydrate</td>
			<td style="width:144px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>207942-5G</td>
			<td>reagent grade; CAUTION suspected carcinogen, fatal if inhaled and causes severe burns to skin and eyes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">2-acetyl dimedone</td>
			<td style="width:144px;">Novabiochem</td>
			<td align="right">8510150005</td>
			<td>Dde-OH</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Rink Amide resin</td>
			<td style="width:144px;">Novabiochem</td>
			<td align="right">8551190005</td>
			<td>100-200 mesh, high loading&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Piperidine</td>
			<td style="width:144px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>411027-1L</td>
			<td>&#62;99.5%, a controlled substance, so adequate permission must be obtained before purchase; CAUTION highly flammable liquid and vapour, harmful if swallowed and toxic in contact with skin or if inhaled, causes severe skin burns and eye damage, harmful to aquatic life with long lasting effects</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Triisopropylsilane</td>
			<td style="width:144px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>233781-50G</td>
			<td>98%; CAUTION flammable liquid and vapour, causes skin irritation and serious eye irritation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">alamarBlue</td>
			<td style="width:144px;">ThermoFischer&#160;</td>
			<td style="width:119px;">DAL1025</td>
			<td>Not classified as hazardous</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Schneider&#39;s Insect Medium</td>
			<td style="width:144px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>S9895-1L</td>
			<td>Powdered, medium must be made prior to use following manafacturers instructions; allow to warm to room temperature before use in biological assays</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">96 well plates</td>
			<td style="width:144px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">734-1793</td>
			<td>Flat bottom (to allow fluorescence measurement from the bottom), tissue-culture treated</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Solvent reservoirs</td>
			<td style="width:144px;">VWR</td>
			<td>613-1182</td>
			<td>Used with multi channel pipette</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Multi channel pipette</td>
			<td style="width:144px;">Eppendorf</td>
			<td align="right" style="width:119px;">3122000043</td>
			<td style="width:1791px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Pipette tips</td>
			<td style="width:144px;">Starlab Group</td>
			<td>S1111-3810, S1113-1810, S1111-6810</td>
			<td>Volume of tip dependent on pipette used. 10 &#181;L, 10 - 200 &#181;L and 1000 &#181;L recommended for assays</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">25 cm3 cell culture flasks</td>
			<td style="width:144px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">734-2312</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">50 mL centrifuge tubes</td>
			<td style="width:144px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">525-0791</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:216px;">dimethylsulphoxide (molecular biology grade)</td>
			<td style="width:144px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>D8418-50ML</td>
			<td>Not classified as hazardous</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Heat Inactivated Fetal Bovine Serum</td>
			<td style="width:144px;">ThermoFischer&#160;</td>
			<td style="width:119px;">10082139-100mL</td>
			<td>Gibco</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Penicillin/Streptomycin</td>
			<td style="width:144px;">ThermoFischer&#160;</td>
			<td style="width:119px;">15140148-20mL</td>
			<td style="width:1791px;">Abbreviation: P/S</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Amphotericin B</td>
			<td style="width:144px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>46006-100mg</td>
			<td>Amphotericin B trihydrate, VetranalTM analytical standard</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an efficient method for the synthesis of peptoids with mixed lysine-type/arginine-type monomers and evaluation of their anti-leishmanial activity

This protocol describes the manual solid-phase synthesis of linear peptoids that contain two differently functionalized cationic monomers. In this procedure amino functionalized 'lysine' and guanido functionalized 'arginine' peptoid monomers can be included within the same peptoid sequence. This procedure uses on-resin (N-(1-(4,4-dimethyl-2,6-dioxocyclohexylidene)ethyl) or Dde protection, orthogonal conditions to the Boc protection of lysine monomers. Subsequent deprotection allows an efficient on-resin guanidinylation reaction to form the arginine residues. The procedure is compatible with the commonly used submonomer method of peptoid synthesis, allowing simple peptoids to be made using common laboratory equipment and commercially available reagents. The representative synthesis, purification and characterization of two mixed peptoids is described. The evaluation of these compounds as potential anti-infectives in screening assays against Leishmania mexicana is also described. The protozoan parasite L. mexicana is a causative agent of cutaneous leishmaniasis, a neglected tropical disease that affects up to 12 million people worldwide.

