We would like to thank Prof. David Somers and Dr. Jeongsik Kim for the luciferase reporter plasmid and initial method development. Prof. Karen Halliday kindly provided all the circadian mutant lines used in this study. This research was supported by Royal Society research grants RS120372 and RS140275. GvO is a Royal Society University Research Fellow (UF110173).

注：このプロトコルでは、記載の試薬およびボリュームがテストされるシロイヌナズナラインごとに表現され、その遺伝子型について6複製ウェルになります。複数の行を分析する場合、分析される行数を有する材料を掛けます。ビデオでは、野生型シロイヌナズナは、（追加の行からの代表的な結果が続いて提供されますが）概日時計突然変異体のラインZTLと比較されます。 <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> 酵素液 </td><td></td></tr><tr><td>セルラーゼ</td><td> 0.5％（w / v）の</td></tr><tr><td>ペクチナーゼR10 </td><td> 0.25％（w / v）の</td></tr><tr><td> D-マンニトール</td><td> 400 mMの</td></tr><tr><td> CaCl 2 </td><td> 10 mMの</td></tr><tr><td>塩化カリウム</td><td> 20 mMの</td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン</td><td> 0.1％（w / v）の</td></tr><tr><td> MES、pHは5.7 </td><td> 20 mMの</td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td> W5ソリューション </td><td></td></tr><tr><td> NaClを</td><td> 150mMの</td></tr><tr><td> CaCl 2 </td><td> 125 mMの</td></tr><tr><td>塩化カリウム</td><td> 5 mMの</td></tr><tr><td> MES、pHは5.7 </td><td> 2 mMの</td></tr><tr><td>グルコース</td><td> 5 mMの</td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td> MMGソリューション </td><td></td></tr><tr><td> MES、pHは5.7 </td><td> 4 mMの</td></tr><tr><td> D-マンニトール</td><td> 400 mMの</td></tr><tr><td> MgCl 2 </td><td> 15 mMの</td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td> PEG溶液 </td><td></td></tr><tr><td> PEG4000 </td><td> 40％（w / v）の</td></tr><tr><td> D-マンニトール</td><td> 200 mMの</td></tr><tr><td> CaCl 2 </td&gt; <td> 100 mMの</td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td> イメージングソリューション </td><td></td></tr><tr><td> W5ソリューション</td><td>最終容量</td></tr><tr><td>ウシ胎仔血清</td><td> 5％（v / v）の</td></tr><tr><td>ルシフェリン</td><td> 1.2 mMの</td></tr><tr><td>アンピシリン</td><td> 50 mg / mlで</td></tr></tbody></table> 表1： ソリューションの一覧。 材料およびバッファの作製<ol><li>植物材料<ol><li>シロイヌナズナコルを保つ-0水に種子を1.5mlチューブ中で4℃の暗所で4日間。ポットに土に種をピペットし、7日間21℃で長日条件下（16時間明8時間の暗）に移します。高湿度を確保するために、最初の3日間、鍋に蓋をしたままにしておきます。移植6新しい8センチメートルのx 13センチメートル×5センチポットに苗とanothため同じ条件で植物を成長を続けます21日えー。土壌は全体で湿っていることを確認してください。 </li></ol></li><li>レポータープラスミド<ol><li>製造業者の説明書に従ってDNA単離キットを使用して、事前に細菌の培養物からLUCレポータープラスミド19：CCA1proを精製します 。 注：20μgのレポータープラスミドをトランスフェクションのため（のdH 2 O中に2μg/μlので10μl）を必要とされます。 </li></ol></li><li>ソリューション 注：このプロトコルのための5つのソリューションが必要とされる：酵素液、洗浄5（W5）溶液、マンニトール、マグネシウム（MMG）溶液を、ポリエチレングリコール（PEG）溶液、及び撮像溶液（ 表1）。プロトプラスト単離工程に進む前に、これらを準備します。 <ol><li> 表1のとおりの酵素溶液10mlを調製し、最後の酵素を追加し、フィルタは、0.22μmのシリンジフィルターを通して溶液を滅菌します。 </li><li>次のボリュームに残っている溶液を調製：15ミリリットルW5ソリューション、10ミリリットルMMG秒表1のとおりolution、1ミリリットルPEG溶液と1.5ミリリットルのイメージングソリューション。 注：これは、PEG溶液は、PEGが完全に溶解していることを確認するために、トランスフェクション前に時間未満何を準備されていないことが重要です。フィルターは、0.22μmのシリンジフィルターを通してイメージング溶液を滅菌します。 </li></ol></li></ol><img alt="図1" src="/files/ftp_upload/54586/54586fig1.jpg" /> 図1：プロトプラスト単離成人シロイヌナズナ植物（A）の葉を（B）に上向き下部表皮層でオートクレーブテープで固定されています。 （C）マジックテープを穏やかに15ミリリットルコニカルチューブの先端と下側の表皮層に押し付けられます。 （D）マジックテープは葉肉細胞（E）を露出させます。 （F）休暇でオートクレーブテープのストリップ添付の溶液にプロトプラストを放出し、セルラーゼおよびペクチナーゼを含む酵素液に浮いています。 （G）は、葉の骨格は、酵素溶液（H）でプロトプラストを残して、酵素消化後、オートクレーブテープ上に残り、廃棄されます。 （I）の最終結果の葉肉プロトプラスト（スケールバー=50μm）を。 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54586/54586fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> 2.プロトプラストの単離<ol><li>シャーレにラベルを付け、10ミリリットルフィルター滅菌酵素溶液を加えます。 </li><li>きれいなラボの表面に粘着面を上にしてオートクレーブテープの4ストリップを修正し、ストリップ上のペトリ皿のサイズをマーク。 </li><li> （4週齢の植物（ 図1a）の葉をカットし、オートクレーブテープに表皮上層を押してください（上を向いすなわち低い表皮面<stroNG&gt;図1b））。 </li><li>ゆっくり15ミリリットルコニカルチューブを使用して、下側の表皮表面にマジックテープのストリップを押してください。葉組織（ 図1c）を鎮圧しないように注意してください。慎重に下表皮（ 図1D）を除去し、葉肉細胞（ 図1eの）を露出するためにマジックテープをやってのけます。 </li><li>ペトリ皿にテープを移動し、酵素液（ 図1F）上に浮遊するように、使用ピンセットをペトリ皿に合うようにオートクレーブテープをカットし、下向きに残します。プロトプラストを溶液中に放出される時に60分のためのプラットフォームシェーカー上で60rpmで回転させます。 </li><li>オートクレーブテープ片を除去し、廃棄するためにピンセットを使用します（ 図1グラム ）と50mlコニカルチューブにプロトプラスト（ 図1H）を含む溶液をピペット。 （端を切断して、このようなP5000チップまたはP1000チップとして）ワイドボアピペットチップを使用してください。 </li><li>遠心分離機100 xにおけるプロトプラスト4℃で3分間グラムとピペットで上清を除去します。ペレットは非常に緩んでいるとして、注意してください。 </li><li>チューブを穏やかに渦巻くことにより、10ミリリットルのW5プロトプラストに対する解決策と再懸濁を追加します。 </li><li> 30〜60分間氷上でプロトプラストを休ま。このステップの間、血球計数器（ 図1I）にプロトプラストをカウントすることにより、歩留まりを評価します。 </li><li> 4℃で3分間、100×gでの遠心分離によってプロトプラストを収集し、ピペットで上清を除去します。ペレットは非常に緩んでいるとして、注意してください。 </li><li> MMG溶液中の5×10 5個のプロトプラスト/ mlの濃度にプロトプラストを再懸濁します。 </li></ol> 3.プロトプラストトランスフェクション<ol><li> 15ミリリットルコニカルチューブに10μlのレポータープラスミド（2μgの/μl）を追加します。 </li><li>チューブに400μlのプロトプラストを追加します。 </li><li> 1ボリューム（410μl）をPEG溶液を追加し、プロトプラストをトランスフェクションするためにチューブを穏やかに12回転倒混和します。 </li><li> 8-15分INC後室温でubationは、4つのボリューム（1640μL）W5溶液でプロトプラスト-DNA-PEG混合物を希釈し、軽く6回転倒混和します。 </li><li>室温で2分間100×gで遠心分離することによってトランスフェクトされたプロトプラストを収集し、ピペットで上清を除去します。ペレットは非常に緩んでいるようにもう一度、注意してください。 </li><li> 1250μlのイメージングソリューションでプロトプラストを再懸濁します。 </li><li> 6へのアリコート200μlを、96ウェルプレートのウェルを複製W5溶液で任意の空のウェルを満たし、及び発光イメージングに適した接着剤明確な蓋でプレートをシール。 </li></ol> 4.イメージング<ol><li>植物イメージングに適した任意の発光イメージングセットアップにプレートを転送します。撮影を開始し、その後、ウェル間の凝縮および圧力の違いを回避するために、転送した後、プレート上に接着剤の蓋に10〜15分を変更します。室温で5日間のプレート毎〜45分（ウェル当たり3秒）を読みます。 注記：プレートの頻度は、読み取り、ウェルあたりのリードタイムは、撮影設定によって異なります。 </li></ol> 5.データ解析<ol><li>任意の解析ソフトウェア（例えば、生体リズム解析ソフトウェアシステム（BRASS）22）を用いた発光結果を分析します。概日の欠陥を明らかにするために、野生型コントロールに変異体のラインを比較してください。 </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

