The authors thank the Nikon Imaging Center at Istituto Italiano di Tecnologia, Genova, Italy (NIC@IIT).

<ol>
	<li>Gygi, S. P., Han, D. K., Gingras, A. C., Sonenberg, N., Aebersold, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+analysis+by+mass+spectrometry+and+sequence+database+searching:+tools+for+cancer+research+in+the+post-genomic+era.">Protein analysis by mass spectrometry and sequence database searching: tools for cancer research in the post-genomic era.</a> Electrophoresis. 20, 310-319 (1999).</li><li>Washburn, M. P., Wolters, D., Yates, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+analysis+of+the+yeast+proteome+by+multidimensional+protein+identification+technology.">Large-scale analysis of the yeast proteome by multidimensional protein identification technology.</a> Nat Biotechnol. 19, 242-247 (2001).</li><li>Zhu, H., Bilgin, M., Snyder, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomics.">Proteomics.</a> Annu Rev Biochem. 72, 783-812 (2003).</li><li>Ito, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Roles+for+the+two-hybrid+system+in+exploration+of+the+yeast+protein+interactome.">Roles for the two-hybrid system in exploration of the yeast protein interactome.</a> Mol Cell Proteomics. 1, 561-566 (2002).</li><li>Evans, M. J., Cravatt, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism-based+profiling+of+enzyme+families.">Mechanism-based profiling of enzyme families.</a> Chem Rev. 106, 3279-3301 (2006).</li><li>Cravatt, B. F., Wright, A. T., Kozarich, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity-based+protein+profiling:+from+enzyme+chemistry+to+proteomic+chemistry.">Activity-based protein profiling: from enzyme chemistry to proteomic chemistry.</a> Annu Rev Biochem. 77, 383-414 (2008).</li><li>Rostovtsev, V. V., Green, L. G., Fokin, V. V., Sharpless, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+stepwise+huisgen+cycloaddition+process:+copper(I)-catalyzed+regioselective+"ligation"+of+azides+and+terminal+alkynes.">A stepwise huisgen cycloaddition process: copper(I)-catalyzed regioselective "ligation" of azides and terminal alkynes.</a> Angew Chem Int Ed Engl. 41, 2596-2599 (2002).</li><li>Meldal, M., Tornoe, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cu-catalyzed+azide-alkyne+cycloaddition.">Cu-catalyzed azide-alkyne cycloaddition.</a> Chem Rev. 108, 2952-3015 (2008).</li><li>Speers, A. E., Adam, G. C., Cravatt, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity-based+protein+profiling+in+vivo+using+a+copper(i)-catalyzed+azide-alkyne+[3+++2]+cycloaddition.">Activity-based protein profiling in vivo using a copper(i)-catalyzed azide-alkyne [3 + 2] cycloaddition.</a> J Am Chem Soc. 125, 4686-4687 (2003).</li><li>Saxon, E., Bertozzi, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+surface+engineering+by+a+modified+Staudinger+reaction.">Cell surface engineering by a modified Staudinger reaction.</a> Science. 287, 2007-2010 (2000).</li><li>Kohn, M., Breinbauer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Staudinger+ligation-a+gift+to+chemical+biology.">The Staudinger ligation-a gift to chemical biology.</a> Angew Chem Int Ed Engl. 43, 3106-3116 (2004).</li><li>Romeo, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity-Based+Probe+for+N-Acylethanolamine+Acid+Amidase.">Activity-Based Probe for N-Acylethanolamine Acid Amidase.</a> ACS Chem Biol. 10, 2057-2064 (2015).</li><li>Ueda, N., Yamanaka, K., Yamamoto, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+characterization+of+an+acid+amidase+selective+for+N-palmitoylethanolamine,+a+putative+endogenous+anti-inflammatory+substance.">Purification and characterization of an acid amidase selective for N-palmitoylethanolamine, a putative endogenous anti-inflammatory substance.</a> J Biol Chem. 276, 35552-35557 (2001).</li><li>Tsuboi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+characterization+of+N-acylethanolamine-hydrolyzing+acid+amidase,+a+novel+member+of+the+choloylglycine+hydrolase+family+with+structural+and+functional+similarity+to+acid+ceramidase.">Molecular characterization of N-acylethanolamine-hydrolyzing acid amidase, a novel member of the choloylglycine hydrolase family with structural and functional similarity to acid ceramidase.</a> J Biol Chem. 280, 11082-11092 (2005).</li><li>Tsuboi, K., Takezaki, N., Ueda, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+N-acylethanolamine-hydrolyzing+acid+amidase+(NAAA).">The N-acylethanolamine-hydrolyzing acid amidase (NAAA).</a> Chem Biodivers. 4, 1914-1925 (2007).</li><li>Ribeiro, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Potent+Systemically+Active+N-Acylethanolamine+Acid+Amidase+Inhibitor+that+Suppresses+Inflammation+and+Human+Macrophage+Activation.">A Potent Systemically Active N-Acylethanolamine Acid Amidase Inhibitor that Suppresses Inflammation and Human Macrophage Activation.</a> ACS Chem Biol. 10, 1838-1846 (2015).</li><li>Zhao, L. Y., Tsuboi, K., Okamoto, Y., Nagahata, S., Ueda, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteolytic+activation+and+glycosylation+of+N-acylethanolamine-hydrolyzing+acid+amidase,+a+lysosomal+enzyme+involved+in+the+endocannabinoid+metabolism.">Proteolytic activation and glycosylation of N-acylethanolamine-hydrolyzing acid amidase, a lysosomal enzyme involved in the endocannabinoid metabolism.</a> Biochim Biophys Acta. 1771, 1397-1405 (2007).</li><li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amino+acid+residues+crucial+in+pH+regulation+and+proteolytic+activation+of+N-acylethanolamine-hydrolyzing+acid+amidase.">Amino acid residues crucial in pH regulation and proteolytic activation of N-acylethanolamine-hydrolyzing acid amidase.</a> Biochim Biophys Acta. 1781, 710-717 (2008).</li><li>West, J. M., Zvonok, N., Whitten, K. M., Wood, J. T., Makriyannis, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometric+characterization+of+human+N-acylethanolamine-hydrolyzing+acid+amidase.">Mass spectrometric characterization of human N-acylethanolamine-hydrolyzing acid amidase.</a> J Proteome Res. 11, 972-981 (2012).</li><li>Bandiera, T., Ponzano, S., Piomelli, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+the+discovery+of+N-acylethanolamine+acid+amidase+inhibitors.">Advances in the discovery of N-acylethanolamine acid amidase inhibitors.</a> Pharmacol Res. 86, 11-17 (2014).</li><li>Sasso, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antinociceptive+effects+of+the+N-acylethanolamine+acid+amidase+inhibitor+ARN077+in+rodent+pain+models.">Antinociceptive effects of the N-acylethanolamine acid amidase inhibitor ARN077 in rodent pain models.</a> Pain. 154, 350-360 (2013).</li><li>Duranti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N-(2-oxo-3-oxetanyl)carbamic+acid+esters+as+N-acylethanolamine+acid+amidase+inhibitors:+synthesis+and+structure-activity+and+structure-property+relationships.">N-(2-oxo-3-oxetanyl)carbamic acid esters as N-acylethanolamine acid amidase inhibitors: synthesis and structure-activity and structure-property relationships.</a> J Med Chem. 55, 4824-4836 (2012).</li><li>Ponzano, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+and+structure-activity+relationship+(SAR)+of+2-methyl-4-oxo-3-oxetanylcarbamic+acid+esters,+a+class+of+potent+N-acylethanolamine+acid+amidase+(NAAA)+inhibitors.">Synthesis and structure-activity relationship (SAR) of 2-methyl-4-oxo-3-oxetanylcarbamic acid esters, a class of potent N-acylethanolamine acid amidase (NAAA) inhibitors.</a> J Med Chem. 56, 6917-6934 (2013).</li><li>Solorzano, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+and+structure-activity+relationships+of+N-(2-oxo-3-oxetanyl)amides+as+N-acylethanolamine-hydrolyzing+acid+amidase+inhibitors.">Synthesis and structure-activity relationships of N-(2-oxo-3-oxetanyl)amides as N-acylethanolamine-hydrolyzing acid amidase inhibitors.</a> J Med Chem. 53, 5770-5781 (2010).</li><li>Vitale, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis,+structure-activity,+and+structure-stability+relationships+of+2-substituted-N-(4-oxo-3-oxetanyl)+N-acylethanolamine+acid+amidase+(NAAA)+inhibitors.">Synthesis, structure-activity, and structure-stability relationships of 2-substituted-N-(4-oxo-3-oxetanyl) N-acylethanolamine acid amidase (NAAA) inhibitors.</a> ChemMedChem 9. 9, 323-336 (2014).</li><li>Fiasella, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3-Aminoazetidin-2-one+derivatives+as+N-acylethanolamine+acid+amidase+(NAAA)+inhibitors+suitable+for+systemic+administration.">3-Aminoazetidin-2-one derivatives as N-acylethanolamine acid amidase (NAAA) inhibitors suitable for systemic administration.</a> ChemMedChem 9. 9, 1602-1614 (2014).</li><li>Armirotti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=beta-Lactones+Inhibit+N-acylethanolamine+Acid+Amidase+by+S-Acylation+of+the+Catalytic+N-Terminal+Cysteine.">beta-Lactones Inhibit N-acylethanolamine Acid Amidase by S-Acylation of the Catalytic N-Terminal Cysteine.</a> ACS Med Chem Lett. 3, 422-426 (2012).</li><li>Nuzzi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potent+alpha-amino-beta-lactam+carbamic+acid+ester+as+NAAA+inhibitors.+Synthesis+and+structure-activity+relationship+(SAR)+studies.">Potent alpha-amino-beta-lactam carbamic acid ester as NAAA inhibitors. Synthesis and structure-activity relationship (SAR) studies.</a> Eur J Med Chem. 111, 138-159 (2016).</li><li>Bonezzi, F. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Important+Role+for+N-Acylethanolamine+Acid+Amidase+in+the+Complete+Freund's+Adjuvant+Rat+Model+of+Arthritis.">An Important Role for N-Acylethanolamine Acid Amidase in the Complete Freund's Adjuvant Rat Model of Arthritis.</a> J Pharmacol Exp Ther. 356, 656-663 (2016).</li><li>Smith, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+protein+using+bicinchoninic+acid.">Measurement of protein using bicinchoninic acid.</a> Anal Biochem. 150, 76-85 (1985).</li><li>Speers, A. E., Cravatt, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity-Based+Protein+Profiling+(ABPP)+and+Click+Chemistry+(CC)-ABPP+by+MudPIT+Mass+Spectrometry.">Activity-Based Protein Profiling (ABPP) and Click Chemistry (CC)-ABPP by MudPIT Mass Spectrometry.</a> Curr Protoc Chem Biol. 1, 29-41 (2009).</li><li>Rybak, J. N., Scheurer, S. B., Neri, D., Elia, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+biotinylated+proteins+on+streptavidin+resin:+a+protocol+for+quantitative+elution.">Purification of biotinylated proteins on streptavidin resin: a protocol for quantitative elution.</a> Proteomics. 4, 2296-2299 (2004).</li><li>Penna, A., Cahalan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Western+Blotting+using+the+Invitrogen+NuPage+Novex+Bis+Tris+minigels.">Western Blotting using the Invitrogen NuPage Novex Bis Tris minigels.</a> J Vis Exp. (264), (2007).</li><li>Giuffrida, A., Piomelli, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isotope+dilution+GC/MS+determination+of+anandamide+and+other+fatty+acylethanolamides+in+rat+blood+plasma.">Isotope dilution GC/MS determination of anandamide and other fatty acylethanolamides in rat blood plasma.</a> FEBS Lett. 422, 373-376 (1998).</li><li>Buczynski, M. W., Parsons, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+brain+endocannabinoid+levels:+methods,+interpretations+and+pitfalls.">Quantification of brain endocannabinoid levels: methods, interpretations and pitfalls.</a> Br J Pharmacol. 160, 423-442 (2010).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