Als ein repräsentatives Ergebnis der Synthese und Charakterisierung von zwei 12-Rest Peptoide, enthaltend zwei Lysin-Monomeren und zwei-arginine Monomeren jeweils beschrieben. Die nachfolgenden Ergebnisse Zytotoxizitätstest werden auch gezeigt. Zwei Peptoide [(N Narg N spe N spe) (N ae N spe N spe)] 2 (a) und [(N hArg N spe N spe) (N Lys N spe N spe)] 2 (b) wurden synthetisiert unter Verwendung von 120 mg Rinkamid each (Beladung = 0,79 mmol / g Harz). Alle Acetylierung und Verdrängungsschritte wurden durchgeführt, wie oben beschrieben, mit allen kommerziell erworben Reagenzien. - (-) - N spe (S) α-Methylbenzylamin, N ae N - (tert - Butoxycarbonyl) -1,2-Durchm: Für diese Rückstände wurden die folgenden Amine in dem Verschiebungsschritt verwendetinoethane, N Lys N - (tert - Butoxycarbonyl) -1,4-diaminobutan. Für die Argininderivat - Reste wurden folgende ungeschützte Diaminen gekoppelt: N hArg 1,4-Diaminobutan oder N Narg 1,2-Diaminoethan, gefolgt von on-Harz Schutz mit 2-acetyldimedone (Dde-OH). Nachdem die gesamte Sequenz synthetisiert worden war, ergibt Hydrazin Abspaltung der Dde freie Amine zu guanidinylate. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/54750/54750fig1.jpg" /> Abbildung 1. Peptoid - Strukturen (a) [(N Narg N spe N spe) (N ae N spe N spe)] 2 und (b) [(N hArg N spe N spe) (N <stro<html> ng&gt; Lys N spe N spe)] 2. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54750/54750fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54750/54750fig1large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/54750/54750fig2.jpg" /> Abbildung 2. Das Verfahren für die gemischte Arginin / Lysin Peptoide synthetisieren. I. Standard-Verdrängungsschritt im submonomeren Verfahren mit Diamin; ii. Die Zugabe von Dde-OH, 90 Minuten schützen freie Amin; iii. Weitere Ergänzungen der Peptoid-Kette unter Verwendung des Submonomer-Verfahren zu verlängern; iv. Entschützung von Dde 2% Hydrazin in DMF verwendet wird; V. Guanidinylierung des freien Amins auf Harz mit Pyrazol-1-carboxamidine und DIPEA in DMF; vi. Saure Spaltung vom Harz und die Entfernung der Schutzgruppe von Boc-Gruppen.large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen. Nach der Spaltung vom Harz und Lyophilisierung wurden die Rohprodukte als weißes Pulver erhalten: (a) 154 mg, (b) 163 mg. Produkte wurden mittels RP-HPLC gereinigt, wie es mit höchstens 50 mg Injektionen unter Verwendung einer LC-Pumpe mit einem UV-VIS-Detektor (λ = 250 nm) auf einer analytischen Säule beschrieben, 250 mm x 10 mm, 5 &amp; mgr; m; Fließgeschwindigkeit = 2 ml / min. Fraktionen, die die Zielmasse entsprechen, wurden kombiniert und als weiße Pulver erhalten: (a) 54 mg (b) 65 mg, endgültige Ausbeuten von ca. 30% für Anteile&gt; 90% rein. Die endgültige Verbindung Identitäten nach der Reinigung wurden mittels LC-MS (siehe Abbildung 3) bestätigte ein Triple - Quadrupol - Massenspektrometer mit einem UPLC ausgestattet ist und einem Photodiodenarray - Detektor. Die genaue Massenspektrometrie wurde unter Verwendung des gleichen Spektrometer auf T unternommen<html> er [M + 2H] 2+ -Ionen. Die folgenden berechneten und beobachteten Massen wurden in enger Übereinstimmung (Abbildung 4): (a) berechnet = 896,0026 amu beobachtet = 896,0038 amu; (B) berechnet = 952,0691 amu beobachtet = 952,0730 amu. <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/54750/54750fig3.jpg" /> Abbildung 3. LC-MS für gereinigtes Peptoide. (A) m / z = 1.792 und (b) m / z = 1.903. Wo die obere TIC ist, mittlere LC-MS - Spektrum, unten UV - Chromatogramm bei 220 nm. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54750/54750fig3large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54750/54750fig3large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/54750/54750fig4.jpg" /> Figur 4. Genaue Massenspektrometrische Daten für Peptoide (a) und (b).