ここでは、プロトプラストの分離、トランスフェクション、およびluminecentイメージングを含むシロイヌナズナ系統における概日周期欠陥をスクリーニングするための迅速なアッセイを、提示します。野生型シロイヌナズナとクロック突然変異体CCA1 / LHY、ZTL、及びCCA1 -OXにおける概日周期はCCA1proからの発光の測定値から算出した：LUCレポーター、よりタイムを使用して、全体の植物から生成された公開されたデータと一致することが見出されかかるトランスジェニックアプローチ（ 表2）。シロイヌナズナ変異体をスクリーニングするために、このアッセイを使用することは時間がかかり、かつ、特定の変異体は、野生型のリズムを示すことを明らかにする可能性がある、トランスジェニック輝線を生成するための初期要件を回避します。このプロトコルの明確な利点は、植物における計時に影響を与える複数の遺伝子の同定を助けるであろう、任意のシロイヌナズナラインが変更された概日転写リズムのために短時間でスクリーニングすることができるということです。 26,27に到達させるために、酵素溶液でストリップを浸潤薄いストリップと真空中に葉や苗を切断することを含みます。その後の消化酵素溶液にプロトプラストを解放するために暗闇の中で、少なくとも3時間のインキュベーションを必要とします。真空浸潤を適用しない場合は、18時間のインキュベーション時間アップをお勧めします。酵素に対する不透過性上皮細胞層がテープによって除去されるので、ここに提示プロトコルでは、真空浸潤は不要です。植物材料を切断してプロトプラストを生成する際には、消化後に細胞壁の破片からプロトプラストを分離する必要があります。これは、典型的には、溶液を濾過または糖勾配27,26上で精製することにより行われます。ここでは、任意の未消化の組織は、後にオートクレーブテープ上に残ります消化ので、プロトプラストの濾過および糖勾配精製を省略することができます。長時間のプロトプラストの手順に起因するストレスが細胞生存率と概日時計に影響を与える可能性があります。ここで可視化し、テープベースのプロトプラスト法20は、プロトプラストの高い数を出します。概日、時系列上での細胞の生存能力を与えられ、プロトプラスト全体実生（ 表2）のマッチング期間の長さは、ここで説明する方法は、プロトプラストを生成するための代替方法よりも好ましいです。 プロトコルのトランスフェクション工程は、そのプロトプラストの生存率に影響を与える重要なステップです。 PEG溶液は、この溶液（段階3.4）で細胞に送達されるDNA、および両方のインキュベーション時間を可能にし、PEGの比率は、経験的に決定されるべきです。標準濃度が低い形質転換効率を低下させる濃度以上では、20％であり、生存能力28を減少させる濃度。 5分ほどの短いインキュベーション時間は、プロトプラスト27の効率的なトランスフェクションをもたらす可能性があります。 プロトプラストは、任意の発光イメージングプラットフォーム上に結像することができます。このビデオでは、我々はハイスループットスクリーニングおよび頻繁な測定を可能にします（〜20μEの複合強度で、それぞれ、赤と青のLED、630および470 nm）の外部ライトを搭載した発光プレートリーダーを、使用しています。照明は、光合成のために利用可能であるような電荷結合素子（CCD）カメラをベース代替プレートリーダーやセットアップなどの発光を検出する他の撮像装置は、長いように等しく良好に適用することができます。制御キャビネットに搭載されたCCDカメラを使用することの利点は、軽量で、温度をプログラムすることができます。欠点は、混乱させるに加えてプロトプラストにストレスを引き起こす可能性が暗闇の長期間を導入し、より長い捕捉時間です内因性の計時をる。かかわらず、実験プラットフォームが選択された、設定の調整は、苗や成熟植物の設定に比べて必要である可能性が高いです。我々の経験では、イメージング・バッファ内のトランスフェクションおよび/またはルシフェリン中にレポータープラスミドの濃度を増加させると、初期の実験で発生する可能性のある不規則なまたは迅速湿リズムを解決する可能性があります。 将来の実験では、ここで説明する方法は、任意の変異シロイヌナズナ線の概日表現型を研究するために適用することができます。軽微な変更では、計時上など様々な薬物の効果は、このセットアップで研究することができました。さらに、トランスフェクションは、さらに、このプロトコルの汎用性を拡大する、19遺伝子サイレンシングのための人工マイクロRNAを含むように修飾することができます。イネプロトプラストを生成するためのプロトコルは、29十分に確立されており、ここで紹介する撮像プロトコルは、均等に私たちのUを促進するために適用することができます経済的に重要な単子葉作物植物におけるクロックのnderstanding。