酵素活性は、微RNA転写、タンパク質合成、タンパク質の転座、翻訳後修飾、およびタンパク質 - タンパク質相互作用を含む種々のレベルで調節されます。多くの場合、単独の酵素の発現は、その活性を考慮していません。 ABPPは、その天然の状態でタンパク質の活性を研究するために開発されました。二つの機能が必要とされている：共有結合プローブで標識された酵素を検出するために、興味のある酵素の活性部位とレポータータグに結合する化学プローブを。 プローブ設計と合成は、手順の重要なポイントです。プローブは、その標的に対する十分な親和性と選択性を持っている必要があります。また、レポータータグの存在は、目標係に影響を及ぼしてはなりません。この問題は、大部分は、ターゲットが捕捉された後のレポータータグが導入された二段ABPの設計によって克服されます。タグを含まないプローブは、 インビボ研究のために特に適しているタンパク質の活性最小限の外部の変化と、生きた細胞または生物で評価することができます。 NAAAプローブARN14686は、上記で概説した要件を満たすように設計されました。 βラクタム反応弾頭はNAAA阻害剤16,26のβラクタムクラスで得られた以前の結果に基づいて選択されました。これらの化合物は、共有結合酵素の触媒システインに結合することによって、強力かつ選択的な方法でNAAAを阻害します。さらに、化合物は、16全身的に活性であることが示されました。私たちは、長い脂肪族鎖のアカウントにNAAAの親和性の増加を取って、C9飽和脂肪族鎖を導入しました。末端アルキンは、二段階標識を可能にするために添加しました。 もう一つの重要なステップは、用量およびin vivo投与のための時間を選択しています。これは、血漿中のプローブの安定性、その標的親和性、およびその選択に依存します。正確な用量は、経口の係合を回避しながら、標的捕捉を可能にするように選択されなければなりませんssibleオフターゲット。我々は、/ kgのARN14686静脈3mgの選択的NAAAを捕捉するために最適であることがわかりました。より高い用量は、相同システインアミダーゼ、酸性セラミダーゼの取り込みをもたらしました。肺のような十分に灌流器官を分析する場合、治療の長さに関しては、短時間（2時間）は、ターゲットと反応す​​るプローブを可能にするのに十分であり得ます。足のために、しかし、我々は反応時間を倍増することが義務付けられました。 タンパク質ブロットによる標的分析で可能な問題は自然にビオチン化タンパク質の存在によるものです。これらは、必然的に、特定のプローブ対象と一緒に識別されます。私たちは、CCを実行する前に、ストレプトアビジンビーズとのpreclearingステップを導入することは非常に我々の結果の品質を増加させることを見出しました。一方、天然のビオチン化タンパク質の存在は、可能なローディングアーチファクトを制御するために使用されるかもしれません。最後に、蛍光顕微鏡による局在化研究に関しては、pを認識することが非常に重要ですローブ選択タンパク質ブロットとは異なり、蛍光顕微鏡は、オフターゲットからターゲットの区別を許可していないからです。予備選択の研究では、実現可能性を評価するために、最適な実験条件を設定するために実行する必要があります。 記載された技術の制限は主に、このような界面活性剤およびアミン含有緩衝液の使用などのCC反応に影響を与えることができる実験条件を、避けることの必要性に関係します。これらの態様は、細胞溶解物または組織ホモジネートを調製する際のアカウントに注意しなければなりません。タンパク質含有量が250μgのない場合、この手順は、適用可能であるため、また、ストレプトアビジン濃縮段階が必要とされる場合、出発物質の量は、別の問題を構成します。この制限は、このような作業CC誘発性沈殿後のボリューム、タンパク質回収、および使用されるストレプトアビジン樹脂の量などの技術的問題に設定されています。 PreviouslY、NAAAの活性は、酵素のインビトロ活性化および基質の可溶化14の活性化緩衝液の使用を必要とする活性アッセイを実施することによって評価することができます。このアプローチは、総NAAAの表現について、アクティブでないNAAAの存在に関する情報を提供します。別の可能性は、PEAとOEAの組織レベルを測定することで、この方法は、NAAA活性34,35を評価する唯一の間接的な方法を表します。また、FAEレベルは、生合成などの他の要因によって影響され得ます。化学プローブARN14686はNAAAの最初のABPです。ここで説明するプロトコルは、 インビトロおよびインビボの両方で 、NAAAの活性型を捕捉し、可視化するための簡単な手順を示しています。すべてのサンプルの操作は、このように、酵素のインビボ状態に関する信頼できる情報を提供する、プローブ-標的反応に続いています。また、蛍光顕微鏡でARN14686の使用は、固有の工具Tを表しますOアクティブNAAAをローカライズ。 NAAA触媒サブユニットを認識する利用可能な抗体は、NAAA全長のプロ酵素および活性酵素を区別しません。 ここに記載したプロトコルから出発して、NAAAの発現および活性化は、炎症の種々の細胞株および動物モデルで分析することができます。共局在の研究は、より良好な生理学的および病理学的状態におけるNAAAの役割を特徴付けるために実施することができます。