&quot;Https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54750/54750fig4large.jpg&quot; target = &quot;_ blank&quot;&gt; Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen. Produktreinheit wurde (mit einem UV-VIS-Detektor auf einer analytischen Säule LC Pumpe, 4,6 mm x 100 mm, 3,5 &amp; mgr; m; Fließgeschwindigkeit = 1 ml / min) unter Verwendung einer analytischen RP-HPLC untersucht, und bei 220 nm sichtbar gemacht, die Extinktion von Amid - Rückgrat. 5a und 5b zeigt , daß die Verbindungen homogen sind. <img alt="Abbildung 5" src="/files/ftp_upload/54750/54750fig5.jpg" /> Figur 5. Analytische HPLC für die gereinigten Peptoide (a) und (b). Es gibt einen Gradienten von 0-100% B über 30 min, Säulenofen bei 40 ° C (A = 95% H 2 O, 5% MeCN, 0,05 % TFA;. B = 95% MeCN, 5% H 2 O, 0,03% TFA) <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54750/54750fig5large.jpg" target="_blank">cl Bitte</a>ick hier eine größere Version dieser Figur zu sehen. Die gereinigten Peptoide (a) und (b) wurden in Zytotoxizitätsassays gegen L. getestet mexicana axenic Amastigoten. Gefrorene Bestände von L. mexicana wurden aufgetaut und in die amastigote Bühne bereit für den Test umgewandelt. 72 Stunden nach dem Auftauen sollte die Parasiten Insekt Stufe Promastigoten in ihrer prozyklischen Form sein, in der log-Phase mit vielen teilender Zellen. In diesem Stadium können die Parasiten in den amastigote Stufe unter Verwendung des pH und Temperaturverschiebung beschrieben. 27 am Tag 9 der Transformation transformiert werden, werden die Parasiten in den nicht-replizierenden infektiösen metazyklisch promastigote Stufe. Schließlich am 14. Tag sollten die Parasiten in der pathogenen amastigote Stadium, wo Parasiten die charakteristische Geißeln der Promastigoten fehlen. 28 5 mM Stammlösungen der Verbindungen wurden in Zellkultur DMSO und getestet in dreifacher Ausführung hergestellt aufmindestens zwei Gelegenheiten eine robuste Datensatz, um sicherzustellen, wurde gesammelt. Ein repräsentativer 96-Well - Platte Plan ist in Figur 6 gezeigt ist . Am Ende des Tests wurde die Lebensfähigkeit der Zellen Reagenzes zu jeder Vertiefung und die Fluoreszenz hinzugefügt wurde gemessen , wie beschrieben , getestet , um die Lebensfähigkeit der Parasiten bei jeder Konzentration zu berechnen (siehe Abbildung 7 ). ED 50 -Werte wurden als Peptoid (a)&gt; 100 uM und Peptoid (b) 37 uM jeweils berechnet. Die Fehlerbalken aufgetragen, um die Unterschiede zwischen den Vertiefungen als Standardabweichung zeigen und es ist zu erkennen, dass diese angemessen sind für die meisten Bars. <img alt="Figur 6" src="/files/ftp_upload/54750/54750fig6.jpg" /> Abbildung 6. Repräsentative 96 - Well - Platte Plan für einen Zytotoxizitätstest auf 2 Peptoid - Lösungen (einschließlich positiver und negativer Kontrollen). Med + = mittel (Schneiders Insektenmedium, pH 5,5, 20% FBS, 1% P / S). L. mex. =8 x 10 6 / ml Parasit Kultur in med +. AmphoB = 5 mM in DMSO. Peptoid = 5 mM Stammlösung in DMSO. Leere Brunnen sollte steriles Wasser enthalten. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54750/54750fig6large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54750/54750fig6large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="7" src="/files/ftp_upload/54750/54750fig7.jpg" /> Abbildung 7. Die Ergebnisse aus Zytotoxizitätstest gegen L. mexicana axenic amastigote Parasiten unter Verwendung von Peptoid (a) und (b). Es ist ersichtlich, dass der Peptoid (b) ist wirksamer als Peptoid (a) auf den Prozentsatz der lebensfähigen Parasiten reduzieren, wobei beide Verbindungen eine dosisabhängige Wirkung. Die Fehlerbalken zeigen die Veränderung zwischen den Wells als Standardabweichung aufgetragen. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54750/54750fig7large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54750/54750fig7large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