ほとんどの生物は、環境への日々の変化を効率的に交渉を支援するために、内因性のタイムキーパーを持っています。このタイムキーパー、概日時計は、外部環境の予測可能な変化を先取りするために、生物の代謝および生理学の多くの側面を規制しています。 4 -例えば植物では、時間的に予測可能な病原体や草食動物の攻撃の期待が強く、全体的な感受性1を低減します。デンプン代謝はしっかりと長いまたは短日条件5で成長したかどうかを夜明けまで、最後のその澱粉の埋蔵量を確保するために、体内時計によって制御されています。確かに、24時間の環境ショーに一致する概日時計を持つ植物は、ミスマッチ期間6のクロックを実行している植物に比べて成長率、炭素固定率と生存率を増加させました。すべてのこれらのプロセスにおける概日リズムの広範な影響が最大のリズミカルなレギュレーションから三番目に大きく発生しますシロイヌナズナ7の全トランスクリプトームの。これらのリズミカルな遺伝子産物は、代謝経路、ホルモンシグナル伝達、およびストレス応答7を含む細胞プロセスの広い範囲に関与しています。その上で、タンパク質機能の直接の概日調節は、リン酸化8の概日調節およびおそらく他の翻訳後修飾（PTMを）によって確立されています。 この毎日の転写再プログラミングを駆動する概日時計の中心に/翻訳フィードバックは朝発現遺伝子を含む（TTFLs）を、ループの転写のネットワークがある発現を抑制概日時計ASSOCIATED 1（CCA1）とLATE細長い胚軸（LHY）夕方の遺伝子のCAB 1（TOC1）のタイミング、GIGANTEA（GI）と夜の複合体（EC）のメンバーの、LUX不整脈（LUX）、早咲き3（ELF3）、およびELF4 9から11まで 。一緒にウィットH 疑似レスポンスレギュレーターの -genes（PRR3、5、7、および9）ECが正レギュレータ12として機能するのに対し、TOC1は CCA1 / LHYの発現を抑制する- 14。 TTFLネットワークコンポーネントの、フィードバック機構に追加の転写後及び翻訳後の調節は、チューニング概日リズムに重要な役割を果たしています。現在までに、概日時計タンパク質の同定された最も豊富なPTMは、リン酸化15です。カゼインキナーゼ2（CK2）によるCCA1のリン酸化は、そのは、プロモーター16と概日時計17の温度補償のために重要であるが標的への結合に影響します。 PRRタンパク質を差動概日周期の上にリン酸化され、TOC1のリン酸化は、その負の調節因子との相互作用に影響を及ぼしている、夜、段階的なクロック成分ZEITLUPE（ZTL）18。これらの例は示してどのように24時間へのPTMおよびタンパク質 - タンパク質相互作用のチューニングTTFLネットワーク転写発振器。転写クロック・ネットワークとその規制のより詳細な概要については、優れた最近のレビューは、（ 例えば 、15を参照）が使用可能です。 しかし、どのようなそれほど明らか残っているのはリズミカルに戻って時計機構自体に細胞代謝フィードのプロセスや他の側面を規制する程度です。クロック欠陥のためのシロイヌナズナ変異体の大規模なスクリーニングはTTFLネットワークから24時間のリズムの生成に関与することができたメカニズムやシグナル伝達経路のさらなる理解を得ることができました。このため、Kimとサマーズは、以前に任意のシロイヌナズナライン19における時計機能の効率的かつ迅速な分析のためのブレークスルー方式を発表しました。プロトプラストにおける一過性発現の使用に基づいて、この方法は、安定したトランスジェニック系統の必要性を上回るまたは発光クロックマーカーラインに交差します。ここでは、高収量プロトプラストisolatioを可視化最適化されたプロトコルと組み合わせたn個の方法20は、96ウェルプレートリーダー中で一過性に発現クロックマーカーの蛍光イメージングによる概日欠陥をスクリーニングします。 我々は、変更された概日リズムを検出し、ここで正常に記載の方法を確認するために、十分に特徴づけクロック変異体に野生型Col- 0シロイヌナズナを比較します。 LUC 19：CCA1pro;これらの株由来のプロトプラストは、概日CCA1プロモーターからホタルルシフェラーゼを発現するレポーター構築物でトランスフェクトされています。ルシフェラーゼはルシフェリンを、これらのプロトプラストにおける転写リズムの周期、振幅及び位相を評価するために時間をかけて撮像される光21を出射する電子的に励起オキシルシフェリンに変換された多段階の反応を触媒します。 プロトコルは、三つの主要な部分で構成されています。レポータープラスミド、及び発光イムでプロトプラストをトランスフェクション、プロトプラストの単離エージング。これらの3つの部分が常に新たに調製した緩衝液および試薬を用いて、単一の日に行われるべきです。レポータープラスミドの十分な量の植物成長及び精製は、事前に行われるべきであり、このプロトコルで可視化されていません。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>CELLULYSIN Cellulase, Trichoderma viride&#160;</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>219466</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pectinase R10</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P2401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-mannitol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M4125&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C4901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P3911</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A4503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MES</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>327765000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>327300010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>G/0500/60</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M2670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene glycol (PEG) 4000</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>434630010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F4135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Luciferin, Firefly</td>
			<td>Biosynth AG</td>
			<td>L-8200</td>
			<td>Dissolve luciferin powder in 0.1M trisphosphate buffer pH 8.0 to a concentration of 50mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A9618</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Comply Steam Indicator Tape</td>
			<td>3M</td>
			<td>1222</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magic Tape</td>
			<td>3M</td>
			<td>819-1460</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dishes</td>
			<td>Scientific Laboratory Supplies</td>
			<td>SLS2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate, 96 well, flat bottom, white</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>655075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TopSeal-A, adhesive lids for 96-well plates</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>6050195</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe, 10 ml, w/o needle</td>
			<td>BD Plastipak</td>
			<td>302188</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe filter 0.22 &#181;m</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>SLGP033RS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biological Rhythms Analysis Software System (BRASS)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Free download at amillar.org</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAfilter Maxiprep Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>12262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Modified Fuch-Rosenthal counting chamber, double cell</td>
			<td>Hawksley</td>
			<td>AC6000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bright field microscope</td>
			<td>Optika Microscopes</td>
			<td>B-150POL-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB942 TriStar2 multimode reader, with luminescence module</td>
			<td>Berthold Technologies Ltd</td>
			<td>57947/57948</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rapid analysis of circadian phenotypes in arabidopsis protoplasts transfected with a luminescent clock reporter