一般的に使用される発現パターン、相互作用、及びショットガン分析1,2のための液体クロマトグラフィー-質量分析プラットフォームを含むタンパク質の機能を調査する方法、酵母ツーハイブリッド法3,4、およびインビトロアッセイにおいて 、それらがあることで制限されていますその天然の状態でタンパク質の活性を評価することができません。活性に基づくタンパク質プロファイリング（ABPP）は、このギャップを埋めるために使用することができます。このアプローチでは、共有結合的に目的の酵素の活性部位に結合することができる小分子プローブは、標的検出を可能にするレポーター基に結合しています。クリックケミストリー（CC）を使用して、レポータープローブに組み込むことができ、または標的係合5,6を発生した後に導入することができます。後者の手順は、SUCバイオ直交反応を介してレポーター試薬の数に変更することができ、そのような末端アルキンまたはアジドなどの適切な化学基を含有するプローブの使用を必要としますCu（I）などのhはヒュイゲン[3 + 2]環7-9またはシュタウディンガーライゲーション10,11 -触媒。 最近、我々は、in vitroでの最初のABPとしてシステイン加水分解酵素、NAAA 12のインビボでの検出中の化合物ARN14686を開示しました。 NAAAは、抗炎症性核内受容体PPAR-α13-15の内因性アゴニストであるオレオイルエタノールアミド（OEA）とパルミトイルエタノールアミド（PEA）を含む飽和および一価不飽和のFAE、の加水分解不活性化を触媒します。 NAAAは、主に先天性免疫応答の調節における役割を示唆し、ならびにBリンパ球14,16のように、マクロファージおよび他の単球由来細胞において発現されます。酵素は不活性型の粗面小胞体で合成され、自己タンパク質分解機構17によって、細胞の酸性区画において活性化されます。自己タンパク質分解切断は、新しいN末端システイン（C13を生成し、マウスおよびラットにおける1、ヒトにおけるC126）、すなわちFAE加水分解18,19のための求核責任があります。 NAAA活性の薬理学的阻害は、のFAE 16,20,21の増加細胞レベルの賛成でFAE合成/分解のバランスを変化させます。いくつかのβラクトンおよびβラクタム誘導体は高い効力および選択16,22-26でNAAA活性を阻害することが示されています。これらの阻害剤は、触媒システイン16,27,28 のS -acylationを介して作用します。 （ - [（S）-2-オキソアゼチジン-3-イル]カルバミン酸4- cyclohexylbutyl- N）16化合物ARN14686は全身活性、セリン由来βラクタムNAAA阻害剤の化学構造、ARN726に基づいて設計しました。 ARN726の4-t-ブチルシクロヘキシル基は、アジドベアリングレポータータグとその後のCCのコンジュゲートのための末端アルキンタグを担持するC9飽和脂肪族鎖で置換しました。私たちは、minimallに2段階のABPを設計することにしましたyはこのようにNAAAに対するプローブの親和性を維持し、元の足場の構造を変更します。また、かさばるタグの導入を避け、そのようなプローブは、直接ABPよりin vivoでの治療のためのより適切である可能性があります。 ARN14686は、酵素12の触媒システインと共有結合付加物を形成することにより、高い効力を有するNAAA（hNAAA IC 50 = 6 nMで、rNAAA IC 50 = 13 nM）を阻害します。生きたラットの実験では、プローブは、NAAAは肺で発現撮影において選択的であることが示されました。高いプローブ濃度（ インビトロでの 10μM、10ミリグラム/静脈、静脈ミリリットル）12を使用する際に酸セラミダーゼ、NAAAと33-34％の同一性を共有する他のシステインアミダーゼは、低親和性標的として同定されました。我々はまた、完全フロイントアジュバント（CFA）29の投与後の炎症を起こしたラット組織における活性NAAAの存在を研究するためにARN14686を使用しています。 ここでは、preparatiためのプロトコルの概要を説明します（ 図1）及びex vivoで NAAA活性化の調査への応用ARN14686の上。例として、我々は、CFA投与後のラットの足でNAAAを可視化する実験手順を説明します。この実験では、タンパク質は、プローブの静脈注射後の足の組織から抽出され、ABP標識プロテオームは、ビオチンアジドとCCに供されます。ビオチン化されたサンプルは、ストレプトアビジンビーズを使用して濃縮され、そしてタンパク質ブロットが行われます。別のアプリケーションでは、我々は、プローブ処置マウスからのマウスの肺における蛍光顕微鏡により活性NAAAの局在化を説明します。この場合には、組織を切片化し、切片をローダミン添加用CCに供されます。ワークフロー方式は、図2に示されています。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1209">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">1,1&#8217;-sulfonyldiimidazole&#160;</td>
			<td style="width:205px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:111px;">367818</td>
			<td style="width:471px;">Harmful</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">2-dipyridylcarbonate</td>
			<td style="width:205px;">Fluorochem</td>
			<td style="width:111px;">11331</td>
			<td style="width:471px;">Harmful</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">2-Methylbutan</td>
			<td style="width:205px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:111px;">M32631</td>
			<td>Flamable, toxic,hazardous to the aquatic environment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">4-(Dimethylamino)pyridine</td>
			<td style="width:205px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:111px;">107700</td>
			<td style="width:471px;">Toxic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">Acetic acid</td>
			<td style="width:205px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:111px;">695092</td>
			<td style="width:471px;">Flammable, Corrosive</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">Acetonitrile&#160;</td>
			<td style="width:205px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:111px;">34998</td>
			<td style="width:471px;">Flammable, Toxic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">Activated charcoal</td>
			<td style="width:205px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:111px;">161551</td>
			<td style="width:471px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">Ammonium chloride</td>
			<td style="width:205px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:111px;">A9434</td>
			<td style="width:471px;">Harmful</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">Azide-PEG3-Biotin</td>
			<td style="width:205px;">Jena Biosciences</td>
			<td style="width:111px;">CLK-AZ104P4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">Azide-PEG3-Fluor 545</td>
			<td style="width:205px;">Jena Biosciences</td>
			<td style="width:111px;">CLK-AZ109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">BCA protein assay kit</td>
			<td style="width:205px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:111px;">23227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">Bio-spin columns</td>
			<td style="width:205px;">Biorad</td>
			<td style="width:111px;">732-6204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">Biotin</td>
			<td style="width:205px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:111px;">B4501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">Blocking buffer</td>
			<td style="width:205px;">Li-Cor Biosciences</td>
			<td style="width:111px;">927-40000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">b-mercaptoethanol</td>
			<td style="width:205px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:111px;">M6250</td>
			<td>Higly toxic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">Bovin serum albumine (BSA)</td>
			<td style="width:205px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:111px;">A7030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">Bromophenol blue</td>
			<td style="width:205px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:111px;">B0126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">Bruker Avance III 400</td>
			<td style="width:205px;">Bruker</td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:471px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">Celite</td>
			<td style="width:205px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:111px;">419931</td>
			<td style="width:471px;">Health hazard</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">Ceric ammonium nitrate&#160;</td>
			<td style="width:205px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:111px;">22249</td>
			<td style="width:471px;">Oxidizing, Harmful</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">Chloral hydrate</td>
			<td style="width:205px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:111px;">C8383</td>
			<td>Higly toxic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">CuSO4.5H2O&#160;</td>
			<td style="width:205px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:111px;">209198</td>
			<td>Toxic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">Cyclohexadiene</td>
			<td style="width:205px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:111px;">125415</td>
			<td style="width:471px;">Flammable, Health hazard</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">Cyclohexane</td>
			<td style="width:205px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:111px;">34855</td>
			<td style="width:471px;">Flammable, Harmful, Health hazard, Environmental hazard</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">Dichloromethane</td>
			<td style="width:205px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:111px;">34856</td>
			<td style="width:471px;">Harmful, Health hazard</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">Diethyl ether</td>
			<td style="width:205px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:111px;">296082</td>
			<td style="width:471px;">Flammable, Harmful</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td style="width:205px;">Acros Organics</td>
			<td style="width:111px;">348441000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">Dimethyl sulfoxide d6 (DMSO-d6)</td>
			<td style="width:205px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:111px;">175943</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">Ethanol</td>
			<td style="width:205px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:111px;">2860</td>
			<td style="width:471px;">Flammable, Harmful</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">Ethyl acetate</td>
			<td style="width:205px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:111px;">34858</td>
			<td style="width:471px;">Flammable, Harmful</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">Glycerol</td>
			<td style="width:205px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:111px;">G5516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">Irdye 680-LT Streptavidin</td>
			<td style="width:205px;">Li-Cor Biosciences</td>
			<td style="width:111px;">925-68031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">IRDye680-LT Streptavidin&#160;</td>
			<td style="width:205px;">Licor</td>
			<td style="width:111px;">925-68031</td>
			<td>Briefly centrifuge before use to precipitate protein complexes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">Methanol</td>
			<td style="width:205px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:111px;">34966</td>
			<td>Highly toxic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">Methanol</td>
			<td style="width:205px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:111px;">34860</td>
			<td style="width:471px;">Flammable, Toxic, Health hazard</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:423px;">N-(3-Dimethylaminopropyl)-N&#8242;-ethylcarbodiimide hydrochloride</td>
			<td style="width:205px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:111px;">E7750</td>
			<td style="width:471px;">Harmful, Corrosive</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">N,N-diisopropylethylamine</td>
			<td style="width:205px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:111px;">D125806</td>
			<td style="width:471px;">Flammable, Corrosive, Toxic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">N,N-dimethylformamide</td>
			<td style="width:205px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:111px;">227056</td>
			<td style="width:471px;">Flammable, Harmful, Health hazard</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">N-Cbz-L-Serine</td>
			<td style="width:205px;">Fluorochem&#160;</td>
			<td style="width:111px;">M03053</td>
			<td style="width:471px;">Harmful</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">Nikon A1 confocal microscopy</td>
			<td style="width:205px;">Nikon</td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td>Read&#160; the user manual</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">NuPAGE 4-12% Bis-Tris gel</td>
			<td style="width:205px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:111px;">NP0335BOX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">Palladium on carbon</td>
			<td style="width:205px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:111px;">330108</td>
			<td style="width:471px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">p-anisidine</td>
			<td style="width:205px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:111px;">A88255</td>
			<td style="width:471px;">Toxic, Health hazard, Environmental hazard</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:205px;">sigma Aldrich</td>
			<td style="width:111px;">441244</td>
			<td>Toxic, respiratory harmful, corrosive, falmable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Poly(ethylene glycol)&#160;</td>
			<td style="width:205px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:111px;">P3265</td>
			<td style="width:471px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">ProLong Gold antifade mountant with DAPI&#160;</td>
			<td style="width:205px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:111px;">P36931</td>
			<td>Avoid bubbles formation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">Protease inhibitor cocktail</td>
			<td style="width:205px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:111px;">P8340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">Sodium bicarbonate</td>
			<td style="width:205px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:111px;">S6014</td>
			<td style="width:471px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">Sodium dodecyl sulfate (SDS)&#160;</td>
			<td style="width:205px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:111px;">L3771</td>
			<td>Toxic, corrosive, falmmable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">Sodium hydride&#160;</td>
			<td style="width:205px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:111px;">452912</td>
			<td style="width:471px;">Flammable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">Sodium sulfate</td>
			<td style="width:205px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:111px;">239313</td>
			<td style="width:471px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">Starion FLA-9000 immage scanner</td>
			<td style="width:205px;">FUJIFILM</td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td>Read&#160; the user manual</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">Streptavidin agarose</td>
			<td style="width:205px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>20349</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">Sucrose</td>
			<td style="width:205px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:111px;">S7903</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">Tert-butanol</td>
			<td style="width:205px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:111px;">360538</td>
			<td>Toxic, flammable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">Tetrahydrofuran</td>
			<td style="width:205px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:111px;">186562</td>
			<td style="width:471px;">Flammable, Harmful, Health hazard</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">Thiourea</td>
			<td style="width:205px;">Acros Organics</td>
			<td style="width:111px;">424542500</td>
			<td>Toxic, warm at 50 &#176;C to dissolve</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">Tris</td>
			<td style="width:205px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:111px;">RDD008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP)</td>
			<td style="width:205px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:111px;">C4706</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tris[(1-benzyl-1H-1,2,3-triazol-4-yl)methyl]amine (TBTA)</td>
			<td style="width:205px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:111px;">678937</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">Triton-x100</td>
			<td style="width:205px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:111px;">X100</td>
			<td>Toxic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">Tween-20</td>
			<td style="width:205px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:111px;">P9416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">Tween-80</td>
			<td style="width:205px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:111px;">P1754</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">Ultra turrax IKA T18 basic tissue homogenizer</td>
			<td style="width:205px;">IKA</td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">Undec-10-yn-1-ol</td>
			<td style="width:205px;">Fluorochem</td>
			<td style="width:111px;">13739</td>
			<td style="width:471px;">Harmful</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">Urea</td>
			<td style="width:205px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:111px;">U5378</td>
			<td>Toxic, warm at 50 &#176;C to dissolve</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation and in vivo use of an activity-based probe for n-acylethanolamine acid amidase