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An Efficient Method for the Synthesis of Peptoids with Mixed Lysine-type/Arginine-type Monomers and Evaluation of Their Anti-leishmanial Activity

A protocol to synthesize peptoids with mixed cationic functionality in the same sequence is presented (lysine- and arginine-type monomers). Subsequent testing of these compounds against Leishmania mexicana, the protozoan parasites that cause cutaneous leishmaniasis, is also described.

Eine effiziente Methode zur Synthese von Peptoide mit gemischten Lysine-Typ / Arginin-Monomeren und die Bewertung der Anti-Leishmania-Aktivität

This protocol describes the manual solid-phase synthesis of linear peptoids that contain two differently functionalized cationic monomers. In this ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biochemistry

12.0K Aufrufe.  Durham University. A protocol to synthesize peptoids with mixed cationic functionality in the same sequence is presented (lysine- and arginine-type monomers). Subsequent testing of these compounds against Leishmania mexicana, the protozoan parasites that cause cutaneous leishmaniasis, is also described.

Serie: An Efficient Method for the Synthesis of Peptoids with Mixed Lysine-type/Arginine-type Monomers and Evaluation of Their Anti-leishmanial Activity

Preparation and In Vivo Use of an Activity-based Probe for N-acylethanolamine Acid Amidase

Activity-based protein profiling (ABPP) is a method for the identification of an enzyme of interest in a complex proteome through the use of a chemical probe that targets the enzyme&#39;s active sites. A reporter tag introduced into the probe allows for the detection of the labeled enzyme by in-gel fluorescence scanning, protein blot, fluorescence microscopy, or liquid chromatography-mass spectrometry. Here, we describe the preparation and use of the compound ARN14686, a click chemistry activity-based probe (CC-ABP) that selectively recognizes the enzyme N-acylethanolamine acid amidase (NAAA). NAAA is a cysteine hydrolase that promotes inflammation by deactivating endogenous peroxisome proliferator-activated receptor (PPAR)-alpha agonists such as palmitoylethanolamide (PEA) and oleoylethanolamide (OEA). NAAA is synthesized as an inactive full-length proenzyme, which is activated by autoproteolysis in the acidic pH of the lysosome. Localization studies have shown that NAAA is predominantly expressed in macrophages and other monocyte-derived cells, as well as in B-lymphocytes. We provide examples of how ARN14686 can be used to detect and quantify active NAAA ex vivo in rodent tissues by protein blot and fluorescence microscopy.

Preparation and In Vivo Use of an Activity-based Probe for N-acylethanolamine Acid Amidase

Here, we describe the preparation and use of an activity-based probe (ARN14686, undec-10-ynyl-N-[(3S)-2-oxoazetidin-3-yl]carbamate) that allows for the detection and quantification of the active form of the proinflammatory enzyme N-acylethanolamine acid amidase (NAAA), both in vitro and ex vivo.

Vorbereitung und<em&gt; In Vivo</em&gt; Die Verwendung eines aktivitätsbasierte Sonde für<em&gt; N</em&gt; -acylethanolamine Säure Amidase

Activity-based protein profiling (ABPP) is a method for the identification of an enzyme of interest in a complex proteome through the use of a chemical ...