The plant circadian clock allows the anticipation of daily changes to the environment. This anticipation aids the responses to temporally predictable biotic and abiotic stress. Conversely, disruption of circadian timekeeping severely compromises plant health and reduces agricultural crop yields. It is therefore imperative that we understand the intricate regulation of circadian rhythms in plants, including the factors that affect motion of the transcriptional clockwork itself.
Testing circadian defects in the model plant Arabidopsis thaliana (Arabidopsis) traditionally involves crossing specific mutant lines to a line rhythmically expressing firefly luciferase from a circadian clock gene promoter. This approach is laborious, time-consuming, and could be fruitless if a mutant has no circadian phenotype. The methodology presented here allows a rapid initial assessment of circadian phenotypes. Protoplasts derived from mutant and wild-type Arabidopsis are isolated, transfected with a rhythmically expressed luminescent reporter, and imaged under constant light conditions for 5 days. Luminescent traces will directly reveal whether the free-running period of mutant plants is different from wild-type plants. The advantage of the method is that any Arabidopsis line can efficiently be screened, without the need for generating a stably transgenic luminescent clock marker line in that mutant background.

野生型シロイヌナズナのプロトプラストは、既知のクロック突然変異体CCA1 / LHY（短周期変異体2）、ZTL（長周期変異体23）、および過剰発現ラインCCA1 -OX（24不整脈）と比較しました。すべては一過CCA1proにトランスフェクトした：LUCレポーターと5日間にわたってプレートリーダー上で一定の光で画像化。 ここでは、CCA1 / LHYの変異体では、概日制御遺伝子発現の自走期間は発光クロックの安定したトランスジェニック発現が2,9マーカーによって分析公開期間に合わせて、（ 図2a）を短縮することを示しています。 ZTL変異体のプロトプラストにおける概日振動の周期は、野生型に比べて長くなっている（ 図2b）、苗から以前に発表された結果に応じて、細胞懸濁液のcultu解像度およびプロトプラスト19,23,25。 CCA1の過剰発現は午前位相でクロックをロックし、グローバルな転写は不整脈24になります 。一貫して、我々はCCA1proに全く振動を観察されない：CCA1 -OX プロトプラストにおけるLUC発現 （ 図2c）。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/54586/54586fig2.jpg" /> 図2：Col- 0のプロトプラスト概日リズムプロトプラスト、CCA1 / LHY、ZTL、とCCA1 -OX 一過CCA1proで形質転換した：LUCは、構築し、発光の概日リズムは、5日間で画像化した（A - C）。 （D）コル-0、CCA1 / LHYとZTL（A - B）での発光トレースに基づいて概日周期を推定。私に±SEM、nは3-5、t検定のp値示されているように。 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54586/54586fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> 遺伝子型 </td><td> 期間（プロトプラスト） </td><td> 期間（トランスジェニック） </td><td> によって報告されました： </td><td> リファレンス </td></tr><tr><td> Col- 0 </td><td> 23.0±0.21 </td><td> 24.4±0.09 </td><td> pCCA1：コルでLUC -0 </td><td> （2） </td></tr><tr><td> CCA1 / LHY </td><td> 20.6±0.13 </td><td> 19.9±0.11 </td><td> pCCA1：コルでLUC -0 </td><td> （2） </td></tr><tr><td></td><td></td><td> 〜18 </td><td> L 小胞体のバックグラウンドでのRNA </td><td> （9） </td></tr><tr><td&gt; ZTL </td><td> 25.1±0.12 </td><td> 27.4±0.5 </td><td> CAB2：C24生態型でLUC </td><td> （22） </td></tr><tr><td> CCA1 -OX </td><td>不整脈の</td><td>不整脈の</td><td> pCCA1：LUC（LDデータのみ） </td><td> （2） </td></tr><tr><td></td><td></td><td>不整脈の</td><td>コル-0バックグラウンドでRNAとタンパク質</td><td> （23） </td></tr></tbody></table> 表2：トランスジェニック苗に比べてプロトプラストにおける概日リズム pCCA1の概日期間：期間最初の変異について報告長さと、利用可能な場合と比較してプロトプラストにおけるLUC発現 、pCCA1と：コル-0でLUC式 。

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Rapid Analysis of Circadian Phenotypes in Arabidopsis Protoplasts Transfected with a Luminescent Clock Reporter

概日時計は、シロイヌナズナのトランスクリプトームの約3分の規制が、計時にフィードバックされる遺伝子の割合は不明のまま。ここでは、急速に一過プロトプラスト内で発現の概日レポーターの発光イメージングを使用して、シロイヌナズナのいずれかの変異体のラインに概日表現型を評価するための方法を視覚化します。

発光時計レポーターとシロイヌナズナプロトプラストトランスフェにおける概日表現型の迅速分析

The plant circadian clock allows the anticipation of daily changes to the environment. This anticipation aids the responses to temporally predictable ...

rapid-analysis-circadian-phenotypes-arabidopsis-protoplasts

Research

JoVE Journal

Biology

12.7K ビュー.  University of Edinburgh. 概日時計は、シロイヌナズナのトランスクリプトームの約3分の規制が、計時にフィードバックされる遺伝子の割合は不明のまま。ここでは、急速に一過プロトプラスト内で発現の概日レポーターの発光イメージングを使用して、シロイヌナズナのいずれかの変異体のラインに概日表現型を評価するための方法を視覚化します。 

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Isolation of Protoplasts from Tissues of 14-day-old Seedlings of Arabidopsis thaliana

Protoplasts are plant cells that have had their cell walls enzymatically removed. Isolation of protoplasts from different plant tissues was first reported more than 40 years ago 1 and has since been adapted to study a variety of cellular processes, such as subcellular localization of proteins, isolation of intact organelles and targeted gene-inactivation by double stranded RNA interference (RNAi) 2-5. Most of the protoplast isolation protocols use leaf tissues of mature Arabidopsis (e.g. 35-day-old plants) 2-4. We modified existing protocols by employing 14-day-old Arabidopsis seedlings. In this procedure, one gram of 14-day-old seedlings yielded 5 106-107 protoplasts that remain intact at least 96 hours. The yield of protoplasts from seedlings is comparable with preparations from leaves of mature Arabidopsis, but instead of 35-36 days, isolation of protoplasts is completed in 15 days. This allows decreasing the time and growth chamber space that are required for isolating protoplasts when mature plants are used, and expedites the downstream studies that require intact protoplasts.