活性に基づくタンパク質プロファイリング（ABPP）は、酵素の活性部位を標的とする化学的プローブの使用を介して複雑なプロテオームにおける目的の酵素を同定するための方法です。プローブに導入されたレポータータグは、ゲル内蛍光スキャニング、タンパク質ブロット、蛍光顕微鏡、または液体クロマトグラフィー - 質量分析法による酵素標識の検出を可能にします。ここでは、化合物のARN14686、選択的にNが酸アミダーゼ（NAAA）を-acylethanolamine酵素を認識し、クリックケミストリーアクティビティベースのプローブ（CC-ABP）の製造および使用を記載します。 NAAAは、パルミトイルエタノールアミド（PEA）及びオレオイルエタノールアミド（OEA）などの内因性ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体（PPAR） - アルファアゴニストを非活性化することによって炎症を促進するシステイン加水分解酵素です。 NAAAは、リソソームの酸性pHで自己タンパク質分解によって活性化される不活性な完全長プロ酵素として合成されます。ローカリゼーション研究の時間AVEは、NAAAは、主にマクロファージおよび他の単球由来細胞における、並びにBリンパ球で発現されることを示します。我々はARN14686タンパク質ブロット、蛍光顕微鏡によりげっ歯類組織において活性NAAA エクスビボの検出および定量化するために使用できる方法の例を提供します。