Forschung

Biochemie

A Facile and Efficient Approach for the Production of Reversible Disulfide Cross-linked Micelles

Nanomedicine is an emerging form of therapy that harnesses the unique properties of particles that are nanometers in scale for biomedical application. Improving drug delivery to maximize therapeutic outcomes and to reduce drug-associated side effects are some of the cornerstones of present-day nanomedicine. Nanoparticles in particular have found a wide application in cancer treatment. Nanoparticles that offer a high degree of flexibility in design, application, and production based on the tumor microenvironment are projected to be more effective with rapid translation into clinical practice. The polymeric micellar nano-carrier is a popular choice for drug delivery applications.
In this article, we describe a simple and effective protocol for synthesizing drug-loaded, disulfide cross-linked micelles based on the self-assembly of a well-defined amphiphilic linear-dendritic copolymer (telodendrimer, TD). TD is composed of polyethylene glycol (PEG) as the hydrophilic segment and a thiolated cholic acid cluster as the core-forming hydrophobic moiety attached stepwise to an amine-terminated PEG using solution-based peptide chemistry. Chemotherapy drugs, such as paclitaxel (PTX), can be loaded using a standard solvent evaporation method. The O2-mediated oxidation was previously utilized to form intra-micellar disulfide cross-links from free thiol groups on the TDs. However, the reaction was slow and not feasible for large-scale production. Recently, an H2O2-mediated oxidation method was explored as a more feasible and efficient approach, and it was 96 times faster than the previously reported method. Using this approach, 50 g of PTX-loaded, disulfide cross-linked nanoparticles have been successfully produced with narrow particle size distribution and high drug loading efficiency. The stability of the resulting micelle solution is analyzed using disrupting conditions such as co-incubation with a detergent, sodium dodecyl sulfate, with or without a reducing agent. The drug-loaded, disulfide cross-linked micelles demonstrated less hemolytic activity when compared to their non-cross-linked counterparts.

To deliver cancer drugs to tumor sites with high specificity and reduced side effects, new methods based on nanoparticles are required. Here, we describe disulfide cross-linked micelles that can be easily prepared by hydrogen peroxide-mediated oxidation and are able to dissociate efficiently under a reducing tumor environment to release payloads.

Eine leichte und effiziente Ansatz für die Produktion von Reversible Disulfid Vernetzte Mizellen

Nanomedicine is an emerging form of therapy that harnesses the unique properties of particles that are nanometers in scale for biomedical application. ...

An Efficient Method for the Isolation of Highly Purified RNA from Seeds for Use in Quantitative Transcriptome Analysis

Plant seeds accumulate large amounts of storage reserves comprising biodegradable organic matter. Humans rely on seed storage reserves for food and as industrial materials. Gene expression profiles are powerful tools for investigating metabolic regulation in plant cells. Therefore, detailed, accurate gene expression profiles during seed development are required for crop breeding. Acquiring highly purified RNA is essential for producing these profiles. Efficient methods are needed to isolate highly purified RNA from seeds. Here, we describe a method for isolating RNA from seeds containing large amounts of oils, proteins, and polyphenols, which have inhibitory effects on high-purity RNA isolation. Our method enables highly purified RNA to be obtained from seeds without the use of phenol, chloroform, or additional processes for RNA purification. This method is applicable to Arabidopsis, rapeseed, and soybean seeds. Our method will be useful for monitoring the expression patterns of low level transcripts in developing and mature seeds.

We have succeeded in establishing a method for RNA isolation from plant seeds containing large amounts of oils, proteins, and polyphenols, which have inhibitory effects on high-purity RNA isolation. Our method is suitable for monitoring the expression of genes with low level transcripts in seeds.

Eine effiziente Methode zur Isolierung von Highly Purified RNA aus Samen für die Verwendung in Quantitative Transkriptomanalyse

Plant seeds accumulate large amounts of storage reserves comprising biodegradable organic matter. Humans rely on seed storage reserves for food and as ...