Isolation of Protoplasts from Tissues of 14-day-old Seedlings of Arabidopsis thaliana

This video shows a procedure for isolating intact protoplasts from tissues of 14-day-old seedlings of Arabidopsis. Given that the isolated protoplasts remain intact for at least 96h and are isolated from seedlings instead of one-month-old mature plants, this procedure expedites assays requiring intact protoplasts.

の14日齢の苗の組織からのプロトプラストの単離シロイヌナズナ</em

Protoplasts are plant cells that have had their cell walls enzymatically removed. Isolation of protoplasts  from different plant tissues was first ...

生物学

Floral-dip Transformation of Arabidopsis thaliana to Examine pTSO2::&beta;-glucuronidase Reporter Gene Expression

The ability to introduce foreign genes into an organism is the foundation for modern biology and biotechnology. In the model flowering plant Arabidopsis thaliana, the floral-dip transformation method1-2 has replaced all previous methods because of its simplicity, efficiency, and low cost. Specifically, shoots of young flowering Arabidopsis plants are dipped in a solution of Agrobacterium tumefaciens carrying specific plasmid constructs. After dipping, the plants are returned to normal growth and yield seeds, a small percentage of which are transformed with the foreign gene and can be selected for on medium containing antibiotics. This floral-dip method significantly facilitated Arabidopsis research and contributed greatly to our understanding of plant gene function. In this study, we use the floral-dip method to transform a reporter gene, &beta;-glucuronidase (GUS), under the control of TSO2 promoter. TSO2, coding for the Ribonucleotide Reductase (RNR) small subunit3, is a cell cycle regulated gene essential for dNDP biosynthesis in the S-phase of the cell cycle. Examination of GUS expression in transgenic Arabidopsis seedlings shows that TSO2 is expressed in actively dividing tissues. The reported experimental method and materials can be easily adapted not only for research but also for education at high school and college levels.

Floral-dip Transformation of Arabidopsis thaliana to Examine pTSO2::&#946;-glucuronidase Reporter Gene Expression

This article illustrates the floral-dip method of Agrobacterium tumefaciens -mediated transformation of Arabidopsis thaliana. By introducing a cell-cycle regulated promoter-reporter, pTSO2::&beta;-glucuronidase (GUS), into Arabidopsis, we illustrates how one detects GUS reporter expression in transgenic seedlings.

フローラルディップ変換のシロイヌナズナ調べに pTSO2：：β-グルクロニダーゼレポーター遺伝子発現

The ability to introduce foreign genes into an organism is the foundation for modern biology and biotechnology. In the model flowering plant Arabidopsis ...

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

C. elegans has proven to be a valuable model system for the discovery and functional characterization of many genes and gene pathways1. More sophisticated tools and resources for studies in this system are facilitating continued discovery of genes with more subtle phenotypes or roles. 
Here we present a generalized protocol we adapted for identifying C. elegans genes with postembryonic phenotypes of interest using RNAi2. This procedure is easily modified to assay the phenotype of choice, whether by light or fluorescence optics on a dissecting or compound microscope. This screening protocol capitalizes on the physical assets of the organism and molecular tools the C. elegans research community has produced. As an example, we demonstrate the use of an integrated transgene that expresses a fluorescent product in an RNAi screen to identify genes required for the normal localization of this product in late stage larvae and adults. First, we used a commercially available genomic RNAi library with full-length cDNA inserts. This library facilitates the rapid identification of multiple candidates by RNAi reduction of the candidate gene product. Second, we generated an integrated transgene that expresses our fluorecently tagged protein of interest in an RNAi-sensitive background. Third, by exposing hatched animals to RNAi, this screen permits identification of gene products that have a vital embryonic role that would otherwise mask a post-embryonic role in regulating the protein of interest. Lastly, this screen uses a compound microscope equipped for single cell resolution.

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

We describe a sensitized method to identify postembryonic regulators of protein expression and localization in C. elegans using an RNAi-based genomic screen and an integrated transgene that expresses a functional, fluorescently tagged protein.

の後胚表現型を識別するためのRNAiスクリーニング C.エレガンス</em

C. elegans has proven to be a valuable model system for the discovery and functional characterization of many genes and gene pathways1. More sophisticated ...

Monitoring Cell-autonomous Circadian Clock Rhythms of Gene Expression Using Luciferase Bioluminescence Reporters

In mammals, many aspects of behavior and physiology such as sleep-wake cycles and liver metabolism are regulated by endogenous circadian clocks (reviewed1,2). The circadian time-keeping system is a hierarchical multi-oscillator network, with the central clock located in the suprachiasmatic nucleus (SCN) synchronizing and coordinating extra-SCN and peripheral clocks elsewhere1,2. Individual cells are the functional units for generation and maintenance of circadian rhythms3,4, and these oscillators of different tissue types in the organism share a remarkably similar biochemical negative feedback mechanism. However, due to interactions at the neuronal network level in the SCN and through rhythmic, systemic cues at the organismal level, circadian rhythms at the organismal level are not necessarily cell-autonomous5-7. Compared to traditional studies of locomotor activity in vivo and SCN explants ex vivo, cell-based in vitro assays allow for discovery of cell-autonomous circadian defects5,8. Strategically, cell-based models are more experimentally tractable for phenotypic characterization and rapid discovery of basic clock mechanisms5,8-13.
Because circadian rhythms are dynamic, longitudinal measurements with high temporal resolution are needed to assess clock function. In recent years, real-time bioluminescence recording using firefly luciferase as a reporter has become a common technique for studying circadian rhythms in mammals14,15, as it allows for examination of the persistence and dynamics of molecular rhythms. To monitor cell-autonomous circadian rhythms of gene expression, luciferase reporters can be introduced into cells via transient transfection13,16,17 or stable transduction5,10,18,19. Here we describe a stable transduction protocol using lentivirus-mediated gene delivery. The lentiviral vector system is superior to traditional methods such as transient transfection and germline transmission because of its efficiency and versatility: it permits efficient delivery and stable integration into the host genome of both dividing and non-dividing cells20. Once a reporter cell line is established, the dynamics of clock function can be examined through bioluminescence recording. We first describe the generation of P(Per2)-dLuc reporter lines, and then present data from this and other circadian reporters. In these assays, 3T3 mouse fibroblasts and U2OS human osteosarcoma cells are used as cellular models. We also discuss various ways of using these clock models in circadian studies. Methods described here can be applied to a great variety of cell types to study the cellular and molecular basis of circadian clocks, and may prove useful in tackling problems in other biological systems.