ARN14686はNAAA阻害剤ARN726の足場に基づいて設計されました。 ARN726の4-t-ブチル-シクロヘキシル基は、C9の飽和脂肪族鎖は、末端アルキンタグ（ 図1）を有する基で置換しました。アルキンタグは、フルオロフォアまたはCCを介してビオチン分子を追加するために二段階標識化手順の使用を可能にするために導入されました。この機能は、in vitroおよびin vivoで NAAAを調査するために非常に汎用性の高いツールをARN14686レンダリングします。 ここでは、この分子の潜在的なの代表的なものであるARN14686の二つのアプリケーションを示す。 図2は、ここで報告された実験手順のスキームです。プローブの静脈内投与した後、二つの異なる検出方法を使用することができる：タンパク質ブロットによるアクティブNAAA式のⅰ）分析とfluorescencによる細胞内の活性NAAAの発現と局在のii）の分析電子顕微鏡。 最初の代表的結果は、最近、我々のグループ29によって出版されました。我々は、CFA誘発性の足の炎症のラットモデルでNAAAの発現を解析しました。プローブ（3mg / kg）またはビヒクルは、ナイーブおよびCFAで処置したラットにおいて静脈内注射しました。ラットは、4時間後に屠殺しました。 CCは、プローブ標識タンパク質にビオチンタグを導入するために濃縮されたリソソーム抽出物で行いました。ビオチン化タンパク質は、次のストレプトアビジンビーズを用いて濃縮しました。溶出したタンパク質は、活性NAAAのレベルが顕著に対照ラットのものとCFAの相対的（ 図3）で処置したラットの足で増加したことを示す、タンパク質ブロットによって分析しました。タンパク質ブロット分析の利点は、ゲル電気泳動によって分離されたプローブ反応プロテオームの詳細な検査を可能にすることです。このアプローチは、潜在的なプローブのオフターゲットの除幕式を可能にします。無プローブ制御はアルでなければなりません方法は実験的背景を構成する内因性のビオチン化タンパク質を排除するために含まれます。 図3の矢印は、次にロード基準コントロールとして使用することができ、このような背景のタンパク質を示します。 第二の未発表の実験（ 図4）では、我々は蛍光顕微鏡によってex vivoで検出するためNAAAをプローブするARN14686を使用しました。私たちは、3ミリグラム/キログラム（IV）でマウスにARN14686を投与し、2時間transcardial灌流による治療後にそれらを屠殺しました。肺は、収集後固定し、冷2- metylbutane中で凍結しました。フルオロフォアの添加のためのCC反応は、クライオスタットを用いて収集さ40μm厚の組織切片上で直接行いました。蛍光顕微鏡による分析は、肺胞マクロファージに属する拡散小胞構造における触媒活性NAAAの存在を示しました。タンパク質特異的抗体の使用、唯一のAと比較するとctive酵素が観察されます。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/54652/54652fig1.jpg" /> 図1：ARN14686合成反応スキームウンデカ-10- YN -2-オール、混合炭酸塩を生成するために、触媒の4-ジメチルアミノピリジン（DMAP）の存在下でdipyridylcarbonate（DPC）によって活性化しました。この炭酸塩は、その後、標的分子ARN14686を得るために、アミノラクタムと反応させた。 <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54652/54652fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/54652/54652fig2.jpg" /> 図2：本研究で示された一般的な戦略のワークフロースキームプローブは、動物（ラットまたはマウス）に注入し、標的とされる式は、二つの異なる実験手順に従い分析されますS：ⅰ）ラベルされたプロテオームが抽出され、ビオチンはCCで追加されます。ストレプトアビジンビーズ上のビオチン化タンパク質の濃縮段階の後、プローブの標的は、タンパク質ブロットにより分析します。 ii）の組織切片を調製し、フルオロフォアは、CCによって付加されます。プローブターゲット局在を蛍光顕微鏡により分析します。この図は、Bonezzi らから適応されています。29は、 <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54652/54652fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/54652/54652fig3.jpg" /> 図3：CFA処置ラットの足でNAAA活性化の分析ナイーブラット（レーン1および2）またはCFA-注射したラットからのストレプトアビジンに富むタンパク質注射の7日後のタンパク質ブロット分析（レーン3および4）。ラットは、車両やARN14686（3mg / kg）の静脈注射を受けました。ブロッティング膜蛍光ストレプトアビジンでプローブしました。矢印は、NAAAバンドを示しています。矢印は、タンパク質の同様の量が各レーンにロードされたことを示す、約90キロダルトンのビオチン含有バンドを示しています。この図は、Bonezzi らから変更されている。29は、 <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54652/54652fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/54652/54652fig4.jpg" /> 図4： プローブで標識された蛍光顕微鏡によって、マウスの肺でNAAAのビヒクル（A）の肺切片またはアジドPEG3-フルーア545とCC後ARN14686-注入（B）マウスの代表的な写真を報告するの ex vivoで 検出します 。無信号がVで検出されなかった正のシグナル（赤血球）は、ARN14686注入マウスで検出されましたehicle投与マウス。アジドPEG3-フルーア545正肺胞マクロファージの詳細は、より高い倍率でCに示されています。核はDAPI（青）でマークしました。スケールバー= Aが50μmとCが10μm <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54652/54652fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a>