Synthesis of 1,2-Azaborines and the Preparation of Their Protein Complexes with T4 Lysozyme Mutants

We describe a general synthesis of 1,2-azaborines using standard air-free techniques and protein complex preparation with T4 lysozyme mutants by vapor diffusion. Oxygen- and moisture-sensitive compounds are prepared and isolated under an inert atmosphere (N2) using either a vacuum gas manifold or a glove box. As an example of azaborine synthesis, we demonstrate the synthesis and purification of the volatile N-H-B-ethyl-1,2-azaborine by a five-step sequence involving distillation and column chromatography for the isolation of products. T4 lysozyme mutants L99A and L99A/M102Q are expressed with Escherichia coli RR1 strain. Standard protocols for chemical cell lysis followed by purification using carboxymethyl ion exchange column affords protein of sufficiently high purity for crystallization. Protein crystallization is performed in various concentrations of precipitant at different pH ranges using the hanging drop vapor diffusion method. Complex preparation with the small molecules is carried out by vapor diffusion method under an inert atmosphere. X-ray diffraction analysis of the crystal complex provides unambiguous structural evidence of binding interactions between the protein binding site and 1,2-azaborines.

A protocol for the synthesis of 1,2-azaborines and the preparation of their protein complexes with T4 lysozyme mutants is presented.

Synthese von 1,2-Azaborines und die Vorbereitung ihrer Proteinkomplexe mit T4-Lysozym Mutants

We describe a general synthesis of 1,2-azaborines using standard air-free techniques and protein complex preparation with T4 lysozyme mutants by vapor ...

Rab10 Phosphorylation Detection by LRRK2 Activity Using SDS-PAGE with a Phosphate-binding Tag

Mutations in leucine-rich repeat kinase 2 (LRRK2) have been shown to be linked with familial Parkinson&#39;s disease (FPD). Since abnormal activation of the kinase activity of LRRK2 has been implicated in the pathogenesis of PD, it is essential to establish a method to evaluate the physiological levels of the kinase activity of LRRK2. Recent studies revealed that LRRK2 phosphorylates members of the Rab GTPase family, including Rab10, under physiological conditions. Although the phosphorylation of endogenous Rab10 by LRRK2 in cultured cells could be detected by mass spectrometry, it has been difficult to detect it by immunoblotting due to the poor sensitivity of currently available phosphorylation-specific antibodies for Rab10. Here, we describe a simple method of detecting the endogenous levels of Rab10 phosphorylation by LRRK2 based on immunoblotting utilizing sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) combined with a phosphate-binding tag (P-tag), which is N-(5-(2-aminoethylcarbamoyl)pyridin-2-ylmetyl)-N,N&#39;,N&#39;-tris(pyridin-2-yl-methyl)-1,3-diaminopropan-2-ol. The present protocol not only provides an example of the methodology utilizing the P-tag but also enables the assessment of how mutations as well as inhibitor treatment/administration or any other factors alter the downstream signaling of LRRK2 in cells and tissues.

The present study describes a simple method of detecting endogenous levels of Rab10 phosphorylation by leucine-rich repeat kinase 2.

Rab10 Phosphorylierung Erkennung von LRRK2 Aktivität mit SDS-PAGE mit einem Phosphat-Bindung

Mutations in leucine-rich repeat kinase 2 (LRRK2) have been shown to be linked with familial Parkinson&#39;s disease (FPD). Since abnormal activation of ...

Highly Sensitive and Quantitative Detection of Proteins and Their Isoforms by Capillary Isoelectric Focusing Method

Immunoblotting has become a routine technique in many laboratories for protein characterization from biological samples. The following protocol provides an alternative strategy, capillary isoelectric focusing (cIEF), with many advantages compared to conventional immunoblotting. This is an antibody-based, automated, rapid, and quantitative method in which a complete western blotting procedure takes place inside an ultrathin capillary. This technique does not require a gel to transfer to a membrane, stripping of blots, or x-ray films, which are typically required for conventional immunoblotting. Here, proteins are separated according to their charge (isoelectric point; pI), using less than a microliter (400 nL) of total protein lysate. After electrophoresis, proteins are immobilized onto the capillary walls by ultraviolet light treatment, followed by primary and secondary (horseradish peroxidase (HRP) conjugated) antibody incubation, whose binding is detected through enhanced chemiluminescence (ECL), generating a light signal that can be captured and recorded by a charge-coupled device (CCD) camera. The digital image can be analyzed and quantified (peak area) using software. This high throughput procedure can handle 96 samples at a time; is highly sensitive, with protein detection in the picogram range; and produces highly reproducible results because of automation. All of these aspects are extremely valuable when the quantity of samples (e.g., tissue samples and biopsies) is a limiting factor. The technique has wider applications as well, including screening of drugs or antibodies, biomarker discovery, and diagnostic purposes.