Circadian clocks function within individual cells, i.e., they are cell-autonomous. Here, we describe methods for generating cell-autonomous clock models using non-invasive, luciferase-based real-time bioluminescence technology. Reporter cells provide tractable, functional model systems for studying circadian biology.

ルシフェラーゼ生物発光レポーターを用いた遺伝子発現のモニタリング細胞自律的な概日時計のリズム

In mammals, many aspects of behavior and physiology such as sleep-wake cycles and liver metabolism are regulated by endogenous circadian clocks ...

Rapid Genetic Analysis of Epithelial-Mesenchymal Signaling During Hair Regeneration

Hair follicle morphogenesis, a complex process requiring interaction between epithelia-derived keratinocytes and the underlying mesenchyme, is an attractive model system to study organ development and tissue-specific signaling. Although hair follicle development is genetically tractable, fast and reproducible analysis of factors essential for this process remains a challenge. Here we describe a procedure to generate targeted overexpression or shRNA-mediated knockdown of factors using lentivirus in a tissue-specific manner. Using a modified version of a hair regeneration model 5, 6, 11, we can achieve robust gain- or loss-of-function analysis in primary mouse keratinocytes or dermal cells to facilitate study of epithelial-mesenchymal signaling pathways that lead to hair follicle morphogenesis. We describe how to isolate fresh primary mouse keratinocytes and dermal cells, which contain dermal papilla cells and their precursors, deliver lentivirus containing either shRNA or cDNA to one of the cell populations, and combine the cells to generate fully formed hair follicles on the backs of nude mice. This approach allows analysis of tissue-specific factors required to generate hair follicles within three weeks and provides a fast and convenient companion to existing genetic models.

Tissue-specific analysis of a hair follicle regeneration model using lentivirus to mediate gain- or loss-of-function.

髪の再生の間に上皮間葉シグナル伝達の迅速遺伝子解析

Hair follicle morphogenesis, a complex process requiring interaction between epithelia-derived keratinocytes and the underlying mesenchyme, is an ...

Efficient and Rapid Isolation of Early-stage Embryos from Arabidopsis thaliana Seeds

In flowering plants, the embryo develops within a nourishing tissue - the endosperm - surrounded by the maternal seed integuments (or seed coat). As a consequence, the isolation of plant embryos at early stages (1 cell to globular stage) is technically challenging due to their relative inaccessibility. Efficient manual dissection at early stages is strongly impaired by the small size of young Arabidopsis seeds and the adhesiveness of the embryo to the surrounding tissues. Here, we describe a method that allows the efficient isolation of young Arabidopsis embryos, yielding up to 40 embryos in 1 hr to 4 hr, depending on the downstream application. Embryos are released into isolation buffer by slightly crushing 250-750 seeds with a plastic pestle in an Eppendorf tube. A glass microcapillary attached to either a standard laboratory pipette (via a rubber tube) or a hydraulically controlled microinjector is used to collect embryos from droplets placed on a multi-well slide on an inverted light microscope. The technical skills required are simple and easily transferable, and the basic setup does not require costly equipment. Collected embryos are suitable for a variety of downstream applications such as RT-PCR, RNA sequencing, DNA methylation analyses, fluorescence in situ hybridization (FISH), immunostaining, and reporter gene assays.

Efficient and Rapid Isolation of Early-stage Embryos from Arabidopsis thaliana Seeds

We report an efficient and simple method to isolate embryos at early stages of development from Arabidopsis thaliana seeds. Up to 40 embryos can be isolated in 1 hr to 4 hr, depending on the downstream application. The procedure is suitable for transcriptome, DNA methylation, reporter gene expression, immunostaining and fluorescence in situ hybridization analyses.

から初期段階の胚の効率的かつ迅速な単離<em&gt;シロイヌナズナ</em&gt;種子

In flowering plants, the embryo develops within a nourishing tissue - the endosperm - surrounded by the maternal seed integuments (or seed coat). As a ...