Watch this Scientific Journal Video about Preparation and In Vivo Use of an Activity-based Probe for N-acylethanolamine Acid Amidase at JoVE.com

Preparation and In Vivo Use of an Activity-based Probe for N-acylethanolamine Acid Amidase

ここでは、アクティビティベースのプローブの調製および使用を記載する（ARN14686、ウンデカ-10- ynyl- N - [（3 S）-2-オキソアゼチジン-3-イル]カルバメート）の検出および定量を可能にします前炎症性酵素Nの活性形態は、in vitroおよびex vivoの両方、酸アミダーゼ（NAAA）を-acylethanolamine。

調製と<em&gt;インビボ</em&gt;アクティビティベースのプローブの使用のために<em&gt; N</em&gt; -acylethanolamine酸アミダーゼ

Activity-based protein profiling (ABPP) is a method for the identification of an enzyme of interest in a complex proteome through the use of a chemical ...

preparation-vivo-use-an-activity-based-probe-for-n-acylethanolamine

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Preparation and In Vivo Use of an Activity-based Probe for N-acylethanolamine Acid Amidase

9.6K ビュー.  Istituto Italiano di Tecnologia. ここでは、アクティビティベースのプローブの調製および使用を記載する（ARN14686、ウンデカ-10- ynyl- N - [（3 S）-2-オキソアゼチジン-3-イル]カルバメート）の検出および定量を可能にします前炎症性酵素Nの活性形態は、in vitroおよびex vivoの両方、酸アミダーゼ（NAAA）を-acylethanolamine。 

ビデオ: Preparation and In Vivo Use of an Activity-based Probe for N-acylethanolamine Acid Amidase

An Efficient Method for the Isolation of Highly Purified RNA from Seeds for Use in Quantitative Transcriptome Analysis

Plant seeds accumulate large amounts of storage reserves comprising biodegradable organic matter. Humans rely on seed storage reserves for food and as industrial materials. Gene expression profiles are powerful tools for investigating metabolic regulation in plant cells. Therefore, detailed, accurate gene expression profiles during seed development are required for crop breeding. Acquiring highly purified RNA is essential for producing these profiles. Efficient methods are needed to isolate highly purified RNA from seeds. Here, we describe a method for isolating RNA from seeds containing large amounts of oils, proteins, and polyphenols, which have inhibitory effects on high-purity RNA isolation. Our method enables highly purified RNA to be obtained from seeds without the use of phenol, chloroform, or additional processes for RNA purification. This method is applicable to Arabidopsis, rapeseed, and soybean seeds. Our method will be useful for monitoring the expression patterns of low level transcripts in developing and mature seeds.

We have succeeded in establishing a method for RNA isolation from plant seeds containing large amounts of oils, proteins, and polyphenols, which have inhibitory effects on high-purity RNA isolation. Our method is suitable for monitoring the expression of genes with low level transcripts in seeds.

定量的トランスクリプトーム解析に使用するための種子から高度に精製されたRNAの単離のための効率的な方法

Plant seeds accumulate large amounts of storage reserves comprising biodegradable organic matter. Humans rely on seed storage reserves for food and as ...

生化学

Preparation of Giant Vesicles Encapsulating Microspheres by Centrifugation of a Water-in-oil Emulsion

The constructive biology and the synthetic biology approach to creating artificial life involve the bottom-up assembly of biological or nonbiological materials. Such approaches have received considerable attention in research on the boundary between living and nonliving matter and have been used to construct artificial cells over the past two decades. In particular, Giant Vesicles (GVs) have often been used as artificial cell membranes. In this paper, we describe the preparation of GVs encapsulating highly packed microspheres as a model of cells containing highly condensed biomolecules. The GVs were prepared by means of a simple water-in-oil emulsion centrifugation method. Specifically, a homogenizer was used to emulsify an aqueous solution containing the materials to be encapsulated and an oil containing dissolved phospholipids, and the resulting emulsion was layered carefully on the surface of another aqueous solution. The layered system was then centrifuged to generate the GVs. This powerful method was used to encapsulate materials ranging from small molecules to microspheres.