Capillary isoelectric focusing is an antibody-based, ultrasensitive, high throughput technique, enabling detailed characterization of proteins and their isoforms from extremely small biological samples. The following describes a protocol for detection and quantification of specific proteins and their isoforms in an automated and robotized manner.

Hochsensible und quantitativen Nachweis von Proteinen und deren Isoformen durch Kapillare isoelektrischen Fokussierung Methode

Immunoblotting has become a routine technique in many laboratories for protein characterization from biological samples. The following protocol provides ...

Method for Efficient Refolding and Purification of Chemoreceptor Ligand Binding Domain

Identification of natural ligands of chemoreceptors and structural studies aimed at elucidation of the molecular basis of the ligand specificity can be greatly facilitated by the production of milligram amounts of pure, folded ligand binding domains. Attempts to heterologously express periplasmic ligand binding domains of bacterial chemoreceptors in Escherichia coli (E. coli) often result in their targeting into inclusion bodies. Here, a method is presented for protein recovery from inclusion bodies, its refolding and purification, using the periplasmic dCACHE ligand binding domain of Campylobacter jejuni (C. jejuni) chemoreceptor Tlp3 as an example. The approach involves expression of the protein of interest with a cleavable His6-tag, isolation and urea-mediated solubilisation of inclusion bodies, protein refolding by urea depletion, and purification by means of affinity chromatography, followed by tag removal and size-exclusion chromatography. The circular dichroism spectroscopy is used to confirm the folded state of the pure protein. It has been demonstrated that this protocol is generally useful for production of milligram amounts of dCACHE periplasmic ligand binding domains of other bacterial chemoreceptors in a soluble and crystallisable form.

A procedure is presented for the refolding of the dCACHE periplasmic ligand binding domain of Campylobacter jejuni chemoreceptor Tlp3 from inclusion bodies and the purification to yield milligram quantities of protein.

Methode für effiziente Umfaltung und Reinigung des Chemorezeptor-Liganden-bindende Domäne

Identification of natural ligands of chemoreceptors and structural studies aimed at elucidation of the molecular basis of the ligand specificity can be ...

Enrichment of Native Lipoprotein Particles with microRNA and Subsequent Determination of Their Absolute/Relative microRNA Content and Their Cellular Transfer Rate

Lipoprotein particles are predominately transporters of lipids and cholesterol in the bloodstream. Furthermore, they contain small amounts of strands of noncoding microRNA (miRNA). In general, miRNA alters the protein expression profile due to interactions with messenger-RNA (mRNA). Thus, knowledge of the relative and absolute miRNA content of lipoprotein particles is essential to estimate the biological effect of cellular particle uptake. Here, a quantitative real-time polymerase chain reaction (qPCR)-based protocol is presented to determine the absolute miRNA content of lipoprotein particles&#8212;exemplified shown for native and miRNA-enriched lipoprotein particles. The relative miRNA content is quantified using multiwell microfluidic array cards. Furthermore, this protocol allows scientists to estimate the cellular miRNA and, thus, the lipoprotein particle uptake rate. A significant increase of the cellular miRNA level is observable when using high-density lipoprotein (HDL) particles artificially loaded with miRNA, whereas incubation with native HDL particles yields no significant effect due to their rather low miRNA content. In contrast, the cellular uptake of low-density lipoprotein (LDL) particles&#8212;neither with native miRNA nor artificially loaded with it&#8212;did not alter the cellular miRNA level.

Here, a quantitative real-time polymerase chain reaction-based protocol is presented for the determination of the native micro-RNA content (absolute/relative) of lipoprotein particles. In addition, a method for increasing the micro-RNA level, as well as a method for determining the cellular uptake rate of lipoprotein particles, is demonstrated.