Design and Analysis of Temperature Preference Behavior and its Circadian Rhythm in Drosophila

The circadian clock regulates many aspects of life, including sleep, locomotor activity, and body temperature (BTR) rhythms1,2. We recently identified a novel Drosophila circadian output, called the temperature preference rhythm (TPR), in which the preferred temperature in flies rises during the day and falls during the night 3. Surprisingly, the TPR and locomotor activity are controlled through distinct circadian neurons3. Drosophila locomotor activity is a well&#160;known circadian behavioral output and has provided strong contributions to the discovery of many conserved mammalian circadian clock genes and mechanisms4. Therefore, understanding TPR will lead to the identification of hitherto unknown molecular and cellular circadian mechanisms. Here, we describe how to perform and analyze the TPR assay. This technique not only allows for dissecting the molecular and neural mechanisms of TPR, but also provides new insights into the fundamental mechanisms of the brain functions that integrate different environmental signals and regulate animal behaviors. Furthermore, our recently published data suggest that the fly TPR shares features with the mammalian BTR3. Drosophila are ectotherms, in which the body temperature is typically behaviorally regulated. Therefore, TPR is a strategy used to generate a rhythmic body temperature in these flies5-8. We believe that further exploration of Drosophila TPR will facilitate the characterization of the mechanisms underlying body temperature control in animals.

Design and Analysis of Temperature Preference Behavior and its Circadian Rhythm in Drosophila

We recently identified a novel Drosophila circadian output, temperature preference rhythm (TPR), in which the preferred temperature in flies rises during the day and falls during the night. TPR is regulated independently from another circadian output, locomotor activity. Here&#160;we describe the design and analysis of TPR in Drosophila.

ショウジョウバエにおける温度嗜好挙動とその概日リズムの設計と解析

The circadian clock regulates many aspects of life, including sleep, locomotor activity, and body temperature (BTR) rhythms1,2. We recently identified a ...

Rapid and Efficient Zebrafish Genotyping Using PCR with High-resolution Melt Analysis

Zebrafish is a powerful vertebrate model system for studying development, modeling disease, and performing drug screening. Recently a variety of genetic tools have been introduced, including multiple strategies for inducing mutations and generating transgenic lines. However, large-scale screening is limited by traditional genotyping methods, which are time-consuming and labor-intensive. Here we describe a technique to analyze zebrafish genotypes by PCR combined with high-resolution melting analysis (HRMA).&#160;This approach is rapid, sensitive, and inexpensive, with lower risk of contamination artifacts.&#160;Genotyping by PCR with HRMA can be used for embryos or adult fish, including in high-throughput screening protocols.

PCR combined with high-resolution melt analysis (HRMA) is demonstrated as a rapid and efficient method to genotype zebrafish.

高解像度メルト解析を用いたPCRを使用して、迅速かつ効率的なゼブラフィッシュ遺伝子型決定

Zebrafish is a powerful vertebrate model system for studying development, modeling disease, and performing drug screening. Recently a variety of genetic ...

Quantification of Orofacial Phenotypes in Xenopus

Xenopus has become an important tool for dissecting the mechanisms governing craniofacial development and defects. A method to quantify orofacial development will allow for more rigorous analysis of orofacial phenotypes upon abrogation with substances that can genetically or molecularly manipulate gene expression or protein function. Using two dimensional images of the embryonic heads, traditional size dimensions-such as orofacial width, height and area- are measured. In addition, a roundness measure of the embryonic mouth opening is used to describe the shape of the mouth. Geometric morphometrics of these two dimensional images is also performed to provide a more sophisticated view of changes in the shape of the orofacial region. Landmarks are assigned to specific points in the orofacial region and coordinates are created. A principle component analysis is used to reduce landmark coordinates to principle components that then discriminate the treatment groups. These results are displayed as a scatter plot in which individuals with similar orofacial shapes cluster together. It is also useful to perform a discriminant function analysis, which statistically compares the positions of the landmarks between two treatment groups. This analysis is displayed on a transformation grid where changes in landmark position are viewed as vectors. A grid is superimposed on these vectors so that a warping pattern is displayed to show where significant landmark positions have changed. Shape changes in the discriminant function analysis are based on a statistical measure, and therefore can be evaluated by a p-value. This analysis is simple and accessible, requiring only a stereoscope and freeware software, and thus will be a valuable research and teaching resource.

Quantification of Orofacial Phenotypes in Xenopus

A method to quantify the orofacial size and shape of Xenopus laevis embryos has been developed. In this protocol, traditional size measurements are combined with geometric morphometrics to allow for more sophisticated analyses of orofacial development and defects.

口腔顔面表現型の定量化で<em&gt;アフリカツメガエル</em

Xenopus has become an important tool for dissecting the mechanisms governing craniofacial development and defects. A method to quantify orofacial ...

Transfecting RAW264.7 Cells with a Luciferase Reporter Gene

Transfection of desired genetic materials into cells is an inevitable procedure in biomedical research studies. While numerous methods have been described, certain types of cells are resistant to many of these methods and yield low transfection efficiency1, potentially hindering research in those cell types. In this protocol, we present an optimized transfection procedure to introduce luciferase reporter genes as a plasmid DNA into the RAW264.7 macrophage cell line. Two different types of transfection reagents (lipid-based and polyamine-based) are described, and important notes are given throughout the protocol to ensure that the RAW264.7 cells are minimally altered by the transfection procedure and any experimental data obtained are the direct results of the experimental treatment. While transfection efficiency may not be higher compared to other transfection methods, the described procedure is robust enough for detecting luciferase signal in RAW264.7 without changing the physiological response of the cells to stimuli.

Transfection into the macrophage cell line, RAW264.7, is difficult due to the cell&#8217;s natural response against foreign materials. We described here a gentle yet robust procedure for transfecting luciferase reporter genes into RAW264.7 cells.