Giant vesicles containing highly packed micrometer-sized components are useful cell models. The water-in-oil emulsion centrifugation method is a simple, powerful tool for the preparation of giant vesicles with encapsulated materials.

油中水型エマルションの遠心分離により巨大ベシクルカプセル化微小球の調製

The constructive biology and the synthetic biology approach to creating artificial life involve the bottom-up assembly of biological or nonbiological ...

Sample Preparation for Mass Spectrometry-based Identification of RNA-binding Regions

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most cases, the action of noncoding RNAs is mediated by proteins whose functions are in turn regulated by these interactions with noncoding RNAs. Consistent with this, a growing number of proteins involved in nuclear functions have been reported to bind RNA and in a few cases the RNA-binding regions of these proteins have been mapped, often through laborious, candidate-based methods.
Here, we report a detailed protocol to perform a high-throughput, proteome-wide unbiased identification of RNA-binding proteins and their RNA-binding regions. The methodology relies on the incorporation of a photoreactive uridine analog in the cellular RNA, followed by UV-mediated protein-RNA crosslinking, and mass spectrometry analyses to reveal RNA-crosslinked peptides within the proteome. Although we describe the procedure for mouse embryonic stem cells, the protocol should be easily adapted to a variety of cultured cells.

We describe a protocol to identify RNA-binding proteins and map their RNA-binding regions in live cells using UV-mediated photocrosslinking and mass spectrometry.

質量分析を用いた識別 RNA 結合領域のための試料作製

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most ...

Preparation of Keratin Hydrolysate from Chicken Feathers and Its Application in Cosmetics

Keratin hydrolysates (KHs) are established standard components in hair cosmetics. Understanding the moisturizing effects of KH is advantageous for skin-care cosmetics. The goals of the protocol are: (1) to process chicken feathers into KH by alkaline-enzymatic hydrolysis and purify it by dialysis, and (2) to test if adding KH into an ointment base (OB) increases hydration of the skin and improves skin barrier function by diminishing transepidermal water loss (TEWL). During alkaline-enzymatic hydrolysis feathers are first incubated at a higher temperature in an alkaline environment and then, under mild conditions, hydrolyzed with proteolytic enzyme. The solution of KH is dialyzed, vacuum dried, and milled to a fine powder. Cosmetic formulations comprising from oil in water emulsion (O/W) containing 2, 4, and 6 weight% of KH (based on the weight of the OB) are prepared. Testing the moisturizing properties of KH is carried out on 10 men and 10 women at time intervals of 1, 2, 3, 4, 24, and 48 h. Tested formulations are spread at degreased volar forearm sites. The skin hydration of stratum corneum (SC) is assessed by measuring capacitance of the skin, which is one of the most world-wide used and simple methods. TEWL is based on measuring the quantity of water transported per a defined area and period of time from the skin. Both methods are fully non-invasive. KH makes for an excellent occlusive; depending on the addition of KH into OB, it brings about a 30% reduction in TEWL after application. KH also functions as a humectant, as it binds water from the lower layers of the epidermis to the SC; at the optimum KH addition in the OB, up to 19% rise in hydration in men and 22% rise in women occurs.

The goal of the protocol is to prepare keratin hydrolysate from chicken feathers by alkaline-enzymatic hydrolysis and to test whether adding keratin hydrolysate into a cosmetics ointment base improves skin barrier function (heightening hydration and diminishing transepidermal water loss). Tests are conducted on men and woman volunteers.

鶏の羽根や化粧品への応用からケラチンを加水分解物の準備

Keratin hydrolysates (KHs) are established standard components in hair cosmetics. Understanding the moisturizing effects of KH is advantageous for ...

Use of Alu Element Containing Minigenes to Analyze Circular RNAs

In addition to linear mRNAs, many eukaryotic genes generate circular RNAs. Most circular RNAs are generated by joining a 5&#39; splice site with an upstream 3&#39; splice site within a pre-mRNA, a process called back-splicing. This circularization is likely aided by secondary structures in the pre-mRNA that bring the splice sites into close proximity. In human genes, Alu elements are thought to promote these secondary RNA structures, as Alu elements are abundant and exhibit base complementarities with each other when present in opposite directions in the pre-mRNA. Here, we describe the generation and analysis of large, Alu element containing reporter genes that form circular RNAs. Through optimization of cloning protocols, reporter genes with up to 20 kb insert length can be generated. Their analysis in co-transfection experiments allows the identification of regulatory factors. Thus, this method can identify RNA sequences and cellular components involved in circular RNA formation.

Use of Alu Element Containing Minigenes to Analyze Circular RNAs

We clone and analyze reporter genes generating circular RNAs. These reporter genes are larger than constructs to analyze linear splicing and contain Alu elements. To investigate the circular RNAs, the constructs are transfected into cells and resulting RNA is analyzed using RT-PCR after removal of linear RNA.

円形RNA解析に対する小遺伝子を含むAlu要素の使用

In addition to linear mRNAs, many eukaryotic genes generate circular RNAs. Most circular RNAs are generated by joining a 5&#39; splice site with an ...

A Plasma Sample Preparation for Mass Spectrometry using an Automated Workstation

Sample preparation for mass spectrometry analysis in proteomics requires enzymatic cleavage of proteins into a peptide mixture. This process involves numerous incubation and liquid transfer steps in order to achieve denaturation, reduction, alkylation, and cleavage. Adapting this workflow onto an automated workstation can increase efficiency and reduce coefficients of variance, thereby providing more reliable data for statistical comparisons between sample types. We previously described an automated proteomic sample preparation workflow1. Here, we report the development of a more efficient and better controlled workflow with the following advantages: 1) The number of liquid transfer steps is reduced from nine to six by combining reagents; 2) Pipetting time is reduced by selective tip pipetting using a 96-position pipetting head with multiple channels; 3) Potential throughput is increased by the availability of up to 45 deck positions; 4) Complete enclosure of the system provides improved temperature and environmental control and reduces the potential for contamination of samples or reagents; and 5) The addition of stable isotope labeled peptides, as well as &#946;-galactosidase protein, to each sample makes monitoring and quality control possible throughout the entire process. These hardware and process improvements provide good reproducibility and improve intra-assay and inter-assay precision (CV of less than 20%) for LC-MS based protein and peptide quantification. The entire workflow for digesting 96 samples in a 96-well plate can be completed in approximately 5 hours.

Here, we present an automated plasma protein digestion method for mass spectrometry-based quantitative proteomic analysis. In this protocol, the liquid transferring and incubation steps for protein denaturation, reduction, alkylation, and trypsin digestion reactions are streamlined and automated. It takes approximately five hours to prepare a 96-well plate with desired precision.