Anreicherung von Ureinium Lipoprotein-Partikeln mit Mikro-RNA und anschließender Bestimmung ihrer Absolute/Relative MicroRNA-Inhalte und ihrer Celluläre Transferquote

Lipoprotein particles are predominately transporters of lipids and cholesterol in the bloodstream. Furthermore, they contain small amounts of strands of ...

Deciphering Molecular Mechanism of Histone Assembly by DNA Curtain Technique

Chromatin is a higher-order structure that packages eukaryotic DNA. Chromatin undergoes dynamic alterations according to the cell cycle phase and in response to environmental stimuli. These changes are essential for genomic integrity, epigenetic regulation, and DNA metabolic reactions such as replication, transcription, and repair. Chromatin assembly is crucial for chromatin dynamics and is catalyzed by histone chaperones. Despite extensive studies, the mechanisms by which histone chaperones enable chromatin assembly remains elusive. Moreover, the global features of nucleosomes organized by histone chaperones are poorly understood. To address these problems, this work describes a unique single-molecule imaging technique named DNA curtain, which facilitates the investigation of the molecular details of nucleosome assembly by histone chaperones. DNA curtain is a hybrid technique that combines lipid fluidity, microfluidics, and total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM) to provide a universal platform for real-time imaging of diverse protein-DNA interactions.Using DNA curtain, the histone chaperone function of Abo1, the Schizosaccharomyces pombe bromodomain-containing AAA+ ATPase, is investigated, and the molecular mechanism underlying histone assembly of Abo1 is revealed. DNA curtain provides a unique approach for studying chromatin dynamics.

DNA curtain, a high-throughput single-molecule imaging technique, provides a platform for real-time visualization of diverse protein-DNA interactions. The present protocol utilizes the DNA curtain technique to investigate the biological role and molecular mechanism of Abo1, a Schizosaccharomyces pombe bromodomain-containing AAA+ ATPase.

Entschlüsselung des molekularen Mechanismus der Histonassemblierung mittels DNA-Vorhangtechnik

Chromatin is a higher-order structure that packages eukaryotic DNA. Chromatin undergoes dynamic alterations according to the cell cycle phase and in ...

A Nanobar-Supported Lipid Bilayer System for the Study of Membrane Curvature Sensing Proteins in vitro

Membrane curvature plays important roles&#160;in various essential processes of cells, such as cell migration, cell division, and vesicle trafficking. It is not only passively generated by cellular activities, but also actively regulates protein interactions and is involved in many intracellular signaling. Thus, it is of great value to examine the role of membrane curvature in regulating the distribution and dynamics of proteins and lipids. Recently, many techniques have been developed to study the relationship between the curved membrane and protein in vitro. Compared to traditional techniques, the newly developed nanobar-supported lipid bilayer (SLB) offers both high-throughput and better accuracy in membrane curvature generation by forming a continuous lipid bilayer on patterned arrays of nanobars with a pre-defined membrane curvature and local flat control. Both the lipid fluidity and protein sensitivity to curved membranes can be quantitatively characterized using fluorescence microscopy imaging. Here, a detailed procedure on how to form a SLB on fabricated glass surfaces containing nanobar arrays&#160;and the characterization of curvature-sensitive proteins on such SLB are introduced. In addition, protocols for nanochip reusing and image processing are covered. Beyond the nanobar-SLB, this protocol is readily applicable to all types of nanostructured glass chips for curvature sensing studies.

A Nanobar-Supported Lipid Bilayer System for the Study of Membrane Curvature Sensing Proteins in vitro

Here, a nanobar-supported lipid bilayer system is developed to provide a synthetic membrane with a defined curvature that enables the characterization of proteins with curvature sensing ability in vitro.

Ein Nanobar-gestütztes Lipiddoppelschichtsystem zur Untersuchung von Membrankrümmungssensorproteinen in vitro

Membrane curvature plays important roles&#160;in various essential processes of cells, such as cell migration, cell division, and vesicle trafficking. It ...