自動ワークステーションを用いた質量分析のためのプラズマサンプル調製

Sample preparation for mass spectrometry analysis in proteomics requires enzymatic cleavage of proteins into a peptide mixture. This process involves ...

Sample Preparation for Probe Electrospray Ionization Mass Spectrometry

Mass spectrometry (MS) is a powerful tool in analytical chemistry because it provides very accurate information about molecules, such as mass-to-charge ratios (m/z), which are useful to deduce molecular weights and structures. While it is essentially a destructive analytical method, recent advancements in the ambient ionization technique have enabled us to acquire data while leaving tissue in a relatively intact state in terms of integrity. Probe electrospray ionization (PESI) is a so-called direct method because it does not require complex and time-consuming pretreatment of samples. A fine needle serves as a sample picker, as well as an ionization emitter. Based on the very sharp and fine property of the probe tip, destruction of the samples is minimal, allowing us to acquire the real-time molecular information from living things in situ. Herein, we introduce three applications of PESI-MS technique that will be useful for biomedical research and development. One involves the application to solid tissue, which is the basic application of this technique for the medical diagnosis. As this technique requires only 10 mg of the sample, it may be very useful in the routine clinical settings. The second application is for in vitro medical diagnostics where human blood serum is measured. The ability to measure fluid samples is also valuable in various biological experiments where a sufficient volume of sample for conventional analytical techniques cannot be provided. The third application leans toward the direct application of probe needles in living animals, where we can obtain real-time dynamics of metabolites or drugs in specific organs. In each application, we can infer the molecules that have been detected by MS or use artificial intelligence to obtain a medical diagnosis.

This article introduces sample preparation methods for a unique real-time analytical method based on the ambient mass spectrometry. This method lets us perform real-time analysis of the biological molecules in vivo without any special pretreatments.

プローブエレクトロスプレーイオン化質量分析のためのサンプル調製

Mass spectrometry (MS) is a powerful tool in analytical chemistry because it provides very accurate information about molecules, such as mass-to-charge ...

Preparation of High-Quality Fermented Fish Product

This protocol provides a method for preparation of industrialized fermented fish product with sturgeon (Aquilaria sinensis) meat product. The procedures were: (1) pretreatment of farmed sturgeon including decapitation, evisceration, skinning-off, cleaning and cutting; (2) marinating fish cubes in 6-12% (w/v) salt solution (1:1, fish cube mass to solution volume); (3) drying fish cubes to a water content of 50-60% by hot air (40-60 &#176;C) or by vacuum; (4) fermentation involving inoculating fish cubes with 0.4-1.6% (w/w) S. cerevisiae in flavor solution to fish cubes and fermenting at 25-35 &#176;C for 6-10 h; (5) sealing fish cubes in vacuum packages with marinating and fermenting solutions; (6) sterilizing at 115-121 &#176;C for 10-20 min. The sturgeon meat product prepared by this method has delicious taste which is mellow and thick, has various types and large amounts of volatile flavor compounds such as alcohols and esters which could mask musty and unpleasant odor from fish, has moderate salt content but good texture properties such as high springiness, gumminess and chewiness, and has bright russet color and attractive appearance. This new technique could also be applied in the processing of other fish to provide convenient fish snack foods which could be stored at room temperature. It is appropriate for both marine and freshwater fish.

The goal of the protocol is to provide an industrialized fish fermentation technique based on inoculation of Saccharomyces cerevisiae.

高品質発酵魚製品の調製

This protocol provides a method for preparation of industrialized fermented fish product with sturgeon (Aquilaria sinensis) meat product. The procedures ...

Use of Microscale Thermophoresis to Measure Protein-Lipid Interactions

The ability to determine the binding affinity of lipids to proteins is an essential part of understanding protein-lipid interactions in membrane trafficking, signal transduction and cytoskeletal remodeling. Classic tools for measuring such interactions include surface plasmon resonance (SPR) and isothermal titration calorimetry (ITC). While powerful tools, these approaches have setbacks. ITC requires large amounts of purified protein as well as lipids, which can be costly and difficult to produce. Furthermore, ITC as well as SPR are very time consuming, which could add significantly to the cost of performing these experiments. One way to bypass these restrictions is to use the relatively new technique of microscale thermophoresis (MST). MST is fast and cost effective using small amounts of sample to obtain a saturation curve for a given binding event. There currently are two types of MST systems available. One type of MST requires labeling with a fluorophore in the blue or red spectrum. The second system relies on the intrinsic fluorescence of aromatic amino acids in the UV range. Both systems detect the movement of molecules in response to localized induction of heat from an infrared laser. Each approach has its advantages and disadvantages. Label-free MST can use untagged native proteins; however, many analytes, including pharmaceuticals, fluoresce in the UV range, which can interfere with determination of accurate KD values. In comparison, labeled MST allows for a greater diversity of measurable pairwise interactions utilizing fluorescently labeled probes attached to ligands with measurable absorbances in the visible range as opposed to UV, limiting the potential for interfering signals from analytes.

Microscale thermophoresis obtains binding constants quickly at low material cost. Either labeled or label free microscale thermophoresis is commercially available; however, label free thermophoresis is not capable of the diversity of interaction measurements that can be performed using fluorescent labels. We provide a protocol for labeled thermophoresis measurements.

タンパク質-脂質相互作用を測定するためのマイクロスケール熱泳動の使用

The ability to determine the binding affinity of lipids to proteins is an essential part of understanding protein-lipid interactions in membrane ...

Plant Sample Preparation for Nucleoside/Nucleotide Content Measurement with An HPLC-MS/MS

Nucleosides/nucleotides are building blocks of nucleic acids, parts of cosubstrates and coenzymes, cell signaling molecules, and energy carriers, which are involved in many cell activities. Here, we describe a rapid and reliable method for the absolute qualification of nucleoside/nucleotide contents in plants. Briefly, 100 mg of homogenized plant material was extracted with 1 mL of extraction buffer (methanol, acetonitrile, and water at a ratio of 2:2:1). Later, the sample was concentrated five times in a freeze dryer and then injected into an HPLC-MS/MS. Nucleotides were separated on a porous graphitic carbon (PGC) column and nucleosides were separated on a C18 column. The mass transitions of each nucleoside and nucleotide were monitored by mass spectrometry. The contents of the nucleosides and nucleotides were quantified against their external standards (ESTDs). Using this method, therefore, researchers can easily quantify nucleosides/nucleotides in different plants.

A precise and reproducible method for in vivo nucleosides/nucleotides quantification in plants is described here. This method employs an HPLC-MS/MS.

HPLC-MS/MSによるヌクレオシド/ヌクレオチド含有量測定のための植物サンプル調製

Nucleosides/nucleotides are building blocks of nucleic acids, parts of cosubstrates and coenzymes, cell signaling molecules, and energy carriers, which ...